Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kristallisering av proteiner på chip genom mikrodialys för in Situ-röntgendiffraktionsstudier

Published: April 11, 2021 doi: 10.3791/61660
Automatic Translation
1, 1,3, 1, 1, 2, 1
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258, Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

Detta dokument beskriver tillverkningsprotokollet för mikrofluidiska chips som utvecklats för proteinkristallisering på chip med dialysmetoden och in situ-röntgendiffraktionsexperiment. Mikrofabriceringsprocessen gör det möjligt att integrera ett semipermeabelt regenererat cellulosadialysmembran med eventuell molekylviktsavskärning, mellan två lager av chipet.

Abstract

Detta protokoll beskriver tillverkningen av reproducerbara och billiga mikrofluidiska anordningar som täcker hela rörledningen för kristallisering av proteiner på chip med dialysmetoden och möjliggör in situ enkristall- eller seriekristallografiexperiment vid rumstemperatur. Protokollet beskriver tillverkningsprocessen för mikrochips, manipulering av kristalliseringsexperimenten på chip och behandlingen av in situ insamlade röntgendiffraktionsdata för strukturell klargörande av proteinprovet. Huvuddragen i detta mikrofabriceringsförfarande ligger på integrationen av ett kommersiellt tillgängligt, halvgenomsläppligt regenererat cellulosadialysmembran mellan två lager av chipet. Molekylviktsavskärningen av det inbäddade membranet varierar beroende på makromolekylens och utfällningsmediernas molekylvikt. Enheten utnyttjar fördelarna med mikrofluidisk teknik, såsom användning av minimala volymer av prover (<1 μL) och finjustering över transportfenomen. Chippet kopplade dem till dialysmetoden, vilket gav exakt och reversibel kontroll över kristalliseringsprocessen och kan användas för att undersöka fasdiagram över proteiner på mikroliterskalan. Enheten är mönstrad med hjälp av ett fotoboterbart tiolenbaserat harts med mjuk avtryckslitografi på ett optiskt transparent polymer substrat. Dessutom utvärderades bakgrundsspridningen av materialen som komponerade mikrochipsen och genererade bakgrundsljud, vilket gjorde chipet kompatibelt för in situ-röntgendiffraktionsexperiment. När proteinkristaller har odlats på chip upp till en tillräcklig storlek och populationsuniformitet kan mikrochipsen monteras direkt framför röntgenstrålen med hjälp av en 3D-utskriven hållare. Detta tillvägagångssätt tar itu med de utmaningar som ökar från användningen av kryoprotekter och manuell skörd i konventionella proteinkristallografiexperiment på ett enkelt och billigt sätt. Kompletta röntgendiffraktionsdatauppsättningar från flera isomorfa lysozymekristaller odlade på chip samlades in vid rumstemperatur för strukturbestämning.

Introduction

Att belysa den tredimensionella (3D) strukturen hos biologiska makromolekyler är en ouppenbar strävan i strukturbiologi där röntgenkristallografi fortfarande är den huvudsakliga undersökningstekniken. Den tillämpas för att riva upp de strukturella detaljerna i komplexa makromolekyler, såsom proteiner, och syftar till att underlätta förståelsen av deras verkningsmekanismer och deras deltagande i olika biologiska funktioner. Kraftfulla röntgenkällor vid synkrotroner och röntgenfria elektronlasrar (XFELs) ger alla verktyg som krävs för en djupare inblick i proteinernas struktur vid nära atomupplösning. Trots de fördelar som följer med användningen av röntgenstrålar för strukturella studier finns det inneboende begränsningar för röntgenstrålning och själva kristalliseringsprocessen. Strålningsskador som orsakas av högt röntgenflöde och långa exponeringstider för proteinkristallen framför röntgenstrålen är restriktiva parametrar som kristallografer måste överträffa med kryogenkylning 1. Att hitta de optimala kryokylningsförhållandena kan dock vara mödosamt eftersom konformationsförändringar från den inhemska proteinstrukturen eller artefakterna kan döljas2,3. Dessutom visar nyligen genomförda studier att utföra diffraktionsexperiment vid rumstemperatur leder till lägre specifika strålningsskador4. En annan flaskhals i strukturbiologin är förvärvet av väldriffande kristaller med en tillräcklig storlek5. Små kristaller är lättare att producera, särskilt när det gäller membranproteiner, men är mer mottagliga för strålningsskador även under kryokylningsförhållanden eftersom en hög stråldos måste riktas i en mindre volym jämfört med fallet med större proteinkristaller6. Den nya metoden medseriekristallografi 7,8 vid synkrotroner och XFELs kan kringgå begränsningarna av strålningsskador och samtidigt utnyttja mindre kristaller (200 nm till 2 μm)7 genom att slå samman datauppsättningar från flera, isomorfa och slumpmässigt orienterade proteinkristaller och dra nytta av tillhörande tekniska framsteg som femtosekviska pulser, kortare exponeringstider och mikrofokuserade röntgenstrålar5,7,9,10.

Mikrofluidisk teknik är värdefull för röntgenkristallografi, som uppvisar många fördelar för kristalliseringen av biologiska makromolekyler och deras strukturella undersökning. Att genomföra kristalliseringsexperiment i mikrofluidiska enheter kräver små volymer proteinprov, vilket begränsar produktionskostnaden för dessa högt värderade biomakromolekyler och underlättar screening och optimering av många kristalliseringsförhållanden. Dessutom möjliggör det inneboende förhållandet mellan stora ytor och volym vid mikrofluidisk skala och diffusionsbegränsade transportfenomen fin kontroll över flöden och temperatur- eller koncentrationsgradienter11,12,13,14, vilket gör mikrofluidiska anordningar lämpliga för odling av kristaller av enhetlig storlek och utforskande fasdiagram15,16,17,18,19. Dessutom uppvisar mikrofluidiska verktyg en särskiljande potential att ta itu med ett annat hinder i proteinkristallografi, som är provleveransen, och behovet av att hantera och skörda proteinkristaller innan de används för röntgendiffraktionsexperiment. Metoden för röntgenkristallografi på chip och in situ eliminerar kristallmanipulationen och den potentiella försämringen av kristallkvaliteten före datainsamlingen. Ett brett utbud av mikrofluidiska chips som är kompatibla för in situ-röntgenproteinkristallografi har utformats, utvecklats och testats av många forskargrupper som konfronterar de relaterade begränsningarna som följer av mikrotillverkningsmaterialens natur och deras interaktioner med röntgenstrålar14,19,20,21,22,23. Tillverkningsmaterialen måste vara optiskt transparenta, biologiskt inerta och uppvisa hög transparens mot röntgenstrålning och ett optimalt signal-till-brusförhållande under datainsamlingen.

De flesta kristalliseringsmetoder som tillämpas i konventionell proteinkristallografi24,25 har också implementerats på den mikrofluidiskaskalan 11,14 för på spånkristallisering och in situ X-ray diffraktionsanalys. Enkel, hybrid eller flerskiktad mikrofluidisk apparat som innehåller ångdiffusion26, avdunstning27, gratis gränssnittsdiffusion (FID)28, mikrobatch26, eller till och medsådd 29 har använts för att kristallisera lösliga och membranproteiner. Screening med hög genomströmning och optimering av kristalliseringsförhållanden kanuppnås 30,31 ivälbaserad 32,droppbaserad33, eller ventil-aktiverade34 enheter. In situ Röntgendiffraktionsexperiment av utmanande proteinmål vid rumstemperatur har utförts i mikrochips tillverkade av olika material som PDMS (polydimethylsiloxane), COC (cyklisk olefin copolymer), PMMA (poly(metylmetakrylat))21,22,26,28,29, grafenfilmer23, Kapton35, epoxilim6, eller NOA (Norland Optical Adhesive)19 och materialens transparens för röntgenstrålning och deras bidrag till bakgrundsljud har utvärderats. Dessutom har mikrochips utformats för att koppla in situ och seriella datainsamlingsstrategier i ett enda verktyg för röntgenproteinkristallografiexperiment vid synkrotronkällor23,35,36 och XFELs7.

Rumstemperatur på plats datainsamling har också implementerats i olika leveransmetoder och enheter. Till exempel använde Nogly et al.54 en lipidisk kubikfasinjektor (LCP) för att studera strukturen hos den ljusdrivna fotonpumpen bacteriorhodopsin (bR) genom seriell femtosekonkristallografi (SFX) med hjälp av en XFEL-källa. Kristallstrukturen i bR löstes till 2,3 Å-upplösning, vilket visar kompatibiliteten hos en LCP-injektor med tidsupplöst seriell femtosekonkristallografi (TR-SFX). Baxter et al.55 konstruerade ett multikristallnät med hög densitet, tillverkat av en 100 eller 200 μm tjock polykarbonatplast med laserskurna hål av olika storlekar. Ytterligare 5 μm tjock polykarbonatfilm kan fästas på ena sidan av gallret när du använder enheten för sittande eller hängande kristalliseringsexperiment. Detta rutnät med hög densitet kan användas på flera sätt eftersom kristaller kan laddas direkt på enhetens portar eller kristaller kan odlas på enheten genom ångdiffusion eller LCP-metoden. Dessutom kan nätet justeras i en standardmagnetisk bas och användas för insamling av röntgendata på plats vid kryogena förhållanden eller rumstemperaturförhållanden. På senare tid utvecklade Feiler et al.56 en provhållare för makromolekylär in situ-röntgenkristallografi vid kryogen och omgivningstemperatur med minimalt bakgrundsljudbidrag. Specifikt består hållaren av ett plaststöd, en transparent COC-folie och en mikroporös strukturerad polyimidfolie. Det utformades för att ersätta de vanliga täckbilderna för att ställa in kristalliseringsdroppar, samtidigt som man tillåter manipulering på plats som ligand blötläggning, komplex formation och kryogent skydd utan att öppna kristalliseringsdropp eller manuellt hantera kristallerna. Dessutom kan provhållaren avlägsnas från kristalliseringsplattan och placeras på en magnetisk bas för in situ-datainsamling vid standard goniometerbaserade strållinjer. För datainsamling av omgivningstemperatur avlägsnas COC-folien före experimentet och endast den 21 μm tjocka polyimidfolien bidrar till bakgrundsspridning, vilket i detta fall är minimalt. Dessa exempel utgör bara en liten del av den pågående forskningen och den mängd mångsidiga mikrochips som utvecklats för röntgenproteinkristallografi.

Dialysproteinkristalliseringsmetoden har dock inte införlivats i stor utsträckning inom mikrofluidik. Dialys är en diffusionsbaserad metod som syftar till jämvikt av utfällningskoncentrationen genom ett halvgenomsläppligt membran för att närma sig den nominella koncentrationen för proteinkristallisering och möjliggör exakt och reversibel kontroll över kristalliseringsförhållandena24. Den molekylära viktavskärningen (MWCO) i det halvgenomsläppliga dialysmembranet kan väljas beroende på makromolekylens och utfällningsfaktorernas molekylvikt för att möjliggöra diffusion av små utfällningsmolekyler samtidigt som makromolekylen bibehålls av intresse. På grund av dialysprocessens reversibilitet kan den användas i kombination med temperaturreglering för att frikoppla och optimera nukleation och kristalltillväxtoberoende av 37 för att undersöka fasdiagram genom att ändra den utfällande koncentrationen samtidigt som samma proteinprov används. Integrationen av membran i mikrofluidik granskas av de Jong et al.38 och fallstudierna i biologi implantering av dialys i mikrochips kan huvudsakligen listas i provberednings-, koncentrations- eller filtreringsapplikationer39,40,41,42 eller cellrelaterade studier43,44. Pervaporation genom PDMS användes av Shim et al.37 för att studera kärnan och tillväxten av xylanas under olika förhållanden. Vatten genomborrades genom det 15 μm tjocka PDMS-membranet i proteinbehållaren på den mikrofluidiska enheten och ändrade därefter protein- och utfällningskoncentrationen.

Protokollet som utvecklats av Junius et al.19,45 för tillverkning av ett mikrofluidiskt chip kompatibelt för både proteinkristallisering på chip via mikrodialys och in situ-röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur presenteras. Protokollet för enhetstillverkningen är direkt inspirerat av det banbrytande arbete som utförs av Studer och medarbetare12,46 för mikromönstrade klistermärken av fotohärdande tiokonenbaserade harts NOA 81 som bäddar in kommersiellt tillgängliga membran med hjälp av mjuk avtryckslitografi. En innovativ modifiering av metoden resulterade i mikrochips som gjorde det möjligt att använda mikrodialys för att noggrant övervaka och kontrollera de experimentella parametrarna för proteinkristallers tillväxt på chip och samtidigt utnyttja fördelarna med mikrofluidik, såsom minskad konsumtion av proteinprover per experiment (<1 μL). I ett tidigare arbete visades principerna för dialys som tillämpas på ett makroskalesystem (typisk volym >20 μL) för screening och optimering av kristalliseringsförhållanden genom kartläggning av temperaturutfällande koncentrationsfasdiagram47. I detta arbete beskrivs ett protokoll för att producera dialysmikrochips som innehåller regenererade cellulosa (RC) dialysmembran av olika MWCO för att utföra kristalliseringsanalyser på chip och in situ X-ray diffraktionsdatainsamling. Materialen som består av mikrochipsen har utvärderats för deras transparens för röntgenstrålar19 och apparaterna kan ställas in direkt framför röntgenstrålen för rumstemperatur i situ diffraktionsexperiment, med undantag för manuell hantering och minimering av nedbrytningen av ömtåliga proteinkristaller. I en fallstudie odlades hen äggvita lysozyme kristaller på chip via mikrodialys som genererar en enhetlig storlek befolkning. Mikrochipet monterades sedan framför röntgenstrålen med ett 3D-printat stöd19 och kompletta in situ diffraktionsdatauppsättningar samlades in vid rumstemperatur från flera isomorfa kristaller, vilket visar chipsens höga potential och relevans för synkrotron seriell kristallografi studier av utmanande makromolekylära mål.

Protocol

1. Maskdesign och mastertillverkning

  1. Rita önskade geometrier för den mikrofluidiska enheten med hjälp av någon vektorritningsprogram. För varje lager av fotoresisten som kommer att användas för nästa steg i fotolitografi, förbered en individuell mask: en mask skisserad med kanaler och pelare och en mask som bara innehåller pelarna.
  2. Översätt CIF-filerna som genereras av ritprogramvaran till filmfotomasker. Detta kan göras genom kommersiella tjänster. Kräv lämplig fotomask beroende på valet av fotoresist som används under fotolitografi.
    OBS: För SU-8-fotoresisten, beställ masker med svarta funktioner på en transparent bakgrund. SU-8 är en epoxibaserad negativ fotoresist, vilket innebär att under exponeringen för UV-ljus (365 nm) är de delar som utsätts för UV korslänkade medan resten förblir lösliga. Därför kommer alla svarta mönster på masken inte att korslänkas av UV-ljus under fotolitografin. Kanaler och pelare kommer att graveras på mästarna.
  3. Förbered två mästare på kiselplattor för varje chips design genom fotolitografi med SU-8 negativ fotoresist.
    OBS: Steg 1.3.1-1.3.7 utförs i ett rent rum. Stegen som beskrivs nedan är de traditionella stegen i fotolitografi följt av PDMS mjuka litografi, som beskrivs i många läroböcker. Alla värden för de experimentella parametrarna (fotoresist, tidslängd, temperatur etc.) beror på många subtila parametrar och måste optimeras beroende på vilken apparat som används.
    1. Använd en 3-tums kiselskiva och behandla ytan med plasma i 90 s för att underlätta nedfall och fastsättning av SU-8-fotoresisten.
    2. Häll ungefär 3 ml SU-8-motstånd på mitten av skivan och snurra beläggningen SU-8 ner till önskad tjocklek (Figur 1A). För 50 μm nominell tjocklek, använd SU-8 3050 och spincoat för 10 s vid 500 varv/min och successivt i 30 s vid 3500 varv/min. Mjukbaka fotoresisten på en kokplatta i 15 min vid 368 K för att delvis stelna genom att låta lösningsmedlet i hartset avdunsta och förhindra att det fastnar på fotomasken. Lämna sedan skivan i rumstemperatur i 2 minuter.
    3. Exponera fotoresisten för UV-ljus (Figur 1B). Använd en maskjusterare med en effekt på 35 mW cm-2 och 8 s exponeringstid.
    4. Fortsätt med bakningen efter exponeringen. Placera skivan på en kokplatta i 5 min vid 368 K för att slutföra den fotoreaktion som åberopas av UV-exponeringen.
    5. Ta bort allt SU-8-motstånd som inte var korslänkat genom att placera skivan i ett bad som innehåller propylenglykolmetyletatacetat (PGMEA) och rör om i 15 minuter. Skölj skivan med isopropanol tills ingen suddig nederbörd kan observeras. Torka skivan med kvävegas och förvara den i en petriskål (100 mm x 15 mm standardstorlek).
    6. Behandla skivans yta med en silan för att underlätta lossning av polydietylsiloxan (PDMS) som kommer att användas för att tillverka 2 frimärken. Deponera skivan på en knackad kokplatta på 368 K i 10 min under ångatmosfären av hexamethyldisilazane (HMDS).
      OBS: Om det blir svårt att skala av PDMS från skivan efter flera användningsområden, bör skivans yta behandlas igen med HMDS-ånga.
    7. Den första mästaren som innehåller kanalerna och pelarna är klar. Upprepa dessa steg och förbered den andra huvudmönstring endast pelarna.
      OBS: Under fotolitografi är målet att erhålla enhetens geometrier på SU-8-masterna med en höjd av 50 μm. Men när de två SU-8-mästarna är tillverkade, mät höjden på de geometrier som är ingraverade på masterna med en profilometer för att förvärva det experimentella värdet. Det uppmätta värdet för båda SU-8-masterna som tillverkas för detta protokoll är cirka 45 μm.

2. PDMS mögel tillverkning

OBS: Följande steg i protokollet kan utföras i vilket laboratorium som helst så länge en laminär flödeshuv används, gult ljus i rummet används vid arbete med NOA 81-hartset (steg 3.6-3.11) och en källa till UV-ljus finns tillgänglig för polymerisering av NOA 81-hartset (steg 3.7 och 3.11).

  1. Förbered 50 g PDMS silikonbas och dess härdningsmedel i ett massförhållande på 10:1.
  2. Blanda båda ingredienserna i en bägare med en spatel och placera blandningen i en vakuumkammare för att ta bort alla luftbubblor.
  3. Häll 25 g av det förblandade PDMS i SU-8-mastern (lagrad i en petriskål) som mönstrar kanalerna och pelarna upp till en höjd av cirka 5 mm. Häll de återstående 25 g av PDMS i den andra SU-8 master mönstring endast pelarna upp till en höjd av ca 5 mm (Figur 1C).
  4. Placera båda petriskålarna i en ugn och härda PDMS-lagren på 338 K i 1 timme.
  5. Skär det härdade PDMS-skiktet runt su-8-mästarnas mönster med en skalpell och skala försiktigt av PDMS-formarna från mästarna (Figur 1D).
    OBS: Förfarandet som beskrivs ovan, kallat replikformning, används ofta för att förbereda formar av PDMS som kommer att fästas på glasytor och vara en del av en mikrofluidiskenhet 53. I detta protokoll är PDMS-formarna inte en del av chipet, men de används som intermediärer för chiptillverkningen. För varje design bereds 2 PDMS-formar från respektive SU-8-master(figurerna 1D och 1E)och kommer att användas i enlighet därmed (enligt beskrivningen nedan) för tillverkning av mikrochipet.

3. Tillverkning av dialyschip

  1. Placera PDMS-mönstret både kanalerna och pelarna på en styv mikroskopglasrutschbana (3 x 1 tum standardstorlek) med mönstren vända uppåt (Figur 1F). Den centrala pelaren som motsvarar proteinbehållaren överstiger vertikalt med 45 μm från PDMS-formens horisontella yta.
  2. Skär och separera en torr bit av det regenererade cellulosamembranet (RC) och deponera det på PDMS-formens centrala pelare, som stöds på glasrutschbanan (Figur 1F).
    OBS: RC-dialysmembranet är kommersiellt tillgängligt, och molekylviktsavskärningen (MWCO) väljs i enlighet därmed med molekylvikten hos det protein som studeras och de fällningsmedel som används. Storleken på biten av RC-dialysmembranet beror på chipets design. I detta protokoll är 2 prototyper utformade där proteinbehållarens volym är 0,1 eller 0,3 μL. I dessa fall är storleken på dialysmembranbiten 2 x 2 mm2 respektive 4 x 4 mm2.
  3. Placera den andra PDMS-formmönstring endast pelarna vända nedåt ovanpå PDMS-formen som stöds på glasrutschbanan (Bild 1F). Den centrala pelaren i denna form motsvarar proteinbehållaren och överstiger vertikalt (vänd nedåt) med 45 μm från den horisontella ytan.
  4. Rikta in de centrala pelarna i de 2 PDMS-formarna. RC-dialysmembranet är "inklämt" mellan de 2 PDMS-formarna (Figur 1G).
    OBS: Inriktningen mellan mikrostrukturerna i de 2 PDMS-formarna kan åstadkommas visuellt, utan extra utrustning. Annars kan denna manipulering uppnås under ett mikroskop. En liten förskjutning mellan reservoarerna är inte problematisk, så länge den flytande kanalen och ingångs- eller utgångarna inte är helt täckta.
  5. Desiccate enheten i 30 min i en vakuumkammare för att ta bort alla fångade luftbubblor i PDMS-formarna och för att främja införandet av hartset under nästa steg i tillverkningen.
    OBS: De 2 PDMS-formarna hålls på plats genom PDMS-PDMS vidhäftning och inget extra tryck eller annat sätt att bryta den tillfälliga bindningen krävs.
  6. Fyll det tomma utrymmet mellan de 2 PDMS-formarna med det fotoboterbara, tioenbaserade hartset NOA 81 med kapillär imbibition (figur 1H och 1I).
  7. Härda hartset genom exponering för UV-ljus (365 nm) i 8 s med hjälp av en kollimerad UV-lampa (effekt 35 mW cm-2).
    OBS: Denna första exponering gör att NOA 81-harts delvis kan korsas eftersom ett tunt lager noa 81 i kontakt med PDMS-formarna på båda sidor förblir oskyddat.
  8. Skär överskottet av NOA 81 från de yttre sidorna av PDMS-formarna med en skalpell.
  9. Ta bort den övre PDMS-formen med den delvis korslänkade NOA 81 fast på den från den nedre PDMS-formen och glasrutschbanan.
  10. Kapa ett 175 μm tjockt PMMA-ark i standardmåtten på en mikroskopglasrutschbana (3 x 1 tum) och skala av plastskyddsplåtarna från varje sida av PMMA-biten. Tryck försiktigt på monteringen av den övre PDMS-formen och den delvis härdade NOA 81 på PMMA-stycket (Figur 1J).
  11. Härda igen NOA 81 genom exponering för UV-ljus i 60 s och ta bort den övre PDMS-formen (Figur 1K). Hartset fäster vid PMMA-substratet utan ytterligare behandling.
    OBS: PDMS-formarna kan återanvändas ungefär upp till 5 gånger efter att ha tvättat dem med isopropanol och aceton, så länge formarna inte är böjda. RC-dialysmembranet ingår i NOA 81-klistermärket och ingen ytterligare manipulering eller mekanisk fastspänning krävs.

4. Fluidiska kontakter

OBS: Utformningen av det mikrofluidiska chipet består av en linjär fluidisk kanal för kristalliseringslösningen och en central reservoar för proteinprovet (proteinbehållaren), båda visade från en toppvy av två mikrochips i figur 2A. Ett RC-dialysmembran är inbäddat mellan dessa två mikrostrukturer (figur 2D) och kristalliseringsprocessen utvecklas medan utfällningsmedel från kristalliseringslösningen sprider sig över membranet på grund av en koncentrationsgradient mellan de två facken i chipet som separeras av membranet. Den mikrofluidiska kanalen är inpräntad på den nedre PDMS-formen (Figur 1F). När tillverkningsprotokollet för chipsen är klart placeras den linjära kanalen på det nedre lagret på NOA 81-klistermärket i kontakt med PMMA-substratet, som visas i figur 1K. Ett inlopp och en utloppsåtkomstpunkt för kristalliseringslösningen finns i varje ände av den linjära kanalen och ser ut som hål (total höjd 90 μm) som man kan se i figur 2A. För hantering av kristalliseringslösningen måste kontakter läggas till på åtkomstpunkterna.

  1. Bindningskontakter som är kommersiellt tillgängliga (NanoPort) på inloppet och utloppet på den mikrofluidiska kanalen med snabbt epoxilim(figur 2C).
  2. Välj lämplig diameter på PTFE-rören baserat på anslutningarnas storlek. PTFE-rören kommer att användas för införandet av kristalliseringslösningen i chipens flytande kanal.
    OBS: Kommersiellt tillgängliga satser rekommenderas för enkel och exakt kontroll över flödeshastigheten och kombineras vanligtvis med automatiserade tryckdrivna eller flödesstyrda (sprutpumpar) för blandning och vätskehantering. Kristalliseringslösningen kan dock införas manuellt i den linjära kanalen med en engångsspruta i plast. I det här fallet föreslås steg 4.3 till 4.5.
  3. Fyll en engångsspruta på 1 ml med kristalliseringslösningen. För de chips som presenteras i detta protokoll är 400 μL tillräckligt för att fylla hela den flytande kanalen.
  4. Kapa två pipettspetsar så att spetsens diameter på ena sidan är lika med PTFE-rörets innerdiameter som ska användas för lösningshanteringen. Limma de beskurna spetsarna på kanalens accesspunkter med snabbt epoxilim (Bild 2B).
  5. Anslut sprutan med de beskurna spetsarna med en bit PTFE-rör av lämplig storlek och introducera lösningen i kanalen genom att ständigt trycka långsamt på sprutkolven.

5. Protein inkapsling

OBS: Mönstret på chipet som är dedikerat till att användas eftersom proteinbehållaren fortfarande är så långt öppen för atmosfären. Följande protokoll föreslås för att noggrant begränsa proteinprovet i det mikrofluidiska chipet.

  1. Manuellt pipett en droppe av proteinprovet inuti proteinbehållaren, som ligger precis på RC-dialysmembranet, enligt figur 2E. Proteinprovet varierar beroende på chipens utformning och kan vara 0,1 eller 0,3 μL.
  2. Applicera ett tunt lager av högvakuumt silikonfett runt proteinbehållaren.
  3. Skär en liten bit av ett 175 μm tjockt PMMA-ark och placera det försiktigt ovanför det tunna lagret av silikonfettet. PMMA-biten måste täcka hela ytan av proteinbehållaren där proteinlösningen deponeras.
    OBS: Silikonfettet används för att förbättra lufttätheten och förhindra spridning av proteindroppen. Det finns ingen bindning eller tätning mellan PMMA-biten som används för att täcka proteinbehållaren och NOA 81-klistermärket. Kontakten mellan dem är ett fast/fast gränssnitt. För att producera en övergripande tätning och en lufttät inkapsling av proteinprovet används en bit Kaptontejp enligt beskrivningen i steg 5.4.
    OBS: Det är ibland svårt att begränsa proteinprovet i enhetens dedikerade hålighet (proteinbehållare) när ett tryckdrivet system används för införandet av kristalliseringslösningen i den fluidiska kanalen (steg 6.4). För att undvika det problem som nämns ovan bör relativt låga tryckvärden bibehållas när kristalliseringslösningen cirkulerar. Ett injektionstryck på 20-60 mbar för vattenlösningar eller 50-150 mbar för mer trögflytande lösningar (PEGs, glycerol) föreslås19.
  4. Skär en bit Kapton tejp (20 μm tjock) tillräckligt stor för att täcka PMMA biten ovanför proteinbehållaren och hålla fast på NOA-chipet runt alla kanter. Proteinprovet är inkapslat i behållaren och chipet är redo att användas för kristalliseringsexperimentet, vilket visas i figur 2C.
    OBS: Spånorna kan återanvändas flera gånger så länge dialysmembranet och vidhäftningen av NOA på PMMA-substratet inte försämras. Om dessa delar av chipet är skadade observeras läckor som verifierar att enheten inte längre kan användas. Att tvätta spånorna beror på kristalliseringslösningen. När det gäller lösningar med låg viskositet (salter, buffertar) kan den fluidiska kanalen tvättas genom att bara införa destillerat vatten och låta det flöda i några minuter. 400 μL är den volym som krävs för att helt kunna byta ut en lösning inom kanalen mot en annan lösning. Vid mer trögflytande lösningar (PEGs, glycerol) rekommenderas inte återanvändning av spånorna eftersom det inte räcker att tvätta kanalen endast med vatten. Den övre delen av chipet, där proteinbehållaren ligger, kan också tvättas med destillerat vatten och torkas med tryckluft.

6. Proteinkristallisering på chip

  1. Väg lyofiliserat ynäggvitt lysozymepulver och lös upp i destillerat vatten för att få en slutlig koncentration på 30 mg mL-1.
  2. Filtrera proteinlösningen genom ett filter på 0,22 μm och centrifug i 5 minuter med högsta hastighet vid 293 K för att avlägsna alla fasta partiklar. Använd supernaten för kristalliseringsexperimentet.
  3. Bered 500 μL kristalliseringslösning som innehåller bufferten och utfällningsmedlet i de koncentrationer som anges i tabell 1. Filtrera lösningen genom ett filter på 0,22 μm.
  4. Injicera lösningen i chippets inloppspunkt med en spruta eller ett automatiserat tryckstyrt fluidiskt system eller en sprutpump enligt beskrivningen i steg 4.1-4.5.
    OBS: Kristalliseringsexperimentet kan ske antingen under statiskt tillstånd, om den mikrofluidiska kanalen fylls med kristalliseringslösningen och åsidosätts, eller under flytande förhållanden, om den kontinuerligt injiceras inuti kanalen med konstant flödeshastighet. För det senare fallet rekommenderas användning av ett externt tryckstyrt system eller sprutpump. Förverkligandet av experimentet under flytande förhållanden ger också möjlighet att dynamiskt utbyta kristalliseringslösningar inom den fluidiska kanalen. Således kan flera experiment utföras medan du använder samma proteinprov.
  5. När den flytande kanalen är fylld med kristalliseringslösningen förseglar du chippets inlopps- och utloppsportar med parafilmstejp.
  6. Pipett med lämplig volym av proteinlösningen i proteinbehållaren och kapsla in proteinprovet enligt beskrivningen i steg 5.1-5.4.
  7. Förvara chippet på 293 K.
    OBS: Kristallisering via dialys följer en annan kinetisk bana än experiment som utförs med ångdiffusionsmetoden eller satskristallisering och beror djupt på arten av fällbara molekyler som är involverade i diffusionsprocessen, enligt uppmätta data51, och det kan ta längre tid för kärnan att starta. För att förhindra avdunstning, om någon, under denna period, placera chipet i en fuktmättad atmosfär på 293 K.

7. Röntgendiffraktion på plats och på chip

  1. 3D-utskrivet stöd för strållinjer
    1. Skriv ut stödet som kan bära upp till tre chips samtidigt. Stödets dimensioner är desamma som dimensionerna av kommersiella kristalliseringsplattor (96 brunn/ SBS-standard) som är kompatibla med i plattröntgendiffraktionsexperiment.
      OBS: Utskriften av stödet kan tilldelas kommersiella tjänster. Stödet utformades med hjälp av en 3D-CAD-designprogramvara och visas i figur 3A under kristalliseringsexperiment för protein på chip och i figur 3B under in situ X-ray diffraktionsdatainsamling vid BM30A-FIP (ESRF).
    2. Stabilisera dialyschipsen på stödet med en enkel- eller dubbelsidig tejp.
  2. In situ Röntgendiffraktion
    1. Samla röntgendiffraktionsdata vid rumstemperatur från kristaller som odlas i proteinbehållaren. Använd till exempel röntgenstrålar med en energi på 12.656 keV, ett flöde på 3.32 x 1010 fotoner s-1 och en strålstorlek på 250 x 250 μm2. Spela in diffraktionsbilderna med en ADSC Quantum 315r-detektor med en matris på 3 x 3 CCD för en aktiv yta på upplösningen 315 x 315 mm2 och 9,4 megapixlar.
      OBS: Diffraktionsdata för lysozymekristallerna som odlades på dialyschipsen samlades in vid BM30A-FIP-strållinjen vid European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Strålstorleken, flödet och detektortypen kan dock vara olika i andra röntgenstrålningskällor. Det 3D-utskrivna stödet möjliggör datainsamling med ett vinkelområde på -40° till +40° runt kristallen. Antalet lysozymekristaller som exponeras för datainsamling på plats, antalet diffraktionsmönster som samlats in för varje kristall, svängningsvinkelområdet per exponering och exponeringstiden sammanfattas i tabell 2.
  3. Databehandling
    1. Bearbeta de fullständiga eller partiella datauppsättningarna med diffraktionsmönstren för lysozymekristallerna med XDS-programmet48.
    2. Generera HKL-filen för varje datauppsättning och skala dem med XSCALE-programvaran48.
    3. Använd molekylär ersättning med programmet Phaser of the CPP4 suite49 och bestäm faserna för modellbyggnad. För det här steget använder du de kända 3D-koordinaterna för lysozyme från Posten Protein Data Bank (PDB) 193L.
    4. Förfina strukturen med Phenix52 och inspektera den slutliga proteinmodellen med COOT50.

Representative Results

De mikrofluidiska chips som utvecklats av Junius et al.19,45 är kompatibla för både proteinkristallisering på chip med mikrodialysmetoden och in situ X-ray diffraktionsdatainsamling vid rumstemperatur. Bilder av mikrochipsen, deras detaljerade design, de fluidiska kontakterna och RC-dialysmembranet illustreras i figur 2. Kristalliseringsexperimenten sätts upp genom att manuellt pipetting proteinprovet direkt i proteinbehållaren och införa kristalliseringslösningen i den linjära fluidiska kanalen med ett automatiserat tryckdrivet system eller sprutpump eller manuellt med hjälp av en spruta. Proteinbehållaren och den flytande kanalen kan särskiljas i figur 2A. Konstruktioner för tillverkning av chips med 0,1 μL eller 0,3 μL maximal volym för proteinbehållaren visas i figur 2A till vänster respektive höger. Chips med en maximal kapacitet på 0,2 μL eller 0,7 μL för proteinprovet visas någon annanstans19. Höjdpunkten i protokollet för enhetstillverkningen kan minskas när det gäller användningen av det fotosäkerhetsbaserade tiokonenbaserade hartset NOA 81 som bäddar in kommersiellt tillgängliga RC-dialysmembran i olika MWCOs. Under tillverkningen av mikrofluidiska anordningar präglas den linjära fluidiska kanalen på den nedre PDMS-formen (figur 1F), medan den övre PDMS-formen endast består av de mönstrade pelarna för proteinbehållaren och inlopps- och utloppsportarna (Figur 1F). När NOA 81 är korslänkad och PDMS-formarna tas bort från enheten (figur 1K), är den fluidiska kanalen placerad i mikrochipens bottenskikt och proteinkanalen och inlopps- / utloppsportarna finns på båda lagren. Figur 1L illustrerar ett sidovyschema för dialyschipet där alla skikt av enheten och deras respektive tjocklek anges. Höjden på de mönster som är inpräntade på chipsens bottenskikt (fluid kanal) är cirka 45 μm, medan den totala höjden på inlopps- och utloppsportarna är cirka 90 μm. Proteinbehållaren (45 μm höjd) illustreras också i figur 2D och 2E. Justeringen av de två skikten undersöktes under ett optiskt mikroskop och den del av RC-dialysmembranet som ingår i mikrochipet kan tydligt särskiljas i figur 2D. I samma figur har luft fastnat i den fluidiska kanalen under injektionen av kristalliseringslösningen, vilket kan ses i den övre vänstra delen av proteinbehållaren. Figur 2E är ett närbildsfoto av proteinbehållaren efter den manuella nedfallet av proteindroppen med en pipett och före inkapslingen av droppen med en bit PMMA- och Kaptontejp, enligt beskrivningen i steg 5.2 och 5.3 i protokollet. Det mikrofluidiska chip som är redo att användas för kristalliseringsexperiment, efter inkapslingen av proteinprovet och limningen av de fluidiska kontakterna, avbildas i figur 2C. Den lufttäta enheten säkerställer att läckage inte kan uppstå. De fluidiska kontakterna för mikrofluidkanalens inlopps- och utloppsportar kan antingen vara de kommersiellt tillgängliga enligt beskrivningen i steg 4.1 i protokollet och visas i figur 2C, eller engångstips för laboratoriepipetter kan användas för samma ändamål (figur 2B, protokollsteg 4.4).

För tillverkning av mikrofluidiska chips valdes optiskt transparenta och biologiskt inerta material, vilket visar hög kompatibilitet för in situ-röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur. Interaktionerna mellan röntgenstrålar, absorption och spridning, med material som komponerar den mikrofluidiska enheten och den omgivande atmosfären (luften) genererar en signal som kallas bakgrundsljud. Detta brus sammanfattar diffraktionssignalen för de proteinkristaller som registrerats av detektorn, förfaller signal-till-brusförhållandet och bör bibehållas så lågt som möjligt under insamlingen av röntgendiffraktionsdata. Vi har utvärderat bakgrundsljudet som genereras av materialen som består av proteinreservoaren, som ligger i röntgenstrålens direkta väg. Proteinbehållaren består av RC-dialysmembranet, Kaptontejpen och två PMMA-bitar, en som används som substrat för mikrochipet och en som används för inkapsling av proteinprovet. Tjockleken på PMMA är 2 x 175 μm, av Kaptonbandet 20 μm och RC-dialysmembranet är cirka 40 μm tjockt (Figur 1L). Den totala tjockleken på dessa lager är ca 410 μm och NOA 81-skiktet är inte i den direkta röntgenbanan. Förutom tjockleken på tillverkningsmaterialen är deras densitet också avgörande för att mäta bakgrundsspridningsljudet, eftersom röntgenspridningen ökar med det elementära atomnumret. Av denna anledning användes heliumflöde (en funktion som tillhandahålls vid BM30A-FIP vid ESRF) istället för luft under datainsamlingen för materialkarakterisering och för proteindiffraktionsexperiment. Figur 3C illustrerar bakgrundsljudet från Kaptontejpen, RC-dialysmembranet, PMMA-arket och deras sammansättning i heliumatmosfären. Varje material exponerades i 20-tal för röntgen på 0,98 Å våglängd och provdetektoravståndet var 200 mm. Experimenten utfördes vid BM30A-FIP-strållinjen vid ESRF, vilket förklaras i steg 7 i protokollet. Diffusa ringar som tillskrivs röntgenstrålens interaktioner med materialen kan särskiljas för Kaptontejpen med en upplösning som är lägre än 4 Å, PMMA-arket mellan 4-8 Å och dialysmembranet mellan 4-5 Å upplösning. Bakgrundsljudet som genereras av dialyschipet observeras främst vid en upplösning lägre än 6 Å som inte påverkar behandlingen av högupplösta diffraktionsdata för de stora lysozymekristallerna. Bakgrundsspridningsintensiteten som en funktion av upplösningen för mikrochipet och de separata materialen visas någon annanstans19. I den mätning som presenteras i figur 3Cvar dialyschipet tomt på någon lösning (protein- eller utfällbar lösning) och bidraget från förekomsten av lösning till bakgrundsljudet har inte mätts. Chipsen monterades framför röntgenstrålen med ett 3D-printat stöd (Figur 3B) utformat för in situ diffraktionsexperiment19. Samma stöd med dimensioner som motsvarar dimensionerna på en 96-brunns/SBS standard kristalliseringsplatta kan dock användas för att utföra 1 till 3 kristalliseringsexperiment samtidigt, eftersom den kan hålla upp till 3 chips samtidigt (Figur 3A).

Experiment utfördes för att utvärdera effektiviteten hos de mikrofluidiska enheterna för kristallisering på chip av modelllösliga proteiner med mikrodialysmetoden. Den fluidiska kanalen fylldes enligt beskrivningen i steg 4 i protokollet, medan steg 5 och 6 beskrev hur man kapslar in proteinprovet i den dedikerade proteinbehållaren och hur man ställer in kristalliseringsexperimenten. Figur 4 visar lysozymkristaller odlade vid 293 K under 1,5 M natriumklorid (NaCl) med 0,1 M natriumacetat (CH3COONa) pH 4,0(A)och under 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5 med 30% polyetylenglykol (PEG) 400 (B). Det lyophilized lysozyme pulvret upplöstes i vatten till en slutlig koncentration av ~30 mg mL-1 eller i 20 mM CH3COONa pH 4.2 buffert till en slutlig koncentration av ~20 mg mL-1 för de experiment som illustreras i figurerna 4A respektive 4B. Volymen av proteinprovet i båda experimenten var ca 0,3 μL och MWCO för RC-dialysmembranet inbäddat i mikrochipsen ligger i intervallet 6-8 kDa. Lysozymekristallerna i figur 3A växte inom 1 timme och kristallerna i figur 3B växte inom 30 minuter från experimentets början. Kristalliseringsexperimenten utfördes under statiska förhållanden. Det har dock visats19 att genomförandet av experimenten under flytande förhållanden ger möjlighet att dynamiskt utbyta kristalliseringsförhållandena och studiefasdiagrammen, vilket verifierar mikrodialysmetodens reversibilitet.

In situ Röntgendiffraktionsdata från lysozymekristallerna i figur 4A samlades in för att visa dialyschipsens lämplighet för sådana experiment. Datainsamlingen utfördes vid BM30A-FIP-strållinjen (ESRF) vid rumstemperatur, enligt beskrivningen i steg 7.2.1 i protokollet. Mikrochipsen monterades vid strållinjen med hjälp av det 3D-printade stödet (figur 3B) och fullständiga röntgendiffraktionsdatauppsättningar samlades in från två enda lysozymekristaller som odlades på chip under de förhållanden som anges i den andra raden i tabell 1. De observerade reflektionerna av datamängderna bearbetades, indexerades och integrerades med XDS48 och den molekylära ersättningen och förfiningen uppnåddes med phaser49 respektive Fenix52. Den kristallografiska statistiken för den fullständiga datamängden för varje lysozymekristall och för sammanslagning av de två datamängderna finns i tabell 2. För den molekylära ersättningen användes PDB-posten 193L.

Elektrondensitetskartor från en enda lysozymkristall och den sammanslagna datauppsättningen av de två kristallerna har erhållits vid 1,95 Å respektive 1,85 Å, och illustreras i figurerna 5A respektive 5B. Båda elektrontäthetskartorna visar detaljerad strukturell information som kan erhållas genom in situ-röntgendiffraktionsexperiment som utförs direkt på dialysmikrochipet vid rumstemperatur från en enda kristall eller från flera kristaller, vilket gör chipsen kompatibla för in situ-röntgenkristallografistudier.

Figure 1
Bild 1: Schematisk illustration av dialyschipstillverkningen. (A) SU-8 harts deponeras på två kiselplattor och snurrar belagda. (B)En SU-8-master förvärvas efter att ha bestrålat fotoresisten med UV-ljus genom en fotomask och utvecklat de oexponerade delarna. C)PDMS doseras på SU-8-masterna och efter att ha härdats vid 338 K i 1 h,(D)skalas de 2 PDMS-formar som framställs genom replikgjutning och prägling av mikromönstren av masterna och (E) skärs till lämplig storlek. (F) PDMS-formarna stöds på en glasrutschbana som innehåller RC-dialysmembranet mellan de två centrala pelarna. (G) De 2 PDMS-formarna justeras sedan och uttorkas i ~ 30 minuter i en vakuumkammare. (H) NOA 81-hartset hälls in mellan de två formarna och (I) fyller utrymmet med kapillritet. (J) Efter den första exponeringen för UV-ljus avlägsnas den nedre PDMS-formen och monteringen deponeras på ett PMMA-ark. (K) Den andra UV-exponeringen följer för att helt polymerisera NOA 81-hartset och dialyschipet är färdigt att användas efter att den återstående övre PDMS-formen har avlägsnats. (L) Sidovyschema för dialyschipet där alla skikt av anordningen och deras respektive tjocklek anges. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2:Dialyschips som bäddar in ett RC-dialysmembran för kristallisering av chipprotein och in situ-röntgendiffraktionsexperiment. (A) NOA 81 mikrochips på 175 μm tjockt PMMA-substrat med en proteinreservoar på 0,1 μL (vänster) och 0,3 μL (höger) nominell volym. (B)Mikrochips med pipettspetsar som fluidiska kontakter limmade på inlopps- och utloppsportarna på den flytande kanalen. C)Bild av ett mikrochip under ett kristalliseringsexperiment. Proteinprovet är inkapslat med en bit av 175 μm tjock PMMA-ark och Kapton-tejp. Peek Nanoport-kontakter används för inlopps- och utloppsportarna på den fluidiska kanalen. D)Proteinbehållarens övre vy under cirkulationen av kristalliseringslösningen i den flytande kanalen. Luft fångas i den övre delen av behållaren precis under RC-dialysmembranet, vilket tydligt kan detekteras. e)Dialysbehållarens övre vy genom ett optiskt mikroskop under nedfallet av proteinprovet. Proteindroppen deponeras precis ovanför det inbäddade RC-dialysmembranet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3:Det 3D-printade stödet (A)för mikrochips som används under kristalliseringsexperiment och (B) monterat framför röntgenstrålen vid BM30A-FIP-strållinjen vid ESRF för in situ-röntgendiffraktionsexperiment. (C) Bakgrundsljud som genereras av interaktionen mellan röntgenstrålar med Kapton, RC-dialysmembran, PMMA och dialyschipet (från vänster till höger). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4:Kristallisering på chip av lysozyme med mikrodialysmetoden. a)Lysozyme (~30 mg ml-1)kristaller odlade på chip under 1,5 M NaCl och 0,1 M CH3COONa pH 4.0 och( B) lysozyme (~ 20 mg mL-1)kristaller odlade under kristalliseringsförhållanden som innehåller 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5, och 30% PEG 400. Båda experimenten utfördes på 293 K. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5:Elektrontäthetskartor över den raffinerade lysozymen från (A) en enda kristall och (B) den sammanslagna datauppsättningen med två kristaller som odlas på chip via mikrodialys. Kartorna erhölls på 1,95 Å respektive 1,84 Å, konturerade vid 1σ. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Protein Proteinkoncentration
(mg mL-1)		 Protein bufffer Inledande koncentration av
fällningslösning		 MWCO från RC
dialysmembran
Jag är inte så bra på att se till att det finns en		 Temperatur
K) I artikel 3.1 skall
Lysozym - 30 Vatten 1,5 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,0		 6 - 8 293
Lysozym - 20 20 mM CH3COONa pH 4,2 1 M NaCl
0,1 M CH3COONa pH 4,5
30% PEG 400		 6 - 8 293

Tabell 1: Proteinbuffertens sammansättning och den utfällbara lösningen för kristallisering av lysozyme med mikrodialysmetoden. Lysozyme kristaller odlas på chip med villkoren i andra raden användes för in situ röntgen diffraktion data insamling.

Protein Lysozym Lysozym Lysozym
Antal kristaller 1 1 2
Antal diffraktionsramar 40 30 70
Oscillation (°) per exponering 1 1
Exponeringstid (er) 30 30
Temperatur (K) 293 293 293
Rymdgrupp P43212 P43212 P43212
Parametrar för enhetsceller 78.86 78.86 37.87
90.0 90.0 90.0		 79.17 79.17 37.95
90.0 90.0 90.0		 78.47 78.47 37.65
90.0 90.0 90.0
Upplösningsområde (Å) 27.31 - 1.95
(2.02 - 1.95)		 27.39 - 1.96
(2.03 - 1.96)		 27.17 - 1.85
(1.91 - 1.85)
Mosaik (°) 0.319 0.121
Totala reflektioner (observeras) 25127 (3552) 19991 (3001)
Unika reflektioner (observeras) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975)
Redudancy (rödudancy) 2.90 (2.61) 2.41 (2.27)
Fullständighet (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15)
Menar jag/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7
CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0
R-sammanslagning 0.184
R-meas (på andra) 0.139 0.221 0.219
R-pim (engelska) 0.116
Reflektioner som används vid förfining 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965)
Reflektioner som används för R-fria 864 (78) 846 (85) 1039 (96)
R-arbete 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102)
R-fri 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703)
Antal icke-väteatomer 1069 1071 1096
Makromolekyler 1012 1012 1012
Vatten 55 57 82
Liganden 2 2 2
Proteinrester 131 131 131
Rms (obligationer, Å) 0.008 0.009 0.005
Rms (vinklar, °) 1.17 1.26 1.05
Ramachandran favoriserade (%) 98.43 97.64 99.21
Ramachandran tillåtet (%) 1.57 2.36 0.79
Ramachandran avvikande (%) 0.00 0.00 0.00
Avegare B-faktor 34.26 28.54 24.34
Protein 33.94 28.14 23.62
Vatten 40.23 35.57 33.16
Ligander 33.23 29.63 24.77

Tabell 2: Datainsamlingsparametrar, kristallografisk statistik och förfiningsstatistik över lysozymekristaller som odlas på chip via mikrodialysmetoden. Värden som anges inom parentes motsvarar skalet med högsta upplösning. Den fjärde kolumnen motsvarar värden som erhållits efter sammanslagning av datauppsättningarna i den andra och tredje kolumnen.

Discussion

En mikrofluidisk enhet har utvecklats för proteinkristallisering på chip med mikrodialysmetoden och in situ-röntgendiffraktionsexperiment vid rumstemperatur. NOA 81-chips som integrerar RC-dialysmembran i någon MWCO för att använda mikrodialys för kristallisering av protein på chip kan tillverkas. Tillverkningsmaterial med relativt hög röntgentransparens användes, vilket gjorde chipsen kompatibla för in situ-proteinkristallografi. De tillverkningsmaterial som komponerar facket för proteinkristallisering av enheten (PMMA, Kapton, RC dialysmembran) utvärderades för att generera lågt bakgrundsljud. Specifikt observeras bakgrundsljudet som genereras av dialyschipet främst vid låg upplösning (> 6 Å) och påverkar inte behandlingen av högupplösta diffraktionsdata för de stora lysozymekristaller som krävs för bestämning av proteinstrukturer. Automatiseringen av datainsamlingen förstärks med hjälp av ett 3D-printat stöd som kan monteras direkt i makromolekylära kristallografistrålar och bära upp till tre mikrochips samtidigt. På så sätt undviks manuell skörd och manipulering av de bräckliga proteinkristallerna. Dessutom sker datainsamlingen vid rumstemperatur, vilket undviker behovet av kryoprotection som kan relateras till konformationsförändringar från den inhemska proteinstrukturen2,3.

Användningen av mikrodialys som metod för att odla kristaller på chip gör det möjligt att noggrant övervaka och kontrollera kristalliseringsprocessen. Som diskuterats i introduktionen har de flesta av de konventionella proteinkristalliseringsmetoderna implementerats med hjälp av mikrofluidiskaenheter 11,14. Fördelarna med dialys för proteinkristallisering hade dock ännu inte utnyttjats fullt ut i mikroskalan. Mikrodialys på chip ger möjlighet att studera fasdiagram och utföra screening och optimering av kristalliseringsförhållanden med samma proteinprov19. För de prototyper som presenteras i detta arbete är proteinförbrukningen per chip begränsad ner till 0,1 eller 0,3 μL. Baserat på det experimentella arbetet hittills härrör de mest kritiska stegen i protokollet inte från chipsens tillverkningsprocedur utan från kristalliseringsprocessen. Tillverkningsprotokollet innehåller många steg men det är enkelt och möjliggör tillverkning av många enheter (20 till 30 chips) på en enda dag i det rena rummet, med relativt billiga material. Kristalliseringen på chip av proteiner kan dock vara ett känsligt förfarande på grund av den inneboende stokastiska karaktären hos nukleation och kristalltillväxt, särskilt i mikroskalan. En fallstudie har beskrivits, där väletablerade villkor användes för kristallisering av lysozyme som gav robusta, väldefinierade kristaller lämpliga för in situ X-ray diffraktion data insamling. Ändå kan svårigheter uppstå genom användning av mer utmanande proteinmål, såsom membranproteiner, där kristalliseringsmediet är mycket mer komplicerat, fasdiagram är inte kända och väl fungerande kristalliseringsförhållanden ännu inte är väletablerade. Dialyschipet ger möjlighet att överträffa dessa svårigheter och studiefasdiagram på chip, utan att kassera det värdefulla och ofta kostsamma proteinprovet, genom att bara byta kristalliseringslösningen inom den mikrofluidiska kanalen.

Mångsidigheten hos mikrofluidiska enheter härrör från att utnyttja mikrodialys för proteinkristallisering på chip för att reversibelt kontrollera kristalliseringsförhållanden och kartlägga koncentration och temperatur varierade fasdiagram med låg proteinvolym. Dessutom är enheten kompatibel med in situ-röntgendiffraktionsexperiment och prototyperna av enheterna är billiga och snabba. Många isomorfa kristaller av lösliga och membranproteiner (som beredning) kan odlas på chip och det förväntas att alla dessa funktioner kan användas för seriella röntgenkristallografistudier av utmanande proteinmål vid synkrotron- och röntgenanläggningar. Slutligen, att utföra on-chip och in situ tidsavgjorda studier är en framtida möjlighet som kan vara av betydande intresse för det kristallografiska samhället. Genom att odla kristaller på dialyschipet och introducera reagenserna i den mikrofluidiska kanalen, antingen manuellt (med en spruta) eller automatiskt (med ett tryckkontrollvätskesystem eller en sprutpump), kommer framtida ansträngningar att fokusera på att bevisa att mikrofluidchipsen framgångsrikt kan användas för att utlösa tidsupplösta experiment på synkrotronstrålar.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

MBS bekräftar stödet från MI / CNRS enligt kontraktet Instrumentation vid gränserna 2014-2015. NJ uppmärksammar CEA:s internationella forskarutbildning (Irtelis) för forskarstipendiet. MBS och SJ erkänner finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtal nummer 722687. MBS, SJ och NJ tackar LIPhy (UGA) för renrumsanläggningen för mikrotillverkningsexperiment. IBS erkänner integrationen i Grenobles tvärvetenskapliga forskningsinstitut (IRIG, CEA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150x150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garman, E. F. Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 339-351 (2010).
  2. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  3. Fraser, J. S., et al. Accessing protein conformational ensembles using room-temperature X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16247-16252 (2011).
  4. Gotthard, G., et al. Specific radiation damage is a lesser concern at room temperature. IUCrJ. 6 (4), 665-680 (2019).
  5. Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 32-47 (2016).
  6. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal X-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  7. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, 73-78 (2011).
  8. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Science Reports. 4, 6026 (2014).
  9. Pawate, A. S., et al. Towards time-resolved serial crystallography in a microfluidic device. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology Communications. 71, 823-830 (2015).
  10. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  11. Leng, J., Salmon, J. -B. Microfluidic crystallization. Lab on a Chip. 9, 24-34 (2009).
  12. Morel, M., Galas, J. -C., Dahan, M., Studer, V. Concentration landscape generators for shear free dynamic chemical stimulation. Lab on a Chip. 12, 1340-1346 (2012).
  13. Miralles, V., Huerre, A., Malloggi, F., Jullien, M. -C. A review of heating and temperature control in microfluidic systems: techniques and applications. Diagnostics. 3, 33-67 (2013).
  14. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: from crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4, 032202 (2017).
  15. Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14431-14436 (2004).
  16. Laval, P., Lisai, N., Salmon, J. -B., Joanicot, M. A microfluidic device based on droplet storage for screening solubility diagrams. Lab on a Chip. 7, 829-834 (2007).
  17. Shim, J. -U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. Journal of the American Chemical Society. 129, 8825-8835 (2007).
  18. Selimovic, S., Gobeaux, F., Fraden, S. Mapping and manipulating temperature-concentration phase diagrams using microfluidics. Lab on a Chip. 10, 1696-1699 (2010).
  19. Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20, 296-310 (2020).
  20. Greaves, E. D., Manz, A. Towards on-chip X-ray analysis. Lab on a Chip. 5, 382-391 (2005).
  21. Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9, 1412-1421 (2009).
  22. Guha, S., Perry, S. L., Pawate, A. S., Kenis, P. J. A. Fabrication of X-ray compatible microfluidic platforms for protein crystallization. Sensors and Actuators B. Chemical. 174, 1-9 (2012).
  23. Sui, S., et al. Graphene-based microfluidics for serial crystallography. Lab on a Chip. 16, 3082-3096 (2016).
  24. Russo Krauss, I., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Science. 14, 11643-11691 (2013).
  25. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 70, 2-20 (2014).
  26. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A droplet-based, composite PDMS/Glass capillary microfluidic system for evaluating protein crystallization conditions by microbatch and vapor-diffusion methods with on-chip X-ray diffraction. Angewandte Chemie. 43, International Edition in English 2508-2511 (2004).
  27. Talreja, S., Kim, D. Y., Mirarefi, A. Y., Zukoski, C. F., Kenis, P. J. A. Screening and optimization of protein crystallization conditions through gradual evaporation using anovel crystallization platform. Journal of Applied Crystallography. 38, 988-995 (2005).
  28. Hansen, C. L., Classen, S., Berger, J. M., Quake, S. R. A microfluidic device for kinetic optimization of protein crystallization and in situ structure determination. Journal of American Chemical Society. 128, 3142-3143 (2006).
  29. Schieferstein, J. M., et al. X-ray Transparent microfluidic platforms for membrane protein crystallization with microseeds. Lab on a Chip. 18, 944-954 (2018).
  30. Ghazal, A., et al. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab on a Chip. 16, 4263-4295 (2016).
  31. Li, L., Ismagilov, R. F. Protein crystallization using microfluidic technologies based on valves, droplets, and SlipChip. Annual Review of Biophysics. 39, 139-158 (2010).
  32. Du, W., Li, L., Nichols, K. P., Ismagilov, R. F. SlipChip. Lab on a Chip. 9, 2286-2292 (2009).
  33. Zhang, S., et al. Microfluidic platform for optimization of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 472, 18-28 (2017).
  34. Abdallah, B. G., et al. Protein crystallization in an actuated microfluidic nanowell device. Crystal Growth & Design. 16, 2074-2082 (2016).
  35. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 406-412 (2019).
  36. de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6, 454-464 (2019).
  37. Shim, J. -U., Cristobal, G., Link, D. R., Thorsen, T., Fraden, S. Using microfluidics to decouple nucleation and growth of protein crystals. Crystal Growth & Design. 7, 2192-2194 (2007).
  38. de Jong, J., Lammertink, R. G. H., Wessling, M. Membranes and microfluidics: a review. Lab on a Chip. 6, 1125-1139 (2006).
  39. Paustian, J. S., Nery Azevedo, R., Lundin, S. T. B., Gilkey, M. J., Squires, T. M. Microfluidic microdialysis: spatiotemporal control over solution microenvironments using integrated hydrogel membrane microwindows. Physical Review X. 3, 041010 (2013).
  40. Kornreich, M., Heymann, M., Fraden, S., Beck, R. Cross polarization compatible dialysis chip. Lab on a Chip. 14, 3700-3704 (2014).
  41. Song, S., Singh, A. K., Shepodd, T. J., Kirby, B. J. Microchip dialysis of proteins using in situ photopatterned nanoporous polymer membranes. Analytical Chemistry. 76, 2367-2373 (2004).
  42. Skou, M., Skou, S., Jensen, T. G., Vestergaard, B., Gillilan, R. E. In situ microfluidic dialysis for biological small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47, 1355-1366 (2014).
  43. Zou, L., et al. A multistage dialysis microdevice for extraction of cryoprotectants. Biomedical Microdevices. 19, 30 (2017).
  44. Satya Eswari, J., Naik, S. A critical analysis on various technologies and functionalized materials for manufacturing dialysis membranes. Materials Science for Energy Technologies. 3, 116-126 (2020).
  45. Spano, M., Salmon, J. -B., Junius, N. FR3044685A1. UJF. , (2015).
  46. Bartolo, D., Degre, G., Nghe, P., Studer, V. Microfluidic stickers. Lab on a Chip. 8, 274-279 (2008).
  47. Junius, N., et al. A crystallization apparatus for temperature controlled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  48. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 125-132 (2010).
  49. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and developments of COOT. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  51. Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semipermeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20, 3927-3936 (2020).
  52. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  53. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28, 153-184 (1998).
  54. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  55. Baxter, E. L., et al. High-density grids for efficient data collection from multiple crystals. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 72, 2-11 (2016).
  56. Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An all-in-one sample holder for macromolecular X-ray crystallography with minimal background scattering. Journal of Visualized Experiments. (149), e59722 (2019).

Tags

Kemi Nummer 170 mikrofluidik proteinkristallisering på chip in situ-röntgendiffraktion mikrodialyskristallisering seriekristallografi fasdiagram dialyschips
Kristallisering av proteiner på chip genom mikrodialys för in Situ-röntgendiffraktionsstudier <i></i>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaho, S., Junius, N., Borel, F.,… More

Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J. B., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter