Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Krystallisering av proteiner på chip ved mikroanalyse for In Situ X-ray Diffraction Studies

Published: April 11, 2021 doi: 10.3791/61660
Automatic Translation
1, 1,3, 1, 1, 2, 1
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258, Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

Dette papiret beskriver fabrikasjonsprotokollen for mikrofluidiske chips utviklet for on-chip proteinkrystallisering med dialysemetoden og in situ X-ray diffraction eksperimenter. Mikrofabrikasjonsprosessen gjør det mulig å integrere en halvgjennomtrengelig regenerert cellulosedialysemembran med en molekylær vekt cut-off, mellom to lag av brikken.

Abstract

Denne protokollen beskriver produksjon av reproduserbare og rimelige mikrofluidiske enheter som dekker hele rørledningen for krystallisering av proteiner på chip med dialysemetoden og tillater in situ enkeltkrystall- eller seriekrystallografieksperimenter ved romtemperatur. Protokollen beskriver fabrikasjonsprosessen av mikrobrikkene, manipuleringen av krystalliseringseksperimentene på brikken og behandlingen av in situ-innsamlede røntgendiffraksjonsdata for den strukturelle belysningen av proteinprøven. Hovedtrekket i denne mikrofabrikasjonsprosedyren ligger på integreringen av en kommersielt tilgjengelig, halvpermetabel regenerert cellulosedialysemembran mellom to lag av brikken. Den molekylære vektutskjæringen av den innebygde membranen varierer avhengig av makromolekylets molekylvekt og utfellingsstoffene. Enheten utnytter fordelene med mikrofluidisk teknologi, for eksempel bruk av minuttvolumer av prøver (< 1 μL) og finjustering over transportfenomener. Brikken sammenlignet dem med dialysemetoden, noe som gir presis og reversibel kontroll over krystalliseringsprosessen og kan brukes til å undersøke fasediagrammer av proteiner i mikroliterskalaen. Enheten er mønstret ved hjelp av en foto uhelbredelig tiolenbasert harpiks med myk avtrykk litografi på et optisk gjennomsiktig polymer substrat. Videre ble bakgrunnsspødingen av materialene som komponerer mikrobrikkene og genererer bakgrunnsstøy evaluert, noe som gjorde brikken kompatibel for in situ X-ray diffraction eksperimenter. Når proteinkrystaller dyrkes på chip opp til en tilstrekkelig størrelse og befolkningsens ensartethet, kan mikrobrikkene monteres direkte foran røntgenstrålen ved hjelp av en 3D-trykt holder. Denne tilnærmingen tar for seg utfordringene som stiger fra bruk av kryobeskyttende midler og manuell høsting i konvensjonelle proteinkrystallografieksperimenter på en enkel og rimelig måte. Komplette røntgendiffraksjonsdatasett fra flere isomorfe lysozymkrystaller dyrket på chip ble samlet inn ved romtemperatur for strukturbestemmelse.

Introduction

Belyse den tredimensjonale (3D) strukturen av biologiske makromolekyler er en uopphørlig jakt på strukturell biologi der røntgenkrystallografi forblir den viktigste undersøkelsesteknikken. Anvendt for å løse de strukturelle detaljene i komplekse makromolekyler, som proteiner, tar den sikte på å legge til rette for forståelsen av deres virkningsmekanismer og deres engasjement i ulike biologiske funksjoner. Kraftige røntgenkilder ved synchrotrons og røntgenfrie elektronlasere (XFELs) gir alle verktøyene som kreves for et dypere innblikk i proteinenes struktur ved nær atomoppløsning. Til tross for fordelene som kommer sammen med bruk av røntgenstråler for strukturelle studier, er det iboende begrensninger for røntgenstråling og selve krystalliseringsprosessen. Strålingsskader provosert av høy røntgenfluks og lange eksponeringstider av proteinkrystallen foran røntgenstrålen er restriktive parametere som krystallografer må overgå ved hjelp av kryogenkjøling 1. Det kan imidlertid være å finne de optimale kryooolingsforholdene, siden konformasjonsendringer fra den innfødte proteinstrukturen eller artefaktene kan skjules2,3. Videre indikerer nyere studier at å utføre diffraksjonseksperimenter ved romtemperatur fører til lavere spesifikk strålingsskade4. En annen flaskehals i strukturell biologi er oppkjøpet av velfnærte krystaller med tilstrekkelig størrelse5. Små krystaller er lettere å produsere, spesielt når det gjelder membranproteiner, men er mer utsatt for strålingsskader selv under kryooolingsforhold fordi en høy strålingsdose må rettes i et mindre volum sammenlignet med tilfelle av større proteinkrystaller6. Den nye tilnærmingen til seriekrystallografi7,8 ved synchrotrons og XFELs kan omgå begrensningene av strålingsskader og samtidig utnytte mindre krystaller (200 nm til 2 μm)7 ved å slå sammen datasett fra flere, isomorfe og tilfeldig orienterte proteinkrystaller og profitterer på de tilknyttede teknologiske fremskrittene som femtosecond pulser, kortere eksponeringstider og mikrofokuserterøntgenstråler 5,7,9,10.

Mikrofluidisk teknologi er verdifull for røntgenkrystallografi, og viser mangfoldige fordeler for krystallisering av biologiske makromolekyler og deres strukturelle undersøkelse. Gjennomføring av krystalliseringseksperimenter i mikrofluidiske enheter krever små mengder proteinprøve, og begrenser derfor produksjonskostnadene for disse høyt verdsatte biomakromolekylene og tilrettelegger for screening og optimalisering av mange krystalliseringsforhold. Videre gir det iboende store overflateareal-til-volum-forholdet i mikrofluidisk skala og diffusjonsbegrensede transportfenomener fin kontroll over strømmer og temperatur- eller konsentrasjonsgradienter11,12,13,14,gjengivelse av mikrofluidiske enheter egnet for dyrking av krystaller i ensartet størrelse og utforsking av fasediagrammer15,16,17,18,19. Videre viser mikrofluidiske verktøy et særegent potensial for å løse et annet hinder i proteinkrystallografi, som er prøveleveringen, og nødvendigheten av å håndtere og høste proteinkrystaller før de bruker røntgendiffraksjonseksperimenter. Metoden for on-chip og in situ X-ray krystallografi eliminerer krystall manipulasjon og potensiell forverring av krystallkvalitet før datainnsamling. Et bredt spekter av mikrofluidiske chips som er kompatible for in situ X-ray protein krystallografi har blitt designet, utviklet og testet av mange forskningsgrupper som konfronterer relaterte restriksjoner som oppstår fra arten av mikrofabrikasjonsmaterialer og deres interaksjonermed røntgenstråler 14,19,20,21,22,23. Fabrikasjonsmaterialene må være optisk gjennomsiktige, biologisk inerte og demonstrere høy gjennomsiktighet til røntgenstråling og et optimalt signal-til-støy-forhold under datainnsamling.

De fleste av krystalliseringsmetodene som brukes i konvensjonell proteinkrystallografi24,25 har også blitt implementert i mikrofluidisk skala11,14 for på chip krystallisering og in situ X-ray diffraksjon analyse. Enkelt, hybrid eller flerlags mikrofluidisk apparat som omfatter dampdiffusjon26,fordampning27,fri grensesnittdiffusjon (FID)28, mikrobatch26, eller til og med seeding29 har blitt brukt til å krystallisere løselige og membranproteiner. Høy gjennomstrømning screening og optimalisering av krystalliseringsforhold kan oppnås30,31 i godtbaserte 32, dråpebaserte33, eller ventil-aktiverte34 enheter. In situ Røntgendiffraksjonseksperimenter av utfordrende proteinmål ved romtemperatur er utført i mikrobrikker fabrikkert fra ulike materialer som PDMS (polydimetylsiloxane), COC (syklisk olefinkopolymer), PMMA (poly(metylmetakkrylat))21,22,26,28,29, grafen filmer23, Kapton35, epoxy lim6, eller NOA (Norland Optical Adhesive)19 og materialenes gjennomsiktighet til røntgenstråling og deres bidrag til bakgrunnsstøy har blitt evaluert. Videre har mikrobrikker blitt designet for å pare in situ og serielle datainnsamlingsstrategier i et enkelt verktøy for røntgenproteinkrystallografieksperimenter ved synchrotron kilder23,35,36 og XFELs7.

