Summary
Este protocolo presenta el ensayo de brotación coroides, un modelo ex vivo de proliferación microvascular. Este ensayo se puede utilizar para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos corooidales y evaluar los tratamientos farmacológicos utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.
Abstract
La angiogénesis coroidal patológica, una característica destacada de la degeneración macular relacionada con la edad, conduce a un deterioro de la visión y ceguera. Los ensayos de proliferación de células endoteliales (EC) que utilizan células endoteliales microvasculares de retina humana (HRMEC) o EC de retina primaria aisladas se utilizan ampliamente en modelos in vitro para estudiar la angiogénesis retiniana. Sin embargo, aislar las células endoteliales de la retina murina pura es técnicamente difícil y las CE de la retina pueden tener diferentes respuestas de proliferación que las células endoteliales coroidales y diferentes interacciones celulares/células. Se desarrolló un ensayo de brotación coroidacional ex vivo altamente reproducible como modelo de proliferación microvascular coroidal. Este modelo incluye la interacción entre la vasculatura coroides (EC, macrófagos, pericitos) y el epitelio pigmentario de la retina (RPE). Los explantes de RPE/coroide/escleral de ratón se aíslan e incuban en el extracto de membrana basal (BME) con factor de crecimiento reducido (BME) (día 0). El medio se cambia cada dos días y la brotación coroides se cuantifica en el día 6. Las imágenes de la explanta de coroides individuales se toman con un microscopio de fase invertida y el área de brotación se cuantifica utilizando un macro plug-in semiautomático para el software ImageJ desarrollado en este laboratorio. Este ensayo de brotación coroidal ex vivo reproducible se puede utilizar para evaluar compuestos para el tratamiento potencial y para la investigación de enfermedades microvasculares para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos coroidacionales utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.
Introduction
La desregulación de la angiogénesis coroidal se asocia con la degeneración macular neovascular relacionada con la edad (AMD)1. La coroides es un lecho microvascular presente debajo del epitelio pigmentario de la retina (RPE). Se ha demostrado que la reducción del flujo sanguíneo en la coroides se asocia con la progresión de AMD2. La intrincada relación entre el endotelio vascular, RPE, macrófagos, pericitos y otras células es responsable de la homeostasis del tejido3,4,5. Por lo tanto, un ensayo reproducible que modela el microambiente coroideo es fundamental para el estudio de la DMAE neovascular.
Los ensayos de angiogénesis ex vivo y los cultivos celulares endoteliales in vitro pueden complementar los estudios del comportamiento microvascular in vivo, para la prueba de nuevos fármacos y para estudios de patogénesis. Células endoteliales tales como células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC), células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), cerebro animal primario aislado o EC de la retina se utilizan a menudo en estudios in vitro para la investigación de la angiogénesis ocular6,7,8. Los HDH, en particular, se han utilizado ampliamente como modelo de neovascularización coroidal in vitro (CNV)9 mediante la evaluación de la proliferación endotelial, la migración, la formación tubular y la fuga vascular para evaluar las intervenciones6,10. Sin embargo, las CE en el cultivo son limitadas como modelo de CNV debido a la falta de interacciones con otros tipos de células que se encuentran en la coroides y porque la mayoría de las CE utilizadas en estos ensayos no se originan en la coroides. Las ECs coroideales de ratón son difíciles de aislar y mantener en el cultivo.
El ensayo de anillo aórtico es ampliamente utilizado como un modelo de proliferación macro vascular. Los brotes vasculares de explantes aórticos incluyen ECs, pericitos y macrófagos11. El ensayo de anillo aórtico modela bien de angiogénesis de vasos grandes12,13,14. Sin embargo, tiene limitaciones como modelo de neovascularización coroidal ya que los anillos aórticos son un tejido macrovascular que carece del entorno microvascular coroidal característico, y los brotes de grandes vasos pueden diferir de los brotes de redes capilares implicadas en la patología microvascular. Recientemente un grupo publicó un ensayo de retina ex vivo15,16. Aunque, es adecuado para la enfermedad neovascular de la retina, no es tan apropiado para la neovascularización coroidal como se ve en la DMAE.
El ensayo coral de brotación utilizando RPE de ratón, tejido coroides y explantado escleral fue desarrollado para modelar mejor el CNV. El tejido se puede aislar fácilmente de los ojos de ratón (u otras especies)17. Este ensayo permite una evaluación reproducible del potencial pro y anti-angiogénico de los compuestos farmacológicos y la evaluación del papel de vías específicas en la neovascularización coroidacional utilizando tejido de ratones modificados genéticamente y controles18. Este ensayo coral de brotación ha sido referenciado en muchas publicaciones posteriores9,10,18,19,20. Aquí se demuestra el método implicado en el uso de este ensayo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en boston Children's Hospital (protocolo ARCH número 19-04-3913R).
1. Preparación
- Añadir 5 ml de penicilina/estreptomicina (10000 U/mL) y 5 ml y 10 ml de suplementos disponibles comercialmente a 500 ml de medio clásico completo con suero. Aliquot 50 mL del medio inicialmente.
NOTA: No devuelva ningún medio a la población para evitar la contaminación. - Ponga una alícuota de medio clásico completo sobre hielo.
- Use 70% de etanol para limpiar el microscopio de disección, los fórceps y las tijeras.
- Preparar dos platos de cultivo celular (10 cm), uno en el microscopio de disección, otro sobre hielo; poner 10 ml de medio clásico completo en cada plato.
2. Pasos experimentales (Figura 1)
- Sacrificar ratones C57BL/6J alrededor del postnatal (P) 20 usando 75-100 mg/kg de ketamina y 7,5 -10 mg/kg de xiazina inyectada intraperitonealmente. Mantenga los ojos en medio clásico completo sobre hielo antes de la disección.
- Retire el tejido conectivo (músculo y tejido graso) y el nervio óptico en el ojo.
- Utilice una micro-tijera para cortar circunferencialmente 0,5 mm posterior al limbo corneal. Retire el complejo de córnea/iris, el vítreo y la lente.
- Haga una incisión de 1 mm perpendicular al borde de corte hacia el nervio óptico y corte una banda circunferencial de 1 mm de ancho. Separe las regiones central y periférica del complejo. Use fórceps para despegar la retina del complejo RPE/coroide/sclera.
- Mantener la banda coroidea periférica en medio clásico completo sobre hielo; aislar el otro ojo y repetir el proceso para cortar una segunda banda.
- Cortar la banda circular en piezas cuadradas iguales a 6o (1 mm x 1 mm).
NOTA: Nunca toque ningún borde. - Descongelar el extracto de membrana basal (BME) por instrucción de fabricación. Añadir 30 l/pozo de BME en el centro de cada pocómo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Asegúrese de que la gota de BME forma una cúpula convexa en la parte inferior de la placa sin tocar los bordes.
NOTA: Descongele el BME durante la noche en un refrigerador. BME debe estar en el hielo en cualquier momento después de descongelar. - Coloque el tejido en el centro de la BME.
NOTA: No aplanar el explano coroides; generalmente, deje que el tejido se expanda dentro de la BME. La orientación del tejido (lado escleral hacia arriba o hacia abajo) no afecta el resultado experimental. - Incubar la placa a 37oC durante 10 min para dejar que el gel se solidifique.
- Añadir 500 l del medio/pozo clásico completo.
- Cambie el medio clásico cada dos días (500 l). La brotación de coroide se puede observar después de 3 días con un microscopio.
NOTA: Para el tratamiento del factor de crecimiento, muera de hambre el tejido durante 4 h. Diluir un compuesto de ensayo en medio reducido por factor de crecimiento (1:200 impulso en lugar de 1:50).
3.SWIFT-Método de cuantificación computarizada Choroid17 (Figura 2)
NOTA: Se utilizó un método computarizado para medir el área cubierta por los buques en crecimiento. Se necesita un plugin de macro para el software ImageJ antes de la cuantificación (consulte Información complementaria para obtener más detalles).
- Abra la imagen de brotación de coroides con ImageJ y marque "Imagen | Tipo| 8 bits" con escala de grises.
- Vaya a"| de imagen Ajustar | Brillo/Contraste (Ctrl/shift/C)" y optimizar el contraste.
- Utilice la función de varita mágica para perfilar y eliminar de la imagen el tejido coroides que está presente en el centro de los brotes (utilizando la tecla de método abreviado "F1") (Figura 2A,B).
NOTA: Establezca la tasa de tolerancia de la varita mágica en 20-30%. - Elimine el fondo de la imagen con las herramientas de selección gratuitas (Figura 2C). Vaya a"| de imagen Ajustar | Umbral (Ctrl/shift/T)". Utilice la función de umbral para definir los brotes microvasculares en el fondo y la periferia (Figura 2D).
- Haga clic en "F2" y aparecerá un resumen. Guarde una imagen del área seleccionada haciendo clic en "Guardar". Guarde en la misma carpeta que la imagen original para futuras referencias.
- Después de medir un grupo de muestras, copie el registro para el análisis de datos.
NOTA: También es posible medir el área (m2) por"Analizar | Establezca Escala" utilizando imágenes con barras de escala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Comparación del crecimiento de brotes de coroides por día
Diseccionamos la coroides con esclerótica, incrustada en BME y la cultivamos durante 6 días(Figura 1). El coroides que brota en ratones C57BL/6J desde el día 3 hasta el día 6 fueron examinados con un microscopio y cuantificados con SWIFT-Choroid un método de cuantificación semiautomático en ImageJ. En un caso representativo, la zona de brotación coroidal (los vasos que se extienden desde el explant, excluyendo el propio explant) fue de 0,38 mm2 en el día 3 (Figura 3A), 1,47 mm2 en el día 4(Figura 3B), 5,62 mm2 en el día 5 (Figura 3C), y 10,09 mm2 en el día 6B ( Figura 6 (Figura 3D).
La supresión del receptor de ácidos grasos libres (FFAR)4 exacerba la neovascularización coroidal ex vivo.
Los efectos de la pérdida de FFAR4 (también conocido como receptor acoplado a proteínas G 120) en la brotación vascular coroidal se evaluaron utilizando el ensayo de brotación de coroides18. El complejo de coroides, RPE y escleróticas fue diseccionado de ratones Ffar4 knock out (-/-) y Ffar4+/+ y cultivados como se describió anteriormente. El área de brotación en Ffar4-/- aumentó el crecimiento vascular coroidal en comparación con Ffar4+/+ en el día 6 (p á 0,004) (Figura 4A,B). El tratamiento del agonista de FFAR4 (1 M) redujo el área de brotación coroidal en comparación con los ratones no tratados en el día 6 (p a 0,03)(Figura 4C,D).
Figura 1: Ilustración esquemática que muestra el ensayo de brotación de coroides.
Los ojos fueron enucleados y cortados circunferencialmente alrededor de 0,5 mm posteriores al limbo. Se extrajeron la córnea, el iris, la lente y el vítreo. Luego se hizo un corte de 1 mm desde el borde de la copa del ojo hacia el nervio óptico. Una banda se cortó circunferencialmente alrededor de 1,0 mm posterior al borde de corte y la banda y las regiones periféricas del complejo se separaron. La banda fue cortada en trozos de aproximadamente 1 mm x 1 mm e incrustada en BME. Luego, usando un microscopio, se visualizaron los brotes microvasculares de la coroides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Método de cuantificación computarizada SWIFT-Choroid.
(A,B) La función de varita mágica se utilizó para esbozar el tejido coroides (flecha blanca) en el centro de los brotes y se eliminó digitalmente (tecla de acceso directo "F1"). (C, D) El fondo de la imagen se eliminó con las herramientas de selección gratuitas (flecha negra). Los brotes microvasculares se definieron entonces utilizando la función de umbral contra el fondo y la periferia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Brote de coroides periféricos del ratón.
(A-D) Imágenes representativas de brotes coroides con un ratón C57BL/6J y demostraciones del método SWIFT-Choroid cuantificando el área de los brotes. El área de brotación coroidal fue de 0,38 mm2 en el día 3(A),1,47 mm2 en el día 4(B),5,62 mm2 en el día 5(C),y 10,09 mm2 en el día 6 (D). Barra de escala; 500 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La supresión del receptor de ácidos grasos libres (FFAR) 4 exacerba la neovascularización coroidal.
(A) Imágenes representativas del ensayo de brotación con coroides del receptor de ácidos grasos libres (Ffar)4+/+ en comparación con ratones (-/-) noqueados Ffar4: la imagen superior muestra el choroides de Ffar4+/+, mientras que la imagen inferior muestra Ffar4-/- choroid. (B)Ffar4-/- mostró un aumento de la brotación de coroides en comparación con los ratones Ffar4 +/+ (n a 6-8). (C) Imágenes representativas de la brotación de la coroides: la imagen superior demuestra el tratamiento del vehículo (control); imagen inferior demuestra el tratamiento agonista FFAR4. (D) El agonista FFAR4 suprimió la brotación coroidal en comparación con el control (n s 10–12). Barras de escala a 500 m. Los datos fueron analizados por la prueba t del estudiante y se expresaron como medio ± SE. *p < 0.05; **p < 0.01. Esta cifra ha sido modificada de Tomita et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo Suplementario 1: Cómo crear plugins y accesos directos para el programa de ensayo de brotes de coroides. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El ensayo coral de brotes ayuda a la investigación en NEOvascular AMD9,10,18,19,20. Los explantes de coroide se pueden aislar de ratones, así como ratas y humanos17,21. El explanto coroides incluye ECs, macrófagos y pericitos17. En este ensayo la interacción entre las CE coroidales y las células adyacentes como las células RPE, ayudan a dilucidar los mecanismos implicados en el crecimiento vascular coroidal17. Además, este método de evaluación reproducible y semiautomático disminuye la variabilidad entreobservaciones17.
El primer estudio publicado del tejido coroidatal ex vivo utilizó coroide aislado para probar intervenciones farmacológicas con potencial para tratar la DR y AMD22,23,24,25. El ensayo contó el número y la longitud de los buques que brotaban, que pueden estar sujetos a la variabilidad entre servidores. Por el contrario, el método de cuantificación descrito aquí se ha estandarizado17. Este ensayo de angiogénesis coroides microvasculares incluye células asociadas interactivas y matriz extracelular. Los ECs en el cultivo pueden perder muchas de sus propiedades fisiológicas, como la capacidad de formar tubos vasculares26 que pueden deberse a la pérdida de interacción con otras células como el RPE. Por lo tanto, los cultivos in vitro de la CE pueden no reflejar todos los aspectos de la neovascularización coroidal. El ensayo de anillo aórtico incluye células endoteliales de grandes vasos y células interactivas para evaluar la brotación de grandes vasos. Pero los brotes de vasos grandes pueden no reflejar con precisión la enfermedad microvascular coroidal27. El ensayo de brotación coroidal es una representación más cercana de las respuestas microvasculares corooidales.
Hay advertencias importantes. En primer lugar, los brotes de explantes complejos de coroides periféricos son más consistentes y crecen mucho más rápido que los explantes de las secciones centrales17. En segundo lugar, el RPE de la coroides no se eliminó porque los brotes coroides con RPE crecen mucho más rápido que sin RPE17. Para entender el impacto de un medicamento solo en la coroides, se puede utilizar el ensayo sin RPE. Finalmente, al esbozar la imagen del tejido coroides y el área de brotación mediante el uso de la función de varita mágica, a veces es difícil trazar el área de brote de coroides debido al alto ruido de fondo. Puede haber variación entre las imágenes. Por lo tanto, para la coherencia, es importante crear digitalmente un contraste suficiente entre la coroides y el fondo como se ve en la Figura 2.
En resumen, el ensayo de brote de coroides ex vivo se ha caracterizado y se ha semiautomático. Este método proporciona una herramienta experimental para la investigación de AMD. Este ensayo se puede utilizar para examinar compuestos como tratamientos potenciales o para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos corooidales que utilizan tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen revelaciones financieras. El método informatizado está disponible de forma gratuita para las instituciones académicas a través de los autores.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por Grants de la Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship y Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
- Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
- Fu, Z., et al.
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
- Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
- Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
- Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
- Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Bellacen, K., Lewis, E. C.
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
- Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
- Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
- Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
- Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
- Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
- Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
- Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
- Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
- Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
- Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).
