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Chemistry

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

Published: April 11, 2021 doi: 10.3791/61660
Automatic Translation
1, 1,3, 1, 1, 2, 1
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258, Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

Este artigo detalha o protocolo de fabricação de chips microfluidos desenvolvidos para cristalização de proteínas on-chip com o método de diálise e experimentos de difração de raios-X in situ. O processo de microfabização permite integrar uma membrana de diálise regenerada de celulose regenese semipermável com qualquer corte de peso molecular, entre duas camadas do chip.

Abstract

Este protocolo descreve a fabricação de dispositivos microfluidos reprodutíveis e baratos que cobrem todo o gasoduto para cristalizar proteínas on-chip com o método de diálise e permitir experimentos de cristalização monoclímdica ou serial in situ a temperatura ambiente. O protocolo detalha o processo de fabricação dos microchips, a manipulação dos experimentos de cristalização on-chip e o tratamento dos dados de difração de raios-X coletados in situ para a elucidação estrutural da amostra de proteína. A principal característica deste procedimento de microfabização está na integração de uma membrana de diálise regenerada e regenerada comercialmente disponível entre duas camadas do chip. O corte de peso molecular da membrana incorporada varia dependendo do peso molecular da macromolécula e dos precipitantes. O dispositivo explora as vantagens da tecnologia microfluida, como o uso de volumes minuciosos de amostras (<1 μL) e ajuste fino sobre fenômenos de transporte. O chip juntou-os ao método de diálise, fornecendo controle preciso e reversível sobre o processo de cristalização e pode ser usado para investigar diagramas de fase de proteínas na escala de microliter. O dispositivo é padronizado usando uma resina fotocurável à base de tianoeno com litografia de impressão suave em um substrato polimérico opticamente transparente. Além disso, a dispersão de fundo dos materiais que compõem os microchips e a geração de ruído de fundo foi avaliada tornando o chip compatível para experimentos de difração de raios-X in situ. Uma vez que os cristais proteicos são cultivados no chip até um tamanho adequado e uniformidade populacional, os microchips podem ser montados diretamente em frente ao feixe de raios-X com o auxílio de um suporte impresso em 3D. Essa abordagem aborda os desafios que se elevam com o uso de crioprotetores e a colheita manual em experimentos convencionais de cristalografia de proteínas por meio de uma maneira fácil e barata. Os conjuntos completos de dados de difração de raios-X de múltiplos cristais de liseozúfofos cultivados no chip foram coletados à temperatura ambiente para determinação da estrutura.

Introduction

Elucidar a estrutura tridimensional (3D) das macromoléculas biológicas é uma busca incessante na biologia estrutural onde a cristalografia de raios-X continua sendo a principal técnica de investigação. Aplicado para desvendar os detalhes estruturais de macromoléculas complexas, como proteínas, tem como objetivo facilitar a compreensão de seus mecanismos de atuação e seu envolvimento em diversas funções biológicas. Poderosas fontes de raios-X em síncrotrons e lasers de elétrons livres de raios-X (XFELs) fornecem todas as ferramentas necessárias para uma visão mais profunda da estrutura das proteínas em resolução quase atômica. Apesar das vantagens que vêm junto com o uso de raios-X para estudos estruturais, há limitações intrínsecas à radiação de raios-X e ao processo de cristalização em si. Os danos causados pelo alto fluxo de raios-X e longos tempos de exposição do cristal de proteína na frente do feixe de raios-X são parâmetros restritivos que os cristalógrafos têm que superar usando resfriamento criogênico1. No entanto, encontrar as condições ideais de criocoolização pode ser trabalhoso, uma vez que mudanças conformais da estrutura proteica nativa ou artefatos podem ser ocultadas2,3. Além disso, estudos recentes indicam que a realização de experimentos de difração à temperatura ambiente leva a menores danos específicos à radiação4. Outro gargalo na biologia estrutural é a aquisição de cristais bem difundidos com tamanho suficiente5. Cristais pequenos são mais fáceis de produzir, especialmente no caso de proteínas de membrana, mas são mais suscetíveis a danos de radiação mesmo sob condições criocooling porque uma alta dose de radiação deve ser direcionada em um volume menor em comparação com o caso de cristais de proteína maiores6. A nova abordagem da cristalografia serial7,8 em síncrotrons e XFELs pode contornar as restrições de danos à radiação e, ao mesmo tempo, explorar cristais menores (200 nm a 2 μm)7 mesclando conjuntos de dados de múltiplos, isomorfos e cristais proteicos orientados aleatoriamente e lucrando com os avanços tecnológicos associados, como pulsos de femtosegundo, tempos de exposição mais curtos e feixes de raios-X microfoques5,7,9,10.

A tecnologia microfluidica é valiosa para a cristalografia de raios-X, exibindo múltiplas vantagens para a cristalização das macromoléculas biológicas e sua investigação estrutural. A realização de experimentos de cristalização em dispositivos microfluidos requer pequenos volumes de amostra de proteína, restringindo assim o custo de produção dessas macromoléculas biomoleculas de alto valor e facilitando a triagem e otimização de alto rendimento de inúmeras condições de cristalização. Além disso, a proporção inerente de área-volume de superfície grande na escala microfluitária e fenômenos de transporte limitados à difusão permitem um controle fino sobre fluxos e gradientes de temperatura ou concentração11,12,13,14, tornando dispositivos microfluidos adequados para o cultivo uniforme de cristais e explorando diagramas de fase15,16,17,18,19. Além disso, as ferramentas microfluidas apresentam um potencial distinto para enfrentar outro obstáculo na cristalografia proteica, que é a entrega da amostra, e a necessidade de manusear e colher cristais proteicos antes de seu uso para experimentos de difração de raios-X. O método de cristalografia de raios-X on-chip e in situ elimina a manipulação de cristal e a potencial deterioração da qualidade do cristal antes da coleta de dados. Uma ampla gama de chips microfluídicos compatíveis para a cristalografia de proteína de raios-X in situ foram projetados, desenvolvidos e testados por muitos grupos de pesquisa que confrontam as restrições relacionadas decorrentes da natureza dos materiais de microfabricação e suas interações com raios-X14,19,20,21,22,23. Os materiais de fabricação devem ser opticamente transparentes, biologicamente inertes e demonstrar alta transparência à radiação de raios-X e uma ótima relação sinal-ruído durante a coleta de dados.

A maioria dos métodos de cristalização aplicada na cristalografia de proteínas convencionais24,25 também foram implementados na escala microfluidica11,14 para a cristalização de chips e na análise de difração de raios-X in situ. Aparelho microfluido simples, híbrido ou multicamadas incorporando difusão de vapor26, evaporação27,difusão de interface livre (FID)28,microbatch26, ou mesmo semeadura29 foram usados para cristalizar proteínas solúveis e membranas. A triagem de alto rendimento e a otimização das condições de cristalização podem ser alcançadas30,31 em32bem-base,33baseados em gotículas ou34 dispositivos acionados por válvulas. In situ Experimentos de difração de raios-X de alvos proteicos desafiadores à temperatura ambiente foram realizados em microchips fabricados a partir de diversos materiais como PDMS (polidimtilsiloxano), COC (copolímero olefina cíclico), PMMA (poli (metil metil))21,2 2,26,28,29, filmes de grafeno23, Kapton35, cola epóxi6, ou NOA (Adesivo Óptico Norland)19 e a transparência dos materiais para a radiação de raios-X e sua contribuição para o ruído de fundo foram avaliadas. Além disso, os microchips foram projetados para acoplar as estratégias de coleta de dados em série em uma única ferramenta para experimentos de cristalografia de proteínas de raios-X nas fontes síncrotrons23,35,36 e XFELs7.

A coleta de dados in situ em temperatura ambiente também foi implementada em vários métodos de entrega e dispositivos. Por exemplo, Nogly et al.54 usaram um injetor de fase cúbica lipídica (LCP) para estudar a estrutura da bomba de fótons acionada pela luz bacteriorhodopsin (bR) por cristalografia femtosegundo serial (SFX) usando uma fonte XFEL. A estrutura cristalina de bR foi resolvida à resolução de 2,3 Å, demonstrando a compatibilidade de um injetor LCP com cristalografia de femtosegundo serial resolvida pelo tempo (TR-SFX). Baxter et al.55 projetaram uma rede multi-cristal de alta densidade, fabricada por um plástico de policarbonato de 100 ou 200 μm de espessura com orifícios cortados a laser de vários tamanhos. Uma outra filme de policarbonato de 5 μm de espessura pode ser fixada em um lado da grade ao usar o dispositivo para experimentos de cristalização sentado ou suspenso. Esta rede de alta densidade pode ser usada de várias maneiras, pois os cristais podem ser carregados diretamente nas portas do dispositivo ou cristais podem ser cultivados no dispositivo por difusão de vapor ou pelo método LCP. Além disso, a rede pode ser ajustada em uma base magnética padrão e usada para a coleta de dados de raios-X in situ em condições criogênicas ou de temperatura ambiente. Mais recentemente, Feiler et al.56 desenvolveram um suporte de amostra para cristalografia de raios-X in situ in situ a temperatura criogênica e ambiente com mínima contribuição de ruído de fundo. Especificamente, o suporte é composto por um suporte plástico, uma folha de COC transparente e uma folha de poliimida estruturada microporosa. Foi projetado para substituir os slides de cobertura comumente usados para configurar gotas de cristalização, permitindo manipulação no local, como imersão de ligante, formação complexa e proteção criogênica sem abrir a gota de cristalização ou manusear manualmente os cristais. Além disso, o suporte da amostra pode ser removido da placa de cristalização e colocado em uma base magnética para coleta de dados in situ em linhas de feixe padrão à base de goniômetro. Para a coleta de dados de temperatura ambiente, a folha COC é removida antes do experimento e apenas a folha de poliípulo de 21 μm de espessura contribui para a dispersão de fundo, que neste caso é mínima. Esses exemplos compõem apenas uma pequena fração da pesquisa em curso e a multiplicidade de microchips versáteis desenvolvidos para cristalografia proteica de raios-X.

No entanto, o método de cristalização da proteína da diálise não foi amplamente incorporado dentro dos microfluidos. A diálise é um método baseado em difusão que visa o equilíbrio da concentração precipitante através de uma membrana semipermese, a fim de abordar a concentração nominal para cristalização proteica e permite o controle preciso e reversível sobre as condições de cristalização24. O Corte de Peso Molecular (MWCO) da membrana de diálise semi-permeável pode ser escolhido dependendo do peso molecular da macromolécula e dos precipitantes para permitir a difusão de pequenas moléculas precipitantes, mantendo a macromolécula de interesse. Devido à reversibilidade do processo de diálise, ele pode ser usado em combinação com o controle de temperatura para desacoplar e otimizar a nucleação e o crescimento de cristal independentemente37 para investigar diagramas de fase alterando a concentração precipitante enquanto usa a mesma amostra de proteína. A integração das membranas em microfluidos é revisada por de Jong et al.38 e os estudos de caso em biologia implantando diálise em microchips podem ser listados principalmente em aplicações de preparação, concentração ou filtragem da amostra39,40,41,42 ou estudos relacionados com células43,44. A pervaporação por PDMS foi utilizada por Shim et al.37 para estudar a nucleação e o crescimento da xilanase em várias condições. A água permeou a membrana PDMS de 15 μm de espessura no reservatório de proteínas do dispositivo microfluido, alterando posteriormente a proteína e a concentração precipitante.

O protocolo desenvolvido por Junius et al.19,45 para a fabricação de um chip microfluido compatível tanto para cristalização de proteínas on-chip via microdiálise quanto em experimentos de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente é apresentado. O protocolo para a fabricação do dispositivo é diretamente inspirado no pioneirismo realizado por Studer e colegas de trabalho12,46 para adesivos micro-padronizados de resina foto-curável à base de tianolene NOA 81 incorporando membranas comercialmente disponíveis, usando litografia de impressão suave. Uma modificação inovadora do método resultou em microchips que permitem o uso de microdiálise para monitorar e controlar com precisão os parâmetros experimentais para o crescimento on-chip de cristais proteicos e explorar simultaneamente as vantagens dos microfluidos, como a redução do consumo de amostras de proteína por experimento (<1 μL). Em um trabalho anterior, foram demonstrados os princípios da diálise aplicados a um sistema de macroes escala (volume típico >20 μL) paratriagem e otimização das condições de cristalização por meio do mapeamento de diagramas de fase de concentração de temperatura-precipitante. Neste trabalho, é descrito um protocolo para a produção de microchips de diálise incorporando membranas de dirálise regenerada (RC) de diferentes MWCO, a fim de realizar ensaios de cristalização no chip e na coleta de dados de difração de raios-X. Os materiais que compõem os microchips foram avaliados por sua transparência aos raios-X19 e os dispositivos podem ser colocados diretamente em frente ao feixe de raios-X para experimentos de difração de temperatura ambiente in situ, excluindo o manuseio manual e minimizando a degradação de cristais proteicos frágeis. Em um estudo de caso, os cristais de lisezina branca de galinha foram cultivados no chip por meio de microdiálise gerando uma população de tamanho uniforme. O microchip foi então montado em frente ao feixe de raios-X com um suporte impresso em 3D19 e conjuntos de dados de difração in situ foram coletados à temperatura ambiente a partir de múltiplos cristais isomorfos, demonstrando o alto potencial e relevância dos chips para estudos de cristalografia serial síncrotron de alvos macromoleculares desafiadores.

Protocol

1. Design de máscaras e fabricação mestre

  1. Desenhe as geometrias desejadas do dispositivo microfluido usando qualquer software de desenho vetorial. Para cada camada do fotoresist que será usada para o próximo passo da fotolitografia, prepare uma máscara individual: uma máscara delineada com canais e pilares e uma máscara contendo apenas os pilares.
  2. Traduza os arquivos CIF gerados pelo software de desenho em máscaras de filme. Isso pode ser feito através de serviços comerciais. Exija a fotomask apropriada dependendo da escolha do fotoresist usado durante a fotolitografia.
    NOTA: Para o fotoresist SU-8, peça máscaras com características pretas em um fundo transparente. SU-8 é um fotoresist negativo à base de epóxi, o que significa que durante a exposição à luz UV (365 nm) as partes expostas ao UV são interligadas enquanto as demais permanecem solúveis. Assim, todos os padrões pretos na máscara não serão cruzados pela luz UV durante a fotolitografia. Canais e pilares serão gravados nos mestres.
  3. Prepare dois mestres em wafers de silício para o design de cada chip por fotolitografia usando fotoresist negativo SU-8.
    NOTA: As etapas 1.3.1-1.3.7 são realizadas em uma sala limpa. As etapas descritas abaixo são as etapas tradicionais da fotolitografia seguidas da litografia suave do PDMS, que são descritas em muitos livros didáticos. Todos os valores dos parâmetros experimentais (fotoresist, duração do tempo, temperatura, etc.) dependem de muitos parâmetros sutis e devem ser otimizados dependendo dos diferentes aparelhos utilizados.
    1. Use um wafer de silício de 3 polegadas e trate a superfície com plasma para 90 s, a fim de facilitar a deposição e fixação do fotoresist SU-8.
    2. Despeje cerca de 3 mL de SU-8 resista no meio do wafer e gire o SU-8 até a espessura desejada(Figura 1A). Para 50 μm de espessura nominal, use SU-8 3050 e spin coat para 10 s a 500 rpm e sucessivamente para 30 s a 3500 rpm. Leve asse o fotoresist de uma placa quente por 15 minutos a 368 K, a fim de ser parcialmente solidificado, permitindo que o solvente contido na resina evapore e evite que ele grude na máscara fotográfica. Depois, deixe o wafer em temperatura ambiente por 2 minutos.
    3. Exponha o fotoresistista à luz UV(Figura 1B). Use um alinhador de máscaras com um poder de 35 mW cm-2 e 8 s tempo de exposição.
    4. Prossiga com o cozimento pós-exposição. Coloque o wafer em uma placa quente por 5 min a 368 K para completar a fotoreação invocada pela exposição UV.
    5. Remova toda a resistência SU-8 que não foi cruzada colocando o wafer em um banho contendo acetato de éter de propilenoglicol (PGMEA) e mexa por 15 minutos. Enxágüe o wafer com isopropanol até que não se observem precipitações embaçadas. Seque o wafer com gás nitrogênio e armazene-o em uma placa de Petri (tamanho padrão de 100 mm x 15 mm).
    6. Trate a superfície do wafer com um silano, a fim de facilitar o descolamento de polidimtilsiloxano (PDMS) que será usado para fabricar 2 selos. Deposite o wafer em uma placa quente batida em 368 K por 10 minutos sob a atmosfera de vapor de hexametiledisilazane (HMDS).
      NOTA: Se retirar o PDMS do wafer se tornar difícil após vários usos, a superfície do wafer deve ser tratada novamente com vapor HMDS.
    7. O primeiro mestre contendo os canais e os pilares está pronto. Repita estas etapas e prepare a padronização do segundo mestre apenas os pilares.
      NOTA: Durante a fotolitografia, o objetivo é obter as geometrias do dispositivo nos mestres SU-8 com uma altura de 50 μm. No entanto, uma vez que os dois mestres SU-8 são fabricados, meça a altura das geometrias gravadas nos mestres com um perfil para adquirir o valor experimental. O valor medido para ambos os mestres SU-8 fabricados para este protocolo é de aproximadamente 45 μm.

2. Fabricação de moldes PDMS

NOTA: As seguintes etapas do protocolo podem ser realizadas em qualquer laboratório, desde que um capô de fluxo laminar seja usado, a luz amarela na sala é usada ao trabalhar com a resina NOA 81 (etapas 3.6-3.11) e uma fonte de luz UV está disponível para polimerizar a resina NOA 81 (passos 3.7 e 3.11).

  1. Prepare 50 g de base de silicone PDMS e seu agente de cura em uma proporção de massa de 10:1.
  2. Misture ambos os ingredientes em um béquer com uma espátula e coloque a mistura em uma câmara de vácuo para remover todas as bolhas de ar.
  3. Despeje 25 g do PDMS pré-misturado no mestre SU-8 (armazenado em uma placa de Petri) padronizando os canais e os pilares até uma altura de aproximadamente 5 mm. Despeje os 25 g restantes do PDMS na segunda padronização mestre SU-8 apenas os pilares até uma altura de aproximadamente 5 mm(Figura 1C).
  4. Coloque as placas de Petri em um forno e cure as camadas PDMS a 338 K por 1h.
  5. Corte a camada PDMS curada em torno dos padrões dos mestres SU-8 com um bisturi e retire suavemente os moldes PDMS dos mestres(Figura 1D).
    NOTA: O procedimento descrito acima, chamado de moldagem de réplica, está sendo frequentemente usado para preparar moldes de PDMS que serão anexados a superfícies de vidro e farão parte de um dispositivo microfluido53. Neste protocolo, os moldes PDMS não fazem parte do chip, mas são usados como intermediários para a fabricação do chip. Para cada desenho, 2 moldes PDMS são preparados a partir dos respectivos mestres SU-8 (Figuras 1D e 1E) e serão usados em conformidade (conforme descrito abaixo) para a fabricação do microchip.

3. Fabricação de chip de diálise

  1. Coloque o molde PDMS padronizando os canais e pilares em uma lâmina de vidro de microscópio rígido (3 x 1 in. tamanho padrão) com os padrões voltados para cima(Figura 1F). O pilar central que corresponde ao reservatório de proteínas excede verticalmente em 45 μm da superfície horizontal do molde PDMS.
  2. Corte e separe um pedaço seco da membrana de diálise de celulose regenerada (RC) e deposite-a no pilar central do molde PDMS, que é suportado na lâmina de vidro(Figura 1F).
    NOTA: A membrana de diálise RC está comercialmente disponível, e o corte de peso molecular (MWCO) é escolhido em conformidade com o peso molecular da proteína em estudo e os precipitantes utilizados. O tamanho da peça da membrana de diálise RC depende do desenho do chip. Neste protocolo, 2 protótipos são projetados onde o volume do reservatório de proteínas é de 0,1 ou 0,3 μL. Nestes casos, o tamanho da peça da membrana de diálise é 2 x 2 mm2 ou 4 x 4 mm2, respectivamente.
  3. Coloque o segundo molde PDMS padronizando apenas os pilares voltados para baixo em cima do molde PDMS suportado na lâmina de vidro(Figura 1F). O pilar central deste molde corresponde ao reservatório de proteínas e excede verticalmente (voltado para baixo) em 45 μm da superfície horizontal.
  4. Alinhe os pilares centrais dos moldes 2 PDMS. A membrana de diálise RC é "sanduíche" entre os 2 moldes PDMS(Figura 1G).
    NOTA: O alinhamento entre as microestruturas dos 2 moldes PDMS pode ser realizado visualmente, sem qualquer equipamento extra. Caso contrário, essa manipulação pode ser alcançada sob um microscópio. Uma pequena mudança entre os reservatórios não é problemática, desde que o canal fluido e os pontos de entrada ou saída não estejam totalmente cobertos.
  5. Dessecar a montagem por 30 minutos em uma câmara de vácuo para remover todas as bolhas de ar presas nos moldes PDMS e promover a inserção da resina durante o próximo passo da fabricação.
    NOTA: Os moldes de 2 PDMS são mantidos no lugar pela adesão PDMS-PDMS e nenhuma pressão extra ou outra forma de ligação temporária é necessária.
  6. Preencha o espaço vazio entre os moldes 2 PDMS com a resina fotocurável à base de tialene NOA 81 por imbibição capilar(Figura 1H e 1I).
  7. Cure a resina por exposição à luz UV (365 nm) para 8 s usando uma lâmpada UV colidida (potência de 35 mW cm-2).
    NOTA: Esta primeira exposição permite que a resina NOA 81 seja parcialmente interligada, uma vez que uma fina camada de NOA 81 em contato com os moldes PDMS em ambos os lados permanece sem correção.
  8. Corte o excesso de NOA 81 dos lados externos dos moldes PDMS com um bisturi.
  9. Remova o molde PDMS superior com o NOA 81 parcialmente cruzado preso sobre ele a partir do molde PDMS inferior e do slide de vidro.
  10. Corte uma folha pmma de 175 μm de espessura nas dimensões padrão de um deslizamento de vidro microscópio (3 x 1 polegadas) e retire as folhas de proteção de plástico de cada lado da peça PMMA. Pressione suavemente a montagem do molde PDMS superior e o NOA 81 parcialmente curado na peça PMMA(Figura 1J).
  11. Cure novamente NOA 81 por exposição à luz UV para 60 s e remova o molde PDMS superior(Figura 1K). A resina adere ao substrato PMMA sem qualquer tratamento adicional.
    NOTA: Os moldes PDMS podem ser reutilizados aproximadamente até 5 vezes depois de lavá-los com isopropanol e acetona, desde que os moldes não estejam dobrados. A membrana de diálise RC é incorporada ao adesivo NOA 81 e não é necessária mais manipulação ou fixação mecânica.

4. Conectores fluidos

NOTA: O desenho do chip microfluido consiste em um canal fluido linear para a solução de cristalização e um reservatório central para a amostra de proteína (reservatório de proteínas), ambos mostrados a partir de uma visão superior de dois microchips na Figura 2A. Uma membrana de diálise RC é incorporada entre essas duas microestruturas (Figura 2D) e o processo de cristalização evolui enquanto precipitantes da solução de cristalização difundem através da membrana devido a um gradiente de concentração entre os dois compartimentos do chip que são separados pela membrana. O canal microfluido está impresso no molde PDMS inferior(Figura 1F). Uma vez concluído o protocolo de fabricação dos chips, o canal linear está localizado na camada inferior do adesivo NOA 81 em contato com o substrato PMMA, como mostrado na Figura 1K. Uma entrada e um ponto de acesso de saída para a solução de cristalização estão localizados em cada extremidade do canal linear e parecem buracos (altura total de 90 μm) como pode ser visto na Figura 2A. Para o manuseio da solução de cristalização, os conectores devem ser adicionados nos pontos de acesso.

  1. Conectores de ligação que estão disponíveis comercialmente (NanoPort) na entrada e saída do canal microfluido com cola epóxi rápida(Figura 2C).
  2. Escolha o diâmetro apropriado dos tubos PTFE com base no tamanho dos conectores. Os tubos PTFE serão utilizados para a introdução da solução de cristalização no canal fluido do chip.
    NOTA: Os kits disponíveis comercialmente são recomendados para controle fácil e preciso sobre a taxa de fluxo e geralmente são combinados com sistemas automatizados de pressão ou controlados por fluxo (bombas de seringa) para mistura e manuseio de fluidos. No entanto, a solução de cristalização pode ser introduzida manualmente no canal linear com uma seringa plástica descartável. Neste caso, sugerem-se as etapas 4.3 a 4.5.
  3. Encha uma seringa descartável de 1 mL com a solução de cristalização. Para os chips apresentados neste protocolo, 400 μL é suficiente para preencher todo o canal fluido.
  4. Corte duas pontas de pipeta para que o diâmetro da ponta de um lado seja igual ao diâmetro interno do tubo PTFE que será usado para o manuseio da solução. Cole as pontas cropped nos pontos de acesso do canal com cola rápida epóxi(Figura 2B).
  5. Conecte a seringa com as pontas cortadas com um pedaço de tubo PTFE do tamanho apropriado e introduza a solução dentro do canal empurrando constantemente o êmbolo da seringa lentamente.

5. Encapsulamento de proteína

NOTA: O padrão do chip dedicado a ser usado como reservatório de proteínas permanece até agora aberto à atmosfera. O protocolo a seguir é proposto para limitar cuidadosamente a amostra de proteína dentro do chip microfluido.

  1. Pipeta manualmente uma gota da amostra de proteína dentro do reservatório de proteínas, localizada bem na membrana de diálise RC, conforme ilustrado na Figura 2E. O volume da amostra de proteína varia de acordo com o desenho do chip e pode ser de 0,1 ou 0,3 μL.
  2. Aplique uma fina camada de graxa de silicone de alto vácuo ao redor do reservatório de proteínas.
  3. Corte um pequeno pedaço de uma folha pmma de 175 μm de espessura e coloque-a suavemente acima da fina camada da graxa de silicone. A peça pmma deve cobrir toda a superfície do reservatório de proteínas onde a solução proteica é depositada.
    NOTA: A graxa de silicone é usada para melhorar o aperto de ar e evitar a propagação da gotícula de proteína. Não há ligação ou vedação entre a peça PMMA usada para cobrir o reservatório de proteínas e o adesivo NOA 81. O contato entre eles é uma interface sólida/sólida. A fim de produzir uma vedação geral e um encapsulamento de ar apertado da amostra de proteína, um pedaço de fita Kapton é usado como descrito na etapa 5.4.
    NOTA: Às vezes é difícil limitar a amostra de proteína dentro da cavidade dedicada do dispositivo (reservatório de proteína) quando um sistema movido a pressão é usado para a introdução da solução de cristalização dentro do canal fluido (passo 6.4). Para evitar o problema mencionado acima, valores de pressão relativamente baixos devem ser mantidos enquanto circulam a solução de cristalização. Uma pressão de injeção de 20-60 mbar para soluções aquosas ou 50-150 mbar para soluções mais viscosas (PEGs, glicerol) é sugerida19.
  4. Corte um pedaço de fita Kapton (20 μm de espessura) grande o suficiente para cobrir a peça PMMA definida acima do reservatório de proteínas e para ficar no chip NOA em todas as bordas. A amostra de proteína é encapsulada dentro do reservatório e o chip está pronto para ser usado para o experimento de cristalização, como mostra a Figura 2C.
    NOTA: Os chips podem ser reutilizados várias vezes, desde que a membrana de diálise e a adesão de NOA no substrato PMMA não sejam deteriorados. Se essas partes do chip estiverem danificadas, são observados vazamentos verificando se o dispositivo não pode mais ser usado. Lavar os chips depende da solução de cristalização. No caso de soluções de baixa viscosidade (sais, tampões), o canal fluido pode ser lavado apenas introduzindo água destilada e deixá-la fluir por alguns minutos. 400 μL é o volume necessário para trocar completamente uma solução dentro do canal com outra solução. No caso de soluções mais viscosas (PEGs, glicerol), reutilizar os chips não é recomendado, uma vez que lavar o canal apenas com água não é suficiente. A parte superior do chip, onde está localizado o reservatório de proteínas, também pode ser lavada com água destilada e seca com ar pressurizado.

6. Cristalização da proteína on-chip

  1. Pese em pó de lisezina branca de ovo de galinha e dissolva-se em água destilada para obter uma concentração final de 30 mg mL-1.
  2. Filtre a solução proteica através de um filtro de 0,22 μm e centrífuga por 5 min na velocidade mais alta a 293 K para remover todas as partículas sólidas. Use o supernatante para o experimento de cristalização.
  3. Prepare 500 μL de solução de cristalização contendo o tampão e o precipitante nas concentrações fornecidas na Tabela 1. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm.
  4. Injete a solução no ponto de entrada do chip com uma seringa ou um sistema fluido automatizado movido a pressão ou uma bomba de seringa, conforme descrito nas etapas 4.1-4.5.
    NOTA: O experimento de cristalização pode ocorrer sob condição estática, se o canal microfluido estiver preenchido com a solução de cristalização e ser deixado de lado, ou em condições de fluxo, se for continuamente injetado dentro do canal a uma taxa de fluxo constante. Para este último caso, recomenda-se o uso de um sistema externo movido a pressão ou bomba de seringa. A realização do experimento em condições de fluxo também proporciona a possibilidade de trocar dinamicamente soluções de cristalização dentro do canal fluido. Assim, vários experimentos podem ser realizados usando a mesma amostra de proteína.
  5. Uma vez que o canal fluido esteja preenchido com a solução de cristalização, sele as portas de entrada e saída do chip com fita parafilm.
  6. Pipeta o volume adequado da solução proteica dentro do reservatório de proteínas e encapsula a amostra de proteína, conforme descrito nas etapas 5.1-5.4.
  7. Armazene o chip a 293 K.
    NOTA: A cristalização via diálise segue uma trajetória cinética diferente dos experimentos realizados com o método de difusão de vapor ou cristalização em lote e depende profundamente da natureza das moléculas precipitantes envolvidas no processo de difusão, de acordo com dados medidos51, e pode levar mais tempo para o início da nucleação. Para evitar a evaporação, se houver, durante este período, coloque o chip em uma atmosfera saturada de umidade a 293 K.

7. Em difusão de raios-X in situ e on-chip

  1. Suporte impresso em 3D para linhas de vigas
    1. Imprima o suporte que pode transportar até três chips simultaneamente. As dimensões do suporte são as mesmas das dimensões das placas de cristalização comercial (padrão 96 bem/SBS) compatíveis com experimentos de difração de raios-X da placa.
      NOTA: A impressão do suporte pode ser atribuída a serviços comerciais. O suporte foi projetado usando um software de design 3D-CAD e é mostrado na Figura 3A durante experimentos de cristalização de proteínas on-chip e na Figura 3B durante a coleta de dados de difração de raios-X in situ no BM30A-FIP (ESRF).
    2. Estabilize os chips de diálise no suporte com uma fita de lado único ou duplo.
  2. In situ Difração de raios-X
    1. Colete dados de difração de raios-X à temperatura ambiente de cristais cultivados no reservatório de proteínas. Por exemplo, use raios-X com uma energia de 12.656 keV, um fluxo de 3,32 x 1010 fótons s-1 e um tamanho de feixe de 250 x 250 μm2. Registo as imagens de difração com um detector ADSC Quantum 315r com uma matriz de 3 x 3 CCD para uma superfície ativa de resolução de 315 x 315 mm2 e 9,4 mega pixels.
      NOTA: Os dados de difração dos cristais de lise cultivadas nos chips de diálise foram coletados na linha de luz BM30A-FIP no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). No entanto, o tamanho do feixe, o fluxo e o tipo de detector podem ser diferentes em outras fontes de radiação de raios-X. O suporte impresso em 3D permite a coleta de dados com uma faixa angular de -40° a +40° ao redor do cristal. O número de cristais de liseoziça expostos para coleta de dados in situ, o número dos padrões de difração coletados para cada cristal, a faixa de ângulo de oscilação por exposição e o tempo de exposição são resumidos na Tabela 2.
  3. Tratamento de dados
    1. Processe os conjuntos de dados completos ou parciais com os padrões de difração para os cristais de lisezímica com o programa XDS48.
    2. Gere o arquivo HKL para cada conjunto de dados e dimensione-os usando o software XSCALE48.
    3. Use a substituição molecular com o programa Phaser da suíte CPP449 e determine as fases para a construção do modelo. Para esta etapa, utilize as coordenadas 3D conhecidas de lysozyme da entrada 193L do Protein Data Bank (PDB).
    4. Refine a estrutura usando Phenix52 e inspecione o modelo final de proteína usando COOT50.

Representative Results

Os chips microfluidos desenvolvidos por Junius et al.19,45 são compatíveis tanto para cristalização de proteínas on-chip com o método de microdiálise quanto na coleta de dados de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. Fotos dos microchips, seu design detalhado, os conectores fluidos e a membrana de diálise RC são ilustrados na Figura 2. Os experimentos de cristalização são configurados, canalizando manualmente a amostra de proteína diretamente no reservatório de proteínas e introduzindo a solução de cristalização no canal fluido linear com um sistema automatizado movido a pressão ou bomba de seringa ou manualmente com o auxílio de uma seringa. O reservatório de proteínas e o canal fluido podem ser distinguidos na Figura 2A. Os desenhos para fabricação de chips com volume máximo de 0,1 μL ou 0,3 μL do reservatório de proteínas são mostrados na Figura 2A à esquerda e à direita, respectivamente. Os chips com capacidade máxima de 0,2 μL ou 0,7 μL para a amostra de proteína são mostrados em outros lugares19. O destaque do protocolo para a fabricação do dispositivo pode ser reduzido sobre o uso da resina fotocurável à base de tianolene NOA 81 incorporando membranas de diálise RC disponíveis comercialmente de vários MWCOs. Durante a fabricação dos dispositivos microfluidos, o canal fluido linear é impresso no molde PDMS inferior(Figura 1F),enquanto o molde PDMS superior consiste apenas dos pilares padronizados para o reservatório de proteínas e as portas de entrada e saída(Figura 1F). Uma vez que o NOA 81 é interligado e os moldes PDMS são removidos do conjunto (Figura 1K),o canal fluido está localizado na camada inferior do microchip e o canal de proteína e portas de entrada/saída estão localizados em ambas as camadas. A Figura 1L ilustra um esquema de visão lateral do chip de diálise onde todas as camadas do dispositivo e sua respectiva espessura são indicadas. A altura dos padrões impressos na camada inferior dos chips (canal fluido) é de aproximadamente 45 μm, enquanto a altura total das portas de entrada e saída é de aproximadamente 90 μm. O reservatório de proteínas (45 μm de altura) também é ilustrado nas Figuras 2D e 2E. O alinhamento das duas camadas foi investigado sob um microscópio óptico e a peça da membrana de diálise RC incorporada dentro do microchip pode ser claramente distinguida na Figura 2D. Na mesma figura, o ar foi preso dentro do canal fluido durante a injeção da solução de cristalização, como pode ser visto na parte superior esquerda do reservatório de proteínas. Figura 2E é uma fotografia de close-up do reservatório de proteína após a deposição manual da gotícula de proteína com uma pipeta e antes do encapsulamento da gotícula com um pedaço de fita PMMA e Kapton, conforme descrito nas etapas 5.2 e 5.3 do protocolo. O chip microfluido pronto para ser usado para experimentos de cristalização, após o encapsulamento da amostra de proteína e a colagem dos conectores fluidos, é retratado na Figura 2C. O conjunto de ar apertado garante que vazamentos não podem ocorrer. Os conectores fluidos para as portas de entrada e saída do canal microfluido podem ser os disponíveis comercialmente conforme descrito na etapa 4.1 do protocolo e mostrados na Figura 2C, ou dicas descartáveis de pipeta de laboratório podem ser usadas para o mesmo propósito (Figura 2B, protocolo passo 4.4).

Para a fabricação dos chips microfluidos, foram escolhidos materiais opticamente transparentes e biologicamente inertes, demonstrando alta compatibilidade para experimentos de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. As interações de raios-X, absorção e dispersão, com os materiais que compõem o dispositivo microfluido e a atmosfera circundante (ar) geram um sinal conhecido como ruído de fundo. Este ruído soma-se ao sinal de difração dos cristais de proteína registrados pelo detector, deteriorando a relação sinal-ruído e deve ser mantido o mais baixo possível durante a coleta de dados de difração de raios-X. Avaliamos o ruído de fundo gerado pelos materiais que compõem o reservatório de proteínas, que está no caminho direto do raio-X. O reservatório de proteínas consiste na membrana de diálise RC, na fita Kapton e em duas peças de PMMA, uma usada como substrato para o microchip e outra para o encapsulamento da amostra de proteína. A espessura do PMMA é de 2 x 175 μm, da fita Kapton 20 μm, e a membrana de diálise RC tem aproximadamente 40 μm de espessura(Figura 1L). A espessura total dessas camadas é de cerca de 410 μm e a camada NOA 81 não está no caminho de raios-X diretos. Além da espessura dos materiais de fabricação, sua densidade também é crucial para medir o ruído de dispersão de fundo, à medida que a dispersão de raios-X aumenta com o número atômico elementar. Por essa razão, o fluxo de hélio (recurso fornecido no BM30A-FIP na ESRF) foi utilizado em vez de ar durante a coleta de dados para caracterização de materiais e para experimentos de difração proteica. A Figura 3C ilustra o ruído de fundo gerado pela fita Kapton, a membrana de diálise RC, a folha pmma e sua montagem na atmosfera de hélio. Cada material foi exposto por raios-X de 20 a 0,98 Å e a distância do detector de amostras foi de 200 mm. Os experimentos foram realizados na linha BM30A-FIP da ESRF, conforme explicado na etapa 7 do protocolo. Anéis difusos atribuídos às interações do feixe de raios-X com os materiais podem ser distinguidos para a fita Kapton em uma resolução inferior a 4 Å, a folha pmma entre 4-8 Å, e a membrana de diálise entre resolução de 4-5 Å. O ruído de fundo gerado pelo chip de diálise é observado principalmente em uma resolução inferior a 6 Å que não afeta o tratamento de dados de difração de alta resolução dos cristais de grande lise. A intensidade de dispersão de fundo em função da resolução do microchip e dos materiais separados são mostradas em outros lugares19. Na medição apresentada na Figura 3C,o chip de diálise estava vazio de qualquer solução (solução proteica ou precipitante) e a contribuição da presença de solução para o ruído de fundo não foi medida. Os chips foram montados em frente ao feixe de raios-X com um suporte impresso em 3D (Figura 3B)projetado para experimentos de difração in situ 19. No entanto, o mesmo suporte com dimensões iguais às dimensões de uma placa de cristalização padrão 96-well/SBS, pode ser usado para realizar experimentos de cristalização de 1 a 3 simultaneamente, pois pode conter até 3 chips simultaneamente(Figura 3A).

Foram realizados experimentos para avaliar a eficiência dos dispositivos microfluidos para a cristalização on-chip de proteínas solúveis do modelo com o método de microdiálise. O canal fluido foi preenchido conforme descrito na etapa 4 do protocolo, enquanto as etapas 5 e 6 descreveram como encapsular a amostra de proteína dentro do reservatório de proteínas dedicado e como configurar os experimentos de cristalização. A Figura 4 mostra cristais de lisezúno cultivados a 293 K sob cloreto de sódio de 1,5 M (NaCl) com acetato de sódio de 0,1 M (CH3COONa) pH 4.0(A) e abaixo de 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4.5 com 30% de polietileno glicol (PEG) 400 (B). O pó de liosozimos liofilizado foi dissolvido em água para uma concentração final de ~30 mg mL-1 ou em 20 mM CH3COONa pH 4.2 tampão para uma concentração final de ~20 mg mL-1 para os experimentos ilustrados nas Figuras 4A e 4B,respectivamente. O volume da amostra de proteína em ambos os experimentos foi de cerca de 0,3 μL e o MWCO da membrana de diálise RC incorporada dentro dos microchips está na faixa de 6-8 kDa. Os cristais de lisezúmola mostrados na Figura 3A cresceram dentro de 1h e os cristais na Figura 3B cresceram dentro de 30 minutos a partir do início do experimento. Os experimentos de cristalização foram realizados em condições estáticas. No entanto, foi demonstrado19 que a realização dos experimentos em condições de fluxo proporciona a possibilidade de trocar dinamicamente as condições de cristalização e estudar diagramas de fase, verificando a reversibilidade do método de microdiálise.

In situ Os dados de difração de raios-X dos cristais de liseze mostrados na Figura 4A foram coletados para demonstrar a adequação dos chips de diálise para tais experimentos. A coleta de dados foi realizada na linha BM30A-FIP (ESRF) à temperatura ambiente, conforme descrito na etapa 7.2.1 do protocolo. Os microchips foram montados na linha de luz com o auxílio do suporte impresso em 3D(Figura 3B)e conjuntos completos de dados de difração de raios-X foram coletados de dois cristais de lisezúmen únicos cultivados no chip sob as condições dadas na segunda linha da Tabela 1. As reflexões observadas dos conjuntos de dados foram processadas, indexadas e integradas por meio do XDS48 e a substituição molecular e refinamento foram realizadas utilizando Phaser49 e Phenix52, respectivamente. As estatísticas cristalográficas para o conjunto completo de dados de cada cristal de lysozyme e para a fusão dos dois conjuntos de dados são fornecidas na Tabela 2. Para a substituição molecular, utilizou-se a entrada PDB 193L.

Mapas de densidade eletrônica de um único cristal de lise e o conjunto de dados mesclados dos dois cristais foram obtidos a 1,95 Å e 1,85 Å, respectivamente, e são ilustrados nas Figuras 5A e 5B. Ambos os mapas de densidade de elétrons mostram informações estruturais detalhadas que podem ser obtidas por experimentos de difração de raios-X in situ realizados diretamente no microchip de diálise à temperatura ambiente a partir de um único cristal ou de vários cristais, tornando os chips compatíveis para estudos de cristalografia de raios-X in situ.

Figure 1
Figura 1: Ilustração esquemática da fabricação do chip de diálise. (A) A resina SU-8 é depositada em dois wafers de silício e revestida de spin. (B) Um mestre SU-8 é adquirido após irradiar o fotoresist com luz UV através de uma máscara fotográfica e desenvolver as partes não expostas. (C) PDMS é dispensado sobre os mestres SU-8 e depois de curado a 338 K por 1 h, (D) os 2 moldes PDMS produzidos pela moldagem e impressão dos micro-padrões são descascados dos mestres e(E) cortados ao tamanho apropriado. (F) Os moldes PDMS são suportados em uma lâmina de vidro que incorpora a membrana de diálise RC entre os dois pilares centrais. (G) Os moldes 2 PDMS são então alinhados e dessecados por ~30 min em uma câmara de vácuo. (H) A resina NOA 81 é derramada entre os dois moldes e (I) preenche o espaço por capilaridade. (J) Após a primeira exposição à luz UV, o molde PDMS inferior é removido e o conjunto é depositado em uma folha pmma. (K) A segunda exposição uv segue-se para polimerizar totalmente a resina NOA 81 e o chip de diálise está pronto para uso depois de remover o molde PDMS superior restante. (L) Esquema de visão lateral do chip de diálise onde todas as camadas do dispositivo e sua respectiva espessura são indicadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Chips de diálise incorporando uma membrana de diálise RC para cristalização de proteínas on-chip e experimentos de difração de raios-X in situ. (A) NOA 81 microchips em 175 μm de espessura substrato PMMA com um reservatório proteico de 0,1 μL (esquerda) e 0,3 μL (direita) volume nominal. (B) Microchips com pontas de pipeta como conectores fluidos colados nas portas de entrada e saída do canal fluido. (C) Imagem de um microchip durante um experimento de cristalização. A amostra de proteína é encapsulada com um pedaço de folha pmma de 175 μm de espessura e fita Kapton. Os conectores Peek Nanoport são usados para as portas de entrada e saída do canal fluido. (D) Vista superior do reservatório de proteínas durante a circulação da solução de cristalização dentro do canal fluido. O ar está preso na parte superior do reservatório bem sob a membrana de diálise RC, que pode ser claramente detectada. (E) Vista superior do reservatório de diálise através de um microscópio óptico durante a deposição da amostra de proteína. A gotícula de proteína é depositada logo acima da membrana de diálise RC incorporada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: O suporte impresso em 3D (A) para os microchips utilizados durante experimentos de cristalização e (B) montado em frente ao feixe de raios-X na linha de feixe BM30A-FIP no ESRF para experimentos in situ de difração de raios-X. (C) Ruído de fundo gerado pela interação dos raios-X com Kapton, membrana de diálise RC, PMMA e o chip de diálise (da esquerda para a direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Cristalização on-chip de lise com o método de microdiálise. (A) Lysozyme (~30 mg mL-1) cristais cultivados no chip sob 1,5 M NaCl e 0,1 M CH3COONa pH 4.0 e (B) lysozyme (~20 mg mL-1) cristais cultivados sob condições de cristalização contendo 1 M NaCl, 0.1 M CH3COONa pH 4.5, e 30% PEG 400. Ambos os experimentos foram realizados a 293 K. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Mapas de densidade eletrônica da estrutura de lysozyme refinada a partir de (A) um único cristal e (B) o conjunto de dados mesclados de dois cristais cultivados no chip via microdiálise. Os mapas foram obtidos a 1,95 Å e 1,84 Å, respectivamente, contornados em 1σ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

proteína Concentração de proteínas
(mg mL-1)		 Bufffer de proteínas Concentração inicial de
solução precipitante		 MWCO de RC
membrana de diálise
(kDa)		 temperatura
(K)
lisozima ~ 30 Água 1,5 M NaCl
0.1 M CH3COONa pH 4.0		 6 - 8 293
lisozima ~ 20 20 mM CH3COONa pH 4.2 1 M NaCl
0.1 M CH3COONa pH 4.5
30% PEG 400		 6 - 8 293

Tabela 1: Composição do tampão proteico e da solução precipitante para cristalização on-chip de lysozyme com o método de microdiálise. Os cristais de lisezúmia cultivados no chip com as condições fornecidas na segunda linha foram utilizados para a coleta de dados de difração de raios-X in situ.

proteína lisozima lisozima lisozima
Número de cristais 1 1 2
Número de quadros de difração 40 30 70
Oscilação (°) por exposição 1 1
Tempo de exposição (s) 30 30
Temperatura (K) 293 293 293
Grupo espacial P43212 P43212 P43212
Parâmetros de células unitárias 78.86 78.86 37.87
90.0 90.0 90.0		 79.17 79.17 37.95
90.0 90.0 90.0		 78.47 78.47 37.65
90.0 90.0 90.0
Faixa de resolução (Å) 27.31 - 1.95
(2.02 - 1.95)		 27.39 - 1.96
(2.03 - 1.96)		 27.17 - 1.85
(1.91 - 1.85)
Mosaicidade (°) 0.319 0.121
Reflexões totais (observadas) 25127 (3552) 19991 (3001)
Reflexões únicas (observadas) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975)
Redudência 2.90 (2.61) 2.41 (2.27)
Completude (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15)
Quero dizer, σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7
CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0
R-mesclagem 0.184
R-meas 0.139 0.221 0.219
R-pim 0.116
Reflexões usadas no refinamento 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965)
Reflexões usadas para r-free 864 (78) 846 (85) 1039 (96)
R-work 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102)
Sem R 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703)
Número de átomos não-hidrogênio 1069 1071 1096
Macromoléculas 1012 1012 1012
Água 55 57 82
ligante 2 2 2
Resíduos proteicos 131 131 131
Rms (títulos, Å) 0.008 0.009 0.005
Rms (ângulos, °) 1.17 1.26 1.05
Ramachandran favorecido (%) 98.43 97.64 99.21
Ramachandran permitido (%) 1.57 2.36 0.79
Ramachandran outliers (%) 0.00 0.00 0.00
Fator B de Avegare 34.26 28.54 24.34
proteína 33.94 28.14 23.62
Água 40.23 35.57 33.16
Ligands 33.23 29.63 24.77

Tabela 2: Parâmetros de coleta de dados, estatísticas cristalográficas e de refinamento de cristais de lise cultivadas no chip através do método de microdiálise. Os valores fornecidos entre parênteses correspondem à concha de maior resolução. A quarta coluna corresponde aos valores obtidos após a fusão dos conjuntos de dados da segunda e terceira coluna.

Discussion

Um dispositivo microfluido foi desenvolvido para cristalização de proteínas on-chip com o método de microdiálise e experimentos de difração de raios-X in situ à temperatura ambiente. Os chips NOA 81 que integram as membranas de diálise RC de qualquer MWCO, a fim de usar microdiálise para cristalização de proteínas on-chip podem ser fabricados. Foram utilizados materiais de fabricação com uma transparência relativamente alta de raios-X, tornando os chips compatíveis para a cristalografia de proteína in situ. Os materiais de fabricação que compõem o compartimento para cristalização proteica do dispositivo (PMMA, Kapton, membrana diálise RC) foram avaliados para gerar baixo ruído de fundo. Especificamente, o ruído de fundo gerado pelo chip de diálise é observado principalmente em baixa resolução (> 6 Å) e não afeta o tratamento de dados de difração de alta resolução dos cristais de grande liseina necessários para a determinação da estrutura proteica. A automação da coleta de dados é amplificada usando um suporte impresso em 3D que pode ser montado diretamente em linhas de cristalografia macromolecular e transportar até três microchips simultaneamente. Dessa forma, evita-se a colheita manual e a manipulação dos frágeis cristais proteicos. Além disso, a coleta de dados ocorre à temperatura ambiente, evitando a necessidade de crioproteção que possa estar relacionada a alterações conformais da estrutura proteica nativa2,3.

O uso da microdiálise como método para cultivar cristais no chip permite monitorar e controlar com precisão o processo de cristalização. Como discutido na introdução, a maioria dos métodos convencionais de cristalização de proteínas foram implementados utilizando dispositivos microfluidos11,14. No entanto, as vantagens da diálise para a cristalização proteica ainda não haviam sido totalmente exploradas na microescala. A microdiálise on-chip oferece a possibilidade de estudar diagramas de fase e realizar a triagem e otimização de condições de cristalização com a mesma amostra de proteína19. Para os protótipos apresentados neste trabalho, o consumo de proteína por chip é limitado a 0,1 ou 0,3 μL. Com base no trabalho experimental até agora, as etapas mais críticas do protocolo não derivam do procedimento de fabricação dos chips, mas do processo de cristalização. O protocolo de fabricação inclui muitas etapas, mas é simples e permite a fabricação de inúmeros dispositivos (20 a 30 chips) em um único dia na sala limpa, com materiais relativamente baratos. No entanto, a cristalização on-chip de proteínas pode ser um procedimento delicado devido à natureza estocástica intrínseca da nucleação e do crescimento cristalino, especialmente na microescala. Foi descrito um estudo de caso, onde foram utilizadas condições bem estabelecidas para a cristalização da lise que produziu cristais robustos e bem definidos adequados para a coleta de dados de difração de raios-X in situ. No entanto, as dificuldades podem surgir com o uso de alvos proteicos mais desafiadores, como as proteínas de membrana, onde o meio de cristalização é muito mais complicado, os diagramas de fase não são conhecidos e as condições de cristalização bem trabalhadas ainda não estão bem estabelecidas. O chip de diálise oferece a possibilidade de superar essas dificuldades e estudar diagramas de fase on-chip, sem descartar a valiosa e frequentemente cara amostra de proteína, apenas trocando a solução de cristalização dentro do canal microfluido.

A versatilidade dos dispositivos microfluidos decorre da exploração da microdiálise para cristalização de proteínas on-chip, a fim de controlar reversivelmente as condições de cristalização e a concentração do mapa e os diagramas de fase variadas usando baixo volume de proteína. Além disso, o dispositivo é compatível com experimentos de difração de raios-X in situ e a prototipagem dos dispositivos é barata e rápida. Numerosos cristais isomorfos de proteínas solúveis e membranas (em preparação) podem ser cultivados on-chip e espera-se que todas essas características possam ser utilizadas para estudos de cristalografia de raios-X em série de alvos proteicos desafiadores em instalações síncrotrons e XFEL. Finalmente, realizar estudos on-chip e in situ tempo-resolvidos é uma possibilidade futura que poderia ser de interesse significativo para a comunidade cristalográfica. Portanto, ao cultivar cristais no chip de diálise e introduzir os reagentes no canal microfluido, manualmente (usando uma seringa) ou automaticamente (com um sistema de fluido de controle de pressão ou uma bomba de seringa), os esforços futuros se concentrarão em provar que os chips microfluidos podem ser usados com sucesso para desencadear experimentos resolvidos com o tempo em linhas de raios síncrotrons.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

A MBS reconhece o suporte do MI/CNRS sob o contrato Instrumentação nos limites 2014-2015. NJ reconhece o Programa Internacional de Pesquisa de Doutorado (Irtelis) do CEA para a Bolsa de Doutorado. A MBS e a SJ reconhecem o financiamento do Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do acordo de subvenção de Marie Skłodowska-Curie número 722687. MBS, SJ e NJ agradecem à LIPhy (UGA) pelo estabelecimento de salas limpas para experimentos de microfabização. O IBS reconhece a integração ao Instituto de Pesquisa Interdisciplinar de Grenoble (IRIG, CEA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker

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References

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Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X <i>in situ</i>
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Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J. B., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).

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