Romtemperatur i situ datainnsamling er også implementert i ulike leveringsmetoder og enheter. For eksempel brukte Nogly et al.54 en lipidisk kubikkfase (LCP) injektor for å studere strukturen til den lysdrevne fotonpumpen bakteriorhodopsin (bR) av seriell femtosecond krystallografi (SFX) ved hjelp av en XFEL-kilde. Krystallstrukturen til bR ble løst til 2,3 Å-oppløsning, noe som viser kompatibiliteten til en LCP-injektor med tidsavklart seriell femtosecond krystallografi (TR-SFX). Baxter et al.55 designet et høy tetthet multi-krystall rutenett, fabrikkert av en 100 eller 200 μm tykk polykarbonat plast med laser-cut hull i ulike størrelser. En ekstra 5 μm tykk polykarbonatfilm kan festes til den ene siden av rutenettet når du bruker enheten til å sitte- eller hengende krystalliseringseksperimenter. Dette høytetthetsgitteret kan brukes på flere måter, da krystaller kan lastes direkte på portene på enheten, eller krystaller kan dyrkes på enheten ved dampdiffusjon eller LCP-metoden. Videre kan rutenettet justeres i en standard magnetisk base og brukes til in situ X-ray datainnsamling ved kryogene eller romtemperaturforhold. Mer nylig utviklet Feiler et al.56 en prøveholder for makromolekylær in situ X-ray krystallografi ved kryogen og omgivelsestemperatur med minimal bakgrunnsstøybidrag. Spesielt består holderen av en plaststøtte, en gjennomsiktig COC-folie og en mikroporisk strukturert polyimidfolie. Den ble designet for å erstatte de vanlige deksellysbildene for å sette opp krystalliseringsdråper, samtidig som den tillater manipulering på stedet som ligand soaking, kompleks formasjon og kryogen beskyttelse uten å åpne krystalliseringsdråpen eller manuelt håndtere krystallene. Videre kan prøveholderen fjernes fra krystalliseringsplaten og plasseres på en magnetisk base for in situ-datainnsamling ved standard goniometerbaserte strålelinjer. For innsamling av omgivelsestemperaturer fjernes COC-folien før forsøket, og bare den 21 μm tykke polyimidefolien bidrar til bakgrunnsspperende, som i dette tilfellet er minimal. Disse eksemplene komponerer bare en liten brøkdel av den pågående forskningen og mangfoldet av allsidige mikrobrikker utviklet for røntgenproteinkrystallografi.

Dialyseproteinkrystalliseringsmetoden har imidlertid ikke vært mye innlemmet i mikrofluidier. Dialyse er en diffusjonsbasert metode som tar sikte på likevekt av bunnkonsentrasjon gjennom en halvgjennomtrengelig membran for å nærme seg den nominelle konsentrasjonen for proteinkrystallisering og muliggjør presis og reversibel kontroll over krystalliseringsforholdene24. Molecular Weight Cut-Off (MWCO) av den halvgjennomtrengelige dialysemembranen kan velges avhengig av makromolekylets molekylvekt og precipitants for å tillate diffusjon av små stupbraptmolekyler samtidig som makromolekylet av interesse beholdes. På grunn av reversibilitet av dialyseprosessen, kan den brukes i kombinasjon med temperaturkontroll for å koble fra og optimalisere kjerne- og krystallvekstuavhengig 37 for å undersøke fasediagrammer ved å endre den utløsende konsentrasjonen mens du bruker samme proteinprøve. Integreringen av membraner i mikrofluidics gjennomgås av de Jong et al.38 og case-studier i biologi implantering dialyse i mikrobrikker kan hovedsakelig listes opp i prøveforberedelse, konsentrasjon eller filtrering applikasjoner39,40,41,42 eller cellerelaterte studier43,44. Pervaporasjon gjennom PDMS ble brukt av Shim et al.37 for å studere kjernering og vekst av xylanase under ulike forhold. Vann gjennomsyret gjennom den 15 μm tykke PDMS-membranen inn i proteinreservoaret på mikrofluidisk enhet, og deretter endret proteinet og bunnkonsentrasjonen.

Protokollen utviklet av Junius et al.19,45 for fabrikasjon av en mikrofluidisk chip kompatibel for både on-chip protein krystallisering via mikroanalyse og in situ X-ray diffraksjon eksperimenter ved romtemperatur er presentert. Protokollen for enhetsfabrikasjonen er direkte inspirert av det banebrytende arbeidet som Studer og kollegaene12,46 for mikromønstrede klistremerker av fotoherdbare tiolenbaserte harpiks NOA 81 bygger inn kommersielt tilgjengelige membraner, ved hjelp av myk avtrykk litografi. En innovativ modifikasjon av metoden resulterte i mikrobrikker som gjør det mulig for bruk av mikroanalyse å nøyaktig overvåke og kontrollere eksperimentelle parametere for on-chip vekst av proteinkrystaller og samtidig utnytte fordelene med mikrofluidics, for eksempel redusert forbruk av proteinprøver per eksperiment (< 1 μL). I et tidligere arbeid ble prinsippene for dialyse som brukes på et makroskalasystem (typisk volum > 20 μL) for screening og optimalisering av krystalliseringsforhold ved å kartlegge temperaturutfellende konsentrasjonsfasediagrammervist 47. I dette arbeidet er en protokoll beskrevet for å produsere dialysemikrobrikker som omfatter regenerert cellulose (RC) dialysemembraner av forskjellige MWCO for å utføre krystalliseringsanalyser på chip og in situ X-ray diffraksjon datainnsamling. Materialene som består av mikrobrikkene har blitt evaluert for deres gjennomsiktighet til røntgen19, og enhetene kan settes rett foran røntgenstrålen for romtemperatur i situ diffraksjonseksperimenter, unntatt manuell håndtering og minimere nedbrytning av skjøre proteinkrystaller. I en case-studie ble høneegg-hvite lysozymkrystaller dyrket på chip via mikrodialyse som genererte en jevnt størrelse befolkning. Mikrobrikken ble deretter montert foran røntgenstrålen med en 3D-trykt støtte19 og komplett in situ diffraksjon datasett ble samlet inn ved romtemperatur fra flere, isomorfe krystaller, viser det høye potensialet og relevansen av chips for synchrotron seriekrystallografi studier av utfordrende makromolekylære mål.

