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Chemistry

시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

Published: April 11, 2021 doi: 10.3791/61660
Automatic Translation
1, 1,3, 1, 1, 2, 1
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258, Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

이 논문은 투석 방법과 시투X선 회절 실험을 통해 온칩 단백질 결정화를 위해 개발된 미세유체 칩의 제조 프로토콜을 자세히 설명합니다. 미세 제조 공정을 통해 반과소성 재생셀룰로오스 투석 막을 칩의 두 층 사이에 분자량 차단과 통합할 수 있습니다.

Abstract

이 프로토콜은 투석 방법으로 온칩단백질을 결정화하고 실온에서 단일 결정 또는 일련 결정예 실험을 허용하는 전체 파이프라인을 포괄하는 재현가능하고 저렴한 미세 유체 장치의 제조를 설명합니다. 이 프로토콜은 마이크로칩의 제조 공정, 온칩 결정화 실험의 조작 및 단백질 샘플의 구조적 용해를 위한 X선 회절 데이터를 수집한 시상 내의 치료에 대해 자세히 설명합니다. 이 미세 제조 절차의 주요 특징은 칩의 두 층 사이에 시판 되는 반투과성 재생 셀룰로오스 투석 막의 통합에 있다. 임베디드 멤브레인의 분자량 절단은 거대 분자와 침전제의 분자량에 따라 달라집니다. 이 장치는 미세 유체 기술의 장점을 악용, 샘플의 분 볼륨의 사용 (<1 μL) 및 운송 현상을 통해 미세 조정. 칩은 투석 방법과 결합하여 결정화 공정에 대한 정확하고 가역적인 제어를 제공하며 마이크로리터 척도에서 단백질의 위상 다이어그램을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 장치는 광학적으로 투명한 폴리머기 기판에 부드러운 각인 리소그래피를 가진 광치료성 티올렌 기반 수지로 패턴화된다. 더욱이, 마이크로칩을 구성하고 배경 잡음 생성재료의 배경 산란이 시투 X선 회절 실험에서 칩과 호환되는 렌더링을 평가하였다. 단백질 결정이 적절한 크기와 균일성까지 칩에 재배되면 마이크로칩을 X선 빔 앞에 직접 장착할 수 있으며 3D 프린팅 홀더를 사용할 수 있습니다. 이 접근법은 쉽고 저렴한 방식으로 기존의 단백질 결정학 실험에서 극저온 보호제 및 수동 수확으로 발생하는 문제를 해결합니다. 칩상에서 자란 여러 개의 이소성 리소지메 결정으로부터 완전한 X선 회절 데이터 세트를 실내 온도에서 수집하여 구조 결정을 내렸다.

Introduction

생물학적 거대 분자의 3차원(3D) 구조를 명확히 하는 것은 X선 결정학이 주요 조사 기술로 남아 있는 구조 생물학에서 끊임없는 추구입니다. 단백질과 같은 복잡한 거대 분자의 구조적 세부 사항을 해명하기 위해 적용, 그것은 행동의 그들의 메커니즘과 다양한 생물학적 기능에 자신의 참여의 이해를 촉진하는 것을 목표로하고있다. 싱크로트론및 X선 프리 전자 레이저(XFELs)의 강력한 X선 소스는 거의 원자 분해능에서 단백질 구조에 대한 심층적인 통찰력을 제공하는 데 필요한 모든 도구를 제공합니다. 구조 연구를 위해 엑스레이의 사용과 함께 오는 장점에도 불구하고, X 선 방사선 및 결정화 과정 자체에 본질적인 한계가 있습니다. X선 빔 앞의 단백질 결정의 높은 X선 플럭스와 긴 노출 시간에 의해 유발되는 방사선 손상은 결정화제작자가 극저온 냉각1을사용하여 능가해야 하는 제한적인 매개변수이다. 그러나, 본종 단백질 구조 또는 유물로부터의 형태 변화가2,3을은폐할 수 있기 때문에 최적의 극저온 냉각 조건을 찾는 것은 힘들 수 있다. 더욱이, 최근 연구에 따르면 실온에서 회절 실험을 수행하면 특정 방사선 손상4가낮아집니다. 구조 생물학의 또 다른 병목 현상은 충분한 크기5를가진 잘 분산된 결정의 취득입니다. 작은 결정은 특히 막 단백질의 경우 생산하기 쉽지만, 더 큰 단백질 결정6의경우에 비해 높은 방사선 량이 더 적은 부피로 지시되어야하기 때문에 냉동 냉각 조건 하에서도 방사선 손상에 더 취약하다. 연속결정7,8싱크로트론 및 XFELs의 새로운 접근법은 방사선 손상억제를 우회할 수 있으며 동시에 작은 결정(200nm ~ 2μm)을 여러, 이소정형 및 임의 지향적 단백질 결정으로부터 병합하고, 펨토초 펄스, 짧은 노출, 마이크로 빔 1,마이크로 빔등관련 기술 발전으로부터 이익을 얻음으로써 더 작은 결정(200nm ~ 2 μm)을 이드로 활용할 수 있다.

미세 유체 기술은 생물학적 거대 분자의 결정화 및 구조적 조사를 위한 매니폴드 이점을 나타내는 X 선 결정학에 중요합니다. 미세 유체 장치에서 결정화 실험을 수행하려면 소량의 단백질 샘플이 필요하므로 이러한 고평가 된 바이오 거대 분자의 생산 비용을 제한하고 수많은 결정화 조건의 고처리량 선별 및 최적화를 용이하게합니다. 더욱이, 내재된 큰 표면적-부피 비는 미세유체 스케일 및 확산 제한 수송 현상에서 유동 및 온도 또는 농도 그라데이션11,12,13,14에미세한 제어를 가능하게 하며, 균일하게 크기의 결정성장과 탐사 단계 다이어그램15,16,17,18, 19,19. 더욱이, 미세유체 공구는 견본 납품인 단백질 결정학에 있는 또 다른 장애물을 해결하는 특유의 잠재력을 표시하고, X 선 회절 실험에 사용하기 전에 단백질 결정을 취급하고 수확하는 필요성. 온칩 및 시투 X선 결정예그래피의 방법은 데이터 수집 전에 결정 조작 및 결정 품질의 잠재적 저하를 제거합니다. 시투 X선 단백질 결정촬영에 적합한 광범위한 미세 유체 칩은 마이크로 패브릭 재료의 특성과 X선14,19,20,21,22, 23과의상호 작용에서 발생하는 관련 제한에 직면한 많은 연구 집단에 의해설계,개발 및 테스트되었습니다. 제조 재료는 광학적으로 투명하고 생물학적으로 불활성이어야 하며 X 선 방사선에 대한 높은 투명성과 데이터 수집 중에 최적의 신호 대 잡음 비율을 입증해야 합니다.

종래의 단백질결정학(24)에적용된 결정화 방법의대부분은,25도 마이크로유체척도(11)에서구현되었으며,14에서는 칩 결정화 및 현장에서 X선 회절 분석이 구현되었다. 증기확산(26),증발(27),자유 인터페이스 확산(FID)28, 마이크로배치(26)또는파종(29)을 통합한 단순, 하이브리드 또는 다층 미세유체 장치는 수용성 및 막 단백질을 결정화하는 데 사용되어 왔다. 결정화 조건의 높은 처리량 스크리닝 및 최적화는 잘 기반한32,물방울 계33,또는 밸브 작동34 장치에서30,31을 달성할 수 있다. 시투에서 실온에서 도전적인 단백질 표적의 X선 회절 실험은 PDMS(폴리디메틸실록산), COC(순환 올레핀 중합체), PMMA(폴리(메틸 메타크릴레이트) 등 다양한 물질로부터 제조된 마이크로칩에서 수행되었습니다.11,22,26,28,29,그래핀 필름23,Kapton35,에폭시 접착제6,또는 NOA (Norland 광학 접착제)19 및 X 선 방사선에 대한 재료의 투명성 및 배경 소음에 대한 기여도가 평가되었습니다. 더욱이, 마이크로칩은 싱크로트론 소스23,35,36 및 XFELs7에서X선 단백질 결정학 실험을 위한 단일 공구에 시투 및 직렬 데이터 수집 전략을 결합하도록 설계되었습니다.

시투 데이터 수집의 실온도 다양한 전달 방법 및 장치에서 구현되고 있다. 예를 들어, Nogly et al.54는 XFEL 소스를 사용하여 연쇄 펨토초 결정학(SFX)에 의해 광구동 광자 펌프 박테리오호도프신(bR)의 구조를 연구하기 위해 립디입방상(LCP) 인젝터를 사용했다. bR의 결정 구조는 2.3 Å 해상도로 해결되었으며, 시간 해결된 연재 된 연재 펨토초 결정학 (TR-SFX)과 LCP 인젝터의 호환성을 입증했습니다. 박스터외. 55는 다양한 크기의 레이저 컷 구멍이있는 100 또는 200 μm 두께의 폴리 카보네이트 플라스틱으로 제작된 고밀도 다중 결정 그리드를 설계했습니다. 추가 5 μm 두께의 폴리 카보네이트 필름은 앉아서 또는 매달려 드롭 결정화 실험을 위해 장치를 사용할 때 그리드의 한쪽에 고정 될 수있다. 이러한 고밀도 그리드는 결정이 디바이스의 포트에 직접 적재될 수 있거나 결정이 증기 확산 또는 LCP 방법에 의해 장치에서 재배될 수 있기 때문에 여러 가지 방법으로 사용될 수 있다. 또한, 그리드는 표준 자기 기저에서 조절하고 극저온 또는 실온 조건에서 시투 X선 데이터 수집에 사용될 수 있다. 최근에는, Feiler외. 56은 최소한의 배경 소음 기여도를 가진 극저온 및 주변 온도에서 시투 X 선 결정학에서 매크로 분자용 샘플 홀더를 개발했습니다. 구체적으로, 홀더는 플라스틱 지지대, 투명한 COC 호일 및 미세다공성 구조의 폴리이미드 호일로 구성된다. 결정화 낙하를 설정하기 위해 일반적으로 사용되는 커버 슬라이드를 교체하는 동시에 결정화 낙하를 열거나 수동으로 수정을 처리하지 않고도 리간드 담그기, 복잡한 형성 및 극저온 보호와 같은 장소에서 조작할 수 있도록 설계되었습니다. 더욱이, 샘플 홀더는 결정화 플레이트에서 제거하고 표준 곤니오미터 계열 빔라인에서 시투 데이터 수집을 위해 자기 베이스에 배치될 수 있다. 주변 온도 데이터 수집의 경우, COC 호일은 실험 전에 제거되고 21 μm 두께의 폴리이미드 호일만이 배경 산란에 기여하며, 이 경우 최소한의 배경 산란에 기여합니다. 이 예는 진행중인 연구와 X 선 단백질 결정학을 위해 개발 된 다재 다능한 마이크로 칩의 무리의 작은 부분만 구성합니다.

그러나, 투석 단백질 결정화 방법은 미세유체내에 널리 통합되지 않았다. 투석은 단백질 결정화를 위한 명목 농도에 접근하고 결정화조건(24)에정밀하고 가역적인 제어를 가능하게 하기 위해 반투과성 멤브레인을 통해 침전물 농도의 평형을 목표로 하는 확산 기반 방법입니다. 반투과성 투석막의 분자량 컷오프(MWCO)는 거시분자의 분자량과 침전제의 분자량에 따라 선택될 수 있어 관심의 거대 분자를 유지하면서 작은 침전물 분자의 확산을 허용할 수 있다. 투석 과정의 가역성으로 인해 동일한 단백질 샘플을 사용하는 동안 침전물 농도를 변경하여 위상 다이어그램을 조사하기위해 독립적으로 핵형성 및 결정 성장을 최적화하기 위해 온도 조절과 결합하여 사용될 수 있다. 미세유체학내 멤브레인의 통합은 de Jong외. 38에 의해 검토되고, 마이크로칩으로 투석을 이식하는 생물학의 사례 연구는 주로 샘플 제제, 농도 또는 여과 응용39,40,41,42 또는 세포 관련 연구43,44에열거될 수 있다. PDMS를 통한 보급은 심외37에 의해 다양한 조건에서 자일라나제의 핵형성 및 성장을 연구하는 데 사용되었다. 물은 15 μm 두께의 PDMS 멤브레인을 통해 미세 유체 장치의 단백질 저장소로 침투하여 단백질과 침전제 농도를 변경합니다.

주니우스 외19,45에 의해 개발된 프로토콜은 마이크로투아진을 통해 및 실온에서 시투 X선 회절 실험을 모두 호환되는 마이크로유체 칩의 제조를 위해 제시된다. 장치 제작 프로토콜은 스터드와 동료가 수행 한 선구적인 작업에서 직접 영감을 받아12,46 은 부드러운 각인 리소그래피를 사용하여 시판되는 현작 을 포함시키는 사진 치료 가능한 티올렌 기반 수지 NOA 81의 마이크로 패턴 스티커에 대해 서술합니다. 이 방법의 혁신적인 변형으로 마이크로칩을 사용하여 단백질 결정의 온칩 성장을 위한 실험 파라미터를 정확하게 모니터링하고 제어하고 실험당 단백질 샘플 소비 감소(<1 μL)와 같은 미세유체의 이점을 동시에 활용할 수 있게 되었습니다. 전작에서는 온도-침전성 농도 상 도면을 매핑하여 결정화 조건을 선별및 최적화하기 위한 거시적 규모의 시스템(일반적인 부피 >20 μL)에 적용된 투석 원리를입증하였다. 이 작품에서, 프로토콜은 칩에 결정화 분석과 시투 X 선 회절 데이터 수집을 수행하기 위해 다른 MWCO의 재생 셀룰로오스 (RC) 투석 막을 통합 투석 마이크로 칩을 생산하기 위한 설명이다. 마이크로칩을 포함하는 물질은X선(19)에 대한 투명성을 평가하고, 장치는 수동 취급을 배제하고 깨지기 쉬운 단백질 결정의 분해를 최소화하는 시투 회절 실험에서 실온을 위해 X선 빔 바로 앞에 설정할 수 있다. 사례 연구에서, 암탉 계란 흰자 리소지메 결정은 균일하게 크기의 인구를 생성 미세 투석을 통해 칩에 성장했다. 마이크로칩은 3D 프린팅지지19를 사용하여 X선 빔 앞에 장착되었고, 현장에서 회절 데이터 세트를 다중, 동질결정에서 실온에서 수집하여 까다로운 거시 분자 표적에 대한 싱크로트론 연쇄 결정학 연구를 위한 칩의 높은 잠재력과 관련성을 입증하였다.

Protocol

1. 마스크 디자인 및 마스터 제작

  1. 벡터 드로잉 소프트웨어를 사용하여 미세 유체 장치의 원하는 형상을 그립니다. 포토리소그래피의 다음 단계에 사용될 포토레지스트의 각 레이어에 대해 채널과 기둥으로 윤곽이 있는 마스크 1개, 기둥만 들어 있는 마스크 1개 등 개별 마스크를 준비합니다.
  2. 드로잉 소프트웨어에서 생성된 CIF 파일을 필름 포토마스크로 변환합니다. 이것은 상업적 서비스를 통해 수행 할 수 있습니다. 포토리소그래피 중에 사용되는 포토레지스트의 선택에 따라 적절한 포토마스크를 필요로 한다.
    참고: SU-8 포토레지스트의 경우 투명한 배경에 검은색 기능이 있는 마스크를 주문합니다. SU-8은 에폭시 계 의 네거티브 포토레지스트로, UV 광(365 nm)에 노출되는 동안 UV에 노출된 부품이 교차 연결되는 반면 나머지는 용해상태로 유지된다는 것을 의미한다. 따라서 마스크의 모든 검은 색 패턴은 포토리소그래피 중에 UV 빛에 의해 교차 연결되지 않습니다. 채널과 기둥은 마스터에 새겨져 있습니다.
  3. SU-8 네거티브 포토레지스트를 사용하여 포토리소그래피를 사용하여 각 칩의 디자인에 실리콘 웨이퍼에 두 개의 마스터를 준비합니다.
    참고: 1.3.1-1.3.7 단계는 클린 룸에서 수행됩니다. 아래에 설명된 단계는 많은 교과서에 설명된 PDMS 연약한 리소그래피가 뒤따르는 포토리소그래피의 전통적인 단계입니다. 실험 파라미터(포토레지스트, 시간 지속시간, 온도 등)의 모든 값은 많은 미묘한 파라미터에 의존하며 사용되는 다양한 장치에 따라 최적화되어야 한다.
    1. SU-8 포토레지스트의 증착 및 부착을 용이하게 하기 위해 3인치 실리콘 웨이퍼를 사용하고 표면을 플라즈마로 90초 동안 처리합니다.
    2. 웨이퍼의 중간에 SU-8 저항의 약 3mL을 붓고 원하는 두께까지 SU-8을 스핀코트(도 1A)한다. 50 μm 명목 두께의 경우 SU-8 3050을 사용하고 500 rpm에서 10 s의 스핀 코트를 사용하고 3500 rpm에서 30 초 연속으로 코팅하십시오. 수지에 포함된 용매가 증발하여 포토마스크에 달라붙지 않도록 하여 부분적으로 고화시키기 위해 368K에서 15분 동안 핫 플레이트에 포토레지스트를 부드럽게 구워줍니다. 그 후, 2 분 동안 실온에서 웨이퍼를 둡니다.
    3. 자외선에 포토레지스트를노출(도 1B). 35mW cm-2 및 8s 노출 시간의 힘으로 마스크 정렬기를 사용합니다.
    4. 노출 후 베이킹을 진행합니다. 368K에서 5분 동안 핫 플레이트에 웨이퍼를 놓아 자외선 노출로 인한 광반응을 완료합니다.
    5. 프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)를 포함하는 욕조에 웨이퍼를 배치하여 교차되지 않은 모든 SU-8 저항을 제거하고 15 분 동안 저어. 흐릿한 강수량을 관찰할 수 없을 때까지 웨이퍼를 이소프로판올로 헹구는 다. 웨이퍼를 질소 가스로 건조시키고 페트리 접시(100mm x 15mm 표준 크기)에 보관하십시오.
    6. 웨이퍼의 표면을 실레인으로 처리하여 2개의 우표를 제작하는 데 사용될 폴리디메틸실록산(PDMS)의 분리를 용이하게 한다. hexamethyldisilazane (HMDS)의 증기 분위기에서 10 분 동안 368 K에서 도청 된 핫 플레이트에 웨이퍼를 보관하십시오.
      참고: 웨이퍼에서 PDMS를 벗겨내는 것이 여러 번 사용되면 웨이퍼표면을 HMDS 증기로 다시 처리해야 합니다.
    7. 채널과 기둥을 포함하는 첫 번째 마스터가 준비되었습니다. 이 단계를 반복하고 두 번째 마스터 패터닝만 준비합니다.
      참고: 포토리소그래피 중, 목표는 50 μm의 높이를 가진 SU-8 마스터의 장치의 형상을 얻는 것입니다. 그러나 두 개의 SU-8 마스터가 제작되면 실험 값을 획득하기 위해 마스터에 새겨진 형상의 높이를 능숙계로 측정합니다. 이 프로토콜을 위해 제작된 SU-8 마스터 모두에 대해 측정된 값은 약 45 μm입니다.

2. PDMS 금형 제작

참고: 프로토콜의 다음 단계는 라미나르 유동 후드가 사용되는 한 모든 실험실에서 수행될 수 있으며, NOA 81 수지(3.6-3.11 단계)와 함께 작업할 때 실내의 노란색 조명이 사용되고 UV 광의 원천은 NOA 81 수지(단계 3.7 및 3.11)를 중합할 수 있다.

  1. 10:1 질량 비율로 PDMS 실리콘 베이스와 경화제 50g을 준비합니다.
  2. 비커에 두 재료를 양수와 섞고 모든 기포를 제거하기 위해 진공 챔버에 혼합물을 놓습니다.
  3. 미리 혼합된 PDMS 25g을 SU-8 마스터(페트리 접시에 저장)에 부어 채널과 기둥을 약 5mm 높이까지 패킹합니다. PDMS의 나머지 25g을 제2 SU-8 마스터 패터닝에 붓고 기둥만 최대 5mm(도1C).
  4. 페트리 접시를 모두 오븐에 넣고 PDMS 층을 338 K에서 1시간 동안 치료합니다.
  5. SU-8 마스터의 패턴 주위의 경화 PDMS 층을 메스로 자르고 마스터(그림 1D)에서PDMS 금형을 부드럽게 벗깁니다.
    참고: 상술한 절차는 복제 성형이라고 불리며, 유리 표면에 부착되고 미세유체장치(53)의일부가 될 PDMS의 금형을 준비하는 데 자주 사용되고 있다. 이 프로토콜에서 PDMS 금형은 칩의 일부가 아니지만 칩 제조를 위한 중간 부분으로 사용됩니다. 각 설계에 대해, 2 PDMS 금형은 각각의 SU-8 마스터(그림 1D 및 1E)로부터제조되며 마이크로 칩의 제조를 위해 그에 따라 (아래에 설명 된 바와 같이)로 사용될 것입니다.

3. 투석 칩 제작

  1. 위쪽으로 향하는 패턴으로 채널과 기둥을 위쪽으로 향하는 패턴과 함께 단단한 현미경 유리 슬라이드(3 x1in. 표준 크기)에 PDMS 금형 패터닝을 배치합니다. 단백질 저수지에 대응하는 중앙 기둥은 PDMS 금형의 수평 표면에서 수직으로 45 μm을 초과합니다.
  2. 재생된 셀룰로오스(RC) 투석막의 건조조각을 잘라서 분리하고 유리슬라이드(도 1F)에서지지되는 PDMS 몰드의 중앙 기둥에 증정한다.
    참고: RC 투석막은 시판되고, 분자량 차단(MWCO)은 연구 중인 단백질의 분자량 및 사용된 침전체에 따라 선택됩니다. RC 투석 막의 조각의 크기는 칩의 디자인에 따라 달라집니다. 이 프로토콜에서, 2 개의 프로토 타입은 단백질 저수지의 부피가 0.1 또는 0.3 μL인 곳에 설계됩니다. 이러한 경우 투석 막 조각의 크기는 각각 2 x 2 mm 2 mm2 또는 4 x 4 mm2입니다.
  3. 두 번째 PDMS 금형 패터닝은 유리슬라이드(도 1F)에서지지되는 PDMS 금형 위에 아래쪽을 향한 기둥만 배치합니다. 이 금형의 중앙 기둥은 단백질 저장소에 해당하며 수평 표면에서 45 μm씩 수직(아래쪽을 향)을 초과합니다.
  4. 2 개의 PDMS 금형의 중앙 기둥을 정렬합니다. RC 투석 막은 2 PDMS금형(도 1G)사이에 "끼어들"입니다.
    참고: 2개의 PDMS 금형의 미세 구조 간의 정렬은 추가 장비 없이 시각적으로 수행할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 이 조작은 현미경의 밑에 달성될 수 있습니다. 유체 채널과 입력 또는 출력 점이 완전히 적용되지 않는 한 저장소 간의 작은 변화는 문제가 되지 않습니다.
  5. PDMS 금형의 모든 갇힌 기포를 제거하고 제조의 다음 단계에서 수지의 삽입을 촉진하기 위해 진공 챔버에서 30 분 동안 어셈블리를 desiccate.
    참고: 2개의 PDMS 금형은 PDMS-PDMS 접착력에 의해 제자리에 보관되며 추가 압력 이나 다른 임시 본딩 방법이 필요하지 않습니다.
  6. 2 PDMS 금형 사이의 빈 공간을 모세관 임비비티온(도1H 및 1I)에의해 광응성, 티올렌 계 수지 NOA 81로 채우십시오.
  7. 8s용 UV 광(365nm)에 노출하여 수지(35mWcm-2)를사용하여 수지를 치료한다.
    참고: 이 첫 번째 노출을 통해 NOA 81 수지는 양쪽의 PDMS 금형과 접촉하여 NOA 81의 얇은 층이 치료되지 않은 상태로 유지되므로 부분적으로 교차 연결될 수 있습니다.
  8. 메스를 가진 PDMS 금형의 외부 측면에서 NOA 81의 초과를 잘라.
  9. 상부 PDMS 몰드를 부분적으로 교차된 NOA 81이 아래PDMS 금형 및 유리 슬라이드에서 고정하여 제거합니다.
  10. 현미경 유리 슬라이드 (3 x 1 인치)의 표준 차원에서 175 μm 두께의 PMMA 시트를 자르고 PMMA 조각의 각 측면에서 플라스틱 보호 시트를 벗깁니다. PMMA조각(도 1J)에서상부 PDMS 몰드와 부분적으로 경화된 NOA 81의 어셈블리를 부드럽게 누릅니다.
  11. 60s용 UV 광에 노출됨으로써 NOA 81을 다시 치료하고 상부 PDMS 몰드(도1K)를제거한다. 수지는 추가 치료없이 PMMA 기판을 부착합니다.
    참고: PDMS 금형은 금형이 구부러지지 않는 한 이소프로판올및 아세톤으로 세척한 후 약 5회 재사용할 수 있습니다. RC 투석 멤브레인은 NOA 81 스티커에 통합되며 더 이상 조작이나 기계적 클램핑이 필요하지 않습니다.

4. 유체 커넥터

참고: 미세 유체 칩의 설계는 결정화 용액을 위한 선형 유체 채널과 단백질 샘플(단백질 저수지)에 대한 중앙 저수지로 구성되며, 둘 다 도 2A에서 두 개의 마이크로칩의 상부 뷰에서 나타낸다. RC 투석 멤브레인은 이 두 개의 미세구조(도 2D)와결정화 공정 사이에 내장되어 있으며, 결정화 용액으로부터의 침전제는 멤브레인에 의해 분리되는 칩의 두 구획 사이의 농도 그라데이션으로 인해 멤브레인을 가로질러 확산된다. 미세 유체 채널은 하단 PDMS금형(도 1F)에각인되어 있습니다. 칩제조 프로토콜이 완료되면 선형 채널은 도 1K에도시된 바와 같이 PMMA 기판과 접촉하는 NOA 81 스티커의 하단 층에 위치한다. 결정화 용액에 대한 입구 및 출구 액세스 포인트는 선형 채널의 각 끝에 위치하며 도 2A에서볼 수 있듯이 구멍(총 높이 90 μm)처럼 보입니다. 결정화 솔루션을 처리하려면 액세스 포인트에 커넥터를 추가해야 합니다.

  1. 빠른 에폭시접착제(도 2C)를가진 미세유체 채널의 입구 및 출구에서 시판되는 본드 커넥터(NanoPort).
  2. 커넥터크기에 따라 PTFE 튜브의 적절한 직경을 선택합니다. PTFE 튜브는 칩의 유체 채널에서 결정화 용액의 도입에 사용될 것이다.
    참고: 상용 키트는 유량을 쉽고 정밀하게 제어하는 데 권장되며 일반적으로 혼합 및 유체 처리를 위한 자동 압력 구동 또는 유량 제어(주사기 펌프) 시스템과 결합됩니다. 그러나 결정화 용액은 일회용 플라스틱 주사기를 통해 선형 채널에 수동으로 도입될 수 있다. 이 경우 4.3~4.5단계가 제안됩니다.
  3. 결정화 용액으로 1mL 일회용 주사기를 채웁니다. 이 프로토콜에 제시된 칩의 경우 400 μL이 전체 유체 채널을 채우기에 충분합니다.
  4. 한쪽에 팁의 직경이 솔루션 처리에 사용되는 PTFE 튜브의 내경과 동일하도록 두 개의 파이펫 팁을 잘라. 빠른 에폭시 접착제(그림 2B)와채널의 액세스 포인트에 크롭 팁을 접착제.
  5. 주사기를 크롭 팁과 적절한 크기의 PTFE 튜브 와 연결하고 주사기 플런저를 천천히 밀어 채널 내에서 솔루션을 소개합니다.

5. 단백질 캡슐화

참고: 단백질 저장소로 사용되는 칩의 패턴은 대기에 지금까지 열려 있습니다. 다음 프로토콜은 미세 유체 칩 내에서 단백질 샘플을 신중하게 제한하도록 제안된다.

  1. 도 2E에도시된 바와 같이 RC 투석 막 바로 위에 위치한 단백질 저장소 내부의 단백질 샘플의 액적을 수동으로 피펫한다. 단백질 샘플의 부피는 칩의 설계에 따라 다르며 0.1 또는 0.3 μL일 수 있다.
  2. 단백질 저장소 주위에 고진공 실리콘 그리스의 얇은 층을 적용하십시오.
  3. 175 μm 두께의 PMMA 시트의 작은 조각을 잘라 부드럽게 실리콘 그리스의 얇은 층 위에 배치합니다. PMMA 조각은 단백질 용액이 증착되는 단백질 저장소의 전체 표면을 커버해야 합니다.
    참고: 실리콘 그리스는 공기 압박감을 높이고 단백질 방울의 확산을 방지하는 데 사용됩니다. 단백질 저장소와 NOA 81 스티커를 덮는 데 사용되는 PMMA 조각 사이에는 결합 이나 밀봉이 없습니다. 둘 사이의 접촉은 솔리드/솔리드 인터페이스입니다. 단백질 샘플의 전체 밀봉 및 공기 밀착 캡슐화를 생산하기 위해, Kapton 테이프의 조각은 5.4 단계에서 설명된 바와 같이 사용된다.
    참고: 압력 구동 시스템이 유체 채널 내결정화 용액의 도입을 위해 사용될 때 장치(단백질 저장소)의 전용 캐비티 내에서 단백질 샘플을 제한하기가 때로는 어렵다(단계 6.4). 위에서 언급한 문제를 피하려면 결정화 용액을 순환하는 동안 상대적으로 저압 값을 유지해야 합니다. 수성 용액용 20-60 mbar 또는 더 많은 점성 용액 (PEGs, 글리세롤)을위한 50-150 mbar의 주입 압력이19을제안합니다.
  4. 단백질 저수지 위에 설정된 PMMA 조각을 커버하고 모든 가장자리 주위에 NOA 칩에 충실 할 만큼 큰 Kapton 테이프 (20 μm 두께)의 조각을 잘라. 단백질 샘플은 저수지 내에 캡슐화되고 칩은 도 2C에도시된 바와 같이 결정화 실험에 사용될 준비가 되어 있다.
    참고: 칩은 투석막과 PMMA 기판에 NOA의 접착이 악화되지 않는 한 여러 번 재사용할 수 있습니다. 칩의 이러한 부분이 손상된 경우 장치를 더 이상 사용할 수 없는지 확인하는 누출이 관찰됩니다. 칩을 세척하는 것은 결정화 용액에 따라 달라집니다. 낮은 점도 용액(염, 완충제)의 경우, 유체 채널은 증류수를 도입하여 세척할 수 있으며 몇 분 동안 흐르게 할 수 있습니다. 400 μL은 채널 내에서 솔루션을 다른 솔루션과 완전히 교환하는 데 필요한 부피입니다. 더 점성 용액 (PEGs, 글리세롤)의 경우, 물로만 채널을 세척하는 것만으로는 충분하지 않기 때문에 칩을 재사용하는 것이 좋습니다. 단백질 저수지가 있는 칩의 상부는 증류수로 세척하고 가압 공기로 건조할 수도 있습니다.

6. 온칩 단백질 결정화

  1. 용성 암탉 계란 흰자 리소지메 분말을 계량하고 증류수에 용해하여 30 mgmL-1의최종 농도를 얻습니다.
  2. 단백질 용액을 0.22 μm 필터및 원심분리기를 293K에서 최고 속도로 5분 동안 걸아 모든 고체 입자를 제거합니다. 결정화 실험에 상체를 사용합니다.
  3. 표 1에제공된 농도의 버퍼 및 침전제를 포함하는 결정화 용액 500 μL을 준비한다. 0.22 μm 필터를 통해 용액을 필터링합니다.
  4. 4.1-4.5 단계에 설명된 대로 주사기 또는 자동 압력 구동 유체 시스템 또는 주사기 펌프로 칩의 입구 점에 용액을 주입합니다.
    참고: 결정화 실험은 정적 조건 하에서, 미세유체 채널이 결정화 용액으로 채워지고, 또는 흐르는 조건 하에서 일정한 유량으로 채널 내부에 지속적으로 주입되는 경우 발생할 수 있습니다. 후자의 경우 외부 압력 구동 시스템 또는 주사기 펌프를 사용하는 것이 좋습니다. 흐르는 조건에서 실험의 실현은 또한 유체 채널 내에서 결정화 솔루션을 동적으로 교환 할 수있는 가능성을 제공한다. 따라서, 동일한 단백질 샘플을 사용하는 동안 여러 실험을 수행할 수 있다.
  5. 유체 채널이 결정화 용액으로 채워지면 칩의 입구및 출구 포트를 파라필름 테이프로 밀봉하십시오.
  6. 파이펫 단백질 저장고 내에서 단백질 용액의 적절한 볼륨을 캡슐화하고 단계 5.1-5.4에 설명된 바와 같이 단백질 샘플을 캡슐화한다.
  7. 칩을 293 K로 저장합니다.
    참고: 투석을 통한 결정화는 증기 확산 방법 또는 배치 결정화로 수행된 실험과는 다른 운동 궤적을 따르며, 측정된데이터(51)에따라 확산 공정에 관여하는 침전성 분자의 특성에 깊이 의존하며, 핵화가 시작되는 데 더 많은 시간이 걸릴 수 있다. 증발을 방지하기 위해, 이 기간 동안, 293 K의 습도 포화 대기에 칩을 배치.

7. 시투 및 온칩 X선 회절

  1. 빔라인에 대한 3D 인쇄 지원
    1. 최대 3개의 칩을 동시에 운반할 수 있는 지지체를 인쇄합니다. 지지체의 치수는 플레이트 X선 회절 실험과 호환되는 상용 결정화 플레이트(96웰/SBS 표준)의 치수와 동일합니다.
      참고: 지원 인쇄는 상용 서비스에 할당할 수 있습니다. 지원은 3D-CAD 설계 소프트웨어를 사용하여 설계되었으며 BM30A-FIP(ESRF)에서 시투 X선 회절 데이터 수집 중에 온칩 단백질 결정화 실험 과 도 3B에 표시됩니다.
    2. 단면 또는 양면 테이프로 지지대에서 투석 칩을 안정화합니다.
  2. 시투에서 엑스레이 회절
    1. 단백질 저수지에서 자란 결정에서 실온에서 X선 회절 데이터를 수집합니다. 예를 들어, 12.656 keV의 에너지, 3.32 x 10광자 s-1의 플럭스 및 250 x 250 μm2의빔 크기로 X 선을 사용합니다. 315 x 315mm2 및 9.4 메가 픽셀 해상도의 활성 표면을 위해 3 x 3 CCD의 매트릭스가 있는 ADSC 퀀텀 315r 검출기로 회절 이미지를 기록합니다.
      참고: 투석 칩에서 자란 리조지메 결정에 대한 회절 데이터는 유럽 싱크로트론 방사선 시설(ESRF)에서 BM30A-FIP 빔라인에서 수집되었다. 그러나, 빔 크기, 플럭스 및 검출기 유형은 다른 X선 방사선 소스에서 상이할 수 있다. 3D 프팅 서포트를 통해 각범위의 -40°에서 +40°의 각범위로 크리스탈 주위의 데이터 수집이 가능합니다. 시투 데이터 수집에 노출된 리소지메 결정의 개수, 각 결정에 대해 수집된 회절 패턴의 수, 노출당 진동 각도 범위 및 노출 시간은 표 2에요약된다.
  3. 데이터 처리
    1. XDS프로그램(48)을사용하여 리소지메 결정에 대한 회절 패턴으로 전체 또는 부분 데이터 세트를 처리합니다.
    2. 각 데이터 집합에 대한 HKL 파일을 생성하고 XSCALE소프트웨어(48)를사용하여 크기를 조정합니다.
    3. CPP4 제품군49의 프로그램 Phaser와 분자 교체를 사용하고 모델 건물의 위상을 결정합니다. 이 단계를 위해, 단백질 데이터 뱅크(PDB) 항목 193L에서 리소지메의 알려진 3D 좌표를 사용한다.
    4. Phenix(52)를 사용하여 구조를 정제하고 COOT50을사용하여 최종 단백질 모델을 검사합니다.

Representative Results

주니우스 외19,45가 개발한 미세유체 칩은 마이크로투아진 법과 함께 온칩 단백질 결정화와 실온에서 의X선 회절 데이터 수집모두에 호환된다. 마이크로칩의 사진, 상세한 설계, 유체 커넥터 및 RC 투석 멤브레인은 도 2에도시되어 있습니다. 결정화 실험은 단백질 샘플을 단백질 저장소에 직접 파이프로 직접 파이프하고 자동 압력 구동 시스템 또는 주사기 펌프를 사용하여 선형 유체 채널에 결정화 용액을 도입하거나 주사기를 사용하여 수동으로 설정합니다. 단백질 저장기및 유체 채널은 도 2A에서구별될 수 있다. 단백질 저장소의 0.1 μL 또는 0.3 μL 최대 부피칩을 제작하기 위한 설계는 각각 좌우 그림 2A에 도시된다. 단백질 시료에 대한 0.2 μL 또는 0.7 μL 최대 용량을 가진 칩은 다른 곳에서19로표시됩니다. 장치 제조프로토콜의 하이라이트는 다양한 MWCO의 시판 가능한 RC 투석 막을 포함시키는 광치료가능한 티올렌 기반 수지 NOA 81의 사용에 따라 좁혀질 수 있다. 미세유체 장치의 제조 동안, 선형 유체 채널은 하단 PDMS 몰드(도1F)에각인되어 있으며, 상부 PDMS 금형은 단백질 저수지 및 입구 및 콘센트 포트(도1F)를위한 패턴 기둥만으로 구성된다. NOA 81이 교차연결되고 PDMS 금형이 어셈블리(도1K)에서제거되면, 유체 채널은 마이크로칩의 하단 층에 위치하고 단백질 채널 및 입구/출구 포트는 두 층에 위치한다. 도 1L은 디바이스의 모든 층과 각각의 두께가 표시되는 투석 칩의 측면 뷰 회로도를 도시한다. 칩(유동성 채널)의 바닥 층에 각인된 패턴의 높이는 약 45μm이며 입구 및 출구 포트의 총 높이는 약 90 μm입니다. 단백질 저수지(45 μm 높이)도 도 2D 및 2E로도시된다. 두 층의 정렬은 광학 현미경하에서 조사되었고 마이크로칩 내에 통합된 RC 투석막의 조각은 도 2D에서명확하게 구별될 수 있다. 동일한 그림에서, 공기는 결정화 용액의 주입 도중 유체 채널 내에서 포획되고, 단백질 저수지의 왼쪽 상부에서 볼 수 있다. 도 2E는 프로토콜의 5.2 및 5.3 단계에 설명된 바와 같이, 피펫을 가진 단백질 액적물의 수동 증착 후 및 PMMA 및 Kapton 테이프의 조각으로 액적의 캡슐화 전에 단백질 저장소의 클로즈업 사진이다. 결정화 실험에 사용될 준비가 된 미세 유체 칩은 단백질 샘플의 캡슐화 및 유체 커넥터의 접착 후 도 2C에묘사된다. 밀착 형 어셈블리는 누출이 발생하지 않도록 합니다. 미세유체 채널의 입구 및 출구 포트에 대한 유체 형커넥터는 프로토콜의 4.1 단계에 설명되어 도 2C에도시된 바와 같이 시판되는 커넥터일 수 있으며, 또는 일회용 실험실 파이펫 팁은 동일한 목적을 위해 사용될 수있다(도 2B,프로토콜 단계 4.4).

미세 유체 칩의 제조를 위해 광학적으로 투명하고 생물학적으로 불활성 물질을 선택하여 실온에서 시투 X 선 회절 실험에 대한 높은 호환성을 입증했습니다. 미세유체 장치를 구성하는 재료와 주변 대기(공기)를 구성하는 재료와 함께 X선, 흡수 및 산란의 상호 작용은 배경 잡음으로 알려진 신호를 생성한다. 이 잡음은 검출기에 의해 기록된 단백질 결정의 회절 신호까지 요약하여 신호 대 잡음 비율을 감소시키고 X 선 회절 데이터 수집 중에 가능한 한 낮게 유지되어야 합니다. 우리는 X선 빔의 직접 경로에 있는 단백질 저수지를 포함하는 물질에 의해 생성된 배경 잡이를 평가했습니다. 단백질 저장소는 RC 투석 막, Kapton 테이프 및 2개의 PMMA 조각으로 구성되며, 하나는 마이크로칩용 기판으로 사용되며 단백질 샘플의 캡슐화에 사용되는 제품입니다. PMMA의 두께는 2 x 175 μm, Kapton 테이프 20 μm, RC 투석 막은 약 40 μm두께(도 1L)이다. 이들 층의 총 두께는 약 410 μm이고 NOA 81 층은 직접 X선 경로에 있지 않다. 제조 재료의 두께 외에도, X 선 산란이 원소 원자 수로 증가함에 따라 그 밀도는 배경 산란 노이즈를 측정하는 데 에도 중요합니다. 이러한 이유로, 헬륨 플럭스(ESRF에서 BM30A-FIP에서 제공되는 기능)는 재료 특성화 및 단백질 회절 실험을 위해 데이터 수집 중에 공기 대신 사용되었습니다. 도 3C는 Kapton 테이프, RC 투석 막, PMMA 시트 및 헬륨 대기에서의 조립에 의해 생성된 배경 노이즈를 보여줍니다. 각 물질은 0.98 Å 파장의 X 선에 20 s를 노출하고 샘플 검출기 거리는 200mm였다. 실험은 프로토콜의 단계 7에서 설명된 바와 같이 ESRF에서 BM30A-FIP 빔라인에서 수행되었다. X선 빔과 재료의 상호 작용에 기인하는 확산 링은 4Å 보다 낮은 해상도에서 Kapton 테이프, 4-8 Å 사이의 PMMA 시트 및 4-5 Å 해상도 사이의 투석 막에 대해 구별 될 수 있습니다. 투석 칩에 의해 생성된 배경 잡음은 주로 대형 리조지메 결정의 고해상도 회절 데이터의 처리에 영향을 미치지 않는 6Å 미만의 해상도로 관찰된다. 마이크로칩 및 별도의 재료에 대한 해상도의 함수로서 배경 산란 강도는 다른 곳에서19로표시된다. 도 3C에제시된 측정에서 투석 칩은 임의의 용액(단백질 또는 침전제 용액)이 비어 있었으며 배경 잡음에 대한 용액의 존재의 기여도는 측정되지 않았다. 칩은 시투 회절실험(19)에서설계된 3D 프린팅 지지체(도3B)를갖춘 X선 빔 앞에 장착되었다. 그러나, 96-well/SBS 표준 결정화 플레이트의 치수와 동일한 치수를 가진 동일한 지지체는, 최대 3개의 칩을 동시에 보유할 수 있으므로 1~3결정화 실험을 동시에 수행하는 데 사용될 수있다(그림 3A).

마이크로투아진 방법을 이용한 모델 용해성 단백질의 온칩 결정화를 위한 미세유체 장치의 효율을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 유체 채널은 프로토콜의 4단계에서 설명된 바와 같이 채워졌고, 5단계와 6단계는 전용 단백질 저장소 내에서 단백질 샘플을 캡슐화하는 방법과 결정화 실험을 설정하는 방법을 설명하였다. 도 4는 리소지메 크리스탈이 1.5M 나트륨 아세테이트(CH 3 COONa) pH 4.0(A) 및 M NaCl1이하, 0.1M CH3COONa pH 4.5, 30% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 400(B)으로 293K에서 재배한 리소지메 크리스탈을 나타낸다. lyophilized 리소자임 분말은 각각 도 4A 및 4B에도시된 실험을위해 ~30 mgmL-1 또는 20mM CH3COONa pH 4.2 완충제의 최종 농도로 물에 용해되었다. 두 실험에서 단백질 샘플의 부피는 약 0.3 μL이었고 마이크로칩 내에 내장된 RC 투석 막의 MWCO는 6-8 kDa의 범위에 있다. 도 3A에 나타난 리소지메 결정은 1시간 이내에 성장했으며 도 3B의 결정은 실험 개시 후 30분 이내에 증가하였다. 결정화 실험은 정적 조건하에서 수행되었다. 그러나,19는 유동조건 하에서 실험을 수행하여 결정화 조건과 연구 단계 다이어그램을 동적으로 교환하여 미세투석 방법의 가역성을 검증하는 가능성을 제공한다는 것을 보여주었다.

시투에서 도 4A에 도시된 리소지메 결정으로부터의 X선 회절 데이터는 이러한 실험에 대한 투석 칩의 적합성을 입증하기 위해 수집되었다. 데이터 수집은 프로토콜의 7.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 실온에서 BM30A-FIP 빔라인(ESRF)에서 수행되었다. 마이크로칩은 3D 프린팅 지지체(도3B)의도움으로 빔라인에 장착되었고, 완전한 X선 회절 데이터 세트는 표 1의제2선에서 주어진 조건하에서 칩에서 자란 두 개의 단일 리소지메 결정으로부터 수집되었다. 데이터 세트의 관찰된 반사는XDS(48)를 사용하여 처리, 인덱싱 및 통합되었고, 분자 교체 및 정제는 Phaser49 및 Phenix52를사용하여 각각 수행되었다. 각 리소지메 결정의 전체 데이터 집합및 두 데이터 세트의 병합에 대한 결정통계는 표 2에제공됩니다. 분자 대체를 위해, PDB 항목 193L이 사용되었다.

단일 리소지메 결정및 두 결정의 병합된 데이터 세트에서 전자 밀도 맵은 각각 1.95 Å 및 1.85 Å로 얻어졌으며, 그림 5A 및 5B에도시되어 있다. 두 전자 밀도 맵은 단일 결정또는 다중 결정에서 실온에서 투석 마이크로칩에서 직접 수행된 시투 X선 회절 실험에서 얻을 수 있는 상세한 구조 정보를 보여 주며, 시투 X선 결정학 연구에 적합한 칩을 렌더링합니다.

Figure 1
도 1: 투석 칩 제조의 회로도 예시. (A)SU-8 수지는 두 개의 실리콘 웨이퍼에 증착되고 스핀 코팅. (B)SU-8 마스터는 포토마스크를 통해 자외선으로 포토레지스트를 조사하고 노출되지 않은 부품을 개발한 후 인수된다. (C)PDMS는 SU-8 마스터에게 분배되고 338 K에서 1h,(D)복제 성형및 각인에 의해 생성된 2개의 PDMS 몰드가 마스터의 박리및(E)적절한 크기로 절단된다. (F)PDMS 금형은 두 개의 중앙 기둥 사이에 RC 투석 막을 통합하는 유리 슬라이드에서 지원됩니다. (G)2 PDMS 금형은 진공 챔버에서 ~30 분 동안 정렬및 건조된다. (H)NOA 81 수지는 두 금형 사이에 부어(I)모세관에 의해 공간을 채웁니다. (J)UV 광에 대한 첫 번째 노출 후, 바닥 PDMS 금형이 제거되고 조립체가 PMMA 시트에 증착된다. (K)제2 UV 노출은 NOA 81 수지와 투석 칩을 완전히 중합하기 위해 나머지 상부 PDMS 금형을 제거한 후 즉시 사용할 수 있도록 한다. (L)투석 칩의 측면 뷰 회로도는 장치의 모든 층과 각각의 두께가 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 투석 칩은 온칩 단백질 결정화 및 시투 X선 회절 실험을 위한 RC 투석 막을 포함하고 있습니다. (A)NOA 81 마이크로칩은 175 μm 두께PMMA 기판에 0.1 μL(왼쪽) 및 0.3 μL(오른쪽) 무민부피를 가진 미세칩입니다. (B)유체 채널의 입구 및 출구 포트에 붙어 있는 유동적인 커넥터로서 파이펫 팁이 있는 마이크로칩. (C)결정화 실험 중 마이크로칩의 그림. 단백질 샘플은 175 μm 두께의 PMMA 시트와 Kapton 테이프조각으로 캡슐화됩니다. Peek Nanoport 커넥터는 유체 채널의 입구 및 콘센트 포트에 사용됩니다. (D)유체 채널 내의 결정화 용액의 순환 중에 단백질 저장소의 최고 보기. 공기는 명확하게 검출 될 수있는 RC 투석 막 바로 아래 저수지의 상부에 갇혀있다. (E)단백질 시료의 증착 시 광학 현미경을 통해 투석 저장소의 최고 보기. 단백질 액적은 임베디드 RC 투석 막 바로 위에 증착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 결정화 실험 중에 사용되는 마이크로칩에 대한3D 프린팅 지지체(A)와(B) ESRF에서 BM30A-FIP 빔라인에서 X선 빔 앞에 장착된 현장에서 X선 회절 실험. (C)칼톤, RC 투석막, PMMA 및 투석 칩(왼쪽에서 오른쪽)과 X선의 상호 작용에 의해 생성된 배경 잡음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 마이크로 투석 방법으로 리소지메의 온칩 결정화. (A)리소지메(~30 mgmL-1) 1.5M NaCl 및 0.1 M CH3COONa pH 4.0 및(B)리소지메(~20 mg mL-1) 결정체하에서 재배된 크리스탈은 1M NaCl, 0.1 M3COONa pH 4.5, 40% 및 40% 두 실험 모두 293 K.에서 수행되었다.

Figure 5
그림 5: (A) 단일 결정및 (B)로부터 정제 된 리소지메 구조의 전자 밀도맵은 마이크로 투석을 통해 칩에서 자란 두 개의 결정의 병합 된 데이터 세트를 한다. 지도는 각각 1.95 Å및 1.84 Å로 얻어졌으며, 1μ00에서 윤곽을 그었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단백질 단백질 농도
(mg mL-1)		 단백질 버퍼 초기 농도
침전물 솔루션		 RC의 MWCO
투석 막
(kDa)		 온도
(K)
리소지메 ~ 30 물 1.5 M NaCl
0.1 M CH3COONa pH 4.0		 6 - 8 293
리소지메 ~ 20 20 mM CH3COONa pH 4.2 1 M NaCl
0.1 M CH3COONa pH 4.5
30% PEG 400		 6 - 8 293

표 1: 마이크로투아분해 방법을 이용한 리소지메의 온칩 결정화를 위한 단백질 완충제 및 침전제 용액의 조성. 두 번째 라인에 제공된 조건과 함께 온칩에서 재배된 리소지메 크리스탈은 시투 X선 회절 데이터 수집에 사용되었습니다.

단백질 리소지메 리소지메 리소지메
결정 수 1 1 2
회절 프레임 수 40 30 70
노출당 진동(°) 1 1
노출 시간(들) 30 30
온도(K) 293 293 293
공간 그룹 P43212 P43212 P43212
단위 셀 매개변수 78.86 78.86 37.87
90.0 90.0 90.0		 79.17 79.17 37.95
90.0 90.0 90.0		 78.47 78.47 37.65
90.0 90.0 90.0
해상도 범위(Å) 27.31 - 1.95
(2.02 - 1.95)		 27.39 - 1.96
(2.03 - 1.96)		 27.17 - 1.85
(1.91 - 1.85)
모사이시티 (°) 0.319 0.121
총 반사(관찰) 25127 (3552) 19991 (3001)
고유 반사(관찰) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975)
레두교 2.90 (2.61) 2.41 (2.27)
완전성(%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15)
평균 i/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7
CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0
R 병합 0.184
R-메아스 0.139 0.221 0.219
R-핌 0.116
정제에 사용되는 반사 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965)
R-free에 사용되는 반사 864 (78) 846 (85) 1039 (96)
R-작업 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102)
R-무료 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703)
비수소 원자 수 1069 1071 1096
고분자 1012 1012 1012
물 55 57 82
리간드 2 2 2
단백질 잔류물 131 131 131
Rms (채권, Å) 0.008 0.009 0.005
Rms(각도, °) 1.17 1.26 1.05
라마찬드란이 선호 (%) 98.43 97.64 99.21
라마찬드란 허용 (%) 1.57 2.36 0.79
라마찬드란 이상치 (%) 0.00 0.00 0.00
아베가레 B-계수 34.26 28.54 24.34
단백질 33.94 28.14 23.62
물 40.23 35.57 33.16
리간드 33.23 29.63 24.77

표 2: 마이크로투아정법을 통해 온칩에서 자란 리조짐 결정의 데이터 수집 파라미터, 결정및 정제 통계. 괄호에 제공된 값은 가장 높은 해상도 셸에 해당합니다. 네 번째 열은 두 번째 및 세 번째 열의 데이터 집합을 병합한 후 얻은 값에 해당합니다.

Discussion

마이크로 유체 장치는 마이크로 투석 방법을 사용하여 온칩 단백질 결정화를 위해 개발되었으며 실온에서 X 선 회절 실험이 발생했습니다. NOA 81 칩은 온칩 단백질 결정화를 위해 마이크로 투석증을 사용하기 위해 모든 MWCO의 RC 투석 막을 통합할 수 있습니다. 상대적으로 높은 X선 투명도를 가진 제조 재료가 사용되어 칩이 시상 단백질 결정학에 호환되는 렌더링되었습니다. 장치의 단백질 결정화를 위한 구획을 구성하는 제조 재료(PMMA, Kapton, RC 투석 막)는 낮은 배경 잡이를 생성하도록 평가되었다. 구체적으로, 투석칩에 의해 생성된 배경 잡음은 주로 저해상도(> 6Å)에서 관찰되며 단백질 구조 결정에 필요한 대형 리조지메 결정의 고해상도 회절 데이터의 치료에영향을 미치지 않는다. 데이터 수집의 자동화는 매크로 분자 결정빔라인에 직접 장착하고 최대 3개의 마이크로칩을 동시에 운반할 수 있는 3D 프린팅 지지대를 사용하여 증폭됩니다. 이러한 방식으로, 깨지기 쉬운 단백질 결정의 수동 수확 및 조작은 피한다. 더욱이, 데이터 수집은 상온에서 이루어지며, 토착 단백질 구조2,3으로부터의형성적 변화와 관련될 수 있는 극저온 보호의 필요성을 피한다.

마이크로투아실시스를 온칩에서 결정화를 성장시키는 방법으로 사용하면 결정화 공정을 정확하게 모니터링하고 제어할 수 있습니다. 도입에서 논의된 바와 같이, 종래의 단백질 결정화 방법의 대부분은 미세유체장치(11,14)를사용하여 구현되었다. 그러나, 단백질 결정화를 위한 투석의 이점은 아직 마이크로스케일에서 완전히 이용되지 않았습니다. 온칩 마이크로투아섭시스는 동일한 단백질샘플(19)을사용하여 위상 다이어그램을 연구하고 결정화 조건의 선별 및 최적화를 수행할 수 있는 가능성을 제공한다. 이 작품에 제시된 프로토타입의 경우 칩당 단백질 소비량은 0.1 또는 0.3 μL로 제한됩니다. 제조 프로토콜은 많은 단계를 포함하지만 간단하고 상대적으로 저렴한 재료와 깨끗한 방에서 하루에 수많은 장치 (20 ~ 30 칩)의 제조를 가능하게한다. 그러나, 단백질의 온칩 결정화는 핵형성과 결정성장, 특히 마이크로스케일의 본질적인 금방 특성으로 인해 섬세한 절차가 될 수 있다. 현장 X선 회절 데이터 수집에 적합한 견고하고 잘 정의된 결정을 산출한 리소지메의 결정화에 잘 설정된 조건이 사용된 사례 연구가 설명되었습니다. 그럼에도 불구하고 결정화 배지가 훨씬 더 복잡하고, 위상 다이어그램이 알려지지 않고 잘 작동하는 결정화 조건이 아직 잘 확립되지 않은 막 단백질과 같은 더 도전적인 단백질 표적을 사용하면 어려움이 발생할 수 있습니다. 투석 칩은 단지 미세 유체 채널 내에서 결정화 용액을 교환하여 귀중하고 자주 비용이 많이 드는 단백질 샘플을 폐기하지 않고 이러한 어려움을 능가하고 칩상 다이어그램을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다.

미세 유체 장치의 다기능성은 결정화 조건과 낮은 단백질 볼륨을 사용하여 다양한 위상 다이어그램을 가역적으로 제어하기 위해 온칩 단백질 결정화를 위한 미세 투약을 악용하는 데서 비롯됩니다. 더욱이, 이 장치는 시투 X선 회절 실험과 호환되며 장치의 프로토타이핑은 저렴하고 빠르다. 수용성 및 멤브레인 단백질의 수많은 동종 결정 (준비)은 칩에서 재배 될 수 있으며 이러한 모든 특징은 싱크로트론 및 XFEL 시설에서 까다로운 단백질 표적에 대한 연쇄 X 선 결정학 연구에 활용 될 것으로 예상됩니다. 마지막으로, 칩 온칩과 시테투 시간 해결 연구를 수행하는 것은 결정적 커뮤니티에 큰 관심을 가질 수 있는 미래의 가능성입니다. 따라서 투석 칩의 결정을 늘리고 시약을 미세 유체 채널에 도입하여 수동으로(주사기를 사용) 또는 자동으로(압력 제어 유체 시스템 또는 주사기 펌프사용)을 도입함으로써, 미래의 노력은 미세유체 칩을 사용하여 싱크로트론 빔라인에 대한 시간 해결 실험을 성공적으로 트리거할 수 있음을 증명하는 데 초점을 맞출 것입니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

MBS는 2014-2015 년 한도에서 계약 계측에 따라 MI / CNRS의 지원을 인정합니다. NJ는 CEA의 국제 박사 과정 연구 프로그램 (Irtelis)을 박사 학위 펠로우십에 대해 인정합니다. MBS와 SJ는 마리 스크와도우스카-퀴리 보조금 계약 번호 722687에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 인정합니다. MBS, SJ, NJ는 미세 제조 실험을 위한 클린룸 설립에 대해 LIPhy(UGA)에 감사드립니다. IBS는 그르노블의 학제 간 연구소 (IRIG, CEA)에 통합을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker

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화학 문제 170 미세 유체 온 칩 단백질 결정화 시투 X 선 회절 미세 투석 결정화 직렬 결정학 위상 다이어그램 투석 칩
<i>시투</i> X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화
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Jaho, S., Junius, N., Borel, F.,… More

Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J. B., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).

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