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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Injection intravitreal et quantitation des paramètres d’infection dans un modèle de souris de l’endophtalmite bactérienne

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Nous décrivons ici une méthode d’injection intravitreal et de quantitation bactérienne suivante dans le modèle de souris de l’endophtalmitis bactérien. Ce protocole peut être étendu pour mesurer les réponses immunitaires de l’hôte et l’expression bactérienne et du gène hôte.

Abstract

Les infections bactériennes intraoculaires sont un danger pour la vision. Les chercheurs utilisent des modèles animaux pour étudier les facteurs hôtes et bactériens et les voies de réponse immunitaire associées à l’infection afin d’identifier des cibles thérapeutiques viables et de tester des médicaments pour prévenir la cécité. La technique d’injection intravitreal est employée pour injecter des organismes, des drogues, ou d’autres substances directement dans la cavité vitreuse dans le segment postérieur de l’oeil. Ici, nous avons démontré cette technique d’injection pour initier l’infection dans l’œil de la souris et la technique de quantification des bactéries intraoculaires. Bacillus cereus a été cultivé dans les médias liquides d’infusion de coeur de cerveau pendant 18 heures et résuspendait à une concentration 100 unités de formation de colonie (CFU)/0.5 μL. Une souris C57BL/6J a été anesthésiée à l’aide d’une combinaison de kétamine et de xylazine. À l’aide d’un microinjecteur picolitre et d’aiguilles capillaires en verre, 0,5 μL de la suspension Bacillus a été injecté dans le milieu vitreux de l’œil de la souris. L’oeil contralatéral de commande a été injecté avec le médias stérile (contrôle chirurgical) ou n’a pas été injecté (contrôle absolu). À 10 heures après l’infection, les souris ont été euthanasiées, et les yeux ont été récoltés à l’aide de pinces chirurgicales stériles et placés dans un tube contenant 400 μL de PBS stérile et 1 mm de perles de verre stériles. Pour les ELISAs ou myeloperoxidase assays, inhibiteur de la proteinase a été ajouté aux tubes. Pour l’extraction de l’ARN, le tampon de lyse approprié a été ajouté. Les yeux ont été homogénéisés dans un homogénéiseur de tissu pendant 1-2 minutes. Les homogénéisations ont été diluées en série 10 fois dans pbs et la voie diluée sur des plaques d’agar. Le reste des homogénées ont été stockés à -80 °C pour des analyses supplémentaires. Les plaques ont été incubées pendant 24 heures et cfu par oeil a été quantifié. Ces techniques entraînent des infections reproductibles dans les yeux des souris et facilitent la quantitation des bactéries viables, la réponse immunitaire de l’hôte et l’omique de l’expression des gènes de l’hôte et des bactéries.

Introduction

L’endophtalmite bactérienne est une infection dévastatrice qui provoque une inflammation et, si elle n’est pas traitée correctement, peut entraîner une perte de vision ou de cécité. L’endophtalmite résulte de l’entrée de bactéries dans l’intérieurde l’œil 1,2,3,4,5. Une fois dans l’œil, les bactéries se répliquent, produisent des toxines et d’autres facteurs nocifs, et peuvent causer des dommages irréversibles aux cellules et tissus rétiniens délicats. Les dommages oculaires peuvent également être provoqués par l’inflammation, due à l’activation des voies inflammatoires menant à l’afflux inflammatoire de cellules dansl’intérieur de l’oeil 1,5,6. L’endophtalmite peut survenir à la suite d’une chirurgie intraoculaire (postopératoire), d’une lésion pénétrante de l’œil (post-traumatique) ou d’une propagation métastatique de bactéries dans l’œil à partir d’un autre site anatomique (endogène)7,8,9,10. Les traitements de l’endophtalmite bactérienne comprennent des antibiotiques, des anti-inflammatoires ou une interventionchirurgicale 3,4,11. Même avec ces traitements, la vision ou l’œil lui-même peut être perdu. Le pronostic visuel après endophtalmite bactérienne varie généralement selon l’efficacité du traitement, l’acuité visuelle à la présentation, et la virulence de l’organisme infectieux.

Bacillus cereus (B. cereus) est l’un des principaux pathogènes bactériens qui provoque l’endophtalmite post-traumatique7,12. La majorité des cas d’endophtalmite de B. cereus ont un cours rapide, qui peut avoir comme conséquence la cécité en quelques jours. Les caractéristiques de l’endophtalmite de B. cereus incluent l’inflammation intraoculaire en évolution rapide, la douleur oculaire, la perte rapide de l’acuité visuelle, et la fièvre. B. cereus se développe rapidement dans l’œil par rapport à d’autres bactéries qui causent généralement des infectionsoculaires 2,4,12 et possède de nombreux facteurs de virulence. Par conséquent, la fenêtre pour une intervention thérapeutique réussie estrelativement courte 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Les traitements pour cette infection réussissent habituellement à traiter l’endophtalmite provoquée par d’autres agents pathogènes moins virulents, mais b. cereus endophthalmitis a généralement comme résultat plus de 70% de patients souffrant de la perte significative de vision. Environ 50% de ces patients subissent l’éviscération ou l’enucleation del’oeil infecté 7,16,22,23. La nature destructrice et rapide de l’endophtalmite de B. cereus exige un traitement immédiat et approprié. Des progrès récents dans le discernement des mécanismes sous-jacents du développement de la maladie ont identifié des ciblespotentielles pour l’intervention 19,26,27. Les modèles expérimentaux de souris de b. cereus endophthalmitis continuent d’être utiles en discernant les mécanismes de l’infection et en testant les thérapeutiques potentielles qui peuvent empêcher la perte de vision.

L’infection intraoculaire expérimentale des souris avec B. cereus a été un modèle instrumental pour comprendre des facteurs bactériens et d’hôte, aussi bien que leurs interactions, pendant l’endophthalmitis28. Ce modèle imite un événement post-traumatique ou postopératoire, dans lequel des bactéries sont introduites dans l’œil lors d’une blessure. Ce modèle est hautement reproductible et a été utile pour tester des thérapies expérimentales et fournir des données pour l’amélioration de la normede soins 1,6,19,29,30. Comme beaucoup d’autres modèles d’infection, ce modèle permet un contrôle indépendant de nombreux paramètres de l’infection et permet un examen efficace et reproductible des résultats de l’infection. Des études menées dans un modèle similaire chez les lapins au cours des dernières décennies ont examiné les effets des facteurs de virulence B. cereus dansl’œil 2,4,13,14,31. En injectant des souches mutantes B. cereus dépourvues de facteurs de virulence individuels ou multiples, la contribution de ces facteurs de virulence à la gravité de la maladie peut être mesurée par des résultats tels que la concentration de bactéries à différentes heures de postinfection ou la perte de fonctionvisuelle 13,14,27,31,32. En outre, des facteurs d’hôte ont été examinés dans ce modèle en infectant des souches de souris de KO manquant des facteurs inflammatoires spécifiquesd’hôte 26,29,33,34,35. Le modèle est également utile pour tester les traitements potentiels pour cette maladie en injectant de nouveaux composés dans l’œil après l’infection30,36. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole détaillé qui inclut infecter un oeil de souris avec B. cereus,récolter l’oeil après infection, quantifier la charge bactérienne intraoculaire, et préserver des spécimens pour évaluer des paramètres additionnels de la sévérité de la maladie.

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Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées à la suite des recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma (numéros de protocole 15-103, 18-043 et 18-087).

1. Aiguilles de verre stériles

  1. Allumez le tire-pipette à aiguilles.
  2. Réglez le bouton chauffage jusqu’à ce que l’écran affiche 12,6.
  3. Ouvrez la porte et alimentez manuellement le tube capillaire de 5 μL à travers la pince supérieure et le filament de chauffage jusqu’à ce que la moitié du tube s’étende sous le filament (Figure 1A).
  4. Confirmez que le tube capillaire se trouve dans la rainure « V » dans la pince supérieure. Serrer la pince supérieure.
  5. Lorsque la pince inférieure est ouverte, ajustez manuellement la glissière verticale jusqu’à ce que la pince inférieure atteigne sa limite supérieure. Confirmez que le tube est dans la rainure « V » dans la pince inférieure. Serrer la pince inférieure.
  6. Fermez la porte et confirmez que la lumière « Ready » est allumée. Appuyez sur le bouton Démarrer pour lancer la séquence de chauffage et de traction( Figure 1B).
  7. Assurez-vous que le chauffe-eau s’éteint automatiquement après que la chaleur et la gravité ont séparé le tube capillaire(figure 1C)et que la glissière se déplace vers le bas.
  8. Ouvre la porte. Tout en tenant le dessus du tube capillaire, désespèrez la pince supérieure. Retirer le tube capillaire supérieur et le mettre de côté.
  9. Tenez le tube capillaire dans la glissière inférieure et désespèrez la pince inférieure. Retirer le tube capillaire inférieur et le mettre de côté.
  10. Utilisez un biseau microélecrode avec une plaque de broyage abrasive d’alumine de 0,05 μm pour biseauter le tube capillaire tiré pour créer les aiguilles d’injection.
  11. Pipette assez d’eau sur la plaque de broyage pour couvrir la surface( Figure 1D).
  12. Allumez le biseauté de sorte qu’il commence à tourner à 60 rpm. Placez le tube capillaire tiré dans la pince pipette dans la rainure « V ». Serrer la pince et ajuster l’angle de la pince pipette à 30°.
  13. Ajustez la pointe du bord pointu du tube capillaire à environ deux tiers de la distance du centre de rotation de la plaque de broyage.
  14. Abaissez le tube capillaire serré en ajustant le bouton de commande grossier au sommet du manipulateur. Continuer à abaisser le tube capillaire jusqu’à ce que la pointe du tube capillaire s’étende sous la surface de l’eau et entre en contact avec la surface abrasive de la plaque de broyage.
  15. Surveillez la progression du biseau à l’aide du microscope fixé au biseauté. Après 5 min, ajuster le contrôle fin pour soulever l’aiguille en verre de la plaque de broyage.
  16. Retirez l’aiguille de verre et placez-la sous le grossissement de 10x pour vérifier la pointe du tube capillaire(figure 1E,F).
  17. Pour s’assurer qu’il n’y a pas de blocages, insérez l’aiguille en verre dans un porte-pipette sur une seringue et poussez l’air dans un tube de 1 mL de 99 % d’éthanol. Si des bulles d’air se forment à l’extrémité de l’aiguille, l’aiguille n’a pas de blocages et peut être utilisée pour la microinjection. Ce processus assure également la stérilité des aiguilles en verre.
  18. Un tube capillaire peut contenir jusqu’à 5 μL de liquide. Marquer le tube capillaire en 10 sections pour calculer les distances sur l’aiguille à marquer pour 0,5 volume de μL. Marquez une échelle avec cette distance qui détient 0,5 μL pour la préparation future. Pour une aiguille de 5 μL, les distances de 0,7 mm de distance équivalent à 0,5 μL(figure 1G).

2. Bacillus cereus culture

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Stock de congélateur strié de B. cereus ATCC 14579 pour l’isolement d’une seule colonie sur une plaque d’agar de sang de mouton de 5 % et d’incubation pendant la nuit à 37 °C (figure 2A).
  3. Pipette 5 mL de bouillon stérile d’infusion de coeur de cerveau (BHI) dans un tube stérile de 10 mL de snap-cap(figure 2B). À l’aide d’une boucle stérile ou d’une aiguille, choisissez une seule colonie de B. cereus ATCC 14579 dans la plaque d’agar et inoculez le liquide BHI.
  4. Vortex l’échantillon brièvement. Placez le tube à capuchon dans un incubateur rotatif. Réglez la température à 37 °C et la vitesse à 200 rpm. Après 18 h, retirer la culture de l’incubateur (Figure 2B).

3. Dilution bactérienne pour injection intravitreal

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Calculer le volume de la culture B. cereus pendant la nuit pour ajouter à 10 mL de BHI frais pour atteindre 200 unités de formation de colonies par microlitre (CFU/μL). Par exemple, une culture nocturne de B. cereus dans BHI se reproduit à environ 2 x 108 CFU/mL, qui peut ensuite être diluée à 200 CFU/μL en pipetant 10 μL de culture du jour au lendemain en 10 mL de BHI frais.
  3. Pipette 1 mL de la culture fraîchement diluée dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Maintenir ce tube sur la glace jusqu’à l’injection intravitreal. Effectuer l’injection intravitreal dans les 60 minutes de diluer la culture bactérienne.

4. Injection intravitreal de souris

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Préparez le site de l’intervention en plaçant des sous-claviers médicaux sur la table d’opération.
  3. Allumez le microinjecteur et ouvrez la vanne de gaz sur le réservoir d’air comprimé fixé au microinjecteur. Réglez le régulateur de réservoir jusqu’à ce que la livraison de gaz soit d’environ 60 psi.
  4. Sur le microinjecteur, appuyez sur Mode jusqu’à ce que l’écran affiche Balance. Appuyez sur Balance et placez la souris d’ordinateur sur la table d’opération. Connectez le support de pipette en acier inoxydable au tube attaché au « remplissage/sortie » de l’injecteur. Ce tube est toujours connecté à l’injecteur.
  5. Insérez l’aiguille capillaire à l’autre extrémité du porte-pipette en vissant le connecteur du porte-pipette autour de l’aiguille.
  6. Allumez le microscope ophtalmique et allumez sa lumière à une intensité de 50%. Ajustez le microscope sur le site de la procédure sur la table d’opération et ajustez le microscope à la mise au point désirée.
  7. Avant le début de la procédure, confirmez que la souris est adéquatement anesthésiée en testant le réflexe de retrait de la pédale. Assurez-vous de suivre votre protocole approuvé par l’IACUC pour l’anesthésie.
  8. Placez la souris anesthésiée sur les dessous médicaux avec son nez pointé vers la droite et appuyé sur son côté gauche.
  9. Regardez l’œil droit de la souris à travers le microscope ophtalmique et ouvrez les couvercles en ouvrant les pinces d’une force d’action inverse de chaque côté de l’œil pour exposer le site d’injection (Figure 3C).
  10. Remplissez l’aiguille capillaire de la dilution de 200 CFU/μL en cliquant à gauche sur le tapis de souris connecté au microinjecteur (Figure 3D).
  11. Fixez la tête de l’animal avec la main gauche et placez le bout de l’aiguille dans les limbes de l’œil. Avec l’aiguille en position biseauté et à angle de 45°, perforez l’œil de la souris, mais assurez-vous que seule la pointe pointue de l’aiguille (~0,5 mm) est insérée lors de l’injection.
  12. Une fois que la pointe de l’aiguille est insérée, déplacez la main gauche de la tête de la souris vers le tapis de souris et cliquez à droite sur le tapis de souris pour injecter 0,5 μL de la dilution B. cereus. Pour éviter les fuites, laissez la pointe de l’aiguille à l’intérieur de l’œil de la souris pendant 2-3 secondes avantd’enlever(Figure 3E) 1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Relâchez les forceps et placez la souris dans une cage qui est assise sur un coussin chauffant. Surveillez ces souris jusqu’à ce qu’elles se soient remises del’anesthésie ( Figure 3F).
  14. Une fois que les souris sont récupérées de l’anesthésie, retourner la cage à son rack approprié. Si les souris sont soumises à l’analyse de la fonction rétinienne par électrorétinographie, les cages doivent être retournées dans une pièce sombre pour une bonne adaptation sombre.

5. Préparation du tube de récolte

  1. Placer des perles de verre stériles de 1 mm dans des tubes de bouchon à vis de 1,5 mL.
  2. Stériliser ces tubes dans un autoclave sur un réglage sec. Laisser refroidir les tubes à température ambiante avant de les utiliser.
  3. Ajouter 10 mL de saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à un tube stérile de centrifugeuse de 15 mL.
  4. Ajouter 1 comprimé de comprimé de cocktail inhibiteur de la protéase dans le tube. Mélanger en vortexant19,27,29,34,35.
  5. Pipette 400 μL de saline 1x tamponnée de phosphate (PBS) contenant l’inhibiteur de protéase dans chaque tube de récolte autoclavé. Étiqueter les tubes et les placer sur la glace. (Figure 4A).

6. Récolter les yeux

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Euthanasier la souris par inhalation de CO2. Utilisez une méthode secondaire pour confirmer l’euthanasie.
  3. Tenez la tête de souris euthanasiée en sécurité et ouvrez les forceps fines de pointe de chaque côté de l’œil infecté. Poussez vers le bas vers la tête pour proptose l’oeil. Une fois que les pinces sont derrière le globe de l’œil, presser les pinces ensemble. Tirez les forceps loin de la tête pour détacher le globe oculaire (Figure 4B).
  4. Placez immédiatement le globe oculaire dans un tube de récolte étiqueté. Placez les tubes sur la glace pendant au plus 60 min(figure 4C).

7. Nombre bactérien intraoculaire

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Confirmez que tous les tubes de récolte sont étroitement fermés et équilibrés dans l’homogénéiseur tissulaire (figure 5A). Allumez l’homogénéiseur tissulaire pendant 1 min pour homogénéiser les échantillons. Attendez 30 s, puis allumez une minute de plus. Placer les tubes sur laglace ( figure 5B,C).
  3. Diluer périodiquement chaque échantillon 10 fois en transférant séquentiellement 20 μL de l’homogénéité en 180 μL de 1x PBS stérile. Diluer jusqu’à ce qu’un facteurde 10 -7 soit atteint( Figure 5D).
  4. Étiquetez chaque rangée d’une plaque BHI chaude et carrée avec les facteurs de dilution appropriés. Transférer 10 μL de chaque dilution d’affilée vers la plaque BHI supérieure inclinée d’environ 45°. Laissez l’échantillon courir jusqu’à ce qu’il atteigne presque le fond de la plaque, puis mentez la plaque à plat (Figure 5E)39.
  5. Lorsque l’échantillon est absorbé dans l’agar BHI, transférer la plaque dans un incubateur de 37 °C. Les colonies doivent commencer à être visibles à 8 h après avoir été placées dans l’incubateur.
  6. Retirer la plaque de l’incubateur avant que la croissance des colonies de B. cereus n’interfère avec l’identification des colonies individuelles (figure 5F).
  7. Pour une représentation précise de la concentration dans l’échantillon, comptez la ligne qui a entre 10-100 colonies. Par exemple, une rangée avec la fraction de dilution de10-4 qui a 45 colonies aura une concentration de 4,5 x 105 CFU/mL.
  8. Pour calculer le nombre total de bactéries par œil, multipliez la concentration par 0,4, ce qui représente le volume millilitre de 1x PBS utilisé pour homogénéiser l’œil. Par exemple, la concentration de 4,5 x 105 CFU/mL se traduirait par 1,8 x 105 CFU B. cereus par œil.

8. Conservation des échantillons

  1. Placer les échantillons d’homogénéité dans une boîte de congélation étiquetée et placer cette boîte dans un congélateur de -80 °C. Ces échantillons peuvent être utilisés plus tard pour l’analyse inflammatoire du médiateur par ELISA.

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Representative Results

La génération d’un inoculum reproductible et l’exactitude de la procédure d’injection intravitreal sont des étapes clés dans le développement de modèles d’endophtalmite microbienne. Ici, nous avons démontré la procédure d’injection intravitreal utilisant Gram-positive Bacillus cereus. Nous avons injecté 100 CFU/0,5 μL de B. cereus dans le milieu vitreux de cinq souris C57BL6. Après 10 h postinfection, nous avons observé la croissance intraoculaire de B. cereus à approximativement 1.8 x 105 CFU/oeil. La figure 1 démontre la construction d’aiguilles en verre pour livrer les bactéries dans le milieu des yeux de souris. Bacillus cereus de plus en plus sur une plaque d’agar de sang et dans les tubes de culture est montré dans la figure 2. La figure 3 montre la procédure d’injection intravitreal de souris utilisant un système d’injection pressurisée d’air. La figure 4 démontre le processus de récolte des yeux infectés après l’autopsie souhaitée. La figure 5 montre la technique d’homogénéisation des yeux infectés. La figure 6 démontre les comptes bactériens intraoculaires de cinq yeux de souris différents à 10 h postinfection. La figure 7 représente la procédure globale et la représentation graphique d’une injection intravitreal de souris.

Figure 1
Figure 1 : Fabrication d’aiguilles en verre biseauté. Les aiguilles en verre ont été fabriquées à partir de pipettes microcapillaires jetables à l’aide d’un tire-aiguille/pipette et d’un biseau à micropipette. (A) Tube capillaire en verre serré dans le puller aiguille/pipette. (B,C) Création d’aiguilles en verre utilisant la tension désirée. (D) Biseautant les micropipettes en verre. (E,F) Micropipettes en verre avant et après biseauté. (E) Mise à l’échelle des aiguilles en verre. L’espace entre deux points noirs contient 0,5 μL. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Bacillus cereus ATCC 14579. (A) Bacillus cereus de plus en plus sur une plaque d’agar de sang. Les colonies individuelles de B. cereus présentent généralement des zones claires d’hémolyse sur une plaque d’agar sanguin. (B) Turbid cultures du jour au lendemain de B. cereus. (C) Gram-coloration de B. cereus. B. cereus sont des bactéries gram-positives en forme de tige. (D) Micrographe électronique de Bacillus cereus. Ce micrographe électronique montre bacillus cereus en forme de tige avec des cheveux comme des structures appelées flagelle. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Injection intravitreal de souris. La procédure d’injection est effectuée à l’aide d’un injecteur d’air pressurisé avec visualisation du champ d’opération à l’aide d’un microscope commercial (A) kétamine et xylazine médicament pour anesthésier la souris. (B) Administration de kétamine et de xylazine par injection intrapénitale pour anesthésier la souris. (C) Serrant la peau périoculaire de nouveau pour proptose l’oeil. (D) Remplir les aiguilles avec des bactéries à l’aide de l’injecteur pressurisé de l’air. (E) Injection intravitreal. (F) Surveillance de la souris infectée après l’anesthésie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Récolte de l’œil infecté par la souris. Après l’infection, après le point de temps désiré, récoltez les yeux de souris infectés à l’aide d’une pince stérile. (A) PBS contenant des perles de verre stériles. (B) Récolte de l’œil infecté. (C) Tube de récolte contenant un oeil de souris. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Traitement de l’œil récolté pour le nombre de bactéries intraoculaires. (A) Tube de récolte avec l’oeil infecté serré étroitement à un homogénéisateur de tissu. (B) Les yeux infectés ont été homogénéisés deux fois pendant 1 min chacun. Dilution de la voie (D) des homogénéisations oculaires (C) et placage ultérieur (E) pour la quantitation bactérienne. (E) Représentant individuel Bacillus cereus colonie après dilution de la voie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Dénombrements bactériens intraoculaires à 10 h postinfection. M, numéro de souris. CFU, unités de formation de colonies. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Injection intravitreal de souris. (A) Débit global de la procédure d’injection intravitreal de souris. (B) Présentation graphique de l’injection intravitreal. Pendant la procédure, des aiguilles en verre stériles et biseautés contenant une culture de B. cereus sont insérées dans le midvitreous de l’oeil de souris, et B. cereus sont livrés utilisant un système de microinjection air-pressurisé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Même avec la disponibilité d’antibiotiques puissants, de médicaments anti-inflammatoires et de chirurgie vitrectomie, l’endophtalmite bactérienne peut aveugler un patient. Les études cliniques ont été utiles dans l’étude de l’endophtalmite; cependant, les modèles expérimentaux de l’endophtalmite fournissent des résultats rapides et reproductibles qui peuvent être traduits au progrès dans la norme de soin, ayant pour résultat de meilleurs résultats visuels pour des patients.

Le volume vitreux de l’œil de souris est d’environ 7 μL40. Ce petit volume ne permet d’injecter qu’une quantité limitée de matériaux. Les volumes supérieurs à 1,0 μL ne doivent pas être injectés afin d’éviter les dommages oculaires. Le processus nécessite un équipement spécifique et la pratique des techniques pour assurer la reproductibilité et la précision. L’endophtalmite a été étudiée chez les primates, les porcs, les lapins, les rats, les cochons d’Inde et chez la souris28,41,42,43,44,45. Parmi les plus grandes espèces, les yeux sont beaucoup plus proches de la taille des yeux humains, et les injections intravitreal dans de plus grands yeux peuvent être exécutées sans équipement spécial. À l’exception de la souris, l’absence de souches knock-out et de réacoagènes pour étudier les réponses immunitaires de l’hôte dans d’autres modèles animaux limite leur utilité dans l’endophtalmite expérimentale.

L’endophtalmite se produit le plus fréquemment comme complication de la chirurgie de cataracte. Cette infection peut également se produire après un traumatisme oculaire pénétrant ou une infection systémique. Les résultats visuels dans cette maladie dépendent en partie de la virulence de l’agent pathogène infectant. Chez la souris, les résultats visuels dépendent également de leur statut immunitaire. La compréhension des mécanismes de la pathogénie de la maladie a été facilitée par l’étude de la maladie dans les modèles animauxexpérimentaux 28. Le protocole pour l’injection intravitreal de souris et la quantification des paramètres d’infection peuvent être adaptés pour étudier l’endophtalmite initiée avec presque n’importe quel type d’agent pathogène bactérien oufongique 28. En outre, ce protocole peut également être appliqué et modifié pour étudier les changements anatomiques, les processus inflammatoires et les profils d’expression génétique des bactéries et de l’hôte pendant l’infection.

L’injection intravitreal de souris et l’analyse suivante des paramètres d’infection se composent de plusieurs étapes critiques( figure 7). L’aiguille en verre doit être créée avec précision, marquée et stérilisée. L’extrémité pointue de l’aiguille en verre biseauté et la mise à l’échelle appropriée détermine la livraison adéquate des bactéries et de la ponction globe. Si l’extrémité de l’aiguille est courte et n’est pas bien biseauté, elle pourrait créer un grand trou sur le globe qui pourrait causer des fuites, la contamination du globe, et un résultat inexact de la maladie. Par conséquent, il est recommandé d’observer les micropipettes en verre tout en biseautant sous le zoom optique 10x d’un microscope de champ lumineux. Pour assurer la livraison de la quantité correcte de bactéries, les dilutions doivent être calculées à l’avance, et l’échelle de volume appropriée doit être marquée sur l’aiguille en verre. Les paramètres de traction et de biseauté des aiguilles à l’aide d’autres types d’équipement peuvent varier.

La technique d’injection intravitreal décrite utilise un système de microinjecteur pressurisé par air pour la livraison appropriée des bactéries dans l’œil de la souris1. L’utilisation appropriée de ce microinjecteur est cruciale pour les paramètres d’infection reproductibles. Puisque la pression d’air détermine la vitesse de livraison, la force excessive pourrait rapidement injecter un plus grand volume dans les yeux, causant la pression intraoculaire excessive et/ou la rupture de globe. Par conséquent, la recommandation est d’utiliser une pression de 10-13 psi pour remplir et injecter pendant la procédure. Un autre problème potentiel est la fuite de la solution bactérienne des aiguilles de verre après le remplissage. Une fuite pourrait entraîner l’injection de volumes inexacts dans les yeux de la souris. Vérifiez toujours les connexions entre le système d’injection, les tubes et les aiguilles en verre avant les injections.

L’injection de quantités précises de bactéries est essentielle à la reproductibilité de l’endophtalmite bactérienne expérimentale. Différents modèles expérimentaux d’endophtalmite nécessitent l’inoculationd’un nombre spécifique de bactéries 12,28,46,47,48,49. Pour b. cereus endophthalmitis, l’injection de 100 CFU est nécessaire pour initier une infection reproductible1. Puisque la croissance bactérienne dépend du milieu de croissance et des conditions, l’environnement de croissance, les médias, et les dilutions doivent être répétés à chaque fois. Par conséquent, il est recommandé de tester les conditions de culture avant l’expérience pour reproduire l’inoculum précis dans le volume approprié pour l’injection. Comme indiqué ci-dessus, la limite supérieure pour l’injection intravitreal dans les yeux de souris est 1.0 μL28. Un volume excessif élève la pression intraoculaire qui pourrait entraîner un glaucome, détacher la rétine du segment postérieur ou rompre le globe. L’injection intravitreal et l’infection résultante chez les souris peuvent ne pas imiter parfaitement B. cereus endophthalmitis dans un humain. La plupart des modèles animaux de maladies humaines sont limités de cette façon. Des quantités connues de B. cereus sont injectées dans l’œil après la croissance dans les médias riches en nutriments. Pour les cas cliniques d’endophtalmite de B. cereus, les quantités infectieuses ne sont pas connues et les sources de contamination varient. Cependant, les avantages d’utiliser des organismes caractérisés et des souches de souris et de générer des cours reproductibles d’infection l’emportent sur ces limitations.

La bonne récolte des yeux infectés est une autre étape cruciale. Le maintien de conditions aseptiques est essentiel pour éviter toute contamination croisée qui pourrait interférer avec l’interprétation des données. Par conséquent, la recommandation est de désinfecter l’établi et tous les instruments avec 70 % d’éthanol avant la récolte. Les nombres bactériens augmentent rapidement à l’intérieur de l’environnement vitreux pendant l’infection, ce qui peut causer un gonflement de l’œil. Par conséquent, il faut prendre soin d’enlever doucement l’œil pendant la récolte empêcher la rupture du globe. En outre, le bouchon du tube de récolte contenant l’œil infecté doit être suffisamment serré avant de placer le tube dans l’homogénéiseur tissulaire. Un bouchon lâche entraînera une fuite et une contamination de l’homogénéiseur tissulaire conduisant à une quantitation inexacte des bactéries dans les tubes qui fuient. La procédure d’homogénéisation des yeux augmente également la température des tubes. Par conséquent, il est recommandé d’homogénéiser 1 minute à la fois. Des températures élevées pourraient avoir un impact sur la quantitation de certains paramètres d’infection. Bien que cette méthode ne fournisse pas le nombre de bactéries dans des endroits spécifiques de l’œil, lorsqu’elle est combinée avec des méthodes histologiques, nous pouvons estimer où les bactéries pourraient être localisées. La localisation de B. cereus dans l’oeil pendant l’endophtalmite a été rapportée chez les lapins, dont les yeux sont plus grands et plus facilement disséqués dans les sous-parties. 2 Ans et plus

L’injection intravitreal imite la livraison des organismes au segment postérieur de l’oeil, qui initie l’infection. Cette première étape facilite l’étude qualitative et quantitative des paramètres d’infection dans un modèle de souris hautement reproductible de l’endophtalmite expérimentale. Ces modèles sont également utilisés pour estimer l’inflammation oculaire en quantifiant la myeloperoxidase dans l’infiltration des neutrophiles, en identifiant des types cellulaires spécifiques par cytométrie de flux, en quantifiant les cytokines et les chimiokines par PCR en temps réel et/ou ELISA, et en observant l’architecture oculaire par histopathologie1,6,19,20,26,27,34,35,38. Les yeux de souris infectés sont récoltés avec différents diluants selon le type de paramètres d’infection à mesurer. Pour l’analyse de l’expression des gènes, un tampon de lyse différent estnécessaire 26. Pour l’examen histopathologique, les yeux récoltés sont placés dans une solution fixative. La multitude de souris ko génétiques facilite également l’étude du rôle de divers facteurs immunitaires et cellules. L’injection intravitreal est donc une technique de base pour les chercheurs dans le domaine des infections intraoculaires et thérapeutiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit financier à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Dr Feng Li et Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, États-Unis) pour leur aide. Nos recherches ont été soutenues par les subventions des National Institutes of Health R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 et R01EY024140. Nos recherches ont également été appuyées par P30EY21725 (subvention NIH CORE pour l’imagerie et l’analyse des animaux vivants, la biologie moléculaire et l’imagerie cellulaire). Notre recherche a également été appuyée par le programme de stages prédoctoraux NEI Vision Science 5T32EY023202, une subvention de soutien à la recherche de la Fondation presbytérienne de la santé et une subvention sans restriction au Dean A. McGee Eye Institute de Research to Prevent Blindness.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

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Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

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