Protocol

1. Maske design og master fabrikasjon

  1. Tegn de ønskede geometriene til mikrofluidisk enhet ved hjelp av en vektorisk tegneprogramvare. For hvert lag av fotoresisten som skal brukes til neste trinn av fotolitografi, forberede en individuell maske: en maske skissert med kanaler og søyler og en maske som bare inneholder søylene.
  2. Oversett CIF filer generert av tegning programvare til film fotomasker. Dette kan gjøres gjennom kommersielle tjenester. Krev riktig fotomaske avhengig av valg av fotoresisten som brukes under fotolitografi.
    MERK: For SU-8-fotoresisten kan du bestille masker med svarte funksjoner på en gjennomsiktig bakgrunn. SU-8 er en epoksybasert negativ fotoresist, noe som betyr at under eksponering for UV-lys (365 nm) blir delene eksponert for UV krysskoblet mens resten forblir løselig. Derfor vil alle svarte mønstre på masken ikke bli krysskoblet av UV-lys under fotolitografien. Kanaler og søyler vil bli gravert på mesterne.
  3. Forbered to mestere på silisiumwafers for hver chip design av fotolitografi ved hjelp av SU-8 negativ fotoresist.
    MERK: Trinn 1.3.1-1.3.7 utføres i et rent rom. Trinnene beskrevet nedenfor er de tradisjonelle trinnene i fotolitografi etterfulgt av PDMS myk litografi, som er beskrevet i mange lærebøker. Alle verdiene til eksperimentelle parametere (fotoresist, varighet, temperatur, etc.) avhenger av mange subtile parametere og må optimaliseres avhengig av det forskjellige apparatet som brukes.
    1. Bruk en 3-tommers silisiumwafer og behandle overflaten med plasma i 90 s, for å lette avsetningen og vedlegget til SU-8-fotoresisten.
    2. Hell omtrent 3 ml SU-8 motstå på midten av wafer og spinn pels SU-8 ned til ønsket tykkelse (Figur 1A). For 50 μm nominell tykkelse, bruk SU-8 3050 og spin coat for 10 s ved 500 rpm og suksessivt for 30 s ved 3500 rpm. Myk bake fotoresistens på en kokeplate i 15 min ved 368 K for å være delvis størknet ved å la oppløsningsvæsken i harpiksen fordampe og hindre at det stikker på fotomasken. Etterpå, la wafer ved romtemperatur i 2 min.
    3. Utsett fotoresisten for UV-lys (figur 1B). Bruk en maskejuster med en effekt på 35 mW cm-2 og 8 s eksponeringstid.
    4. Fortsett med baking etter eksponering. Plasser wafer på en kokeplate i 5 min ved 368 K for å fullføre fotoreaksjonen som er påkalt av UV-eksponeringen.
    5. Fjern alle SU-8 motstå som ikke ble krysset ved å plassere wafer i et bad som inneholder propylenglykol metylengedyleteracetat (PGMEA) og rør i 15 min. Skyll wafer med isopropanol til ingen uklar nedbør kan observeres. Tørk wafer med nitrogengass og lagre den i en petriskål (100 mm x 15 mm standardstørrelse).
    6. Behandle overflaten av wafer med et silan for å lette løsrivelse av polydimetylsiloxane (PDMS) som skal brukes til å fremstille 2 frimerker. Deponer wafer på en tappet kokeplate på 368 K i 10 min under dampatmosfæren til heksametyldisilazan (HMDS).
      MERK: Hvis peeling av PDMS fra wafer blir vanskelig etter flere bruksområder, bør overflaten av wafer behandles igjen med HMDS damp.
    7. Den første mesteren som inneholder kanalene og søylene er klare. Gjenta disse trinnene og forberede den andre master mønster bare søylene.
      MERK: Under fotolitografi er målet å oppnå geometriene til enheten på SU-8-mesterne med en høyde på 50 μm. Men når de to SU-8-mesterne er fabrikkert, måler du høyden på geometriene gravert på mesterne med et profilometer for å skaffe seg den eksperimentelle verdien. Den målte verdien for begge SU-8-mestere fabrikkert for denne protokollen er ca. 45 μm.

2. PDMS former fabrikasjon

MERK: Følgende trinn i protokollen kan utføres i ethektig laboratorium så lenge en laminær strømningshette brukes, gult lys i rommet brukes når du arbeider med NOA 81-harpiksen (trinn 3.6-3.11) og en kilde til UV-lys er tilgjengelig for polymerisering av NOA 81-harpiksen (trinn 3.7 og 3.11).

  1. Forbered 50 g PDMS silikonbase og herdingsmiddelet i et 10:1-masseforhold.
  2. Bland begge ingrediensene i et beger med en slikkepott og legg blandingen i et vakuumkammer for å fjerne alle luftboblene.
  3. Hell 25 g av de forhåndsblandet PDMS i SU-8 master (lagret i en petriskål) mønster kanalene og søylene opp til en høyde på ca 5 mm. Hell de resterende 25 g pdmene i det andre SU-8-hovedmønsteret, bare søylene opp til en høyde på ca. 5 mm (figur 1C).
  4. Legg begge Petri-rettene i en ovn og herd PDMS-lagene ved 338 K i 1 time.
  5. Klipp det herdede PDMS-laget rundt mønstrene til SU-8-mesterne med en skalpell og fjern forsiktig PDMS-formene fra mesterne (figur 1D).
    MERK: Prosedyren beskrevet ovenfor, kalt replikastøping, brukes ofte til å forberede former av PDMS som vil bli festet til glassflater og være en del av en mikrofluidiskenhet 53. I denne protokollen er PDMS-formene ikke en del av brikken, men de brukes som mellomprodukter for chipfabrikasjonen. For hver design er 2 PDMS-former utarbeidet fra de respektive SU-8-mesterne (figur 1D og 1E) og vil bli brukt tilsvarende (som beskrevet nedenfor) for fabrikasjon av mikrobrikken.

3. Dialyse chip fabrikasjon

  1. Plasser PDMS-formen som både kanaler og søyler på et stivt mikroskopglasslysbilde (3 x 1 tommer standardstørrelse) med mønstrene vendt oppover (figur 1F). Den sentrale søylen som tilsvarer proteinreservoaret overstiger vertikalt med 45 μm fra den horisontale overflaten av PDMS-formen.
  2. Klipp og skill et tørt stykke av den regenererte cellulose (RC) dialysemembranen og deponer den på den sentrale søylen i PDMS-formen, som støttes på glasslysbildet (figur 1F).
    MERK: RC dialysemembranen er kommersielt tilgjengelig, og den molekylære vektkuttet (MWCO) velges tilsvarende med proteinets molekylære vekt under studier og bunndempivane som brukes. Størrelsen på stykke RC dialysemembran avhenger av utformingen av brikken. I denne protokollen er 2 prototyper utformet der volumet av proteinreservoaret er 0,1 eller 0,3 μL. I disse tilfellene er størrelsen på dialysemembranstykket henholdsvis 2 x 2 mm2 eller 4 x 4 mm2.
  3. Plasser den andre PDMS-formen som bare er vendt nedover på toppen av PDMS-formen som støttes på glasslysbildet (figur 1F). Den sentrale søylen i denne formen tilsvarer proteinreservoaret og overskrider vertikalt (vendt nedover) med 45 μm fra den horisontale overflaten.
  4. Juster de sentrale pilarene i de 2 PDMS-formene. RC dialysemembranen er "klemt" mellom de 2 PDMS-formene (figur 1G).
    MERK: Justeringen mellom mikrostrukturene til de 2 PDMS-formene kan oppnås visuelt, uten ekstra utstyr. Ellers kan denne manipulasjonen oppnås under et mikroskop. Et lite skifte mellom reservoarene er ikke problematisk, så lenge den fluidiske kanalen og inngangs- eller utgangspunktene ikke er helt dekket.
  5. Uttørk forsamlingen i 30 min i et vakuumkammer for å fjerne alle fanget luftbobler i PDMS-formene og for å fremme innsetting av harpiksen i løpet av neste trinn av fabrikasjonen.
    MERK: De 2 PDMS-formene holdes på plass av PDMS-PDMS-vedheft, og det kreves ikke ekstra trykk eller annen måte å binde på midlertidig binding på.
  6. Fyll det tomme rommet mellom de 2 PDMS-formene med den fotohelbredelige, tiolenbaserte harpiksen NOA 81 ved kapillær imbibition (figur 1H og 1I).
  7. Herd harpiksen ved eksponering for UV-lys (365 nm) i 8 s ved hjelp av en kollidert UV-lampe (effekt 35 mW cm-2).
    MERK: Denne første eksponeringen gjør at NOA 81 harpiks kan være delvis krysskoblet siden et tynt lag av NOA 81 i kontakt med PDMS-formene på begge sider forblir usikret.
  8. Skjær det overskytende av NOA 81 fra de ytre sidene av PDMS-formene med en skalpell.
  9. Fjern den øvre PDMS-formen med den delvis krysskoblede NOA 81 fast på den fra den nederste PDMS-formen og glasslysbildet.
  10. Klipp et 175 μm tykt PMMA-ark i standarddimensjonene til et mikroskopglasssklie (3 x 1 tommer) og skrell av plastbeskyttelsesarkene fra hver side av PMMA-stykket. Trykk forsiktig på monteringen av den øvre PDMS-formen og den delvis herdede NOA 81 på PMMA-stykket (figur 1J).
  11. Herd igjen NOA 81 ved eksponering for UV-lys i 60 s og fjern den øvre PDMS-formen (figur 1K). Harpiksen holder seg til PMMA-substratet uten videre behandling.
    MERK: PDMS-formene kan gjenbrukes omtrent 5 ganger etter vask av dem med isopropanol og aceton, så lenge formene ikke er bøyd. RC dialysemembranen er inkorporert i NOA 81 klistremerket og ingen ytterligere manipulering eller mekanisk klemming er nødvendig.

