Summary
Ce protocole présente l’essai choroïde de germination, un modèle ex vivo de prolifération microvasculaire. Cet essai peut être utilisé pour évaluer les voies impliquées dans la prolifération des micro-vaisseaux choroïdiens et évaluer les traitements médicamenteux à l’aide de tissus de souris sauvages et génétiquement modifiés.
Abstract
L’angiogenèse choroïde pathologique, une caractéristique saillante de la dégénérescence maculaire relative à l’âge, mène à l’affaiblissement de vision et à la cécité. Les tests de prolifération des cellules endothéliales (EC) utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMECs) ou des EC rétiniennes primaires isolées sont largement utilisés dans des modèles in vitro pour étudier l’angiogenèse rétinienne. Cependant, isoler les cellules endothéliales rétiniennes murines pures est techniquement difficile et les CE rétiniens peuvent avoir des réponses de prolifération différentes que les cellules endothéliales choroïdes et les différentes interactions cellule/cellule. Un essai choroïdien choroïde fortement reproductible de germination comme modèle de prolifération microvasculaire choroïde a été développé. Ce modèle inclut l’interaction entre la vascularisation choroïde (EC, macrophages, péricytes) et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Les explants rpe/choroïdes/scléraux de souris sont isolés et incubés dans l’extrait basal de membrane croissance-facteur-réduit (BME) (jour 0). Le milieu est changé tous les deux jours et la germination choroïde est quantifiée au jour 6. Les images de l’explantation choroïde individuelle sont prises avec un microscope de phase inversée et la zone de germination est quantifiée à l’aide d’un plug-in macro semi-automatisé au logiciel ImageJ développé dans ce laboratoire. Cet essai reproductible de germination choroïde ex vivo peut être employé pour évaluer des composés pour le traitement potentiel et pour la recherche microvasculaire de maladie pour évaluer des voies impliquées dans la prolifération choroïde de micro navire utilisant le type sauvage et le tissu génétiquement modifié de souris.
Introduction
La dysrégulation choroïde d’angiogenèse est associée à la dégénérescence maculaire relative à l’âge néoovasculaire (DME)1. Le choroïde est un lit microvasculaire présent sous l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Il a été démontré que la réduction du flux sanguin dans le choroïde est associée à la progression de la D AMD2. La relation complexe entre l’endothélium vasculaire, l’EPR, les macrophages, les péricytes et d’autres cellules est responsable de l’homéostasiedu tissu 3,4,5. Par conséquent, un microenvironnement choroïdien reproductible de modélisation d’essai est critique pour l’étude de la DMO néovasculaire.
Les analyses d’angiogenèse ex vivo et les cultures cellulaires endothéliales in vitro peuvent compléter les études sur le comportement microvasculaire in vivo, pour tester de nouveaux médicaments et pour des études sur la pathogénie. Les cellules endothéliales telles que les cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMECs), les cellules endothéliales des veines ombilicales humaines (HUVEC), le cerveau animal primaire isolé ou les CE rétiniens sont souvent utilisées dans des études in vitro pour la recherche sur l’angiogenèseoculaire 6,7,8. Les HRMEC en particulier ont été largement utilisés comme modèle de néovascularisation choroïdienne in vitro (CNV)9 en évaluant la prolifération endothéliale, la migration, la formation tubulaire et les fuites vasculaires pour évaluer les interventions6,10. Cependant, les CE en culture sont limités comme modèle de CNV en raison du manque d’interactions avec d’autres types de cellules trouvés dans le choroïde et parce que la plupart des EC utilisés dans ces analyses ne proviennent pas de choroïdes. Les CE choroïdes de souris sont difficiles à isoler et à maintenir dans la culture.
L’essai aortique d’anneau est employé couramment comme modèle de prolifération vasculaire macro. Les pousses vasculaires provenant d’explants aortiques comprennent les CE, les péricytes et les macrophages11. L’essai d’anneau aortique modèle le grand angiogenèse denavire bien 12,13,14. Cependant, il a des limitations comme modèle de néovascularisation choroïdienne car les anneaux aortiques sont un tissu macrovasculaire dépourvu de l’environnement microvasculaire choroïde caractéristique, et les germes des grands vaisseaux peuvent différer des germes des réseaux capillaires impliqués dans la pathologie microvasculaire. Récemment, un groupe a publié un essai rétinien ex vivo15,16. Bien qu’il soit approprié pour la maladie néovasculaire rétinienne, il n’est pas aussi approprié pour la néovascularisation choroïde comme vu dans AMD.
L’essai choroïde de germination utilisant le RPE de souris, le choroïde, et le tissu explanté sclérical a été développé pour mieux modéliser CNV. Le tissu peut facilement être isolé des yeux de souris (ou d’autres espèces)17. Cet essai permet l’évaluation reproductible du potentiel pro- et anti-angiogenic des composés pharmacologiques et l’évaluation du rôle des voies spécifiques dans la néovascularisation choroïde utilisant le tissu des souris génétiquement modifiées et contrôle18. Cet essai choroïde de germination a été référencé dans beaucoup de publicationssuivantes 9,10,18,19,20. Ici, la méthode impliquée dans l’utilisation de cet essai sont démontrées.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Boston Children’s Hospital (numéro de protocole ARCH 19-04-3913R).
1. Préparation
- Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (10000 U/mL) et 5 mL et 10 mL de suppléments disponibles dans le commerce à 500 mL de milieu classique complet avec sérum. Aliquot 50 mL du milieu initialement.
REMARQUE : Ne retournez aucun milieu au stock pour éviter la contamination. - Mettez un aliquot de milieu classique complet sur la glace.
- Utilisez 70 % d’éthanol pour nettoyer le microscope, les forceps et les ciseaux disséquants.
- Préparer deux plats de culture cellulaire (10 cm), l’un au microscope à dissection, l’autre sur glace; mettre 10 mL de milieu classique complet dans chaque plat.
2. Étapes expérimentales (Figure 1)
- Sacrifier les souris C57BL/6J autour de la kétamine postnatale (P) 20 à l’aide de kétamine de 75 à 100 mg/kg et de 7,5 à 10 mg/kg de xylazine injectée intraperitoneally. Gardez les yeux dans le milieu classique complet sur la glace avant la dissection.
- Enlever le tissu conjonctif (muscle et tissu adipeux) et le nerf optique sur l’œil.
- Utilisez un micro-ciseaux pour couper circonférentiellement 0,5 mm postérieur au limbus cornéen. Retirer le complexe cornée/iris, vitreux et la lentille.
- Faire une incision de 1 mm perpendiculairement au bord de coupe vers le nerf optique et couper une bande circonférentielle de 1 mm de largeur. Séparez les régions centrales et périphériques du complexe. Utilisez des forceps pour décoller la rétine du complexe RPE/choroid/sclera.
- Gardez la bande choroïde périphérique dans un milieu classique complet sur la glace; isoler l’autre œil et répéter le processus pour couper une deuxième bande.
- Couper la bande circulaire en 6 ~morceaux carrés égaux (~1 mm x 1 mm).
REMARQUE : Ne touchez jamais à aucun bord. - Décongeler l’extrait de membrane basale (BME) par instruction de fabrication. Ajouter 30 μL/puits de BME au centre de chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Assurez-vous que la gouttelette de BME forme un dôme convexe au bas de la plaque sans toucher les bords.
REMARQUE : Décongeler le BME toute la nuit au réfrigérateur. Le BME doit être sur la glace à tout moment après le dégel. - Placez le tissu au milieu du BME.
REMARQUE : N’aplatissez pas l’explantation choroïde; généralement, laissez le tissu se développer dans le BME. L’orientation du tissu (côté sclérical vers le haut ou vers le bas) n’a pas d’impact sur les résultats expérimentaux. - Incuber la plaque à 37 °C pendant 10 min pour laisser le gel se solidifier.
- Ajouter 500 μL du milieu/puits classique complet.
- Changez le médium classique tous les deux jours (500 μL). La germination choroïde peut être observée après 3 jours au microscope.
REMARQUE : Pour le traitement des facteurs de croissance, affamer le tissu pendant 4 h. Diluer un composé d’essai dans un milieu à facteur de croissance réduit (1:200 boost au lieu de 1:50).
3.SWIFT-Choroid méthode informatisée de quantification17 (Figure 2)
REMARQUE : Une méthode informatisée pour mesurer la superficie couverte par les navires en croissance a été utilisée. Un plugin macro au logiciel ImageJ est nécessaire avant la quantification (voir informations complémentaires pour plus de détails).
- Ouvrez l’image de germination choroïde avec ImageJ et vérifiez "Image | Le type| 8-bit" à l’échelle grise.
- Aller à "Image | Ajuster | Luminosité/Contraste (Ctrl/shift/C)" et optimiser le contraste.
- Utilisez la fonction baguette magique pour décrire et enlever de l’image le tissu choroïde qui sont présents au centre des germes (en utilisant la clé raccourcie "F1« ) (Figure 2A,B).
REMARQUE : Réglez le taux de tolérance de la baguette magique à 20-30%. - Supprimez l’arrière-plan de l’image avec les outils de sélectiongratuits ( Figure 2C). Aller à "Image | Ajuster | Seuil (Ctrl/shift/T)« . Utilisez la fonction seuil pour définir les germes microvasculaires en arrière-plan et en périphérie (Figure 2D).
- Cliquez sur" F2" et un résumé apparaîtra. Enregistrez une image de la zone sélectionnée en cliquant sur "Enregistrer« . Enregistrer dans le même dossier que l’image d’origine pour la référence future.
- Une fois qu’un groupe d’échantillons est mesuré, copiez l’enregistrement pour analyse de données.
REMARQUE : Il est également possible de mesurer la zone (μm²) par «Analyser | Set Scale" à l’aide d’images avec barres d’échelle.
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Representative Results
Comparaison de la croissance de la germination choroïde par jour
Nous avons disséqué le choroïde avec de la sclérienne, incrusté dans le BME et les avons cultivés pendant 6 jours( Figure 1). La germination choroïde chez les souris C57BL/6J du jour 3 au jour 6 a été examinée au microscope et quantifiée avec SWIFT-Choroid une méthode de quantification semi-automatisée dans ImageJ. Dans un cas représentatif, la zone choroïde de germination (les vaisseaux s’étendant de l’explantation, à l’exclusion de l’explant elle-même) était de 0,38 mm2 au jour 3 (figure 3A), 1,47 mm2 au jour 4 (figure 3B), 5,62 mm2 au jour 5 (figure 3C) et 10,09 mm2 au jour 6(figure 3D).
Récepteur d’acide gras libre (FFAR)4 suppression exacerbe la néovascularisation choroïdienne ex vivo.
Les effets de la perte de FFAR4 (également connu sous le nom de récepteur couplé g-protéine 120) sur la germination vasculaire choroïde ont été évalués en utilisant l’essai choroïdede germination 18. Le complexe choroïde, RPE, et sclera ont été disséqués de Ffar4 knock out (-/-) et Ffar4+/+ souris et cultivés comme décrit ci-dessus. La zone de germination dans Ffar4-/- augmentation de la croissance vasculaire choroïde par rapport à Ffar4+/+ au jour 6 (p = 0,004) (Figure 4A,B). Le traitement de l’agoniste FFAR4 (1 μM) a réduit la zone choroïde de germination par rapport aux souris non traitées au jour 6 (p = 0,03) (figure 4C,D).
Figure 1 : Illustration schématique montrant l’essai choroïde de germination.
Les yeux ont d’abord été édulés et coupés circonférentiellement environ 0,5 mm postérieur au limbus. La cornée, l’iris, la lentille et vitreux ont été enlevés. Puis une coupe de 1 mm a été faite à partir du bord de la tasse des yeux vers le nerf optique. Une bande a ensuite été coupée circonférentiellement environ 1,0 mm postérieure au bord de coupe et la bande et les régions périphériques du complexe ont été séparées. La bande a été coupée en morceaux d’environ 1 mm x 1 mm et encastrée dans le BME. Puis à l’aide d’un microscope, les germes microvasculaires du choroïde ont été visualisés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Méthode informatisée de quantification SWIFT-Choroid.
(A,B) La fonction magique de baguette magique a été employée pour décrire le tissu choroïde (flèche blanche) au centre des pousses et elle a été enlevée numériquement (clé de raccourci « F1 »). (C, D) L’arrière-plan de l’image a été supprimé avec les outils de sélection gratuits (flèche noire). Les germes microvasculaires ont ensuite été définis en utilisant la fonction seuil en arrière-plan et en périphérie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Choroïde périphérique de souris qui pousse.
(A-D) Images représentatives des choroïdes germés avec une souris C57BL/6J et démonstrations de la méthode SWIFT-Choroid quantifiant la zone des pousses. La zone de germination choroïde était de 0,38 mm2 au jour 3 (A), 1,47 mm2 au jour 4 (B), 5,62 mm2 au jour 5 (C), et 10,09 mm2 au jour 6 (D). Barre d’échelle; 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Récepteur libre d’acide gras (FFAR) 4 suppression exacerbent la néovascularisation choroïde.
(A) Images représentatives de l’essai de germination avec choroïde du récepteur des acides gras libres (Ffar)4+/+ par rapport à Ffar4 knock out (-/-) souris: image supérieure montre le choroïde de Ffar4 +/+ tandis que l’image inférieure montre Ffar4-/- choroïde. (B)Ffar4-/- a montré une augmentation de la germination choroïde par rapport aux souris Ffar4 +/+(n = 6-8). (C) Images représentatives de la germination des choroïdes : l’image supérieure démontre le traitement du véhicule (contrôle); l’image inférieure démontre le traitement agoniste de FFAR4. (D) L’agoniste FFAR4 a supprimé la germination choroïde par rapport au contrôle (n = 10-12). Barres d’échelle = 500 μm. Les données ont été analysées par t-test de l’étudiant et ont été exprimées en ± se. *p < 0,05; **p < 0,01. Ce chiffre a été modifié de Tomita et coll.18. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Fichier supplémentaire 1: Comment créer des plugins et des raccourcis pour le programme d’analyse de germination choroïde. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’analyse choroïdienne de germination aide la recherche dans amd néovasculaire9,10,18,19,20. Les explantations choroïdes peuvent être isolées de souris ainsi que de rats etd’humains 17,21. L’explant choroïde comprend les CE, les macrophages et les péricytes17. Dans cet essai l’interaction entre les CE choroïdes et les cellules adjacentes telles que des cellules de RPE, aident à élucider les mécanismes impliqués dans la croissance vasculaire choroïde17. De plus, cette méthode d’évaluation reproductible et semi-automatisée diminue la variabilité interobservateur17.
La première étude éditée du tissu choroïde ex vivo a employé choroïde isolé pour tester des interventions pharmacologiques avec le potentiel de traiter DR et AMD22,23,24,25. L’analyse a compté le nombre et la longueur des vaisseaux germés, qui peuvent être sujets à la variabilité interobservateur. En revanche, la méthode de quantification décrite ici a été normalisée17. Cet essai de l’angiogenèse choroïde microvasculaire inclut les cellules partenaires interactives et la matrice extracellulaire. Les CE en culture peuvent perdre beaucoup de leurs propriétés physiologiques, telles que la capacité de former des tubesvasculaires 26 qui peuvent être dus à la perte d’interaction avec d’autres cellules telles que l’EPR. Par conséquent, les cultures in vitro d’EC peuvent ne pas refléter tous les aspects de la néovascularisation choroïde. L’analyse de l’anneau aortique comprend de grandes cellules endothéliales de vaisseaux et des cellules interactives pour évaluer la germination des grands vaisseaux. Mais les grandes pousses de vaisseau peuvent ne pas refléter exactement la maladie microvasculaire choroïde27. L’essai choroïde de germination est une représentation plus étroite des réponses microvasculaires choroïdes.
Il y a d’importantes mises en garde. Tout d’abord, les pousses périphériques d’explantation complexe choroïde sont plus cohérentes et se développent beaucoup plus rapidement que les explantations des sectionscentrales 17. Deuxièmement, l’EPR de choroïde n’a pas été enlevé parce que les choroïdes pousses avec RPE poussent beaucoup plus vite que sans RPE17. Pour comprendre l’impact d’un médicament sur le seul choroïde, l’analyse sans EPR peut être utilisée. Enfin, lorsqu’on souligne l’image du tissu choroïde et de la zone de germination en utilisant la fonction baguette magique, il est parfois difficile de retracer la zone de germination choroïde en raison du bruit de fond élevé. Il peut y avoir des variations entre les images. Par conséquent, pour assurer la cohérence, il est important de créer numériquement un contraste suffisant entre choroïde et arrière-plan, comme on le voit à la figure 2.
En résumé, l’essai choroïde de germination d’ex vivo a été caractérisé et semi-automatisé. Cette méthode fournit un outil expérimental pour la recherche amd. Cet essai peut être employé pour examiner des composés comme traitements potentiels ou pour évaluer des voies impliquées dans la prolifération des micro-vaisseaux choroïdaux utilisant le type sauvage et le tissu génétiquement modifié de souris.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de divulgation financière. La méthode informatisée est disponible gratuitement aux établissements d’enseignement par l’intermédiaire des auteurs.
Acknowledgments
Les travaux ont été soutenus par des subventions de la Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), du Boston Children’s Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, de la Boston Children’s Hospital Ophthalmology Foundation, du BCH Pilot Award, de la BCH Manton Center Fellowship et de la Little Giraffe Foundation (ZF), de la German Research Foundation (DFG; à BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH CRDI (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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