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Chemistry

Cristallisation des protéines sur puce par microdialyse pour les études in situ sur la diffraction des rayons X

Published: April 11, 2021 doi: 10.3791/61660
Automatic Translation
1, 1,3, 1, 1, 2, 1
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258, Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

Cet article détaille le protocole de fabrication des puces microfluidiques développées pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de dialyse et les expériences in situ de diffraction des rayons X. Le processus de microfabrication permet d'intégrer une membrane de dialyse à cellulose régénérée semi-perméable avec n'importe quel coupure de poids moléculaire, entre deux couches de la puce.

Abstract

Ce protocole décrit la fabrication d'appareils microfluidiques reproductibles et peu coûteux couvrant l'ensemble du pipeline pour cristalliser les protéines sur puce avec la méthode de dialyse et permettre des expériences de cristallographie in situ à cristaux simples ou en série à température ambiante. Le protocole détaille le processus de fabrication des puces, la manipulation des expériences de cristallisation sur puce et le traitement des données in situ recueillies sur la diffraction des rayons X pour l'élucidation structurelle de l'échantillon protéique. La principale caractéristique de cette procédure de microfabrication réside dans l'intégration d'une membrane de dialyse à cellulose régénérée semi-perméable disponible dans le commerce entre deux couches de la puce. La coupure de poids moléculaire de la membrane intégrée varie en fonction du poids moléculaire de la macromolécule et des précipités. L'appareil exploite les avantages de la technologie microfluidique, comme l'utilisation de volumes infimes d'échantillons (<1 μL) et l'accordage fin sur les phénomènes de transport. La puce les a couplés avec la méthode de dialyse, fournissant un contrôle précis et réversible sur le processus de cristallisation et peut être utilisé pour étudier les diagrammes de phase des protéines à l'échelle du microlitre. L'appareil est modelé à l'aide d'une résine à base de thiolene photocurable avec lithographie à empreinte douce sur un substrat polymérique optiquement transparent. En outre, la diffusion en arrière-plan des matériaux composant les puces et générant du bruit de fond a été évaluée rendant la puce compatible pour les expériences in situ de diffraction des rayons X. Une fois que les cristaux protéiques sont cultivés sur puce jusqu'à une taille adéquate et l'uniformité de la population, les puces peuvent être directement montés en face du faisceau de rayons X à l'aide d'un support imprimé en 3D. Cette approche répond aux défis qui se lèvent de l'utilisation de cryoprotecteurs et de la récolte manuelle dans les expériences conventionnelles de cristallographie protéique d'une manière facile et peu coûteuse. Des ensembles complets de données de diffraction des rayons X provenant de cristaux de lysozyme multiples et isomorphes cultivés sur puce ont été recueillis à température ambiante pour la détermination de la structure.

Introduction

L'élucidation de la structure tridimensionnelle (3D) des macromolécules biologiques est une poursuite incessante en biologie structurale où la cristallographie aux rayons X demeure la principale technique d'investigation. Appliqué pour démêler les détails structurels des macromolécules complexes, telles que les protéines, il vise à faciliter la compréhension de leurs mécanismes d'actions et leur implication dans diverses fonctions biologiques. De puissantes sources de rayons X aux synchrotrons et aux lasers à électrons libres à rayons X (XFELs) fournissent tous les outils nécessaires pour mieux comprendre la structure des protéines à une résolution presque atomique. Malgré les avantages qui viennent avec l'utilisation des rayons X pour les études structurelles, il ya des limites intrinsèques au rayonnement radiographique et le processus de cristallisation lui-même. Les dommages causés par les radiations provoquées par un flux de rayons X élevé et de longs temps d'exposition du cristal protéique devant le faisceau de rayons X sont des paramètres restrictifs que les cristallographes doivent surpasser à l'aide du refroidissement cryogénique1. Cependant, trouver les conditions cryocooling optimales peut être laborieux puisque les changements conformationnels de la structure ou des artefacts indigènes de protéine peuvent être cachés2,3. En outre, des études récentes indiquent que l'exécution d'expériences de diffraction à température ambiante entraîne des dommages spécifiques plus faibles auxradiations 4. Un autre goulot d'étranglement en biologie structurale est l'acquisition de cristaux bien diffracting avec une taille suffisante5. Les petits cristaux sont plus faciles à produire, surtout dans le cas des protéines membranaires, mais sont plus sensibles aux dommages causés par les radiations, même dans des conditions cryocoolantes, car une dose élevée de rayonnement doit être dirigée dans un volume plus faible par rapport au cas des cristaux de protéines plusgros 6. La nouvelle approche de la cristallographieen série 7,8 chez les synchrotrons et les XFELs peut contourner les limites des dommages causés par les radiations tout en exploitant les cristaux plus petits (200 nm à 2 μm)7 en fusionnant des ensembles de données à partir de multiples, cristaux de protéines isomorphes et orientés au hasard et profitant des progrès technologiques associés tels que les impulsions femtosecondes, des temps d'exposition plus courts et des faisceaux de rayons X micro-focalisés5,7,9,10.

La technologie microfluidique est précieuse pour la cristallographie aux rayons X, présentant de multiples avantages pour la cristallisation des macromolécules biologiques et leur étude structurelle. La réalisation d'expériences de cristallisation dans des dispositifs microfluidiques nécessite de petits volumes d'échantillons de protéines, limitant ainsi le coût de production de ces macromolécules bio de grande valeur et facilitant le criblage et l'optimisation à haut débit de nombreuses conditions de cristallisation. En outre, le rapport surface-volume inhérent à l'échelle microfluidique et les phénomènes de transport limités par diffusion permettent un contrôle fin des débits et des gradients de température ou de concentration11,12,13,14, rendant les dispositifs microfluidiques adaptés à la croissance de cristaux de taille uniforme et à l'exploration des diagrammes de phase15,16,17,18,19. De plus, les outils microfluidiques présentent un potentiel distinctif pour surmonter un autre obstacle à la cristallographie des protéines, c'est-à-dire la livraison d'échantillons, et la nécessité de manipuler et de récolter des cristaux de protéines avant leur utilisation pour des expériences de diffraction aux rayons X. La méthode de cristallographie aux rayons X sur puce et in situ élimine la manipulation des cristaux et la détérioration potentielle de la qualité des cristaux avant la collecte de données. Un large éventail de puces microfluidiques compatibles pour la cristallographie in situ des protéines aux rayons X ont été conçus, développés et testés par de nombreux groupes de recherche confrontés aux restrictions connexes découlant de la nature des matériaux de microfabrication et de leurs interactions avec les rayons X14,19,20,21,22,23. Les matériaux de fabrication doivent être optiquement transparents, biologiquement inertes et démontrer une grande transparence par rapport au rayonnement radiographique et un rapport signal-bruit optimal lors de la collecte des données.

La plupart des méthodes de cristallisation appliquées dans la cristallographie conventionnelledes protéines 24,25 ont également été mises en œuvre à l'échelle microfluidique11,14 pour la cristallisation des copeaux et l'analyse in situ de la diffraction des rayons X. Des appareils microfluidiques simples, hybrides ou multicou couches intégrant la diffusion de vapeur26,l'évaporation27,la diffusion libre de l'interface (FID)28,le microbatch26,ou même l'ensemencement29 ont été utilisés pour cristalliser les protéines solubles et membranaires. Le criblage et l'optimisation à haut débit des conditions de cristallisation peuventêtre atteints 30,31 dans32,droplet-based33,ou valve-actionné34 dispositifs. In situ (in situ) Des expériences de diffraction aux rayons X de cibles protéiques difficiles à température ambiante ont été menées dans des micropuces fabriquées à partir de divers matériaux tels que pdms (polydimethylsiloxane), COC (copolymère olefin cyclique), PMMA (poly(méthacrylate méthyle))2 1,22,26,28,29, graphène films23, Kapton35, colle époxy6, ou NOA (Adhésif optique Norland)19 et la transparence des matériaux aux rayonnements radiographiques et leur contribution au bruit de fond ont été évalués. En outre, les puces ont été conçues pour coupler les stratégies in situ et les stratégies de collecte de données en série dans un seul outil pour les expériences de cristallographie des protéines aux rayons X aux sources synchrotron23,35,36 et XFELs7.

La collecte de données in situ sur la température ambiante a également été mise en œuvre dans diverses méthodes et dispositifs de livraison. Par exemple, Nogly et coll.54 ont utilisé un injecteur de phase cubique lipidique (LCP) afin d'étudier la structure de la bactériorophodopsine de pompe à photons à commande lumineuse (bR) par cristallographie femtoseconde en série (SFX) à l'aide d'une source XFEL. La structure cristalline de bR a été résolue à la résolution de 2.3 Å, démontrant la compatibilité d'un injecteur de LCP avec la cristallographie en série de femtoseconde de temps-résolue (TR-SFX). Baxter et coll.55 ont conçu une grille multi cristalline haute densité, fabriquée par un plastique polycarbonate de 100 ou 200 μm d'épaisseur avec des trous découpés au laser de différentes tailles. Un film supplémentaire en polycarbonate de 5 μm d'épaisseur peut être fixé d'un côté de la grille lors de l'utilisation de l'appareil pour des expériences de cristallisation assis ou suspendus. Cette grille à haute densité peut être utilisée de multiples façons car les cristaux peuvent être chargés directement sur les ports de l'appareil ou des cristaux peuvent être cultivés sur l'appareil par diffusion de vapeur ou la méthode LCP. En outre, la grille peut être ajustée dans une base magnétique standard et utilisée pour la collecte in situ de données aux rayons X dans des conditions cryogéniques ou de température ambiante. Plus récemment, Feiler et coll.56 ont mis au point un porte-échantillon pour la cristallographie aux rayons X in situ macromoléculaire à température cryogénique et ambiante avec une contribution minimale au bruit de fond. Plus précisément, le support comprend un support en plastique, une feuille COC transparente et une feuille de polyimide structuré microporeuse. Il a été conçu pour remplacer les glissières de couverture couramment utilisées pour la mise en place de gouttes de cristallisation, tout en permettant une manipulation en place comme le trempage des ligands, la formation complexe et la protection cryogénique sans ouvrir la chute de cristallisation ou manipuler manuellement les cristaux. De plus, le porte-échantillon peut être retiré de la plaque de cristallisation et placé sur une base magnétique pour la collecte de données in situ aux faisceaux standard s'appuyant sur le goniomètre. Pour la collecte de données sur la température ambiante, le papier d'aluminium COC est retiré avant l'expérience et seule la feuille de polyimide de 21 μm d'épaisseur contribue à la diffusion en arrière-plan, ce qui dans ce cas est minime. Ces exemples ne représentent qu'une petite fraction de la recherche en cours et la multitude de puces polyvalentes développées pour la cristallographie des protéines aux rayons X.

Cependant, la méthode de cristallisation des protéines de dialyse n'a pas été largement incorporée dans les microfluidiques. La dialyse est une méthode basée sur la diffusion visant l'équilibrage de la concentration des précipités à travers une membrane semi-perméable afin d'approcher la concentration nominale pour la cristallisation des protéines et permet un contrôle précis et réversible sur les conditions de cristallisation24. Le cut-off du poids moléculaire (MWCO) de la membrane de dialyse semi-perméable peut être choisi en fonction du poids moléculaire de la macromolécule et des précipités pour permettre la diffusion de petites molécules précipitantes tout en conservant la macromolécule d'intérêt. En raison de la réversibilité du processus de dialyse, il peut être utilisé en combinaison avec le contrôle de la température pour découpler et optimiser la nucléation et la croissance descristaux indépendamment 37 pour étudier les diagrammes de phase en modifiant la concentration de précipitation tout en utilisant le même échantillon de protéines. L'intégration des membranes en microfluidique est examinée par de Jong et coll.38 et les études de cas en biologie implantant la dialyse dans les micropuces peuvent être principalement énumérées dans les applications de préparation, de concentration ou de filtrationde l'échantillon 39,40,41,42 ou les études liées aux cellules43,44. La pervaporation par PDMS a été employée par Shim et autres37 pour étudier la nucléation et la croissance de la xylanase dans diverses conditions. L'eau a imprégné la membrane PDMS de 15 μm d'épaisseur dans le réservoir protéique du dispositif microfluidique, modifiant par la suite la concentration en protéines et en précipités.

Le protocole développé par Junius et coll.19,45 pour la fabrication d'une puce microfluidique compatible à la fois pour la cristallisation des protéines sur puce par microdialyse et des expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante est présenté. Le protocole pour la fabrication de l'appareil est directement inspiré par le travail pionnier accompli par Studer et ses collègues12,46 pourles autocollants à micro-motifs de résine photo-curable à base de thiolene NOA 81 intégrant des membranes disponibles dans le commerce, en utilisant la lithographie à empreinte douce. Une modification novatrice de la méthode a permis aux micropuces permettant l'utilisation de la microdialyse pour surveiller et contrôler avec précision les paramètres expérimentaux de la croissance sur puce des cristaux protéiques et exploiter simultanément les avantages des microfluidiques, tels que la réduction de la consommation d'échantillons de protéines par expérience (<1 μL). Dans un travail précédent, les principes de dialyse appliqués à un système à macro-échelle (volume typique >20 μL) pour le criblage et l'optimisation des conditions de cristallisation en cartographiant les diagrammes de phase de concentration de température-précipitant ont étédémontrés 47. Dans le cadre de ces travaux, un protocole est décrit pour la production de micropuces de dialyse incorporant des membranes de dialyse régénérées de cellulose (RC) de différents MWCO afin d'effectuer des analyses de cristallisation sur puce et la collecte in situ de données de diffraction aux rayons X. Les matériaux comprenant les puces ont été évalués pour leur transparence aux rayons X19 et les dispositifs peuvent être réglés directement devant le faisceau de rayons X pour des expériences de diffraction in situ à température ambiante, excluant la manipulation manuelle et minimisant la dégradation des cristaux de protéines fragiles. Dans une étude de cas, les cristaux de lysozyme blanc d'œuf de poule ont été cultivés sur puce par microdialyse générant une population uniformément dimensionnée. La puce a ensuite été montée devant le faisceau de rayons X avec un support imprimé en 3D19 et des ensembles complets de données de diffraction in situ ont été recueillis à température ambiante à partir de cristaux multiples et isomorphes, démontrant le potentiel élevé et la pertinence des puces pour les études de cristallographie en série synchrotron de cibles macromoléculaires difficiles.

Protocol

1. Conception de masque et fabrication principale

  1. Dessinez les géométries désirées de l'appareil microfluidique à l'aide de n'importe quel logiciel de dessin vectoriel. Pour chaque couche de la photorésistante qui sera utilisée pour la prochaine étape de la photolithographie, préparez un masque individuel : un masque esquissé de canaux et de piliers et un masque ne contenant que les piliers.
  2. Traduire les fichiers CIF générés par le logiciel de dessin en photomasques de films. Cela peut se faire par le biais de services commerciaux. Exigez le photomask approprié selon le choix du photorésistant utilisé pendant la photolithographie.
    REMARQUE : Pour le photorésiste SU-8, commandez des masques avec des traits noirs sur un fond transparent. Su-8 est un photorésiste négatif à base d'époxy, ce qui signifie que pendant l'exposition à la lumière UV (365 nm) les pièces exposées aux UV sont reliées entre elles alors que le reste reste soluble. Par conséquent, tous les motifs noirs sur le masque ne seront pas reliés par la lumière UV pendant la photolithographie. Des canaux et des piliers seront gravés sur les maîtres.
  3. Préparez deux maîtres sur des plaquettes de silicium pour la conception de chaque puce par photolithographie à l'aide d'un photorésiste négatif SU-8.
    REMARQUE : Les étapes 1.3.1-1.3.7 sont effectuées dans une pièce propre. Les étapes décrites ci-dessous sont les étapes traditionnelles de la photolithographie suivies de la lithographie douce PDMS, qui sont décrites dans de nombreux manuels scolaires. Toutes les valeurs des paramètres expérimentaux (photorésist, durée du temps, température, etc.) dépendent de nombreux paramètres subtils et doivent être optimisées en fonction des différents appareils utilisés.
    1. Utilisez une gaufrette en silicium de 3 pouces et traitez la surface avec du plasma pendant 90 s, afin de faciliter le dépôt et l'attachement du photorésistant SU-8.
    2. Verser environ 3 mL de SU-8 résister au milieu de la gaufrette et faire tourner le SU-8 jusqu'à l'épaisseur désirée (Figure 1A). Pour 50 μm d'épaisseur nominale, utiliser su-8 3050 et spin coat pour 10 s à 500 tours et successivement pour 30 s à 3500 rpm. Cuire doucement le photorésistant sur une plaque chaude pendant 15 min à 368 K afin d'être partiellement solidifié en permettant au solvant contenu dans la résine de s'évaporer et de l'empêcher de coller sur le photomask. Ensuite, laisser la gaufrette à température ambiante pendant 2 min.
    3. Exposez le photorésiste à la lumière UV( Figure 1B). Utilisez un gouttière de masque d'une puissance de 35 mW cm-2 et 8 s de temps d'exposition.
    4. Procéder à la cuisson post-exposition. Placez la gaufrette sur une plaque chaude pendant 5 min à 368 K pour compléter la photoréaction invoquée par l'exposition aux UV.
    5. Retirez toute la résistance SU-8 qui n'a pas été reliée entre elles en plaçant la gaufrette dans un bain contenant de l'acétate d'éther de méthyle glycol propylène glycol (PGMEA) et remuer pendant 15 min. Rincer la gaufrette à l'isopropanol jusqu'à ce qu'aucune précipitation floue ne puisse être observée. Séchez la gaufrette avec du gaz azoté et conservez-la dans une boîte de Pétri (taille standard de 100 mm x 15 mm).
    6. Traiter la surface de la gaufrette avec une silane afin de faciliter le détachement de polydimethylsiloxane (PDMS) qui sera utilisé pour fabriquer 2 timbres. Déposer la gaufrette sur une plaque chaude tapée à 368 K pendant 10 min sous l'atmosphère de vapeur de hexaméthyldisilazane (HMDS).
      REMARQUE : Si l'épluchage du PDMS de la gaufrette devient difficile après plusieurs utilisations, la surface de la gaufrette doit être traitée à nouveau avec de la vapeur HMDS.
    7. Le premier maître contenant les canaux et les piliers est prêt. Répétez ces étapes et préparez le deuxième maître modelage que les piliers.
      REMARQUE : Lors de la photolithographie, l'objectif est d'obtenir les géométries de l'appareil sur les maîtres SU-8 d'une hauteur de 50 μm. Cependant, une fois que les deux maîtres SU-8 sont fabriqués, mesurez la hauteur des géométries gravées sur les maîtres avec un profilomètre afin d'acquérir la valeur expérimentale. La valeur mesurée pour les deux maîtres SU-8 fabriqués pour ce protocole est d'environ 45 μm.

2. Fabrication de moules PDMS

REMARQUE : Les étapes suivantes du protocole peuvent être effectuées dans n'importe quel laboratoire tant qu'un capot d'écoulement laminaire est utilisé, que la lumière jaune dans la pièce est utilisée lorsque vous travaillez avec la résine NOA 81 (étapes 3.6-3.11) et qu'une source de lumière UV est disponible pour polymériser la résine NOA 81 (étapes 3.7 et 3.11).

  1. Préparez 50 g de base en silicone PDMS et son agent de séchage dans un rapport de masse de 10:1.
  2. Mélanger les deux ingrédients dans un bécher avec une spatule et placer le mélange dans une chambre à vide pour enlever toutes les bulles d'air.
  3. Verser 25 g de PDMS pré-mélangé dans le maître SU-8 (stocké dans une boîte de Pétri) modelant les canaux et les piliers jusqu'à une hauteur d'environ 5 mm. Versez les 25 g restants du PDMS dans le deuxième modèle principal SU-8 seulement les piliers jusqu'à une hauteur d'environ 5 mm (figure 1C).
  4. Placer les deux boîtes de Pétri dans un four et guérir les couches PDMS à 338 K pendant 1 h.
  5. Coupez la couche pdms durcie autour des motifs des maîtres SU-8 avec un scalpel et décollez doucement les moules PDMS des maîtres (Figure 1D).
    REMARQUE : La procédure décrite ci-dessus, appelée réplication du moulage, est fréquemment utilisée pour préparer des moules de PDMS qui seront fixés à des surfaces vitrées et feront partie d'un dispositif microfluidique53. Dans ce protocole, les moules PDMS ne font pas partie de la puce, mais ils sont utilisés comme intermédiaires pour la fabrication de puces. Pour chaque conception, 2 moules PDMS sont préparés à partir des maîtres SU-8 respectifs (figures 1D et 1E) et seront utilisés en conséquence (comme décrit ci-dessous) pour la fabrication de la puce.

3. Fabrication de puces de dialyse

  1. Placez le moule PDMS modelant les canaux et les piliers sur une lame de verre microscope rigide (3 x 1 dans. taille standard) avec les motifs orientés vers le haut (Figure 1F). Le pilier central qui correspond au réservoir de protéines dépasse verticalement de 45 μm de la surface horizontale du moule PDMS.
  2. Couper et séparer un morceau sec de la membrane de dialyse régénérée de cellulose (RC) et le déposer sur le pilier central du moule PDMS, qui est soutenu sur la glissière de verre (Figure 1F).
    REMARQUE : La membrane de dialyse RC est disponible dans le commerce, et le cut-off de poids moléculaire (MWCO) est choisi en conséquence avec le poids moléculaire de la protéine à l'étude et les précipités utilisés. La taille du morceau de la membrane de dialyse RC dépend de la conception de la puce. Dans ce protocole, 2 prototypes sont conçus lorsque le volume du réservoir protéique est de 0,1 ou 0,3 μL. Dans ces cas, la taille de la pièce de membrane de dialyse est 2 x 2 mm2 ou 4 x 4 mm2, respectivement.
  3. Placez le deuxième moule PDMS modelant seulement les piliers orientés vers le bas sur le dessus du moule PDMS soutenu sur la glissière en verre (Figure 1F). Le pilier central de ce moule correspond au réservoir de protéines et dépasse verticalement (orienté vers le bas) de 45 μm de la surface horizontale.
  4. Aligner les piliers centraux des 2 moules PDMS. La membrane de dialyse RC est « pris en sandwich » entre les 2 moules PDMS (Figure 1G).
    REMARQUE : L'alignement entre les microstructures des 2 moules PDMS peut être réalisé visuellement, sans équipement supplémentaire. Sinon, cette manipulation peut être réalisée au microscope. Un petit décalage entre les réservoirs n'est pas problématique, tant que le canal fluidique et les points d'entrée ou de sortie ne sont pas entièrement couverts.
  5. Desiccate l'assemblage pendant 30 min dans une chambre à vide pour enlever toutes les bulles d'air emprisonnées dans les moules PDMS et pour favoriser l'insertion de la résine au cours de la prochaine étape de la fabrication.
    REMARQUE : Les 2 moules PDMS sont maintenus en place par adhérence PDMS-PDMS et aucune pression supplémentaire ou autre moyen de collage temporaire n'est nécessaire.
  6. Remplissez l'espace vide entre les 2 moules PDMS avec la résine photocurable à base de thiolene NOA 81 par imbibition capillaire (Figure 1H et 1I).
  7. Guérir la résine par exposition à la lumière UV (365 nm) pendant 8 s à l'aide d'une lampe UV collimée (puissance 35 mW cm-2).
    REMARQUE : Cette première exposition permet à la résine NOA 81 d'être partiellement reliée entre eux puisqu'une fine couche de NOA 81 en contact avec les moules PDMS des deux côtés n'est toujours pas guérie.
  8. Couper l'excès de NOA 81 des côtés externes des moules PDMS avec un scalpel.
  9. Retirez le moule PDMS supérieur avec le NOA 81 partiellement relié entre eux collé sur elle du moule PDMS inférieur et de la glissière en verre.
  10. Couper une feuille pmma de 175 μm d'épaisseur dans les dimensions standard d'une lame de verre au microscope (3 x 1 pouce) et décoller les feuilles de protection en plastique de chaque côté de la pièce PMMA. Appuyez doucement sur l'assemblage du moule PDMS supérieur et du NOA 81 partiellement durci sur la pièce PMMA (Figure 1J).
  11. Cure again NOA 81 par exposition à la lumière UV pendant 60 s et enlever le moule PDMS supérieur (Figure 1K). La résine adhère au substrat PMMA sans autre traitement.
    REMARQUE : Les moules PDMS peuvent être réutilisés environ 5 fois après les avoir lavés avec de l'isopropanol et de l'acétone, tant que les moules ne sont pas pliés. La membrane de dialyse RC est incorporée dans l'autocollant NOA 81 et aucune autre manipulation ou serrage mécanique n'est nécessaire.

4. Connecteurs fluidiques

REMARQUE : La conception de la puce microfluidique se compose d'un canal fluidique linéaire pour la solution de cristallisation et d'un réservoir central pour l'échantillon de protéines (réservoir de protéines), tous deux présentés à partir d'une vue supérieure de deux puces de la figure 2A. Une membrane de dialyse RC est intégrée entre ces deux microstructures (figure 2D) et le processus de cristallisation évolue tandis que les précipités de la solution de cristallisation diffusent à travers la membrane en raison d'un gradient de concentration entre les deux compartiments de la puce qui sont séparés par la membrane. Le canal microfluidique est imprimé sur le moule PDMS inférieur (Figure 1F). Une fois le protocole de fabrication des copeaux terminé, le canal linéaire est situé sur la couche inférieure de l'autocollant NOA 81 en contact avec le substrat PMMA, comme le montre la figure 1K. Une entrée et un point d'accès de sortie pour la solution de cristallisation sont situés à chaque extrémité du canal linéaire et ressemblent à des trous (hauteur totale de 90 μm) comme on peut le voir dans la figure 2A. Pour la manipulation de la solution de cristallisation, des connecteurs doivent être ajoutés sur les points d'accès.

  1. Connecteurs obligataires disponibles dans le commerce (NanoPort) sur l'entrée et la sortie du canal microfluidique avec colle époxy rapide (Figure 2C).
  2. Choisissez le diamètre approprié des tubes PTFE en fonction de la taille des connecteurs. Les tubes PTFE seront utilisés pour l'introduction de la solution de cristallisation dans le canal fluidique de la puce.
    REMARQUE : Les trousses disponibles dans le commerce sont recommandées pour un contrôle facile et précis du débit et sont généralement combinées à des systèmes automatisés à pression ou à débit contrôlé (pompes à seringues) pour le mélange et la manipulation des fluides. Cependant, la solution de cristallisation peut être introduite manuellement dans le canal linéaire avec une seringue en plastique jetable. Dans ce cas, des étapes 4.3 à 4.5 sont suggérées.
  3. Remplissez une seringue jetable de 1 mL avec la solution de cristallisation. Pour les puces présentées dans ce protocole, 400 μL suffisent pour remplir l'ensemble du canal fluidique.
  4. Coupez deux pointes de pipette de sorte que le diamètre de la pointe d'un côté soit égal au diamètre intérieur du tube PTFE qui sera utilisé pour la manipulation de la solution. Collez les pointes recadrées sur les points d'accès du canal avec de la colle époxy rapide( Figure 2B).
  5. Connectez la seringue avec les pointes recadrées avec un morceau de tube PTFE de la taille appropriée et introduisez la solution dans le canal en poussant constamment le piston de seringue lentement.

5. Encapsulation des protéines

REMARQUE : Le modèle de la puce dédiée à l'utilisation comme réservoir de protéines reste jusqu'à présent ouvert à l'atmosphère. Le protocole suivant est proposé pour confiner soigneusement l'échantillon de protéines dans la puce microfluidique.

  1. Pipette manuellement une gouttelette de l'échantillon de protéines à l'intérieur du réservoir de protéines, situé juste sur la membrane de dialyse RC, comme l'illustre la figure 2E. Le volume de l'échantillon protéique varie selon la conception de la puce et peut être de 0,1 ou 0,3 μL.
  2. Appliquez une fine couche de graisse de silicone à vide élevé tout autour du réservoir de protéines.
  3. Couper un petit morceau d'une feuille pmma de 175 μm d'épaisseur et la placer délicatement au-dessus de la fine couche de graisse de silicone. La pièce PMMA doit couvrir toute la surface du réservoir protéique où la solution protéique est déposée.
    REMARQUE : La graisse de silicone est utilisée pour améliorer l'étanchéité à l'air et prévenir la propagation de la gouttelette protéique. Il n'y a pas de collage ou d'étanchéité entre la pièce PMMA utilisée pour couvrir le réservoir de protéines et l'autocollant NOA 81. Le contact entre eux est une interface solide/solide. Afin de produire un étanchéité globale et une encapsulation étanche à l'air de l'échantillon de protéines, un morceau de ruban Kapton est utilisé tel que décrit à l'étape 5.4.
    REMARQUE : Il est parfois difficile de confiner l'échantillon protéique dans la cavité dédiée de l'appareil (réservoir de protéines) lorsqu'un système à pression est utilisé pour l'introduction de la solution de cristallisation dans le canal fluidique (étape 6.4). Pour éviter le problème mentionné ci-dessus, des valeurs de pression relativement faibles doivent être maintenues tout en faisant circuler la solution de cristallisation. Une pression d'injection de 20-60 mbar pour les solutions aqueuses ou 50-150 mbar pour des solutions plus visqueuses (PEGs, glycérol) estsuggérée 19.
  4. Coupez un morceau de ruban Kapton (20 μm d'épaisseur) assez grand pour couvrir la pièce PMMA au-dessus du réservoir de protéines et pour coller sur la puce NOA sur tous les bords. L'échantillon de protéines est encapsulé dans le réservoir et la puce est prête à être utilisée pour l'expérience de cristallisation, comme le montre la figure 2C.
    REMARQUE : Les copeaux peuvent être réutilisés plusieurs fois tant que la membrane de dialyse et l'adhérence de NDA sur le substrat PMMA ne sont pas détériorées. Si ces parties de la puce sont endommagées, des fuites sont observées pour vérifier que l'appareil ne peut plus être utilisé. Le lavage des copeaux dépend de la solution de cristallisation. Dans le cas des solutions à faible viscosité (sels, tampons), le canal fluidique peut être lavé en introduisant simplement de l'eau distillée et en la faisant couler pendant quelques minutes. 400 μL est le volume nécessaire pour échanger complètement une solution dans le canal avec une autre solution. Dans le cas de solutions plus visqueuses (PEGs, glycérol), il n'est pas recommandé de réutiliser les copeaux puisque le lavage du canal uniquement avec de l'eau n'est pas suffisant. La partie supérieure de la puce, où se trouve le réservoir de protéines, peut également être lavée avec de l'eau distillée et séchée à l'air pressurisé.

6. Cristallisation des protéines sur puce

  1. Peser la poudre de lysozyme blanc d'œuf de poule lyophilisée et dissoudre dans l'eau distillée pour obtenir une concentration finale de 30 mg mL-1.
  2. Filtrer la solution protéique à travers un filtre et une centrifugeuse de 0,22 μm pendant 5 min à la vitesse la plus élevée à 293 K pour éliminer toutes les particules solides. Utilisez le supernatant pour l'expérience de cristallisation.
  3. Préparez 500 μL de solution de cristallisation contenant le tampon et le précipité dans les concentrations fournies dans le tableau 1. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm.
  4. Injectez la solution dans le point d'entrée de la puce à l'l'insuffle d'une seringue ou d'un système fluidique automatisé à pression ou d'une pompe à seringues, tel que décrit dans les étapes 4.1-4.5.
    REMARQUE : L'expérience de cristallisation peut se produire soit dans un état statique, si le canal microfluidique est rempli de la solution de cristallisation et mis de côté, soit dans des conditions d'écoulement, s'il est injecté en permanence à l'intérieur du canal à un débit constant. Dans ce dernier cas, l'utilisation d'un système externe à pression ou d'une pompe à seringues est recommandée. La réalisation de l'expérience dans des conditions fluides offre également la possibilité d'échanger dynamiquement des solutions de cristallisation dans le canal fluidique. Ainsi, plusieurs expériences peuvent être menées tout en utilisant le même échantillon de protéines.
  5. Une fois que le canal fluidique est rempli de la solution de cristallisation, sceller les ports d'entrée et de sortie de la puce avec du ruban parafilm.
  6. Pipette le volume approprié de la solution protéique dans le réservoir de protéines et encapsuler l'échantillon de protéines tel que décrit dans les étapes 5.1-5.4.
  7. Conserver la puce à 293 K.
    REMARQUE : La cristallisation par dialyse suit une trajectoire cinétique différente des expériences menées avec la méthode de diffusion de vapeur ou la cristallisation par lots et dépend profondément de la nature des molécules précipitées impliquées dans le processus de diffusion, selon les donnéesmesurées 51, et il pourrait prendre plus de temps pour que la nucléation commence. Afin d'éviter l'évaporation, le cas échéant, pendant cette période, placez la puce dans une atmosphère saturée d'humidité à 293 K.

7. Diffraction in situ et sur puce aux rayons X

  1. Prise en charge imprimée 3D pour les faisceaux
    1. Imprimez le support qui peut transporter jusqu'à trois jetons simultanément. Les dimensions du support sont les mêmes que les dimensions des plaques de cristallisation commerciales (96 bien/norme SBS) compatibles avec les expériences de diffraction des rayons X dans les plaques.
      REMARQUE : L'impression du support peut être attribuée aux services commerciaux. Le support a été conçu à l'aide d'un logiciel de conception 3D-CAD et est montré dans la figure 3A lors d'expériences de cristallisation des protéines sur puce et dans la figure 3B lors de la collecte in situ de données de diffraction des rayons X à BM30A-FIP (ESRF).
    2. Stabilisez les puces de dialyse sur le support à l'aide d'un ruban adhésif unifaté ou double face.
  2. In situ (in situ) Diffraction aux rayons X
    1. Recueillir des données sur la diffraction des rayons X à température ambiante à partir de cristaux cultivés dans le réservoir de protéines. Par exemple, utilisez des rayons X avec une énergie de 12.656 keV, un flux de 3.32 x 1010 photons s-1 et une taille de faisceau de 250 x 250 μm2. Enregistrez les images de diffraction à l'aide d'un détecteur ADSC Quantum 315r avec une matrice de 3 x 3 CCD pour une surface active de 315 x 315 mm2 et 9,4 mégapixels de résolution.
      REMARQUE : Les données de diffraction des cristaux de lysozyme cultivés sur les puces de dialyse ont été recueillies à la ligne de faisceau BM30A-FIP de l'Installation européenne de rayonnement synchrotron (ESRF). Cependant, la taille du faisceau, le flux et le type de détecteur peuvent être différents dans d'autres sources de rayonnement aux rayons X. Le support imprimé 3D permet la collecte de données avec une plage angulaire de -40° à +40° autour du cristal. Le nombre de cristaux de lysozyme exposés pour la collecte de données in situ, le nombre de modèles de diffraction recueillis pour chaque cristal, la plage d'angle d'oscillation par exposition et le temps d'exposition sont résumés dans le tableau 2.
  3. Traitement des données
    1. Traiter les ensembles de données complets ou partiels avec les modèles de diffraction pour les cristaux de lysozyme avec le programme XDS48.
    2. Générez le fichier HKL pour chaque ensemble de données et mettez-les à l'échelle à l'aide du logiciel XSCALE48.
    3. Utiliser le remplacement moléculaire par le phaser du programme de la suite49 du RPC4 et déterminer les phases de construction du modèle. Pour cette étape, utilisez les coordonnées 3D connues du lysozyme de l'entrée 193L de la Protein Data Bank (PDB).
    4. Affiner la structure à l'aide de Phenix52 et inspecter le modèle protéique final à l'aide du COOT50.

Representative Results

Les puces microfluidiques développées par Junius et coll.19,45 sontcompatibles à la fois pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de microdialyse et la collecte in situ de données de diffraction des rayons X à température ambiante. Les images des puces, leur conception détaillée, les connecteurs fluidiques et la membrane de dialyse RC sont illustrées à la figure 2. Les expériences de cristallisation sont mises en place en pipetant manuellement l'échantillon de protéines directement dans le réservoir de protéines et en introduisant la solution de cristallisation dans le canal fluidique linéaire à l'aide d'un système automatisé à pression ou d'une pompe à seringues ou manuellement à l'aide d'une seringue. Le réservoir protéique et le canal fluidique peuvent être distingués dans la figure 2A. Les conceptions de fabrication de copeaux de 0,1 μL ou de 0,3 μL de volume maximal du réservoir protéique sont indiquées dans la figure 2A à gauche et à droite, respectivement. Les copeaux d'une capacité maximale de 0,2 μL ou de 0,7 μL pour l'échantillon de protéines sont montrésailleurs 19. Le point culminant du protocole pour la fabrication de l'appareil peut être réduit sur l'utilisation de la résine photocurable à base de thiolene NOA 81 intégrant des membranes de dialyse RC disponibles dans le commerce de divers MWCOs. Lors de la fabrication des dispositifs microfluidiques, le canal fluidique linéaire est imprimé sur le moule PDMS inférieur (Figure 1F), tandis que le moule PDMS supérieur se compose uniquement des piliers à motifs pour le réservoir de protéines et les ports d'entrée et de sortie (Figure 1F). Une fois que noa 81 est relié entre eux et que les moules PDMS sont retirés de l'assemblage (figure 1K), le canal fluidique est situé à la couche inférieure de la puce et le canal protéique et les ports d'entrée/sortie sont situés sur les deux couches. La figure 1L illustre un schéma de vue latérale de la puce de dialyse où toutes les couches de l'appareil et leur épaisseur respective sont indiquées. La hauteur des motifs imprimés sur la couche inférieure des copeaux (canal fluidique) est d'environ 45 μm, tandis que la hauteur totale des ports d'entrée et de sortie est d'environ 90 μm. Le réservoir protéique (hauteur de 45 μm) est également illustré dans les figures 2D et 2E. L'alignement des deux couches a été étudié au microscope optique et le morceau de la membrane de dialyse RC incorporé dans la puce électronique peut être clairement distingué dans la figure 2D. Dans la même figure, l'air a été piégé dans le canal fluidique lors de l'injection de la solution de cristallisation, comme on peut le voir dans la partie supérieure gauche du réservoir protéique. La figure 2E est une photographie en gros plan du réservoir protéique après le dépôt manuel de la gouttelette protéique à l'aide d'une pipette et avant l'encapsulation de la gouttelette à l'aide d'un morceau de PMMA et de ruban Kapton, tel que décrit dans les étapes 5.2 et 5.3 du protocole. La puce microfluidique prête à être utilisée pour des expériences de cristallisation, après l'encapsulation de l'échantillon protéique et le collage des connecteurs fluidiques, est représentée dans la figure 2C. L'assemblage étanche à l'air garantit que les fuites ne peuvent pas se produire. Les connecteurs fluidiques pour les ports d'entrée et de sortie du canal microfluidique peuvent être soit ceux disponibles dans le commerce tels que décrits à l'étape 4.1 du protocole et indiqués à la figure 2C,soit les pointes jetables de pipette de laboratoire peuvent être utilisées dans le même but (figure 2B, étape protocolaire 4.4).

Pour la fabrication des puces microfluidiques, des matériaux optiquement transparents et biologiquement inertes ont été choisis, démontrant une compatibilité élevée pour les expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante. Les interactions des rayons X, de l'absorption et de la diffusion, avec les matériaux composant le dispositif microfluidique et l'atmosphère environnante (air) génèrent un signal connu sous le nom de bruit de fond. Ce bruit résume le signal de diffraction des cristaux protéiques enregistrés par le détecteur, la décomposition du rapport signal-bruit et doit être maintenu aussi bas que possible lors de la collecte de données de diffraction aux rayons X. Nous avons évalué le bruit de fond généré par les matériaux composant le réservoir de protéines, qui est dans la trajectoire directe du faisceau de rayons X. Le réservoir protéique se compose de la membrane de dialyse RC, du ruban Kapton et de deux morceaux de PMMA, l'un utilisé comme substrat pour la puce et l'autre utilisé pour l'encapsulation de l'échantillon protéique. L'épaisseur de la PMMA est de 2 x 175 μm, de la bande Kapton de 20 μm, et la membrane de dialyse RC est d'environ 40 μm d'épaisseur (figure 1L). L'épaisseur totale de ces couches est d'environ 410 μm et la couche NOA 81 n'est pas dans la trajectoire directe des rayons X. Outre l'épaisseur des matériaux de fabrication, leur densité est également cruciale pour mesurer le bruit de diffusion en arrière-plan, à mesure que la diffusion des rayons X augmente avec le nombre atomique élémentaire. Pour cette raison, le flux d'hélium (une caractéristique fournie à BM30A-FIP à l'ESRF) a été utilisé au lieu de l'air lors de la collecte de données pour la caractérisation des matériaux et pour les expériences de diffraction des protéines. La figure 3C illustre le bruit de fond généré par la bande kapton, la membrane de dialyse RC, la feuille pmma et leur assemblage dans l'atmosphère hélium. Chaque matériau a été exposé pendant 20 s à des rayons X de 0,98 longueur d'onde Å et la distance échantillon-détecteur était de 200 mm. Les expériences ont été réalisées à la ligne de faisceau BM30A-FIP à l'ESRF, comme expliqué à l'étape 7 du protocole. Les anneaux diffus attribués aux interactions du faisceau de rayons X avec les matériaux peuvent être distingués pour le ruban Kapton à une résolution inférieure à 4 Å, la feuille PMMA entre 4-8 Å, et la membrane de dialyse entre 4-5 résolution Å. Le bruit de fond généré par la puce de dialyse est principalement observé à une résolution inférieure à 6 Å qui n'affecte pas le traitement des données de diffraction à haute résolution des gros cristaux de lysozyme. L'intensité de diffusion en arrière-plan en fonction de la résolution de la puce et des matériaux séparés sont montrés ailleurs19. Dans la mesure présentée à la figure 3C,la puce de dialyse était vide de toute solution (protéine ou solution précipitante) et la contribution de la présence de solution au bruit de fond n'a pas été mesurée. Les puces ont été montées devant le faisceau de rayons X avec un support imprimé en 3D (Figure 3B) conçu pour les expériences de diffraction in situ19. Toutefois, le même support avec des dimensions égales aux dimensions d'une plaque de cristallisation standard 96-well/SBS, peut être utilisé pour effectuer 1 à 3 expériences de cristallisation simultanément, car il peut contenir jusqu'à 3 puces simultanément (Figure 3A).

Des expériences ont été menées pour évaluer l'efficacité des dispositifs microfluidiques pour la cristallisation sur puce des protéines solubles modèles avec la méthode de microdialyse. Le canal fluidique a été rempli tel que décrit à l'étape 4 du protocole, tandis que les étapes 5 et 6 décrivaient comment encapsuler l'échantillon de protéines dans le réservoir de protéines dédié et comment mettre en place les expériences de cristallisation. La figure 4 montre des cristaux de lysozyme cultivés à 293 K sous 1,5 M de chlorure de sodium (NaCl) avec 0,1 M d'acétate de sodium (CH3COONa) pH 4,0 (A) et moins de 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5 avec 30% polyéthylène glycol (PEG) 400 (B). La poudre de lysozyme lyophilisée a été dissoute dans l'eau à une concentration finale d'~30 mg mL-1 ou dans 20 mM CH3COONa pH 4.2 tampon à une concentration finale d'~20 mg mL-1 pour les expériences illustrées dans les figures 4A et 4B, respectivement. Le volume de l'échantillon protéique dans les deux expériences était d'environ 0,3 μL et le MWCO de la membrane de dialyse RC intégrée dans les puces se situe dans la gamme de 6-8 kDa. Les cristaux de lysozyme indiqués dans la figure 3A ont augmenté dans les 1 h et les cristaux de la figure 3B ont grandi dans les 30 minutes qui ont pris le début de l'expérience. Les expériences de cristallisation ont été menées dans des conditions statiques. Cependant, il a été démontré19 que la conduite des expériences dans des conditions d'écoulement offre la possibilité d'échanger dynamiquement les conditions de cristallisation et les diagrammes de phase d'étude, en vérifiant la réversibilité de la méthode de microdialyse.

In situ (in situ) Des données de diffraction aux rayons X provenant des cristaux de lysozyme indiqués à la figure 4A ont été recueillies pour démontrer l'adéquation des puces de dialyse pour de telles expériences. La collecte de données a été effectuée à la ligne de faisceau BM30A-FIP (ESRF) à température ambiante, tel que décrit à l'étape 7.2.1 du protocole. Les puces ont été montées à la ligne de faisceau à l'aide du support imprimé en 3D (figure 3B) et des ensembles complets de données de diffraction aux rayons X ont été recueillis à partir de deux cristaux de lysozyme cultivés sur puce dans les conditions données dans la deuxième ligne du tableau 1. Les réflexions observées des ensembles de données ont été traitées, indexées et intégrées à l'aide de XDS48 et le remplacement et le raffinement moléculaires ont été réalisés à l'aide de phaser49 et Phenix52,respectivement. Les statistiques cristallographiques pour l'ensemble complet de données de chaque cristal de lysozyme et pour la fusion des deux ensembles de données sont fournies dans le tableau 2. Pour le remplacement moléculaire, l'entrée PDB 193L a été utilisée.

Les cartes de densité électronique à partir d'un seul cristal de lysozyme et de l'ensemble de données fusionné des deux cristaux ont été obtenues à 1,95 Å et 1,85 Å, respectivement, et sont illustrées dans les figures 5A et 5B. Les deux cartes de densité électronique montrent des informations structurelles détaillées qui peuvent être obtenues par des expériences in situ de diffraction des rayons X menées directement sur la puce de dialyse à température ambiante à partir d'un seul cristal ou de cristaux multiples, rendant les puces compatibles pour les études de cristallographie aux rayons X in situ.

Figure 1
Figure 1: Illustration schématique de la fabrication de puces de dialyse. (A) La résine SU-8 est déposée sur deux plaquettes de silicium et enduite de spin. (B) Un maître SU-8 est acquis après avoir irradié le photorésist avec la lumière UV à travers un photomask et le développement des parties non exposées. (C) PDMS est distribué sur les maîtres SU-8 et après avoir été guéri à 338 K pendant 1 h, (D) les 2 moules PDMS produits par la réplication de moulage et l'impression des micro-modèles sont pelés des maîtres et (E) coupé à la taille appropriée. (F) Les moules PDMS sont soutenus sur une glissière en verre incorporant la membrane de dialyse RC entre les deux piliers centraux. (G) Les 2 moules PDMS sont ensuite alignés et desséchés pendant ~30 min dans une chambre à vide. (H) La résine NOA 81 est versée entre les deux moules et (I) remplit l'espace par capillarité. (J) Après la première exposition à la lumière UV, le moule PDMS inférieur est enlevé et l'assemblage est déposé sur une feuille PMMA. (K) La deuxième exposition aux UV suit afin de polymériser entièrement la résine NOA 81 et la puce de dialyse est prête à l'emploi après avoir enlevé le moule PDMS supérieur restant. (L) Schéma de vue latérale de la puce de dialyse où toutes les couches de l'appareil et leur épaisseur respective sont indiquées. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Copeaux de dialyse intégrant une membrane de dialyse RC pour la cristallisation des protéines sur puce et expériences in situ de diffraction des rayons X. (A) 81 micropuces NOA sur substrat PMMA de 175 μm d'épaisseur avec un réservoir protéique de 0,1 μL (gauche) et 0,3 μL (droite) volume nominal. (B) Micropuces avec des pointes de pipette comme connecteurs fluidiques collés sur les ports d'entrée et de sortie du canal fluidique. (C) Image d'une puce au cours d'une expérience de cristallisation. L'échantillon de protéines est encapsulé avec un morceau de 175 μm d'épaisseur feuille PMMA et ruban Kapton. Les connecteurs Peek Nanoport sont utilisés pour les ports d'entrée et de sortie du canal fluide. (D) Vue supérieure du réservoir de protéines pendant la circulation de la solution de cristallisation dans le canal fluidique. L'air est emprisonné dans la partie supérieure du réservoir juste sous la membrane de dialyse RC, qui peut être clairement détectée. (E) Vue supérieure du réservoir de dialyse au microscope optique lors du dépôt de l'échantillon protéique. La gouttelette protéique est déposée juste au-dessus de la membrane de dialyse RC intégrée. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: Support imprimé en 3D (A) pour les puces utilisées lors d'expériences de cristallisation et (B) monté devant le faisceau de rayons X à la ligne de faisceau BM30A-FIP à l'ESRF pour les expériences in situ de diffraction des rayons X. (C) Bruit de fond généré par l'interaction des rayons X avec Kapton, membrane de dialyse RC, PMMA, et la puce de dialyse (de gauche à droite). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Cristallisation sur puce du lysozyme avec la méthode de microdialyse. (A) Cristaux Lysozyme (~30 mg mL-1)cultivés sur puce sous 1,5 M NaCl et 0,1 M CH3COONa pH 4.0 et (B) lysozyme (~20 mg mL-1) cristaux cultivés dans des conditions de cristallisation contenant 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5, et 30% PEG 400. Les deux expériences ont été menées à 293 K. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Cartes de densité électronique de la structure lysozyme raffinée à partir de (A) d'un seul cristal et (B) de l'ensemble de données fusionné de deux cristaux cultivés sur puce par microdialyse. Les cartes ont été obtenues à 1,95 Å et 1,84 Å, respectivement, profilé à 1ν. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

protéine Concentration protéique
(mg mL-1)		 Bufffer protéique Concentration initiale de
solution précipitée		 MWCO de RC
membrane de dialyse
(kDa)		 température
(K)
lysozyme ~ 30 Eau 1,5 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,0		 6 - 8 293
lysozyme ~ 20 20 mM CH3COONa pH 4,2 1 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,5
30% PEG 400		 6 - 8 293

Tableau 1 : Composition du tampon protéique et de la solution précipitée pour la cristallisation sur puce du lysozyme avec la méthode de microdialyse. Les cristaux de lysozyme cultivés sur puce avec les conditions fournies dans la deuxième ligne ont été utilisés pour la collecte in situ de données de diffraction des rayons X.

protéine lysozyme lysozyme lysozyme
Nombre de cristaux 1 1 2
Nombre de cadres de diffraction 40 30 70
Oscillation (°) par exposition 1 1
Temps d'exposition (s) 30 30
Température (K) 293 293 293
Groupe spatial P43212 P43212 P43212
Paramètres des cellules unitaires 78.86 78.86 37.87
90.0 90.0 90.0		 79.17 79.17 37.95
90.0 90.0 90.0		 78.47 78.47 37.65
90.0 90.0 90.0
Plage de résolution (Å) 27.31 - 1.95
(2.02 - 1.95)		 27.39 - 1.96
(2.03 - 1.96)		 27.17 - 1.85
(1.91 - 1.85)
Mosaïque (°) 0.319 0.121
Réflexions totales (observées) 25127 (3552) 19991 (3001)
Réflexions uniques (observées) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975)
Redudancy (Redudancy) 2.90 (2.61) 2.41 (2.27)
Exhaustivité (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15)
Je veux dire que je /σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7
CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0
R-fusion 0.184
R-meas ( R-meas ) 0.139 0.221 0.219
R-pim 0.116
Réflexions utilisées dans le raffinement 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965)
Réflexions utilisées pour R-free 864 (78) 846 (85) 1039 (96)
R-travail 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102)
Sans R 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703)
Nombre d'atomes non hydrogène 1069 1071 1096
Macromolécules 1012 1012 1012
Eau 55 57 82
ligand 2 2 2
Résidus de protéines 131 131 131
Rms (obligations, Å) 0.008 0.009 0.005
Rms (angles, °) 1.17 1.26 1.05
Ramachandran favorisé (%) 98.43 97.64 99.21
Ramachandran autorisé (%) 1.57 2.36 0.79
Ramachandran aberrants (%) 0.00 0.00 0.00
Facteur B avegare 34.26 28.54 24.34
protéine 33.94 28.14 23.62
Eau 40.23 35.57 33.16
Ligands 33.23 29.63 24.77

Tableau 2 : Paramètres de collecte de données, statistiques cristallographiques et de raffinement des cristaux de lysozyme cultivés sur puce par l'intermédiaire de la méthode de microdialyse. Les valeurs fournies entre parenthèses correspondent à la coquille de résolution la plus élevée. La quatrième colonne correspond aux valeurs obtenues après la fusion des ensembles de données de la deuxième et de la troisième colonne.

Discussion

Un dispositif microfluidique a été développé pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de microdialyse et des expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante. Les puces NOA 81 intégrant des membranes de dialyse RC de n'importe quel MWCO afin d'utiliser la microdialyse pour la cristallisation des protéines sur puce peuvent être fabriquées. Des matériaux de fabrication avec une transparence relativement élevée des rayons X ont été utilisés, rendant les puces compatibles pour la cristallographie in situ des protéines. Les matériaux de fabrication qui composent le compartiment pour la cristallisation protéique de l'appareil (PMMA, Kapton, membrane de dialyse RC) ont été évalués pour générer un faible bruit de fond. Plus précisément, le bruit de fond généré par la puce de dialyse est principalement observé à basse résolution (> 6 Å) et n'affecte pas le traitement des données de diffraction à haute résolution des gros cristaux de lysozyme nécessaires à la détermination de la structure protéique. L'automatisation de la collecte de données est amplifiée à l'aide d'un support imprimé 3D qui peut être monté directement dans des faisceaux de cristallographie macromoléculaire et transporter jusqu'à trois puces simultanément. De cette façon, la récolte manuelle et la manipulation des cristaux de protéines fragiles sont évitées. En outre, la collecte de données a lieu à température ambiante, en évitant le besoin de cryoprotection qui peut être liée à des changements conformationnels de la structure des protéinesindigènes 2,3.

L'utilisation de la microdialyse comme méthode de croissance des cristaux sur puce permet de surveiller et de contrôler avec précision le processus de cristallisation. Comme nous l'avons vu dans l'introduction, la plupart des méthodes conventionnelles de cristallisation des protéines ont été mises en œuvre à l'aide de dispositifs microfluidiques11,14. Cependant, les avantages de la dialyse pour la cristallisation des protéines n'avaient pas encore été pleinement exploités à l'échelle microscale. La microdialyse sur puce permet d'étudier les diagrammes de phase et d'effectuer le criblage et l'optimisation des conditions de cristallisation avec le même échantillon deprotéines 19. Pour les prototypes présentés dans ce travail, la consommation de protéines par puce est limitée à 0,1 ou 0,3 μL. D'après les travaux expérimentaux jusqu'à présent, les étapes les plus critiques du protocole ne proviennent pas de la procédure de fabrication des puces, mais du processus de cristallisation. Le protocole de fabrication comprend de nombreuses étapes, mais il est simple et permet la fabrication de nombreux appareils (20 à 30 puces) en une seule journée dans la salle propre, avec des matériaux relativement peu coûteux. Cependant, la cristallisation sur puce des protéines peut être une procédure délicate en raison de la nature stochastique intrinsèque de la nucléation et de la croissance du cristal, en particulier dans le micro-échelle. Une étude de cas a été décrite, où des conditions bien établies ont été employées pour la cristallisation du lysozyme qui a donné des cristaux robustes et bien définis appropriés pour la collecte in situ de données de diffraction de rayon X. Néanmoins, des difficultés peuvent survenir en utilisant des cibles protéiques plus difficiles, telles que les protéines membranaires, où le milieu de cristallisation est beaucoup plus compliqué, les diagrammes de phase ne sont pas connus et les conditions de cristallisation qui fonctionnent bien ne sont pas encore bien établies. La puce de dialyse offre la possibilité de dépasser ces difficultés et d'étudier les diagrammes de phase sur puce, sans disposer de l'échantillon de protéines précieux et souvent coûteux, en échangeant simplement la solution de cristallisation dans le canal microfluidique.

La polyvalence des dispositifs microfluidiques provient de l'exploitation de la microdialyse pour la cristallisation des protéines sur puce afin de contrôler de manière réversible les conditions de cristallisation et de cartographier la concentration et la température des diagrammes de phase variés à l'aide d'un faible volume de protéines. En outre, l'appareil est compatible avec les expériences in situ de diffraction des rayons X et le prototypage des appareils est peu coûteux et rapide. De nombreux cristaux isomorphes de protéines solubles et membranaires (en préparation) peuvent être cultivés sur puce et on s'attend à ce que toutes ces caractéristiques puissent être utilisées pour des études en série de cristallographie aux rayons X sur des cibles protéiques difficiles dans les installations synchrotron et XFEL. Enfin, l'exécution d'études sur puce et in situ résolues dans le temps est une possibilité future qui pourrait intéresser particulièrement la communauté cristallographique. Par conséquent, en cultivant des cristaux sur la puce de dialyse et en introduisant les réachemins dans le canal microfluidique, soit manuellement (à l'aide d'une seringue) ou automatiquement (avec un système de fluide de contrôle de la pression ou une seringue-pompe), les efforts futurs se concentreront sur la preuve que les puces microfluidiques peuvent être utilisées avec succès pour déclencher des expériences résolues dans le temps sur les faisceaux synchrotron.

Disclosures

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgments

MBS reconnaît le soutien du MI/CNRS dans le cadre du contrat Instrumentation aux limites 2014-2015. NJ reconnaît le Programme international de recherche doctorale (Irtelis) du CEA pour la bourse de doctorat. MBS et SJ reconnaissent le financement du Programme horizon 2020 de recherche et d'innovation de l'Union européenne dans le cadre de l'accord de subvention Marie Skłodowska-Curie numéro 722687. MBS, SJ et NJ remercient LIPhy (UGA) pour l'établissement de chambres propres pour les expériences de microfabrication. IBS reconnaît son intégration à l'Institut interdisciplinaire de recherche de Grenoble (IRIG, CEA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker

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References

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Chimie Numéro 170 microfluidique cristallisation des protéines sur puce diffraction in situ des rayons X cristallisation de la microdialyse cristallographie en série diagrammes de phase puce de dialyse
Cristallisation des protéines sur puce par microdialyse pour <i>les études in situ</i> sur la diffraction des rayons X
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Jaho, S., Junius, N., Borel, F.,… More

Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J. B., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).

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