4. Fluidic-kontakter

MERK: Utformingen av mikrofluidisk chip består av en lineær fluidisk kanal for krystalliseringsløsningen og et sentralt reservoar for proteinprøven (proteinreservoar), begge vist fra en toppvisning av to mikrobrikker i figur 2A. En RC dialysemembran er innebygd mellom disse to mikrostrukturene (figur 2D) og krystalliseringsprosessen utvikler seg mens utfellingsmidler fra krystalliseringsløsningen diffuserer over membranen på grunn av en konsentrasjonsgradient mellom de to rommene på brikken som er skilt av membranen. Den mikrofluidiske kanalen er trykt på den nederste PDMS-formen (figur 1F). Når fabrikasjonsprotokollen for sjetongene er fullført, er den lineære kanalen plassert på det nederste laget av NOA 81-klistremerket i kontakt med PMMA-underlaget, som vist i figur 1K. Et innløp og et utløpstilgangspunkt for krystalliseringsløsningen er plassert i hver ende av den lineære kanalen og ser ut som hull (total høyde 90 μm) som det kan ses i figur 2A. For håndtering av krystalliseringsløsningen må kontakter legges til på tilgangspunktene.

  1. Bond-kontakter som er kommersielt tilgjengelige (NanoPort) på innløpet og utløpet på den mikrofluidiske kanalen med raskt epoksylim (figur 2C).
  2. Velg riktig diameter på PTFE-rørene basert på størrelsen på kontaktene. PTFE-rørene vil bli brukt til innføring av krystalliseringsløsningen i den fluidiske kanalen på brikken.
    MERK: Kommersielt tilgjengelige sett anbefales for enkel og nøyaktig kontroll over strømningshastigheten og kombineres vanligvis med automatiserte trykkdrevne eller strømningsstyrte (sprøytepumper) systemer for blanding og væskehåndtering. Krystalliseringsløsningen kan imidlertid innføres manuelt i den lineære kanalen med en engangsplastsprøyte. I dette tilfellet foreslås trinn 4.3 til 4.5.
  3. Fyll en 1 ml engangssprøyte med krystalliseringsoppløsningen. For sjetongene som presenteres i denne protokollen, er 400 μL tilstrekkelig for å fylle opp hele fluidisk kanal.
  4. Klipp to pipettespisser slik at diameteren på spissen på den ene siden er lik den indre diameteren på PTFE-røret som skal brukes til løsningshåndteringen. Lim de beskårne tipsene på tilgangspunktene på kanalen med raskt epoksylim (figur 2B).
  5. Koble sprøyten med de beskårne spissene med et stykke PTFE-rør av riktig størrelse og sett inn oppløsningen i kanalen ved å stadig skyve sprøytestempelet sakte.

5. Protein innkapsling

MERK: Mønsteret på brikken dedikert til å bli brukt som proteinreservoaret forblir så langt åpent for atmosfæren. Følgende protokoll foreslås å nøye begrense proteinprøven i mikrofluidisk chip.

  1. Pipette en dråpe proteinprøven manuelt inne i proteinreservoaret, som ligger rett ved RC dialysemembranen, som vist i figur 2E. Volumet av proteinprøven varierer i henhold til utformingen av brikken og kan være 0,1 eller 0,3 μL.
  2. Påfør et tynt lag med høyvakuss silikonfett rundt proteinreservoaret.
  3. Klipp et lite stykke av et 175 μm tykt PMMA-ark og legg det forsiktig over det tynne laget av silikonfettet. PMMA-stykket må dekke hele overflaten av proteinreservoaret der proteinoppløsningen deponeres.
    MERK: Silikonfettet brukes til å øke lufttettheten og forhindre spredning av proteindråpen. Det er ingen binding eller tetting mellom PMMA-stykket som brukes til å dekke proteinreservoaret og NOA 81-klistremerket. Kontakten mellom dem er et solid/solid grensesnitt. For å produsere en total forsegling og en lufttett innkapsling av proteinprøven, brukes et stykke Kapton-tape som beskrevet i trinn 5.4.
    MERK: Det er noen ganger vanskelig å begrense proteinprøven i enhetens dedikerte hulrom (proteinreservoar) når et trykkdrevet system brukes til innføring av krystalliseringsløsningen i den fluidiske kanalen (trinn 6.4). For å unngå problemet nevnt ovenfor, bør relativt lavtrykksverdier opprettholdes mens du sirkulerer krystalliseringsløsningen. Et injeksjonstrykk på 20-60 mbar for vandige løsninger eller 50-150 mbar for mer viskøse løsninger (PEGs, glyserol) foreslås19.
  4. Klipp et stykke Kapton tape (20 μm tykk) stor nok til å dekke PMMA-stykket som er satt over proteinreservoaret og å holde seg på NOA-brikken rundt alle kanter. Proteinprøven er innkapslet i reservoaret og brikken er klar til bruk til krystalliseringseksperimentet, som vist i figur 2C.
    MERK: Sjetongene kan gjenbrukes flere ganger så lenge dialysemembranen og vedheftet av NOA på PMMA-underlaget ikke forverres. Hvis disse delene av brikken er skadet, observeres lekkasjer som bekrefter at enheten ikke lenger kan brukes. Vasking av chips avhenger av krystalliseringsløsningen. Ved lave viskositetsløsninger (salter, buffere), kan den fluidiske kanalen vaskes ved bare å innføre destillert vann og la den strømme i noen minutter. 400 μL er volumet som kreves for å fullstendig bytte en løsning i kanalen med en annen løsning. Ved mer viskøs løsninger (PEGs, glyserol), anbefales det ikke å gjenbruke chips siden det ikke er tilstrekkelig å vaske kanalen med vann. Den øvre delen av brikken, hvor proteinreservoaret ligger, kan også vaskes med destillert vann og tørkes med trykkluft.

6. Proteinkrystallisering på chip

  1. Vei lyofilisert høneeggehvitt lysozympulver og oppløses i destillert vann for å oppnå en endelig konsentrasjon på 30 mg ml-1.
  2. Filtrer proteinoppløsningen gjennom et 0,22 μm filter og sentrifuge i 5 min ved høyeste hastighet ved 293 K for å fjerne alle faste partikler. Bruk det overnaturlige for krystalliseringseksperimentet.
  3. Forbered 500 μL krystalliseringsløsning som inneholder bufferen og bunnstet i konsentrasjoner gitt i tabell 1. Filtrer oppløsningen gjennom et filter på 0,22 μm.
  4. Injiser oppløsningen i innløpspunktet på brikken med en sprøyte eller et automatisert trykkdrevet fluidisk system eller en sprøytepumpe, som beskrevet i trinn 4.1-4.5.
    MERK: Krystalliseringseksperimentet kan oppstå enten under statisk tilstand, hvis mikrofluidkanalen er fylt med krystalliseringsløsningen og settes til side, eller under flytende forhold, hvis det kontinuerlig injiseres inne i kanalen med konstant strømningshastighet. I sistnevnte tilfelle anbefales bruk av et eksternt trykkdrevet system eller sprøytepumpe. Realiseringen av eksperimentet under flytende forhold gir også mulighet til å dynamisk utveksle krystalliseringsløsninger i den fluidiske kanalen. Dermed kan flere eksperimenter utføres mens du bruker samme proteinprøve.
  5. Når den fluidiske kanalen er fylt med krystalliseringsløsningen, forsegler du innløps- og utløpsportene på brikken med parafilmtape.
  6. Pipette riktig volum av proteinoppløsningen i proteinreservoaret og kapsle proteinprøven som beskrevet i trinn 5.1-5.4.
  7. Oppbevar brikken på 293 K.
    MERK: Krystallisering via dialyse følger en annen kinetisk bane fra eksperimenter utført med dampdiffusjonsmetoden eller batchkrystallisering og avhenger dypt av arten av stupbrakte molekyler som er involvert i diffusjonsprosessen, ifølge målte data51, og det kan ta mer tid før kjerneringen starter. For å forhindre fordampning, hvis noen, i denne perioden, plasser brikken i en fuktighet mettet atmosfære på 293 K.

7. In situ og on-chip X-ray diffraction

  1. 3D-trykt støtte for strålelinjer
    1. Skriv ut støtten som kan bære opptil tre sjetonger samtidig. Dimensjonene på støtten er de samme som dimensjonene på kommersielle krystalliseringsplater (96 godt / SBS standard) kompatibel med i plate røntgendiffraksjonseksperimenter.
      MERK: Utskriften av støtten kan tilordnes kommersielle tjenester. Støtten ble designet ved hjelp av en 3D-CAD designprogramvare og vises i figur 3A under on-chip protein krystallisering eksperimenter og i figur 3B under in situ X-ray diffraksjon datainnsamling på BM30A-FIP (ESRF).
    2. Stabiliser dialysebrikkene på støtten med et enkelt- eller dobbeltsidig tape.
  2. In situ X-ray diffraksjon
    1. Samle røntgendiffraksjonsdata ved romtemperatur fra krystaller dyrket i proteinreservoaret. Bruk for eksempel røntgenstråler med en energi på 12.656 keV, en fluks på 3,32 x 1010 fotoner s-1 og en strålestørrelse på 250 x 250 μm2. Ta opp diffraksjonsbildene med en ADSC Quantum 315r-detektor med en matrise på 3 x 3 CCD for en aktiv overflate på oppløsning på 315 x 315 mm2 og 9,4 megapiksler.
      MERK: Diffraksjonsdataene for lysozymkrystallene som dyrkes på dialysebrikkene ble samlet inn ved BM30A-FIP-strålelinjen ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Strålestørrelsen, fluksen og detektortypen kan imidlertid være forskjellig i andre røntgenstrålingskilder. 3D-trykt støtte muliggjør datainnsamling med et vinkelområde på -40° til +40° rundt krystallen. Antall lysozymkrystaller eksponert for in situ datainnsamling, antall diffraksjonsmønstre samlet inn for hver krystall, svingningsvinkelområdet per eksponering og eksponeringstiden oppsummeres i tabell 2.
  3. Databehandling
    1. Behandle de fullstendige eller delvise datasettene med diffraksjonsmønstrene for lysozymkrys krystallene med XDS-programmet48.
    2. Generer HKL-filen for hvert datasett og skaler dem ved hjelp av XSCALE-programvaren48.
    3. Bruk molekylær erstatning med programmet Phaser av CPP4 suite49 og bestemme fasene for modellbygging. For dette trinnet, bruk de kjente 3D-koordinatene til lysozyme fra Protein Data Bank (PDB) oppføring 193L.
    4. Avgrens strukturen ved hjelp av Phenix52 og inspiser den endelige proteinmodellen ved hjelp av COOT50.

Representative Results

Mikrofluidiske chips utviklet av Junius et al.19,45 er kompatible for både on-chip protein krystallisering med mikrodialyse metoden og in situ X-ray diffraksjon datainnsamling ved romtemperatur. Bilder av mikrobrikkene, deres detaljerte design, de fluidiske kontaktene og RC dialysemembranen er illustrert i figur 2. Krystalliseringseksperimentene settes opp ved å pipe proteinprøven manuelt inn i proteinreservoaret og introdusere krystalliseringsløsningen i den lineære fluidiske kanalen med et automatisert trykkdrevet system eller sprøytepumpe eller manuelt ved hjelp av en sprøyte. Proteinreservoaret og den fluidiske kanalen kan skilles i figur 2A. Design for fabrikasjon av chips med henholdsvis 0,1 μL eller 0,3 μL maksimalt volum av proteinreservoaret er vist i figur 2A til venstre og høyre. Chips med en 0,2 μL eller 0,7 μL maksimal kapasitet for proteinprøven er vist andre steder19. Høydepunktet i protokollen for enheten fabrikasjon kan begrenses ned på bruk av foto uhelbredelig tiolen-basert harpiks NOA 81 innebygging kommersielt tilgjengelige RC dialysemembraner av ulike MWCOer. Under fabrikasjonen av mikrofluidiske enheter er den lineære fluidiske kanalen trykt på den nederste PDMS-formen (figur 1F), mens den øvre PDMS-formen bare består av de mønstrede pilarene for proteinreservoaret og innløps- og utløpsportene (figur 1F). Når NOA 81 er krysskoblet og PDMS-formene er fjernet fra enheten (figur 1K),er den fluidiske kanalen plassert på det nederste laget av mikrobrikken og proteinkanalen og innløps-/utløpsportene er plassert på begge lag. Figur 1L illustrerer en sidevisning skjematisk av dialysebrikken der alle lagene av enheten og deres respektive tykkelse er angitt. Høyden på mønstrene som er trykt på det nederste laget av sponene (fluidisk kanal) er ca. 45 μm, mens den totale høyden på innløps- og utløpsportene er ca. 90 μm. Proteinreservoaret (45 μm høyde) er også illustrert i figur 2D og 2E. Justeringen av de to lagene ble undersøkt under et optisk mikroskop, og delen av RC dialysemembranen innlemmet i mikrobrikken kan tydelig skilles i figur 2D. I samme figur har luft blitt fanget i den fluidiske kanalen under injeksjonen av krystalliseringsløsningen, som det kan ses i øvre venstre del av proteinreservoaret. Figur 2E er et nærbilde av proteinreservoaret etter manuell avsetning av proteindråpen med pipette og før innkapslingen av dråpen med et stykke PMMA og Kapton tape, som beskrevet i trinn 5.2 og 5.3 av protokollen. Den mikrofluidiske brikken klar til bruk til krystalliseringseksperimenter, etter innkapsling av proteinprøven og liming av de fluidiske kontaktene, er avbildet i figur 2C. Den lufttette enheten sikrer at lekkasjer ikke kan oppstå. De fluidiske kontaktene for innløps- og utløpsportene på den mikrofluidiske kanalen kan enten være de kommersielt tilgjengelige som beskrevet i trinn 4.1 i protokollen og vist i figur 2C,eller engangs laboratoriepipettespisser kan brukes til samme formål (figur 2B, protokolltrinn 4.4).

For fabrikasjon av mikrofluidiske chips ble optisk gjennomsiktige og biologisk inerte materialer valgt, noe som viser høy kompatibilitet for in situ X-ray diffraksjonseksperimenter ved romtemperatur. Interaksjonene mellom røntgenstråler, absorpsjon og spredning, med materialene som komponerer mikrofluidisk enhet og den omkringliggende atmosfæren (luft) genererer et signal kjent som bakgrunnsstøy. Denne støyen oppsummerer til diffraksjonssignalet til proteinkrys krystallene som er registrert av detektoren, forfaller signal-til-støy-forholdet og bør opprettholdes så lavt som mulig under innsamling av røntgendiffraksjonsdata. Vi har evaluert bakgrunnsstøyen som genereres av materialene som består av proteinreservoaret, som er i røntgenstrålens direkte bane. Proteinreservoaret består av RC dialysemembranen, Kapton-båndet og to PMMA-stykker, en som brukes som substrat for mikrobrikken og en som brukes til innkapsling av proteinprøven. Tykkelsen på PMMA er 2 x 175 μm, av Kapton tape 20 μm, og RC dialysemembranen er ca 40 μm tykk (figur 1L). Den totale tykkelsen på disse lagene er ca 410 μm og NOA 81-laget er ikke i den direkte røntgenbanen. Bortsett fra tykkelsen på fabrikasjonsmaterialene, er tettheten også avgjørende for å måle bakgrunnssprustende støy, da røntgensprusking øker med det elementære atomnummeret. Av denne grunn ble heliumfluks (en funksjon gitt ved BM30A-FIP ved ESRF) brukt i stedet for luft under datainnsamlingen for materialkarakterisering og for proteindiffraksjonseksperimenter. Figur 3C illustrerer bakgrunnsstøyen som genereres av Kapton-båndet, RC-dialysemembranen, PMMA-arket og deres montering i heliumatmosfære. Hvert materiale ble utsatt for 20 s til røntgenstråler på 0,98 Å bølgelengde og prøvedetektoravstanden var 200 mm. Eksperimentene ble utført ved BM30A-FIP-strålelinjen ved ESRF, som forklart i trinn 7 i protokollen. Diffuse ringer tilskrives samspillet mellom røntgenstrålen med materialene kan skilles for Kapton-båndet med en oppløsning lavere enn 4 Å, PMMA-arket mellom 4-8 Å og dialysemembranen mellom 4-5 Å-oppløsning. Bakgrunnsstøyen som genereres av dialysebrikken observeres hovedsakelig ved en oppløsning lavere enn 6 Å som ikke påvirker behandlingen av høyoppløselige diffraksjonsdata for de store lysozymkrys krystallene. Bakgrunnen spredning intensitet som en funksjon av oppløsningen for mikrobrikken og de separate materialene vises andre steder19. I målingen som presenteres i figur 3C,var dialysebrikken tom for enhver løsning (protein- eller bunnløsning) og bidraget fra tilstedeværelsen av løsning på bakgrunnsstøyen er ikke målt. Sjetongene ble montert foran røntgenstrålen med en 3D-trykt støtte (figur 3B) designet for in situ diffraksjonseksperimenter19. Den samme støtten med dimensjoner som tilsvarer dimensjonene til en 96-brønns/SBS-standard krystalliseringsplate, kan imidlertid brukes til å utføre 1 til 3 krystalliseringseksperimenter samtidig, da den kan holde opptil 3 sjetonger samtidig (figur 3A).

Eksperimenter ble utført for å evaluere effektiviteten av mikrofluidiske enheter for on-chip krystallisering av modellløselige proteiner med mikrodialysemetoden. Den fluidiske kanalen ble fylt som beskrevet i trinn 4 i protokollen, mens trinn 5 og 6 beskrev hvordan man innkapsler proteinprøven i det dedikerte proteinreservoaret og hvordan man setter opp krystalliseringseksperimentene. Figur 4 viser lysozymkrystaller dyrket ved 293 K under 1,5 M natriumklorid (NaCl) med 0,1 M natriumacetat (CH3COONa) pH 4,0 (A) og under 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5 med 30 % polyetylenglykol (PEG) 400 (B). Det lyofiliserte lysozympulveret ble oppløst i vann til en endelig konsentrasjon på ~30 mg ml-1 eller i 20 mM CH3COONa pH 4.2 buffer til en endelig konsentrasjon på henholdsvis ~20 mg ml-1 for forsøkene illustrert i henholdsvis figur 4A og 4B. Volumet av proteinprøven i begge forsøkene var ca. 0,3 μL og MWCO av RC dialysemembran innebygd i mikrobrikkene ligger i området 6-8 kDa. Lysozymkrystallene vist i figur 3A vokste innen 1 time og krystallene i figur 3B vokste innen 30 minutter fra begynnelsen av eksperimentet. Krystalliseringseksperimentene ble utført under statiske forhold. Det har imidlertid vistseg 19 at gjennomføring av forsøkene under flytende forhold gir mulighet til å dynamisk utveksle krystalliseringsforholdene og studiefasediagrammene, verifisere reversibilitetet til mikrodialysemetoden.

In situ Røntgendiffraksjonsdata fra lysozymkrystene vist i figur 4A ble samlet inn for å demonstrere egnetheten til dialysebrikkene for slike eksperimenter. Datainnsamlingen ble utført ved BM30A-FIP-strålelinje (ESRF) ved romtemperatur, som beskrevet i trinn 7.2.1 i protokollen. Mikrobrikkene ble montert ved strålelinjen ved hjelp av 3D-trykt støtte (figur 3B) og komplette røntgendiffraksjonsdatasett ble samlet inn fra to enkeltlysozymkrystaller dyrket på chip under forholdene gitt i den andre linjen i tabell 1. De observerte refleksjonene av datasettene ble behandlet, indeksert og integrert ved hjelp av XDS48, og molekylær utskifting og raffinement ble oppnådd ved hjelp av henholdsvis Phaser49 og Phenix52. Den krystallografiske statistikken for hele datasettet for hver lysozymkrystall og for sammenslåing av de to datasettene er gitt i tabell 2. For molekylær erstatning ble PDB-oppføringen 193L brukt.

Elektron tetthet kart fra en enkelt lysozyme krystall og det sammenslåtte datasettet av de to krystallene er oppnådd på 1,95 Å og 1,85 Å, og er illustrert i figur 5A og 5B. Begge kartene for elektrontetthet viser detaljert strukturell informasjon som kan oppnås ved in situ X-ray diffraction eksperimenter utført direkte på dialyse mikrobrikke ved romtemperatur fra en enkelt krystall eller fra flere krystaller, noe som gjør chips kompatibel for in situ X-ray krystallografi studier.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av dialysebrikkefabrikasjonen. (A) SU-8 harpiks deponeres på to silisiumwafers og spinbelagt. (B) En SU-8-mester er anskaffet etter bestrålende fotoresisten med UV-lys gjennom en fotomaske og utvikling av de ueksponerte delene. (C) PDMS dispenseres på SU-8-mestere og etter å ha blitt herdet ved 338 K i 1 t, (D) de 2 PDMS-formene produsert ved replikastøping og imprinting mikromønstrene skrelles av mesterne og (E) kuttes til riktig størrelse. PDMS-formene støttes på et glasssklie som omfatter RC-dialysemembranen mellom de to sentrale søylene. (G)De 2 PDMS-formene justeres deretter og uttørkes i ~ 30 min i et vakuumkammer. (H)NOA 81 harpiks helles mellom de to formene og (I) fyller rommet etter kapillæritet. (J) Etter første eksponering for UV-lys fjernes den nederste PDMS-formen og enheten deponeres på et PMMA-ark. (K) Den andre UV-eksponeringen følger for å fullstendig polymerisere NOA 81 harpiks og dialysebrikken er klar til bruk etter å ha fjernet den gjenværende øvre PDMS-formen. (L) Sidevisning skjematisk av dialysebrikken der alle lagene på enheten og deres respektive tykkelse er angitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2:Dialysebrikker som bygger inn en RC-dialysemembran for proteinkrystallisering på chip og in situ X-ray diffraksjonseksperimenter. (A) NOA 81 mikrobrikker på 175 μm tykt PMMA-substrat med et proteinreservoar på 0,1 μL (venstre) og 0,3 μL (høyre) nominell volum. (B)Mikrobrikker med pipettespisser som fluidiske kontakter limt på innløps- og utløpsportene på den fluidiske kanalen. (C) Bilde av en mikrobrikke under et krystalliseringseksperiment. Proteinprøven er innkapslet med et stykke 175 μm tykt PMMA-ark og Kapton tape. Peek Nanoport-kontakter brukes til innløps- og utløpsportene på den fluidiske kanalen. (D) Top view av proteinreservoaret under sirkulasjonen av krystalliseringsløsningen i den fluidiske kanalen. Luft er fanget i den øvre delen av reservoaret rett under RC dialysemembranen, som tydelig kan oppdages. (E) Toppvisning av dialysereservoaret gjennom et optisk mikroskop under avsetning av proteinprøven. Proteindråpen deponeres rett over den innebygde RC dialysemembranen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3:Den 3D-trykte støtten (A) for mikrobrikkene som brukes under krystalliseringseksperimenter og (B) montert foran røntgenstrålen ved BM30A-FIP-strålelinjen ved ESRF for in situ X-ray diffraksjonseksperimenter. (C) Bakgrunnsstøy generert av samspillet mellom røntgenstråler med Kapton, RC dialysemembran, PMMA og dialysebrikken (fra venstre til høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Krystallisering av lysozym med mikrodialysemetoden på chipen. (A) Lysozyme (~ 30 mg ml-1) krystaller dyrket on-chip under 1,5 M NaCl og 0,1 M CH3COONa pH 4.0 og (B) lysozyme (~ 20 mg ml-1) krystaller dyrket under krystalliseringsforhold som inneholder 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5, og 30 % PEG 400. Begge eksperimentene ble utført på 293 K. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Kart over elektrontetthet av den raffinerte lysozymstrukturen fra (A) en enkelt krystall og (B) det sammenslåtte datasettet med to krystaller dyrket på chip via mikroanalyse. Kartene ble innhentet på henholdsvis 1,95 Å og 1,84 Å, konturert på 1 0. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protein Proteinkonsentrasjon
(mg ml-1)		 Protein bufffer Innledende konsentrasjon av
precipitant løsning		 MWCO av RC
dialysemembran
(kDa)		 Temperatur
(K)
Lysozyme - 30.00.2015 Vann 1.5 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,0		 6 - 8 293
Lysozyme ~ 20 ( 20 ) 20 mM CH3COONa pH 4,2 1 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,5
30 % PEG 400		 6 - 8 293

Tabell 1: Sammensetningen av proteinbufferen og den utløsende løsningen for krystallisering av lysozym med mikrodialysemetoden. Lysozyme krystaller dyrket på chip med forholdene i den andre linjen ble brukt til in situ X-ray diffraksjon datainnsamling.

Protein Lysozyme Lysozyme Lysozyme
Antall krystaller 1 1 2
Antall diffraksjonsrammer 40 30 70
Oscillasjon (°) per eksponering 1 1
Eksponeringstid (er) 30 30
Temperatur (K) 293 293 293
Romgruppe P43212 P43212 P43212
Parametere for enhetsceller 78.86 78.86 37.87
90.0 90.0 90.0		 79.17 79.17 37.95
90.0 90.0 90.0		 78.47 78.47 37.65
90.0 90.0 90.0
Oppløsningsområde (Å) 27.31 - 1.95
(2.02 - 1.95)		 27.39 - 1.96
(2.03 - 1.96)		 27.17 - 1.85
(1.91 - 1.85)
Mosaikk (°) 0.319 0.121
Totale refleksjoner (observert) 25127 (3552) 19991 (3001)
Unike refleksjoner (observert) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975)
Rødudancy 2.90 (2.61) 2.41 (2.27)
Fullstendighet (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15)
Mener jeg/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7
CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0
R-fusjon 0.184
R-meas 0.139 0.221 0.219
R-pim 0.116
Refleksjoner som brukes i raffinement 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965)
Refleksjoner som brukes til R-free 864 (78) 846 (85) 1039 (96)
R-arbeid 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102)
R-fri 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703)
Antall ikke-hydrogenatomer 1069 1071 1096
makromolekyler 1012 1012 1012
Vann 55 57 82
Ligand 2 2 2
Proteinrester 131 131 131
Rms (obligasjoner, Å) 0.008 0.009 0.005
Rms (vinkler, °) 1.17 1.26 1.05
Ramachandran favoriserte (%) 98.43 97.64 99.21
Ramachandran tillatt (%) 1.57 2.36 0.79
Ramachandran outliers (%) 0.00 0.00 0.00
Avegare B-faktor 34.26 28.54 24.34
Protein 33.94 28.14 23.62
Vann 40.23 35.57 33.16
ligands 33.23 29.63 24.77

Tabell 2: Datainnsamlingsparametere, krystallografisk og raffinementstatistikk for lysozymkrystaller dyrket på chip via mikroanalysemetoden. Verdiene i parentes tilsvarer skallet med høyeste oppløsning. Den fjerde kolonnen tilsvarer verdier som er oppnådd etter sammenslåing av datasettene for den andre og tredje kolonnen.

Discussion

En mikrofluidisk enhet er utviklet for on-chip proteinkrystallisering med mikrodialysemetoden og in situ X-ray diffraction eksperimenter ved romtemperatur. NOA 81 chips integrere RC dialyse membraner av noen MWCO for å bruke mikrodialyse for on-chip protein krystallisering kan fremstilles. Fabrikasjonsmaterialer med relativt høy røntgengjennomsiktighet ble brukt, noe som gjorde sjetongene kompatible for in situ proteinkrystallografi. Fabrikasjonsmaterialene som komponerer rommet for proteinkrystallisering av enheten (PMMA, Kapton, RC dialysemembran) ble evaluert for å generere lav bakgrunnsstøy. Spesielt observeres bakgrunnsstøyen som genereres av dialysebrikken hovedsakelig ved lav oppløsning (> 6 Å) og påvirker ikke behandlingen av høyoppløselige diffraksjonsdata av de store lysozymkrystallene som kreves for bestemmelse av proteinstruktur. Automatiseringen av datainnsamlingen forsterkes ved hjelp av en 3D-trykt støtte som kan monteres direkte i makromolekylære krystallografistrålelinjer og bære opptil tre mikrobrikker samtidig. På denne måten unngås manuell høsting og manipulering av de skjøre proteinkrys krystallene. Videre foregår datainnsamlingen ved romtemperatur, og unngår behovet for kryobeskyttelse som kan være relatert til konformasjonsendringer fra den innfødte proteinstrukturen2,3.

Bruken av mikroanalyse som en metode for å dyrke krystaller på brikken gjør det mulig å nøyaktig overvåke og kontrollere krystalliseringsprosessen. Som diskutert i innledningen, de fleste av de konvensjonelle protein krystallisering metoder har blitt implementert ved hjelp av mikrofluidiskeenheter 11,14. Fordelene med dialyse for proteinkrystallisering hadde imidlertid ennå ikke blitt fullt utnyttet på mikroskalaen. On-chip mikroanalyse gir mulighet til å studere fasediagrammer og utføre screening og optimalisering av krystalliseringsforhold med samme proteinprøve19. For prototypene som presenteres i dette arbeidet, er proteinforbruket per chip begrenset ned til 0,1 eller 0,3 μL. Basert på det eksperimentelle arbeidet så langt, kommer de mest kritiske trinnene i protokollen ikke fra chipsfabrikasjonsprosedyren, men fra krystalliseringsprosessen. Fabrikasjonsprotokollen inneholder mange trinn, men det er enkelt og muliggjør fabrikasjon av mange enheter (20 til 30 chips) på en enkelt dag i det rene rommet, med relativt rimelige materialer. Imidlertid kan krystallisering av proteiner på chip være en delikat prosedyre på grunn av den iboende stokastiske natur kjernering og krystallvekst, spesielt i mikroskalaen. En case-studie er beskrevet, hvor veletablerte forhold ble brukt til krystallisering av lysozym som ga robuste, veldefinerte krystaller egnet for in situ X-ray diffraksjon datainnsamling. Likevel kan det oppstå vanskeligheter ved bruk av mer utfordrende proteinmål, som membranproteiner, hvor krystalliseringsmediet er mye mer komplisert, fasediagrammer er ikke kjente og velfnende krystalliseringsforhold er ennå ikke godt etablert. Dialysebrikken gir mulighet til å overgå disse vanskelighetene og studere fasediagrammene på chip, uten å kaste den verdifulle og ofte kostbare proteinprøven, ved bare å utveksle krystalliseringsløsningen i mikrofluidisk kanal.

Allsidigheten til mikrofluidiske enheter stammer fra å utnytte mikrodialyse for on-chip proteinkrystallisering for å reversibelt kontrollere krystalliseringsforhold og kartkonsentrasjon og temperatur varierte fasediagrammer ved hjelp av lavt proteinvolum. Videre er enheten kompatibel med in situ X-ray diffraksjon eksperimenter og prototyping av enhetene er billig og rask. Tallrike, isomorfe krystaller av løselige og membranproteiner (i forberedelse) kan dyrkes på chip, og det forventes at alle disse funksjonene kan benyttes til serielle røntgenkrystallografistudier av utfordrende proteinmål ved synchrotron og XFEL-anlegg. Til slutt, utføre on-chip og in situ tid-løst studier er en fremtidig mulighet som kan være av betydelig interesse for det krystallografiske samfunnet. Derfor, ved å dyrke krystaller på dialysebrikken og introdusere reagensene i mikrofluidkanalen, enten manuelt (ved hjelp av en sprøyte) eller automatisk (med et trykkkontrollvæskesystem eller en sprøytepumpe), vil fremtidig innsats fokusere på å bevise at mikrofluidiske chips kan brukes til å utløse tidsløste eksperimenter på synchrotron beamlines.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

MBS anerkjenner støtte fra MI / CNRS under kontrakten Instrumentering på grensene 2014-2015. NJ anerkjenner CEA's International Doctoral Research Program (Irtelis) for PhD Fellowship. MBS og SJ anerkjenner støtte fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale nummer 722687. MBS, SJ og NJ takker LIPhy (UGA) for det rene romet for mikrofabrikasjonseksperimenter. IBS anerkjenner integrering i Det tverrfaglige forskningsinstituttet i Grenoble (IRIG, CEA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garman, E. F. Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 339-351 (2010).
  2. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  3. Fraser, J. S., et al. Accessing protein conformational ensembles using room-temperature X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16247-16252 (2011).
  4. Gotthard, G., et al. Specific radiation damage is a lesser concern at room temperature. IUCrJ. 6 (4), 665-680 (2019).
  5. Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 32-47 (2016).
  6. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal X-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  7. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, 73-78 (2011).
  8. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Science Reports. 4, 6026 (2014).
  9. Pawate, A. S., et al. Towards time-resolved serial crystallography in a microfluidic device. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology Communications. 71, 823-830 (2015).
  10. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  11. Leng, J., Salmon, J. -B. Microfluidic crystallization. Lab on a Chip. 9, 24-34 (2009).
  12. Morel, M., Galas, J. -C., Dahan, M., Studer, V. Concentration landscape generators for shear free dynamic chemical stimulation. Lab on a Chip. 12, 1340-1346 (2012).
  13. Miralles, V., Huerre, A., Malloggi, F., Jullien, M. -C. A review of heating and temperature control in microfluidic systems: techniques and applications. Diagnostics. 3, 33-67 (2013).
  14. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: from crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4, 032202 (2017).
  15. Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14431-14436 (2004).
  16. Laval, P., Lisai, N., Salmon, J. -B., Joanicot, M. A microfluidic device based on droplet storage for screening solubility diagrams. Lab on a Chip. 7, 829-834 (2007).
  17. Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. Journal of the American Chemical Society. 129, 8825-8835 (2007).
  18. Selimovic, S., Gobeaux, F., Fraden, S. Mapping and manipulating temperature-concentration phase diagrams using microfluidics. Lab on a Chip. 10, 1696-1699 (2010).
  19. Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20, 296-310 (2020).
  20. Greaves, E. D., Manz, A. Towards on-chip X-ray analysis. Lab on a Chip. 5, 382-391 (2005).
  21. Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9, 1412-1421 (2009).
  22. Guha, S., Perry, S. L., Pawate, A. S., Kenis, P. J. A. Fabrication of X-ray compatible microfluidic platforms for protein crystallization. Sensors and Actuators B. Chemical. 174, 1-9 (2012).
  23. Sui, S., et al. Graphene-based microfluidics for serial crystallography. Lab on a Chip. 16, 3082-3096 (2016).
  24. Russo Krauss, I., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Science. 14, 11643-11691 (2013).
  25. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 70, 2-20 (2014).
  26. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A droplet-based, composite PDMS/Glass capillary microfluidic system for evaluating protein crystallization conditions by microbatch and vapor-diffusion methods with on-chip X-ray diffraction. Angewandte Chemie. 43, International Edition in English 2508-2511 (2004).
  27. Talreja, S., Kim, D. Y., Mirarefi, A. Y., Zukoski, C. F., Kenis, P. J. A. Screening and optimization of protein crystallization conditions through gradual evaporation using anovel crystallization platform. Journal of Applied Crystallography. 38, 988-995 (2005).
  28. Hansen, C. L., Classen, S., Berger, J. M., Quake, S. R. A microfluidic device for kinetic optimization of protein crystallization and in situ structure determination. Journal of American Chemical Society. 128, 3142-3143 (2006).
  29. Schieferstein, J. M., et al. X-ray Transparent microfluidic platforms for membrane protein crystallization with microseeds. Lab on a Chip. 18, 944-954 (2018).
  30. Ghazal, A., et al. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab on a Chip. 16, 4263-4295 (2016).
  31. Li, L., Ismagilov, R. F. Protein crystallization using microfluidic technologies based on valves, droplets, and SlipChip. Annual Review of Biophysics. 39, 139-158 (2010).
  32. Du, W., Li, L., Nichols, K. P., Ismagilov, R. F. SlipChip. Lab on a Chip. 9, 2286-2292 (2009).
  33. Zhang, S., et al. Microfluidic platform for optimization of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 472, 18-28 (2017).
  34. Abdallah, B. G., et al. Protein crystallization in an actuated microfluidic nanowell device. Crystal Growth & Design. 16, 2074-2082 (2016).
  35. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 406-412 (2019).
  36. de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6, 454-464 (2019).
  37. Shim, J. -U., Cristobal, G., Link, D. R., Thorsen, T., Fraden, S. Using microfluidics to decouple nucleation and growth of protein crystals. Crystal Growth & Design. 7, 2192-2194 (2007).
  38. de Jong, J., Lammertink, R. G. H., Wessling, M. Membranes and microfluidics: a review. Lab on a Chip. 6, 1125-1139 (2006).
  39. Paustian, J. S., Nery Azevedo, R., Lundin, S. T. B., Gilkey, M. J., Squires, T. M. Microfluidic microdialysis: spatiotemporal control over solution microenvironments using integrated hydrogel membrane microwindows. Physical Review X. 3, 041010 (2013).
  40. Kornreich, M., Heymann, M., Fraden, S., Beck, R. Cross polarization compatible dialysis chip. Lab on a Chip. 14, 3700-3704 (2014).
  41. Song, S., Singh, A. K., Shepodd, T. J., Kirby, B. J. Microchip dialysis of proteins using in situ photopatterned nanoporous polymer membranes. Analytical Chemistry. 76, 2367-2373 (2004).
  42. Skou, M., Skou, S., Jensen, T. G., Vestergaard, B., Gillilan, R. E. In situ microfluidic dialysis for biological small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47, 1355-1366 (2014).
  43. Zou, L., et al. A multistage dialysis microdevice for extraction of cryoprotectants. Biomedical Microdevices. 19, 30 (2017).
  44. Satya Eswari, J., Naik, S. A critical analysis on various technologies and functionalized materials for manufacturing dialysis membranes. Materials Science for Energy Technologies. 3, 116-126 (2020).
  45. Spano, M., Salmon, J. -B., Junius, N. FR3044685A1. UJF. , (2015).
  46. Bartolo, D., Degre, G., Nghe, P., Studer, V. Microfluidic stickers. Lab on a Chip. 8, 274-279 (2008).
  47. Junius, N., et al. A crystallization apparatus for temperature controlled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  48. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 125-132 (2010).
  49. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and developments of COOT. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  51. Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semipermeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20, 3927-3936 (2020).
  52. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  53. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28, 153-184 (1998).
  54. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  55. Baxter, E. L., et al. High-density grids for efficient data collection from multiple crystals. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 72, 2-11 (2016).
  56. Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An all-in-one sample holder for macromolecular X-ray crystallography with minimal background scattering. Journal of Visualized Experiments. (149), e59722 (2019).

Tags

Kjemi utgave 170 mikrofluidier proteinkrystallisering på chip in situ X-ray diffraksjon mikrodialysekrystallisering seriell krystallografi fasediagrammer dialysebrikke
Krystallisering av proteiner på chip ved mikroanalyse for <i>In Situ</i> X-ray Diffraction Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaho, S., Junius, N., Borel, F.,… More

Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J. B., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter