Summary
Presenteras här är ett protokoll för att studera födans mikrocirkulation i levande murin hjärtvävnad genom ex vivo övervakning av kranskärlens perfusion tryck och flöde som upprätthåller trycket, liksom vaskulär träd komponenter inklusive kapillär sängar och pericytes, som septal gatan är kanylerad och trycksatt.
Abstract
Kranskärlens artärton tillsammans med öppnandet eller stängningen av kapillärerna bestämmer till stor del blodflödet till kardiomyocyter vid konstant perfusionstryck. Det är dock svårt att övervaka de dynamiska förändringarna i kranskärlen och kapillärerna i hela hjärtat, främst på grund av dess rörelse och non-stop slå. Här beskriver vi en metod som möjliggör övervakning av kranskärlens perfusionshastighet, tryck och diameter förändringar av artärer och kapillärer i mus rätt Ventrikulärt papillary muskler. Musens septala artär är kannulerad och perfused vid ett konstant flöde eller tryck med den andra dynamiskt uppmätta. Efter perfusion med en fluorescerande märkt lectin (t.ex. Alexa Fluor-488 eller -633 märkt Wheat-Germ Agglutinin, WGA), arterioler och kapillärer (och andra kärl) i rätt ventrikel papillary muskel och septum kunde lätt avbildas. Förändringar i kärldiametern kan sedan mätas i närvaro eller frånvaro av hjärtkontraktioner. När genetiskt kodade fluorescerande proteiner uttrycktes kunde specifika egenskaper övervakas. Till exempel visualiserades pericyter i mushjärtan som uttryckte NG2-DsRed. Denna metod har gett en användbar plattform för att studera de fysiologiska funktionerna hos kapillärpericyter i hjärtat. Det är också lämpligt för att studera effekten av reagenser på blodflödet i hjärtat genom att mäta kärl/kapillärdiametern och det arteriella luminaltrycket samtidigt. Denna förberedelse, i kombination med ett toppmodernt optiskt bildsystem, gör det möjligt att studera blodflödet och dess kontroll på cellulär och molekylär nivå i hjärtat under nästan fysiologiska förhållanden.
Introduction
Lämplig reglering av kranskärlstrycket säkerställer tillräcklig blodtillförsel till hjärtat för att uppfylla dess metaboliska krav1. Det har dock först nyligen blivit tydligt hur kranskärlstryckets flöde regleras dynamiskt i hjärtat, trots omfattande studier som har utförts in vivo och in vitro under de senaste decennierna. En av anledningarna är svårigheten att etablera en fysiologisk arbetsmodell för sådana studier på grund av hjärtats ständiga slag. Oavsett har en mängd olika metoder fastställts för observation av kranskärlen i levande vävnader eller djur, men ingen av dessa metoder kunde uppnå konstant / stabilt fokus och mätningarna av tryck, flöde och mikrovaskulär diameter samtidigt2,3. Den direkta visualiseringen av kranskärlens kranskärlens mikrokärl i bultande hjärta introduceradesför årtionden sedan 4,3, men diametermätningarna i små kärl var utmanande och de specifika funktionerna hos de många specialiserade celltyperna i samband med mikrocirkulationen var lika irriterande. Inte ens den stroboskopiska metoden och det flytande objektiva systemet kunde samtidigt lämna ovanstående information5. Ändå har en betydande mängd värdefull information erhållits med hjälp av ovannämnda teknik, vilket har hjälpt oss att förstå mer om regleringen av kranskärlens blodflöde6. Metoden vi beskriver i detta dokument kommer att hjälpa en att undersöka och förstå i detalj hur komponenter i kranskärlen, artärerna och mikrovaskulaturen reagerar olika på stimuleringar och metaboliska krav.
Den arbetsmodell som vi upprättade för att genomföra dessa studier byggde på det tidigare arbetet i Westerhofm.fl. Efter cannulation av septal gatan i mus hjärtat, fysiologiska saltlösning användes för att granska den gatan för att hålla myocyter och andra komponenter i hjärtvävnad näring. Kranskärlens perfusion tryck, flödet och vaskulär diameter övervakades bland andra fysiologiska funktioner med hjälp av lämpliga fluorescerande indikatorer. Denna metod gör det möjligt för oss att visualisera kranskärlsbädden under fysiologiskt tryck i levande vävnad och studera de cellulära mekanismerna bakom mikrocirkulationsreglering för första gången.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djurvård var i enlighet med riktlinjerna från University of Maryland Baltimore och Institutional Animal Care and Use Committee godkände protokoll.
1. Förberedelse av lösningarna
OBS: Förbered lösningar i förväg. Två typer av grundläggande lösningar används i experimenten: (1) fysiologiska saltlösningslösningar (PSS) för badsmumfusat och (2) Tyrodes lösningar för lumen perfuserar. Kontinuerlig bubblande med CO2 behövs för att bibehålla PSS pH. HEPES-buffrade Tyrodes lösning används i lumen istället för PSS för att undvika bubblor som går in i kärlen, eftersom bubblor skulle skada endotelcellerna7 och ocklusera flödet.
- PSS-lösning: Se formeln och sammansättningen av PSS-lösningen i tabell 1. Gör 10 L Ca2+-fri och glukosfri PSS-lagerlösning och förvara i rumstemperatur. 1 h före någon procedur, ta ut 1 L av lagerlösningen och bubblan med 5% CO2 (74% N2 och 21% O2) för att hålla pH-lösningen på ~ 7,4. Tillsätt 1,8 g glukos och 1,8 ml CaCl2 (1 M lager)8.
OBS: Tillsätt Ca2+ först efter bubblande när pH är ~7,4, annars kommer Ca2+ att fällas ut. - Tyrods lösning: Se formeln och sammansättningen av Tyrodens lösning i tabell 1. Filtrera lösningen (0,22 μm) och förvaras vid 4 °C för framtida användning9.
- Tyrodes lösning med BDM (2,3-Butanedione monoxime): Tillsätt BDM som en reversibel myofilamenthämmare för att förhindra sammandragning av myocyterna10. Väg 600 mg BDM och lägg till 200 ml av Tyrodes lösning. Rör om lösningen med BDM tills den är helt upplöst. Ingen ytterligare filtrering krävs.
- Förvara Tyrodens lösning som innehåller BDM vid 4 °C för framtida användning.
2. Förberedelse av kammaren
- Täck både dissekeringskammaren och experimentkammaren i förväg med polydimethylsiloxan (PDMS) enligt tillverkarens instruktioner.
- Fyll dissekeringskammaren med tyrodens lösning som innehåller BDM.
- Slå på kylaggregatet 1 timme före proceduren. Ställ in temperaturen på 4 °C.
3. Cannula beredning
- Slå på mikropipettedragaren. Välj inställningarna enligt tillverkarens instruktioner.
- Ta ett rent borosilikatglasrör (den yttre och inre diametern på de använda glasrören var 1,2 mm respektive 0,69 mm).
- Sätt in ett glasrör i de räfflade klämmorna på en Sutter-pipettdragare med en U-formad platinavärmefilament.
- Aktivera pullern för att producera två kanyler, var och en med en lång tunn spets.
- Skär spetsen på varje kanyl med en fin sax under ett dissekerande mikroskop för att göra spetsens slutliga diameter runt 100 till 150 μm.
- Eldpolering spetsen på den skurna kanylen för att något runda de skarpa kanterna.
- Böj kanylen längs axeln med hjälp av en platinatråd (uppvärmd med fin kontroll) placerad på sidan av axeln ca 2 mm från spetsen. Böjvinkeln i kanylen ska vara runt 45°.
- För in kanylens öppna ände i tryckkammarens hållare och dra åt armaturen. Anslut en 5 ml spruta fylld med Tyrodes lösning på andra sidan armaturen. Anslut kanylen till en mikromanipulator monterad på kammaren (se figur 1 och figur 2).
- Fyll kanylen med Tyrodes lösning med sprutan (5 ml), spola den, slangen och kontakten med luftbubblor.
- Före kanyleringsproceduren, mät perfusionstrycket inuti kanylen över ett givet flödesområde (50 till 300 μL/min, figur 3). Gör det endast när en ny kanyl används.
OBS: Perfusionstrycket inuti kanylen står i proportion till flödet och är linjärt monterat (bild 3).
4. Utvinning av mushjärta
- Lägg en C57BL/6 mus (antingen kön, 8-16 veckor gammal) i anestesilådan som är ansluten till tankarna av isofluran och syre.
- Sätt på syrgastanken och starta flödet av isofluran. Vänta ~5 min tills musen är helt sövd.
- När anestesi har fastställts, ta musen ur anestesilådan och injicera heparin IP (i peritonealhålan, 360 enheter, 0,5 ml / mus) för att undvika blodproppsbildning i vaskulaturen. Lägg sedan tillbaka musen i anestesilådan.
- 10 min efter att heparin har injicerats, flytta musen till den uppvärmda sängen i ett supinläge och stabilisera tassarna med hjälp av märkningstejp. Håll musen under full anestesi med isofluran med en noskon.
- Lyft musens bukhud ovanför membranet med tång och använd kirurgisk sax för att skära och exponera membranet.
- Skär mellangärdet och bröstbenet. Öppna kistan.
- Dissekera hjärtat ur brösthålan och skär så nära dorsala bröstväggen som möjligt.
- Placera hjärtat i iskalla Tyrodes lösning som innehåller 30 mM BDM.
- Rengör hjärtat för att ta bort bindväven som lunga.
- Överför hjärtat till den förkylda dissekeringskammaren fylld med Tyrodes lösning som innehåller 30 mM BDM.
5. Förberedelse och kannulering av septal artär
- Sätt på servopumpen. Ställ in servopumpen i "flödesläge". Låt den gå i hög hastighet tills slangen är fylld med Tyrodens lösning som kommer att användas för att granska kärllummen. Se till att det inte finns några bubblor i slangen. Sänk sedan hastigheten.
- Fäst hjärtat på PDMS och undvik skador på hjärtats mittområde.
- Ta bort både höger och vänster atria. Skär upp rätt ventrikel och ta bort rätt ventrikulärt fri vägg med hjälp av ett dissekerande mikroskop.
- Exponera och identifiera septal gatan. Placera en nylongänga (30 μm diameter) under septalartären och knyt en lös knut för framtida användning.
OBS: Septal artären kan lätt identifieras med hjälp av ett dissekerande mikroskop. Septal gatan är en stor gatan på septum som härrör från rätt födans gatan i de flesta fall. - Ta bort den vänstra ventrikulära fria väggen med fin sax.
- Överför papillary muskel förberedelsen till den experimentella kammaren där kanylen var placerad. Kammaren är fylld med Tyrodes lösning som innehåller BDM. Botten av denna kammare är belagd med ett tunt (~ 2 mm) lager AV PDMS.
- Justera kanylens position (med hjälp av mikromanipulatorn) för att möjliggöra kanylering av septalartären. Dra åt knuten.
- Säkra papillärmuskeln med små stift till kammargolvet så att mikroskopmålet har en klar bild av vaskulaturen. Var uppmärksam på kanylens vinkel och position och se till att kanylspetsen är parallell med artärväggen.
- Testa kanyleringen genom att gradvis driva ut lösningen från sprutan genom kanylen. Om alla element fungerar korrekt kommer kvarvarande blod i papillärmuskeln att lämna vävnaden i början av denna process och endast Tyrodes lösning kommer att ses senare.
6. Stabilisering av preparatet
- Slå på den peristaltiska pumpen som ger superfusionslösningen. Superfuse sedan ständigt preparatet i badet med förgasad PSS med en hastighet av 3-4 ml/min.
- Slå på temperaturregulatorn för superfusionslösningen. Justera temperaturen på badet superfusate till ~35-37 °C.
- Anslut kanylen till servopumpen. Läs av trycket på tryckservormen.
- Övervaka flödet och trycket. Flödet (μL/min) och kranskärlens perfusionstryck (mm Hg) digitaliseras med hjälp av digitizer och registreras med hjälp av tillhörande programvara (figur 2).
- Justera flödet för att ställa in trycket ~10 mmHg och låt det gå i ~10 min.
- Öka flödet av den luminala lösningen för att göra trycket från artären ~ 60 mmHg. Erhåll det slutliga perfusionstrycket i själva artären genom att subtrahera kanylens tryckfall (figur 3).
OBS: Om "tryck"-läget på tryckservormen väljs ställs det luminala trycket in ~60 mmHg för dessa experiment. Övervaka sedan ändringen av flödet. - Låt provet stabiliseras i ~30-60 min genom att övervaka flödes- och/eller trycknivåerna. En gradvis ökning av kranskärlens tryck observeras normalt i början av perfusionen efter cannulation. Ett nytt stabilt tillstånd kommer att etableras av sig självt om cirka 30 minuter (figur 4).
- Påbörja ett experiment efter att perfusionstrycket har stabiliserats (vid konstant flöde).
7. Lastning av preparatet med fluorescerande märkt veteglutinin (WGA)
- Förbered Tyrodes lösning som innehåller Alexa-Fluor-488 konjugerad WGA genom att tillsätta 100 μg konjugerad WGA i 5 ml av Tyrodes lösning.
- Växla försiktigt perfusatet från normal Tyrodes lösning till en som innehåller fluorescerande märkt WGA. Det är viktigt att försiktigt växla perfusate så att inga bubblor införs.
- Efter ~30 min WGA perfusion eller när WGA-lösningen är på väg att ta, ändra perfusate tillbaka till normala Tyrodes lösning.
8. Konfokal avbildning av artärer och kapillärer
- Slå på Nipkow-diskens konfokala mikroskopsystem.
- Använd mikroskopet för att lokalisera septalartären med hjälp av ett lågeffektmål (4x) i överfört ljusläge.
OBS: Septal artär kan lokaliseras genom att följa kanylens position. - Starta konfokal avbildning med den snurrande diskkonfokalen och välj 488 nm excitationslaser, 40x objektiv förstoring och justera laserintensiteten och samplingshastigheten (10 - 500 ms per bild).
- Ställ in de övre och nedre bildpositionerna för det konfokala mikroskopet för att definiera bildområdet och ange parametrarna för z-stack-avbildningen.
- Ställ in stegstorleken enligt rekommendationerna för det system som används eller ställ in stegstorleken efter önskemål.
- Välj z-stackinställning och/eller tidsserieinställningar.
- Markera eller ange en ny mapp för att lagra den nya bilden.
- Klicka på "Kör" för att börja spela in bildbehandling för framtida analys (Bild 5).
9. Exempel vasodilatator experiment: pinacidil-inducerad vasodilatation (Video 1).
- Förbered pinacidilbuljonglösning (100 mM i DMSO) och förvaras vid 4 °C.
- Förbered 10 ml av Tyrodes lösning. Tillsätt 10 μL pinacidilbuljonglösning för att göra den slutliga koncentrationen av pinacidil 100 μM.
- Avbilda papillärmuskeln vid låg förstoring (4x mål) för att inkludera septal gatan och gren arterioles.
- Byt luminal lösning till den pinacidilinnehållande lösningen.
10. Exempel på experiment för blodflödeskontroll: Vasokonontrictorinducerat arteriellt perfusionstryck ökar vid konstant flöde (figur 6)
- Bered endothelin-1 (ET-1) stamlösning (10 μM) och förvaras vid -20 °C.
- Förbered 10 ml av Tyrodes lösning. Tillsätt 10 μL ET-1-stamlösning (10 μM) för att göra den slutliga koncentrationen av ET-1 10 nM.
- Registrera luminaltrycket med konstant flöde och avbilda papillärmuskeln.
- Byt luminal lösning till ET-1-lösningen.
11. Exempelbilder av kapillär med pericyter (figur 7)
- Offra en NG2DsRedBAC transgen mus enligt beskrivningen i avsnitt 4 i detta protokoll.
- Extrahera hjärtat, kannulera septal gatan och ladda provet med Alexa-Fluor-488 konjugerade WGA enligt protokoll 5-7.
- Avbilda papillärmuskeln vid 488 nm och 560 nm excitation och 510-525 nm, 575-625 nm utsläpp med confocal. Arterioletrycket kommer att vara cirka 40 mmHg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När en fluorescensvaskulär markör perfunderas i vaskulär lumen (här WGA konjugerad med Alexa Fluor-488), är det möjligt att visualisera hela kärlträd som visas i figur 5 (vänster panel) med hjälp av höghastighets confocal mikroskop. Ytterligare förstoring gör det möjligt att avbilda kapillären i detalj(figur 5, höger panel). Eftersom det trycksatta systemet stöder en konstant övervakning av luminalt tryck, kan detta preparat användas för associerade förändringar i arteriell diameter med kranskärlens tryck. Video 1 visar att när pinacidil, en ATP-känslig K+ kanal (KATP)agonist serverades från lumen, ökade diametern på artärerna. Figur 6 visar att när vasoconstrictor ET-1 applicerades från lumen minskades arteriolens diameter och luminaltrycket ökade när flödet sattes konstant.
På grund av högupplösta funktioner för konfokal mikroskopi i kombination med specifika cellmarkörer kan denna procedur också användas för att visualisera många andra celltyper som är associerade med mikrocirkulationen. Här använde vi en mus (NG2DsRedBAC transgen mus) som uttrycker DsRed fluorescensprotein under en pericyte specifik promotor (NG2) och märkta kärlen med WGA-Alexa Fluor 488. Detta gör det möjligt för oss att samtidigt avbilda både kapillären (grön) och pericytes (röd) i musen papillära muskeln (Figur 7) under förhållanden som bättre efterliknar fysiologi hos levande djur.
Figur 1: Kannulering av musens septala artär.
(A) Överförd ljusbild visar ett exempel på den kanylerade papillärmuskeln. Micromanipulator, kanyl och prov (septum med rätt ventrikel papillär muskel) anges som etiketter. (B)Inzoomat prov i A visar papillärmuskeln och den kanylerade septalartären. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Utrustning som användes i alla experiment.
A)Huvudkomponenterna i den installation som används i experimentet. B)Diagrammet illustrerar sambanden mellan papillärmuskelpreparatet och den fysiologiska kontrollprovutrustningen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Mätning av tryck inuti kanylen.
(A) Ett exempel för att visa hur en kanylbeständighet bestämdes genom att mäta trycket inuti kanylen över ett flödesområde (50-300 μl/min). B)Förhållandet mellan trycket inuti kanylen och flödet från 6 kanyler. Trycket inuti kanylen var proportionellt mot flödet och passades av uttrycket Pc=0,08f-12,25, där Pc som tryck inuti kanylen, f som flöde. N=6 kanyler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Perfusionstryck förändras under stabilisering vid ett konstant flöde.
a)En typisk registrering av perfusionstryck under stabilisering vid ett konstant flöde (~250 μL/min). Notera ökningen av perfusionstrycket efter 30 minuters stabilisering. (B) Statistiken visar perfusionstrycket före och efter stabiliseringen när tonen utvecklades. Det genomsnittliga flödet av artärerna för att bibehålla det ursprungliga trycket (~ 60 mmHg) är 201,7 ± 8,6 μL/min (n= 45 möss). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Avbildning av kapillärer och artärer.
( A) Bilden visar artärerna och kapillärerna som var laddade med vetegroddar agglutinin (WGA). (B) Zooma in det boxade området i A. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: ET-1 ökar det luminala trycket och minskar artärdiametern.
A)Artärdiametern har ändrats vid applicering av ET-1 (10 nM). B)WGA-fluorescensprofilerna som visar diameterförändringen med ET-1. Diametern på arteriolen återspeglades av avståndet mellan toppintensiteten i fluorescensen på arteriole väggen. (C) Luminaltrycket ökade i närvaro av ET-1 (10 nM) vid ett konstant flöde. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Kapillär med pericyter från NG2-DsRed mus.
Hjärt pericytes (röd) och kapillärer (grön) var avbildas i trycksatt (40 mmHg) och perfused mus höger Ventrikulärt papillary muskel. Höger panel, de inzoomade bilderna av de rutade områdena i de vänstra panelerna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Pinacidil-inducerad vasodilatation. Pinacidil (100 μM) applicerades från lumen. Vasodilatation sågs i artärträdet. Klicka här för att ladda ner den här videon.
| Sammansättningen av fysiologisk saltlösning (PSS) | |||
| Reagenser | Slutlig koncentration (mM) | Molekylvikt | g/10 Liter |
| Nacl | 112 | 58.44 | 65.45 |
| KCl (kcl) | 5 | 74.55 | 3.73 |
| MgSO4 (olika) | 1.2 | 120.37 | 1.44 |
| NaH2PO4 (NaH2PO4) | 1.2 | 119.98 | 1.44 |
| NaHCO3 (på NaHCO3) | 24 | 84.01 | 20.16 |
| Glukos | 10 | 180.16 | tillsätt 1,8 g glukos till 1 liter PSS före användning |
| CaCl2 (cacl2) | 1.8 | 110.99 | tillsätt 1,8 ml 1 M CaCl2 till 1 liter PSS före användning |
| Sammansättningen av Tyrodes lösning | |||
| Reagenser | Slutlig koncentration (mM) | Molekylvikt | g/L |
| Nacl | 140 | 58.44 | 8.18 |
| KCl (kcl) | 5 | 74.55 | 0.37 |
| NaH2PO4 (NaH2PO4) | 0.33 | 119.98 | 0.04 |
| HEPES (HEPES) | 10 | 238.3 | 2.38 |
| Glukos | 5.5 | 180.16 | 0.99 |
| CaCl2 (cacl2) | 1.8 | 110.99 | tillsätt 1,8 ml 1 M CaCl2-lösning |
| MgCl2.6H2O | 0.5 | 203.3 | tillsätt 0,5 ml 1 M MgCl2-lösning |
| Obs: Justera pH till 7,4 med 1 M NaOH. | |||
Tabell 1: Lösningarnas sammansättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nuvarande arbetet har vi introducerat en anmärkningsvärt enkel men ändå mycket praktisk ex vivo-metod för att studera kranskärlsmikrocirkulationen i hjärtat under fysiologiska förhållanden. Denna metod modifierades från mekaniska undersökningar med råttor2. Det utmanande tillskottet var bildtekniken med hög hastighet och hög optisk upplösning. Vi kunde därför dra nytta av de avancerade optiska bildsystem som nu är kommersiellt tillgängliga. Genom noggrann dissekering och placering av den fungerande papillary muskel förberedelse i en gynnsam position, vi kunde visualisera arterioles, pre-kapillär arterioles, kapillärer och venules, liksom pericytes och kunde mäta kranskärlens tryck och/eller flöde medan du kontrollerar den andra. Arteriole och kapillär diameter ändringar övervakades med hjälp av en highspeed spinning disk confocal mikroskop. Kombinationen av de optiska bilderna och den inre perfusionen av den fysiologiska saltlösningen gör detta preparat användbart vid utvärderingen av effekten av de biomedicinska behandlingarna, liksom i studien av de mekanismer som är involverade i den fysiologiska och patologiska regleringen av blodflödet i hjärtat1.
Hjärt papillära muskler har använts i stor utsträckning i studien av hjärt fysiologi i många år. Frånvaron av perfusion förringar dock fysiologin om egenskaper hos "arbete" eller "metabolism" eller "elektrisk aktivitet" övervägs. Uppenbarligen är icke-perfused papillary muskler uppenbarligen inte fysiologiska. Ändå, årtionden sedan, Westerhof et al. gjorde den trycksatta tunna papillärpreparatet från råtta för att studera blodflödesförordningen2, men denna förberedelse användes inte hos möss som vi gjorde här, på grund av hanteringssvårigheterna. Dessa utredare kunde inte heller avbilda de detaljer som behövdes för att avgöra hur blodflödesregleringen inträffade. Vi hade tur att musens septala artär är cirka 100 μm i diameter vid ~ 60 mmHg perfusionstryck, mindre än det hos råtta, men tillräckligt stor för vårt arbete. Som en praktisk anmärkning måste särskild uppmärksamhet ägnas åt beredningen av kanylen och det anslutna slangarna. Undvik bubblor i slangen och kanylen. Bubblor fastnar lätt i det anslutna området och blockerar eller förvränger blodflödet. Dubbelkolla därför dessa områden. Dessutom skulle det vara bra att använda en kanyl med en relativt stor spets så länge den är tillräckligt liten för att komma in i artären, eftersom en större kanyl håller artären öppen och möjliggör smidigt flöde. Om en plötslig och oväntad ökning av trycket (vid konstant flöde) observeras under inspelningen är det mycket troligt att kanylspetsen har fastnat på artärväggen eller kanylen har blockerats av vävnadsskräp. Därför är kanylens position mycket viktig för att hålla flödet och trycket stabilt. Ju snabbare cannulation, desto bättre för vävnaden. Detta leder till en snabbare återhämtning av dess fysiologiska funktion. Vi rekommenderar att den tid som spenderas på cannulation inte överstiger ~ 45 min (från extraktion av hjärtat till slutförandet av cannulation).
Hur försiktig man än är, tar denna till synes enkla metod övning till perfekt. Ibland svarar preparatet inte på någon stimulering, oavsett den vård som tas under dissekeringen eller snabbheten och effektiviteten i hela proceduren. Badtemperaturen ska vara konstant och mellan 35 och 37 °C. En annan viktig sak är att köra en rutinmässig referenskontroll för vävnadsfunktion (till exempel svaret på KCl) för varje experiment, antingen före eller efter att ditt experiment är klart. Vi använder ET-1 eller KCl (70 mM) som referenser. Slutligen är det mycket viktigt att kontrollera och bestämma att kanylen fortfarande är på plats när experimentet är klart. Ignorera data om kanylen är ur plats eller artären bryts eller vrids av kanylspetsen. Två viktiga saker som är värda att notera centrerar på "beredningens rörelse" och "dataanalys". Även i "quiescence" rör sig preparatet fortfarande (Video 1). Mindre rörelse är inte ett problem för höghastighets spinning disk confocal imaging. Att sänka perfusionstrycket eller använda Na+ kanalblockerare kan förhindra eller minimera rörelsen utan att störa mikrovaskulär kärlfunktion. Vi gjorde offlineanalys av förvärvade data med ImageJ-win64 (Fiji) och/eller MATLAB med anpassad programvara för mätningar av fartygsdiameter. Vi specificerar inte diameteranalysen här eftersom någon programvara (t.ex. Vasotracker11 ) ska kunna analysera diameterändringarna.
Genom att kombinera de fysiologiska undersökningarna med optiska bildframställning tekniker och höghastighets confocal mikroskopi, detta preparat kan användas i stor utsträckning för att 1) testa den reglerande effekten av nya läkemedel på blodflödet i hjärtat; 2) Studera intercellulär kommunikation (mellan och mellan kardiomyocyter, kapillär endotelceller, pericyter och arteriella glatta muskelceller och fibroblaster); och 3) Studera den dynamiska funktionella förändringen av olika celltyper med fluorescensmärkta transgena möss1. Denna metod inkluderar visualisering av delar av hjärtvävnaden med nätverk under "nära" fysiologi. Även om vi kanske kan efterlikna in vivo-förhållanden genom att gå i beredningen och / eller inkludera några röda blodkroppar i perfusatet, kan det inte ersätta sann in vivo-avbildning med ett komplett utbud av metaboliska och arbetsbördor. Det kanske inte heller används på de stora djuren på grund av begränsat siktdjup på ett konfokalt mikroskop. Det bör dock vara ett användbart verktyg i studien av de molekylära och cellulära mekanismerna bakom koronar mikrocirkulationsreglering hos små djur inklusive mus och råtta. Liknande begrepp kan utvidgas och antas i studien av blodflödeskontroll i andra vävnader eller organ, inklusive men inte begränsat till gastrointestinala system, bukspottkörtel, sköldkörtel, lymfkörtlar, lever, njure, skelettmuskulatur, hjärna12, näthinna, ganglier, ben, hud, livmoder, testikel, äggstockar, binjure, fett etc. Detta tillvägagångssätt kommer att förbättra och främja förståelsen av blodflödeskontroll och regleringsmekanismer på cellulära och molekylära nivåer under fysiologiska förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET); NIH (1U01HL116321) och (1R01HL142290) och American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
