Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הזרקה תוך-ואטראלית וכמות של פרמטרי זיהום במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים כאן שיטה של הזרקה תוך-ואטראלית וכמות חיידקית עוקבת במודל העכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי. ניתן להאריך פרוטוקול זה למדידת תגובות חיסוניות מארחות וביטוי גנים חיידקי ומארח.

Abstract

זיהומים חיידקיים תוך עיניים מהווים סכנה לחזון. חוקרים משתמשים במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את הגורמים המארחים והחיידקיים ואת מסלולי התגובה החיסונית הקשורים לזיהום כדי לזהות מטרות טיפוליות קיימא ולבדוק תרופות למניעת עיוורון. טכניקת ההזרקה התוך-ויטריאלית משמשת להזרקת אורגניזמים, סמים או חומרים אחרים ישירות לחלל הירך בחלק האחורי של העין. כאן, הדגמנו טכניקת הזרקה זו כדי ליזום זיהום בעין העכבר ואת הטכניקה של כימות חיידקים תוך עיניים. Bacillus cereus גדל במדיה נוזלית עירוי לב המוח במשך 18 שעות ו resuspended לריכוז 100 מושבה להרכיב יחידות (CFU)/0.5 μL. עכבר C57BL/6J היה הרדמה באמצעות שילוב של קטמין וקסילאזין. באמצעות מיקרו-מיינר פיקוליטר ומחטי נימי זכוכית, הוזרק 0.5 מיקרו-ל' של ההשעיה של בצילוס אל תוך זיבת האמצע של עין העכבר. עין הבקרה ההפוך הוזרקה עם מדיה סטרילית (שליטה כירורגית) או לא הוזרקה (שליטה מוחלטת). ב 10 שעות לאחר זיהום, עכברים היו המתת דם, ועיניים נקצרו באמצעות פינצטה כירורגית סטרילית והוכנסו לצינור המכיל PBS סטרילי μL 400 ו 1 מ"מ חטוזי זכוכית סטרילית. עבור ELISAs או מיאלופרוקסידאז, מעכב פרוטאינאז נוסף לצינורות. עבור חילוץ RNA, מאגר התיזה המתאים נוסף. העיניים היו הומוגניות ב homogenizer רקמות במשך 1-2 דקות. הומוג'נים דוללים באופן סדרתי פי 10 ב-PBS ומעקב מדולל על צלחות אגר. שאר ההומוגנים אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס לצורך בדיקות נוספות. צלחות היו דגירה במשך 24 שעות CFU לכל עין היה לכמת. טכניקות אלה לגרום זיהומים לשחזור בעיני העכבר להקל על כימות של חיידקים קיימא, התגובה החיסונית המארחת, ו omics של ביטוי גנים מארח חיידקי.

Introduction

אנדופתלמיטיס בקטריאלי הוא זיהום הרסני שגורם לדלקת, ואם לא מטופלים כראוי, יכול לגרום לאובדן ראייה או עיוורון. אנדופתלמיטיס נובעת כניסת חיידקים לתוך הפנים שלהעין 1,2,3,4,5. פעם אחת בעין, חיידקים לשכפל, לייצר רעלים וגורמים מזיקים אחרים, והוא יכול לגרום נזק בלתי הפיך לתאי רשתית עדינים ורקמות. נזק עיני יכול להיגרם גם על ידי דלקת, עקב הפעלת מסלולים דלקתיים המוביל זרם תאים דלקתיים לתוךהפנים של העין 1,5,6. אנדופתלמיטיס יכול להתרחש לאחר ניתוח תוך עיני (לאחר הניתוח), פציעה חודרת לעין (פוסט טראומטית), או מהתפשטות גרורתית של חיידקים לתוך העין מאתר אנטומי אחר (אנדוגני)7,8,9,10. הטיפולים בדלקת אנדופתלמית חיידקית כוללים אנטיביוטיקה, תרופות אנטי דלקתיות,או התערבות כירורגית 3,4,11. אפילו עם טיפולים אלה, ראייה או העין עצמה עלולה ללכת לאיבוד. הפרוגנוזה החזותית לאחר אנדופתלמיטיס חיידקית משתנה בדרך כלל בהתאם ליעילות הטיפול, חדות הראייה במצגת, ואת הארסיות של האורגניזם המדביק.

בצילוס cereus (B. cereus) הוא אחד הפתוגנים החיידקיים העיקריים הגורמים אנדופתלמיטיס פוסטטראומטית 7,12. רוב המקרים B. cereus אנדופתלמיטיס יש כמובן מהיר, אשר יכול לגרום לעיוורון בתוך כמה ימים. סימני ההיכר של B. cereus endophthalmitis כוללים דלקת תוך עינית המתפתחת במהירות, כאבי עיניים, אובדן מהיר של חדות ראייה, וחום. B. cereus גדל במהירות בעין לעומת חיידקים אחרים אשר בדרך כלל לגרוםלדלקות עיניים 2,4,12 ויש לו גורמי ארסיות רבים. לכן, החלון להתערבות טיפוליתמוצלחת הוא קצר יחסית 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. טיפולים בזיהום זה הם בדרך כלל מוצלחים בטיפול אנדופתלמיטיס הנגרמת על ידי פתוגנים פחות ארסיים אחרים, אבל B. cereus endophthalmitis בדרך כלל תוצאות יותר מ 70% מהחולים הסובלים מאובדן ראייה משמעותי. כ -50% מהחולים האלה עוברים סילוק או חינוך של העין הנגועה7,16,22,23. האופי ההרסני והמהר של B. cereus endophthalmitis דורש טיפול מיידי ונכון. ההתקדמות האחרונה בהבחנה המנגנונים הבסיסיים של התפתחות המחלה זיהו יעדים פוטנציאלייםלהתערבות 19,26,27. מודלים ניסיוניים של העכבר של B. cereus אנדופתלמיטיס ממשיכים להיות שימושיים בהבחנה במנגנונים של זיהום ובדיקת טיפולים פוטנציאליים שעשויים למנוע אובדן ראייה.

זיהום תוך עיני ניסיוני של עכברים עם B. cereus כבר מודל אינסטרומנטלי להבנת גורמים חיידקיים ומארח, כמו גם האינטראקציות שלהם, במהלך אנדופתלמיטיס28. מודל זה מחקה אירוע פוסט-טראומטי או פוסט-אופרטיבי, שבו חיידקים מוחכנסים לעין במהלך פציעה. מודל זה ניתן לשחזור רב והיה שימושי לבדיקת טיפולים ניסיוניים ולספק נתונים לשיפורים בסטנדרט הטיפול1,6,19,29,30. כמו מודלים רבים אחרים של זיהום, מודל זה מאפשר שליטה עצמאית בפרמטרים רבים של זיהום ומאפשר בדיקה יעילה ובלתי ניתנת לשחזור של תוצאות הזיהום. מחקרים במודל דומה בארנבים בעשורים האחרונים בחנו את ההשפעות של גורמי ארסיות B. cereus בעין 2,4,13,14,31. על ידי הזרקת B. cereus מוטציה זנים חסרים גורמים בודדים או ארסיים מרובים, התרומה של גורמים אלה ארסיות לחומרת המחלה ניתן למדוד על ידי תוצאות כגון ריכוז של חיידקים בשעות שונות של postinfection אואובדן תפקוד חזותי 13,14,27,31,32. בנוסף, נבדקו גורמים מארחים במודל זה על ידי להדביק זני עכברנוקאאוט חסרים גורמי מארח דלקתיים ספציפיים 26,29,33,34,35. המודל שימושי גם לבדיקת טיפולים פוטנציאליים למחלה זו על ידי הזרקת תרכובות חדשניות לתוך העין לאחרזיהום 30,36. בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט הכולל הדבקת עין העכבר עם B. cereus, קצירת העין לאחר זיהום, כימות עומס חיידקי תוך עיני, ושמירה על דגימות כדי לסמן פרמטרים נוספים של חומרת המחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ובהצהרה של האגודה לחקר הראייה והרופא לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון. הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (מספרי פרוטוקול 15-103, 18-043 ו-18-087).

1. מחטי זכוכית סטריליות

  1. הפעל את מושך פיפטה מחט.
  2. כוונן את ידית התנור עד שהצג יציג 12.6.
  3. פתחו את הדלת והאכילו ידנית את צינור נימי 5 μL דרך המהדק העליון ואת נימי התנור עד שחצי הצינורית משתרעת מתחת לתנור (איור 1A).
  4. ודא כי צינור נימי הוא חריץ "V" במהדק העליון. הדק את המהדק העליון.
  5. כאשר המהדק התחתון פתוח, כוונן ידנית את השקופית האנכית למעלה עד שהמהדק התחתון יגיע לקצה העליון שלו. ודא כי הצינור הוא חריץ "V" במהדק התחתון. הדק את המהדק התחתון.
  6. סגור את הדלת ותאשר שהאור 'מוכן' דום. לחץ על לחצן התחל כדי ליזום את רצף התנור והממשוך (איור 1B).
  7. ודא שהתנור נכבה באופן אוטומטי לאחר שהחום וכוח המשיכה מושכים את צינור נימי זה מזה (איור 1C), והמגלשה נעה כלפי מטה.
  8. פתח את הדלת. תוך החזקת החלק העליון של צינור נימי, לזמן את המהדק העליון. מוציאים את צינור נימי העליון ומניחים אותו בצד.
  9. החזק את צינור נימי במגלשה התחתונה ו untighten המהדק התחתון. מוציאים את צינור נימי התחתון ומניחים אותו בצד.
  10. השתמש beveler microelectrode עם 0.05 מיקרומטר אלומינה לוח שחיקה שוחקים כדי שפשופ צינור נימי משך כדי ליצור את מחטי ההזרקה.
  11. פיפטה מספיק מים על צלחת השחיקה כדי לכסות את פני השטח (איור 1D).
  12. הפעל את הבולבול כך שיתחיל להסתובב במהירות של 60 סל"ד. מניחים את צינור נימי משך לתוך מהדק פיפטה בגרוב "V". הדקו את המהדק והתאיימו את זווית המהדק ל-30°.
  13. התאימו את קצה הקצה המחודד של הצינור נימי במרחק של כשני שלישים ממרכז הסיבוב של צלחת השחיקה.
  14. מנמיך את צינור נימי מהודק על ידי התאמת ידית הבקרה גס בחלק העליון של המניפולטור. ממשיכים להנמיך את צינור נימי עד קצה צינור נימי משתרע מתחת לפני השטח של המים ומגע פני השטח שוחקים של צלחת שחיקה.
  15. נטר את התקדמות המיתר באמצעות המיקרוסקופ המחובר לשומר. לאחר 5 דקות, להתאים את השליטה בסדר כדי להעלות את מחט הזכוכית מצלחת השחזה.
  16. הסר את מחט הזכוכית והצב אותה תחת הגדלה של פי 10 כדי לבדוק את קצה צינור נימי (איור 1E, F).
  17. כדי להבטיח כי אין חסימות, להכניס את מחט הזכוכית לתוך מחזיק פיפטה על מזרק ולדחוף אוויר לתוך צינור 1 מ"ל של 99% אתנול. אם בועות אוויר טופס בקצה המחט, המחט אין חסימות והוא יכול לשמש microinjection. תהליך זה גם מבטיח את הסטריליות של מחטי הזכוכית.
  18. צינור נימי אחד יכול להחזיק עד 5 μL נוזל. סמן את הצינור נימי לתוך 10 חלקים כדי לחשב את המרחקים על המחט כדי לסמן עבור 0.5 כרכים μL. סמן סולם עם מרחק זה המחזיק 0.5 μL להכנה עתידית. עבור מחט 5 μL, מרחקים של 0.7 מ"מ זה מזה להשוות 0.5 μL (איור 1G).

2. תרבות בצילוס צריוס

  1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
  2. מלאי מקפיא פסים של B. cereus ATCC 14579 לבידוד מושבה אחת על צלחת אגר דם כבשים 5% ודגירה לילה ב 37 °C(איור 2A).
  3. פיפטה 5 מ"ל של עירוי לב המוח סטרילי (BHI) מרק לתוך צינור 10 מ"ל סטרילי כובע הצמד (איור 2B). באמצעות לולאה סטרילית או מחט, לבחור מושבה אחת של B. cereus ATCC 14579 מצלחת אגר לחסן את BHI נוזלי.
  4. וורטקס הדגימה לזמן קצר. מניחים את צינור כובע ההצמדה באינקובטור מסתובב. הגדר את הטמפרטורה ב 37 °C (69 °F) ומהירות ב 200 סל"ד. לאחר 18 שעות, הסר את התרבות מהחממה (איור 2B).

3. דילול בקטריאלי להזרקה תוך-ואטראלית

  1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
  2. לחשב את הנפח של תרבות B. cereus לילה להוסיף 10 מ"ל של BHI טרי כדי להשיג 200 מושבה להרכיב יחידות למיקרוליטר (CFU / μL). לדוגמה, תרבות לילה של B. cereus ב BHI משכפלת כ 2 x 108 CFU / מ"ל, אשר לאחר מכן ניתן לדלל ל 200 CFU / μL על ידי צינורות 10 μL של תרבות לילה לתוך 10 מ"ל של BHI טרי.
  3. Pipette 1 מ"ל של התרבות הטרייה המדוללת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. יש לשמור את הצינור על הקרח עד להזרקה תוך-ואטראלית. בצע את הזרקת תוך ויטראלי בתוך 60 דקות של דילול התרבות החיידקית.

4. הזרקת עכבר תוך-ויטריאלי

  1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
  2. הכן את אתר ההליך על ידי הצבת משטחים רפואיים על שולחן הניתוחים.
  3. הפעל את microinjector ולפתוח את שסתום הגז על מיכל האוויר הדחוס מחובר microinjector. התאימו את ווסת המיכל עד להספקת הגז כ-60 psi.
  4. במיקרו-מיינר, הקש Mode עד שהמסך מציג את איזון. הקש על איזון והצב את עכבר המחשב על שולחן ההפעלה. חבר את מחזיק פיפטה נירוסטה צינורות מחובר 'מילוי / פלט' של המזרק. הצינור הזה תמיד מחובר למזרק.
  5. הכנס את מחט נימי לקצה השני של מחזיק פיפטה על ידי בורג חזק מחבר מחזיק פיפטה סביב המחט.
  6. הפעל את המיקרוסקופ עיניים והדליק את האור שלו בעוצמה של 50%. התאם את המיקרוסקופ על אתר ההליך בטבלת ההפעלה והתאם את המיקרוסקופ למוקד הרצוי.
  7. לפני תחילת ההליך, לאשר כי העכבר הוא הרדמה נאותה על ידי בדיקת רפלקס נסיגת הדוושה. הקפד לפעול בהתאם לפרוטוקול המאושר של IACUC להרדמת.
  8. מניחים את העכבר הרדמה על החלק התחתון הרפואי עם אפו הצביע ימינה נשען על הצד השמאלי שלה.
  9. הביטו בעין ימין של העכבר דרך המיקרוסקופ העיניים ופתחו את העפעפיים על ידי פתיחת מלקחיים של פעולה הפוכה משני צדי העין כדי לחשוף את אתר ההזרקה (איור 3C).
  10. מלאו את מחט נימי בדילול של 200 CFU/μL על ידי לחיצה שמאלית על משטח העכבר המחובר למיקרו-מיינר (איור 3D).
  11. אבטחו את ראש החיה ביד שמאל והמקם את קצה המחט בלימבוס של העין. עם המחט במצב משופע למעלה ובזווית של 45 מעלות, לנקב את עין העכבר, אבל להבטיח כי רק את הקצה החד של המחט (~ 0.5 מ"מ) מוכנס בעת ההזרקה.
  12. לאחר קצה המחט מוכנס, להזיז את היד השמאלית מן הראש העכבר אל כרית העכבר ולחץ ימינה על כרית העכבר כדי להזריק 0.5 μL של דילול B. cereus. כדי למנוע דליפה, השאירו את קצה המחט בתוך עין העכבר למשך 2.3 שניות לפני ההסרה (איור 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. שחררו את המדפים והכנסו את העכבר לכלוב שיושב על משטח התחממות. לפקח על עכברים אלה עד שהם התאוששו מהרדמה (איור 3F).
  14. ברגע שהעכברים יתאוששו מההרדמת, החזירו את הכלוב למדף הנכון שלו. אם העכברים יהיו נתונים לניתוח תפקוד רשתית על ידי אלקטרורטינוגרפיה, יש להחזיר כלובים לחדר חשוך להסתגלות כהה נאותה.

5. הכנת צינור קציר

  1. מניחים 1 מ"מ בחנוזי זכוכית סטריליים לתוך צינורות כובע בורג 1.5 מ"ל.
  2. לעקר את הצינורות האלה במקלעת אוטומטית על סביבה יבשה. תן את הצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  3. הוסף 10 מ"ל של 1x מלוחים סטריליים פוספט מאגר (PBS) לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל.
  4. הוסף 1 טבליה של טבלית קוקטייל מעכבי פרוטאז לתוך הצינור. מערבבים במערבולת19,27,29,34,35.
  5. פיפטה 400 μL של 1x פוספט מאגר מלוחים (PBS) המכיל מעכב פרוטאז לתוך כל צינור קציר autoclaved. תייג את הצינורות ומקום על קרח. (איור4A).

6. קצירת העיניים

  1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
  2. המתת לחץ הפוך את העכבר על ידי שאיפת CO2. השתמש בשיטה משנית כדי לאשר המתת חסד.
  3. החזק את ראש העכבר המתת דם מאובטח ולפתוח את מדפים קצה בסדר משני צדי העין הנגועה. לדחוף כלפי מטה לכיוון הראש כדי להניע את העין. ברגע המלקחיים הם מאחורי כדור הארץ של העין, לסחוט את המלקחיים יחד. משוך מעצורים מהראש כדי לנתק את גלגל העין (איור 4B).
  4. מיד מניחים את גלגל העין לתוך צינור קציר שכותרתו. מניחים צינורות על קרח לא יותר מ-60 דקות (איור 4C).

7. ספירת חיידקים תוך עינית

  1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
  2. ודאו שכל צינורות הקציר סגורים היטב ומאוזנים בזמן שהם נמצאים בהומוגניזציה של הרקמה (איור 5A). הפעל את homogenizer רקמה במשך 1 דקות כדי homogenize את הדגימות. חכה 30 שניות, ואז תדליק עוד דקה. מניחים צינורות על קרח (איור 5B,C).
  3. לדלל באופן סדרתי כל מדגם 10-פי על ידי העברה רציפה 20 μL של הומוגנטי לתוך 180 μL של PBS סטרילי 1x. מדללים עד לקבלת פקטור של10-7 (איור 5D).
  4. תייג כל שורה של צלחת BHI מרובעת וחמה עם גורמי הדילול הנכונים. העבר 10 μL של כל דילול ברציפות לצלחת BHI העליון כי הוא מוטה כ 45°. תן לדגימה לרוץ עד שהיא כמעט מגיעה לתחתית הצלחת, ולאחר מכן הנח את הלוח שטוח (איור 5E)39.
  5. כאשר המדגם נספג לתוך אגר BHI, להעביר את הצלחת אינקובטור 37 °C (69 °F). מושבות צריך להתחיל להיות גלוי 8 שעות לאחר שהוצב באינקובטור.
  6. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור לפני שצמיחת מושבות B. cereus מפריעה לזיהוי מושבות בודדות (איור 5F).
  7. לייצוג מדויק של הריכוז המדגם, ספור את השורה שיש בה בין 10-100 מושבות. לדוגמה, שורה עם שבר דילול של10-4 שיש לו 45 מושבות יהיה ריכוז של 4.5 x 105 CFU / מ"ל.
  8. כדי לחשב את המספר הכולל של חיידקים לכל עין, להכפיל את הריכוז על ידי 0.4, המייצג את נפח מיליליטר של 1x PBS המשמש הומוגניזציה העין. לדוגמה, ריכוז 4.5 x 105 CFU /mL יתורגם ל- 1.8 x 105 CFU B. cereus לכל עין.

8. שימור דגימות

  1. מניחים דגימות הומוגניות בקופסת מקפיא מסומנת וממקמים את הקופסה הזו במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. דגימות אלה ניתן להשתמש מאוחר יותר לניתוח מתווך דלקתי על ידי ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יצירת inoculum לשחזור ודיוק של הליך הזרקת תוך ויטראלי הם צעדים מרכזיים בפיתוח מודלים של אנדופתלמיטיס מיקרוביאלית. כאן, הדגמנו את הליך ההזרקה תוך-ויטרית באמצעות גרם חיובי Bacillus cereus. הזרקנו 100 CFU/0.5 μL של B. cereus לאמצע זקיף של חמישה עכברי C57BL6. לאחר 10 שעות לאחר ההידלקות, ראינו צמיחה תוך עינית של B. cereus כ 1.8 x 105 CFU / עין. איור 1 מדגים את בניית מחטי הזכוכית כדי להעביר את החיידקים לאמצע עיני העכבר. בצילוס צריוס גדל על צלחת אגר דם ובצינורות תרבות מוצג איור 2. איור 3 מציג את הליך ההזרקה הבין-ויטריאלית של העכבר באמצעות מערכת הזרקה בלחץ אוויר. איור 4 מדגים את תהליך קצירת העיניים הנגועים לאחר ההידבקות הרצויה. איור 5 מציג את הטכניקה להומוגניזציה של העיניים הנגוועות. איור 6 מדגים את ספירת החיידקים התוך עיניים מחמש עיני עכבר שונות ב-10 שעות לאחר ההיתוך. איור 7 מתאר את ההליך הכולל וייצוג גרפי של הזרקת עכבר תוך-ויטריאלית.

Figure 1
איור 1: הכנת מחטי זכוכית משופעות. מחטי זכוכית נעשו מפיגטות מיקרו-אפילריות חד פעמיות באמצעות משיכת מחט/פיפיטה ושיפוע מיקרופיפיט. (א)צינור נימי זכוכית מהודק במוציא המחט / פיפטה. (B, C) יצירת מחטי זכוכית באמצעות המתח הרצוי. (D)שיפוע מיקרופיטים זכוכית. (E, F) מיקרופיגט זכוכית לפני ואחרי שילינג. (E)שינוי קנה המידה של מחטי הזכוכית. רווח בין שתי נקודות שחורות מחזיק 0.5 μL. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 2
איור 2: בצילוס סיריוס ATCC 14579. (א) בצילוס צריוס גדל על צלחת אגר דם. מושבות בודדות של B. cereus בדרך כלל להציג אזורים ברורים של המוליזה על צלחת אגר דם. (ב)תרבויות לילה טורביות של ב. סיריוס. (ג)כתמי גרם של B. cereus. B. cereus הם חיידקים בצורת מוט גרם חיובי. (D)מיקרוגרף אלקטרונים של בצילוס cereus. מיקרוגרף אלקטרונים זה מראה מוט בצורת Bacillus cereus עם שיער כמו מבנים הנקראים פלאגלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הזרקת עכבר תוך-ויטריאלי. הליך ההזרקה מבוצע באמצעות מזרק אוויר בלחץ עם צפייה בשדה ההפעלה באמצעות מיקרוסקופ מסחרי (A) קטמין ותרופת קסילאזין כדי להרים את העכבר. (B)ניהול קטמין וקסילאזין על ידי הזרקה תוך-לידתית כדי להרים את העכבר. (C)הידוק העור הקדים בחזרה כדי להניע את העין. (D)מילוי המחטים בחיידקים באמצעות מזרק בלחץ האוויר. (E)הזרקה תוך-ויטריאלית. (F)ניטור עכבר נגוע לאחר הרדמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קצירת עכבר נגוע בעין. לאחר ההדבקה, לאחר נקודת הזמן הרצויה, לקצור עיני עכבר נגועות באמצעות פינצטה סטרילית. (א)PBS המכיל גם גם גם (ב)קצירת העין הנגועה. (C)צינור הקציר המכיל עין עכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: עיבוד העין שנקטפו לספירת חיידקים תוך עינית. (א)צינור הקציר עם העין הנגועה מהודקת בחוזקה להומוגניזציה של רקמות. (B)עיניים נגועות היו הומוגניות פעמיים במשך דקה אחת כל אחת. עקוב אחרדילול( D ) של הומוגנטים העין (C) וציפוי הבא (E) לכמת חיידקי. (E)נציג בודדים Bacillus cereus המושבה לאחר דילול המסלול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ספירת חיידקים תוך עיניים ב- 10 שעות לאחר ההידלקה. מ', מספר עכבר. CFU, יחידות להרכיב מושבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: הזרקת עכבר תוך-ויטריאלי. (A)תרשים זרימה כולל של הליך הזרקת תוך-ויטריאלית של העכבר. (B)הצגה גרפית של הזרקת תוך-ויטריאלית. במהלך ההליך, מחטי זכוכית סטריליות, משופעות המכילות תרבות של B. cereus מוכנסים לתוך אמצע הדרך של עין העכבר, ו B. cereus מועברים באמצעות מערכת microinjection בלחץ אוויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אפילו עם הזמינות של אנטיביוטיקה חזקה, תרופות אנטי דלקתיות, ניתוח vitrectomy, אנדופתלמיטיס חיידקי יכול לעוור את המטופל. מחקרים קליניים היו שימושיים בחקר אנדופתלמיטיס; עם זאת, מודלים ניסיוניים של אנדופתלמיטיס מספקים תוצאות מהירות לשחזור שניתן לתרגם להתקדמות ברמת הטיפול, וכתוצאה מכך תוצאה חזותית טובה יותר עבור חולים.

נפח ההיסטריה של עין העכבר הוא כ 7 μL40. נפח קטן זה מאפשר רק כמות מוגבלת של חומר להיות מוזרק. אין להזריק אמצעי אחסון הגדולים מ- 1.0 μL כדי למנוע נזק עיני. התהליך דורש ציוד ספציפי ותרגול של טכניקות כדי להבטיח רבייה ודיוק. אנדופתלמיטיס נחקרה בפרימטים, חזירים, ארנבות, חולדות, שרקניםובעכבר 28,41,42,43,44,45. בין המינים הגדולים יותר, העיניים קרובות הרבה יותר בגודלן לעיניים אנושיות, וזריקות תוך-ויטמינים לעיניים גדולות יותר יכולות להתבצע ללא ציוד מיוחד. למעט העכבר, היעדר זנים נוקאאוט reagents ללמוד את התגובות החיסונית המארחת במודלים אחרים של בעלי חיים מגביל את התועלת שלהם אנדופתלמיטיס ניסיוני.

אנדופתלמיטיס מתרחשת בתדירות הגבוהה ביותר כמו סיבוך של ניתוח קטרקט. זיהום זה יכול להתרחש גם בעקבות טראומה עינית חודרת או זיהום מערכתי. התוצאה החזותית במחלה זו תלויה בחלקה בארסיות של הפתוגן המדביק. בעכברים, התוצאה החזותית תלויה גם במצבם החיסוני. הבנת המנגנונים של פתוגנזה המחלה התאפשרה על ידי לימוד המחלה במודלים ניסיוניים של בעליחיים 28. הפרוטוקול להזרקה תוך-אטראלית של העכבר וכימות פרמטרי זיהום ניתן להתאים לחקר אנדופתלמיטיס יזם עם כמעט כל סוג של פתוגן חיידקי אופטרייתי 28. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מיושם ושונה כדי ללמוד שינויים אנטומיים, תהליכים דלקתיים, ואת פרופילי ביטוי הגנים של החיידקים והן המארח במהלך ההדבקה.

הזרקת עכבר תוך-חזור וניתוח של פרמטרי ההדבקה הבאים מורכבים ממספר שלבים קריטיים (איור 7). מחט הזכוכית חייבת להיווצר במדויק, לסמן ולסטריל. הקצה החד של מחט זכוכית משופעת ו קנה מידה תקין קובע את המסירה נאותה של חיידקים וניקוב גלובוס. אם קצה המחט קצר ולא משופע כראוי, זה יכול ליצור חור גדול על פני כדור הארץ אשר יכול לגרום דליפה, זיהום של כדור הארץ, ואת תוצאת מחלה לא מדויקת. לכן, מומלץ להתבונן micropipettes זכוכית תוך שיפוע תחת זום אופטי 10x של מיקרוסקופ שדה בהיר. כדי להבטיח את המסירה של הכמות הנכונה של חיידקים, דילול צריך להיות מחושב מראש, ואת סולם נפח הנכון צריך להיות מסומן על מחט הזכוכית. פרמטרים עבור משיכת מחט ושילינג באמצעות סוגים אחרים של ציוד עשויים להשתנות.

טכניקת ההזרקה התוך-ויטריאלית המתוארת משתמשת במערכת מיקרו-הגנה בלחץ אוויר למסירה נכונה של החיידקים לעין העכבר1. השימוש המתאים של microinjector זה הוא חיוני עבור פרמטרים זיהום לשחזור. מאז לחץ האוויר קובע את מהירות המסירה, כוח מופרז עלול במהירות להזריק נפח גדול יותר לתוך העיניים, גרימת לחץ תוך עיני מוגזם ו / או קרע כדור הארץ. לכן, ההמלצה היא להשתמש בלחץ של 10-13 psi כדי למלא ולהזריק במהלך ההליך. בעיה פוטנציאלית נוספת היא דליפה של הפתרון החיידקי ממחטי הזכוכית לאחר מילוי. דליפה עלולה לגרום להזרקה של כרכים לא מדויקים לתוך עיני העכבר. בדוק תמיד את הקשרים בין מערכת ההזרקה, צינורות, מחטי זכוכית לפני זריקות.

הזרקת כמויות מדויקות של חיידקים חיונית לשחזור של אנדופתלמיטיס חיידקי ניסיוני. מודלים ניסיוניים שונים של אנדופתלמיטיס דורשים חיסון של מספריםספציפיים של חיידקים 12,28,46,47,48,49. עבור B. cereus אנדופתלמיטיס, הזרקת 100 CFU יש צורך ליזום זיהום לשחזור1. מכיוון שצמיחת החיידקים תלויה במדיום הצמיחה ובתנאים, יש לחזור על סביבת הצמיחה, המדיה והדילולים בכל פעם. לכן, מומלץ לבדוק את התנאים התרבותיים לפני הניסוי כדי לשחזר את inoculum מדויק בנפח המתאים להזרקה. כפי שצוין לעיל, הגבול העליון עבור הזרקת תוך ויטראלי לתוך עיני העכבר הוא 1.0 μL28. נפח מוגזם מרומם את הלחץ ה תוך עיני אשר יכול לגרום גלאוקומה, לנתק את הרשתית מהקטע האחורי, או לקרוע את הגלובוס. הזרקה תוך-ואטראלית ואת הזיהום וכתוצאה מכך בעכברים לא יכול לחקות באופן מושלם B. cereus אנדופתלמיטיס באדם. רוב המודלים של בעלי חיים של מחלות אנושיות מוגבלים בדרך זו. כמויות ידועות של B. cereus מוזרקים לתוך העין לאחר צמיחה במדיה עשירה בחומרים מזינים. במקרים קליניים של B. cereus אנדופתלמיטיס, הכמויות המדביקות אינן ידועות ומקורות הזיהום משתנים. עם זאת, היתרונות של שימוש באורגניזמים מאופיינים וזנים של עכברים ויצירת קורסי זיהום לשחזור עולים על מגבלות אלה.

קציר נכון של עיניים נגועות הוא צעד קריטי נוסף. שמירה על תנאים אספטיים חיונית כדי למנוע כל זיהום צולב אשר יכול להפריע לפרשנות של הנתונים. לכן, ההמלצה היא לחטא את workbench ואת כל המכשירים עם 70% אתנול לפני הקציר. מספרי חיידקים להגדיל במהירות בתוך הסביבה ההגייה במהלך זיהום, אשר עלול לגרום לנפיחות של העין. לכן, יש לדאוג בעדינות להסיר את העין במהלך הקציר למנוע קרע של כדור הארץ. יתר על כן, את הכובע של צינור הקציר המכיל את העין הנגועה חייב להיות מהודק כראוי לפני הצבת הצינור הומוגניזציה רקמות. כובע רופף יגרום דליפה וזיהום של homogenizer הרקמה המוביל לכמות לא מדויק של חיידקים בצינורות דולפים. הליך הומוגניזציה העין גם מרומם את הטמפרטורות של הצינורות. לכן, מומלץ הומוגניזציה 1 דקה בכל פעם. טמפרטורות גבוהות יכולות להשפיע על כימות של כמה פרמטרים זיהום. בעוד שיטה זו אינה מספקת את מספר החיידקים בתוך מיקומים ספציפיים של העין, בשילוב עם שיטות היסטולוגיות, אנו יכולים להעריך היכן חיידקים עשויים להיות מקומיים. לוקליזציה של B. cereus בעין במהלך אנדופתלמיטיס דווח ארנבים, שעיניהם גדולות יותר בקלות נותח לתוך subcompartments. 2

הזרקה תוך-ואטראלית מחקה את העברת האורגניזמים למקטע האחורי של העין, אשר יוזם זיהום. שלב ראשוני זה מקל על מחקר איכותי וכמותי של פרמטרי זיהום במודל עכבר מאוד להתרבות של אנדופתלמיטיס ניסיוני. מודלים אלה משמשים גם כדי להעריך דלקת עינית על ידי כימות myeloperoxidase חדירת נויטרופילים, זיהוי סוגי תאים ספציפיים לפי ציטומטריית זרימה, כימות ציטוקיני כימוקין על ידי PCR ו/או ELISA בזמן אמת, ושמירה על ארכיטקטורתעיניים על ידי היסטופתולוגיה 1,6,19,20,26,27,34,35,38. עיני עכבר נגועות נקצרות עם diluents שונים בהתאם לסוג הפרמטרים זיהום להימדד. עבור ניתוח ביטוי גנים, מאגר תזה שונה נדרש26. לבדיקה היסטופתולוגית, עיניים שנקטפו ממוקמות בתסריט קבוע. ריבוי עכברי הנוקאאוט הגנטיים גם מקל על המחקר את תפקידם של גורמים ותאים חיסוניים שונים. הזרקה תוך-עינית היא אפוא טכניקה עיקרית לחוקרים בתחום זיהומים תוך עיניים וטיפולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים כספיים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר פנג לי ומארק דיטמר (ליבת הדמיה חיה של בעלי חיים OUHSC P30, מכון דין א. מקגי לעיניים, אוקלהומה סיטי, אישור, ארה"ב) על עזרתם. המחקר שלנו נתמך על ידי מענקי מכוני הבריאות הלאומיים R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 ו- R01EY024140. המחקר שלנו נתמך גם על ידי P30EY21725 (מענק NIH CORE להדמיה וניתוח בעלי חיים חיים, ביולוגיה מולקולרית והדמיה תאית). המחקר שלנו נתמך גם על ידי תוכנית המתלמדים הקדם-דוקטורט NEI Vision Science 5T32EY023202, מענק תמיכה במחקר של קרן הבריאות פרסביטריאנית, ומענק בלתי מוגבל למכון דין א. מקגי עין ממחקר למניעת עיוורון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L. Jr, Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Jr Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O'Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Tags

אימונולוגיה וזיהום בעיה 168 דלקת עיניים חיידקית כימות חיידקים תוך עינית פרמטרים זיהום עיני הזרקה תוך-ואטראלית הזרקת תוך עינית אנדופתלמיטיס
הזרקה תוך-ואטראלית וכמות של פרמטרי זיהום במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mursalin, M. H., Livingston, E.,… More

Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter