Summary
Ovariecancer stamceller (OCSC) er ansvarlige for kræftinitiering, gentagelse, terapeutisk resistens og metastase. OCSC-vaskulær niche anses for at fremme selvfornyelse af OCSC'er, hvilket fører til kemoresistance. Denne protokol danner grundlag for etablering af en reproducerbar OCSC-vaskulær nichemodel in vitro.
Abstract
Kræftstamceller (CSC'er) befinder sig i en støttende niche, der udgør et mikromiljø bestående af tilstødende stromale celler, kar og ekstracellulær matrix. CSC'ernes evne til at deltage i udviklingen af endotel udgør en vigtig egenskab, der direkte bidrager til den generelle forståelse af mekanismerne for tumorigenese og tumormetastase. Formålet med dette arbejde er at etablere en reproducerbar metode til at undersøge tumorinitieringsevnen hos ovariecancerstamceller (OCSC'er). Heri undersøgte vi neovaskulariseringsmekanismen mellem endotelceller og OCSC'er sammen med de morfologiske ændringer af endotelceller ved hjælp af in vitro-co-kulturmodellen NICO-1. Denne protokol tillader visualisering af neovaskulariseringstrinnet omkring OCSC'erne på en tidsforløbsmåde. Teknikken kan give indsigt i de angiogenetiske egenskaber af OCSC'er i tumormetastase.
Introduction
Kræft i æggestokkene er den ottende mest almindelige malignitet hos kvinder over hele verden med ca. 300.000 nye diagnoser og anslået 180.000 dødsfald årligt1. Ved den første diagnose præsenterer kræft i æggestokkene ofte med alvorlige symptomer, hvor ca. 75% af patienterne allerede er i fase III-IV. Følgelig er den 5-årige overlevelsesrate <30%, og dødeligheden er den højeste blandt gynækologiske kræftformer2, hvor effektiviteten af behandlingen af kræft i æggestokkene er meget afhængig af kliniske faktorer såsom den vellykkede gennemførelse af debulking-kirurgi, modstand mod kemoterapi og gentagelse efter den indledende behandling.
Ovariecancervæv er hierarkisk organiseret, hvor ikke alle tumorkomponenter er lige i stand til at generere efterkommere. De eneste celler, der er i stand til at forny sig selv og producere en heterogen tumorcellepopulation, anses for at repræsentere kræftstamceller (CSC'er)3. CSC selvfornyelse og tumorinitiering ledsages af fremme af angiogenese for at ombygge deres tumormikromiljø med det formål at opretholde en støttende niche. Tidligere modeller kunne imidlertid ikke anvendes til in vitro-analyser på grund af den begrænsede reproducerbarhed af dyrkning af CSC'er afledt af kliniske prøver på grund af forstyrrelse af sfæroider efter flere passaging. For nylig er eksperimentelle metoder til dyrkning af CSC'er fra patienter blevet udviklet til flere applikationer 4,5,6,7. Især ved at udnytte karakteristikken ved CSC'er til at vokse ved at danne sfæroider i ultralave fastgørelsesplader med serumfrit medium, induceres de dyrkede CSC'er til at udtrykke en stamcelleoverflademarkør, der ikke udtrykkes i normale tumorceller med multilineagedifferentieringspotentiale 8,9.
Nylige data har vist, at persistensen af sovende ovarie (O) CSC'er visualiseret som formidling ved peritoneum er forbundet med deres regenerering som tilbagevendende tumorer10. Forståelse af de molekylære og biologiske egenskaber ved OCSC'er kan således muliggøre effektiv målretning og udryddelse af disse celler, hvilket resulterer i potentiel tumorremission. Især er der lidt kendt om de cellulære og molekylære mekanistiske træk ved CSC'ers roller i angiogenese11. Derfor brugte vi i den nuværende protokol patientafledte OCSC'er i en in vitro-indstilling til at undersøge den angiogene egenskab af endotelceller ved hjælp af co-kulturmodellen, som kan efterligne tumormikromiljøet af CSC'er og endotelceller på det metastatiske sted i den kliniske indstilling. I sidste ende, da neovaskularisering udgør en kritisk proces, der er nødvendig for at understøtte tumorvækst og metastase, vil en bedre forståelse af dens mekanisme muliggøre udviklingen af en ny målretningsterapi til OCSC'er på det metastatiske sted.
Her præsenterer vi en protokol til at visualisere neovaskulariseringstrinnet omkring CSC'erne på en tidsforløbsmåde. Fordelen ved protokollen inkluderer at tillade fuldt reproducerbare undersøgelser ved hjælp af 3D-samkultursystemet, NICO-1, hvilket muliggør observation af virkningerne på patienter af den OCSC-afledte tumorinitieringsevne under endotelcelleangiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i henhold til den protokol, der blev godkendt af den etiske komité for menneskers velfærd. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke til forskningsbrug af deres prøver, og indsamling og brug af væv til denne undersøgelse blev godkendt af Human Genome, Gene Analysis Research Ethics Committee ved Teikyo University.
1. Isolering og dyrkning af stamceller fra æggestokkræft (OCSC'er) fra patienter med kræft i æggestokkene og ascites i et niveau 2 biosikkerhedsskab
- Isoler kræftstamceller fra humane ovariecancer ascites opnået via paracentese. Saml mindst 100-250 ml ascites fra patienter for at tage nok antal kræftstamceller. Derudover evalueres ekspressionsprofilerne for kræftstamcellemarkører (dvs. EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 og Oct4) og ovariecancermarkører (pAX-8, WT-1) ved flowcytometri.
- Centrifuge den menneskelige kræft i æggestokkene ascites ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur inden for 24 timer efter ascites aspiration.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 2 ml OCSC-medium og 8 ml 30 % Histodenz/phosphatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4).
- Forbered OCSC-medium: StemPro hESC supplement, DMEM ⁄ F-12 med L-glutamin (GlutaMAX medium), 25% BSA, 100 μM 2-mercaptoethanol, 8 ng / mL FGF BASIC, 10 μM insulin og 20 μM Y-27632.
- Overlejr forsigtigt 2 ml OCSC-medium til celleopløsningen i trin 1.1.2 i et 15 ml rør og centrifuge ved 450 x g i 20 minutter ved stuetemperatur i en svingende skovlrotor uden bremsning.
- Overfør forsigtigt OCSC-laget (uforstyrret i mellemfasen) til et nyt 15 ml rør ved overførselspipet.
- Fyld med PBS op til 15 ml. Centrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i OCSC-medium og frø på en kulturskål med ultralav vedhæftning; kulturer bør holdes ved 37 °C i 5 % CO2.
- Skift mediet hver tredje dag. Stå forsigtigt kulturskålen i ca. 1 minut, og kassér en del af supernatanten og tilsæt det nye medium.
- Passage af CSC'er
- Saml OCSC'er i et 15 ml rør og centrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten, fyld med PBS, og centrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, der tilsættes 1 ml celleopløsning, der består af proteolytiske og collagenolytiske enzymer (f.eks. AccuMax), og inkuberes ved 37 °C i 10 min.
- Bland godt ved pipettering og inkuberes ved 37 °C i 5 min. Sørg for, at cellerne er i en enkelt suspension.
- Bland godt ved pipettering, fyld med PBS, og centrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og cellepelleten gensuspenderes i OCSC-medium til efterfølgende såning på kulturretter med ultralav fastgørelse og vedligeholdelse ved 37 °C i 5 % CO2.
2. HUEhT-1 endotelcellekultur
- Passage af HUEhT-1-celler
- Fjern medium fra HUEhT-1 dyrkningsskålen og vask cellerne med PBS.
- Tilsæt 1 ml 0,025% trypsin og inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 5 ml endotelcellevækstmedium 2, saml celler i et 15 ml rør, og centrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, cellepelleten gensuspenderes i HUEhT-1-mediet, og cellerne sås på kollagenbelagte kulturretter efterfulgt af vedligeholdelse ved 37 °C i 5 % CO2.
- Skift mediet hver tredje dag.
3. Fremstilling af NICO-1-kokulturpladen til rørdannelsesassay ved hjælp af HUEhT-1-celler
- Saml NICO-1 og belægning med den ekstracellulære matrixbaserede hydrogel (Matrigel Matrix).
- Saml den ene side af NICO-1 efter producentens anvisninger og hold dig på is.
- Dæk overfladen af NICO-1 med 300 μL koldt PBS, og fjern derefter bufferen.
- Der tilsættes 300 μL kølet ekstracellulær matrixbaseret hydrogel og inkuberes ved 37 °C i 60 min.
- For at ækvilibrere nedsænkes filteret med 100% ethanol og vaskes derefter et 13 mm ICCP-filter (0,6 μm) med PBS i 1 min.
- Saml NICO-1 inklusive både hovedkropsdele A (højre kammer) og B (venstre kammer) sammen med O-ringen og det ækvilibrerede filter.
4. Såning af HUEhT-1-celler og CSC'er på NICO-1-systemet
- Forbered HUEhT-1 cellesuspensioner ved at trypsinisere cellemonolagene og resuere cellerne i endotelcellevækstmedium med 2% føtalt kalveserum.
- Der tilsættes 1,2 ml cellesuspension (1,5 x 105 celler) til hver ekstracellulær matrixbaseret hydrogelbelagt brønd.
- Tilsæt 1,5 ml OCSC'er dyrket i fem dage til den anden brønd.
- Nico-1 inkuberes ved 37 °C i 5 % CO2 Rørdannelse kan observeres under mikroskop og netværksdannelse på ekstracellulær matrixbaseret hydrogel målt ved hjælp af antallet af grene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi indsamlede ascitesvæsker opnået fra patienter med avanceret kræft i æggestokkene under operation eller paracentese med det formål at udføre en langsigtet stabil kultur for sfæroider. Her præsenterer vi tilfælde af en langsigtet sfæroidkultur af ovarie-CSC'er kaldet CSC1 og CSC2. Begge cellelinjer bærer den samme diagnose og histologiske profiler. De mekanistiske roller af OCSC'er, der ligger til grund for interaktionen med endotelceller, der er nødvendige for at inducere neovaskularisering af endotelceller omkring OCSC'erne, forbliver ukendte. Derfor sigtede vi mod at afklare processerne i CSC-vaskulær nicheudvikling på de metastatiske steder. Vi undersøgte interaktionen mellem endotelceller (HUEhT-1) og OCSC'er ved hjælp af in vitro-kokulturmodellen NICO-1. Figur 1 viser en sammenligning af rørdannelsesaktivitet induceret af CSC1 og CSC2. Antallet af dannede vaskulære rør steg dramatisk over tid i samkulturen med CSC2 (figur 2A). For den positive kontrol præsenterer vi figur 2B , som viser HuEhT-1's angiogene egenskab efter behandling af VEGF (10 ng/ml) uden samdyrkning af CSC2. Vi er nu ved at afklare den detaljerede mekanisme, der ligger til grund for resultatet. Figur 3 viser repræsentative billeder af kokulturmodel af OCSC med endotelceller ved hjælp af NICO-1. HUEhT-1-celler blev samdyrket med CSC2 i 20 timer, og timelapse-videobilledet blev taget. Figur 3A viser fænotypen af CSC2 før og efter samdyrkning i 20 timer. Figur 3B viser HUEhT-1-celler, der samdyrkes på samme tid. Det er bemærkelsesværdigt, at HUEhT-1-celler dannede vaskulære rør under samdyrkningen med CSC2 (figur 3C: Videoklip)
Figur 1: OCSC'er vaskulær nichemodel. De mekanistiske roller, hvormed OCSC'er inducerer rørdannelsen (vaskularisering) af endotelceller, forbliver ukendte. Vi undersøgte interaktionen mellem endotelceller (HUEhT-1) og OCSC'er ved hjælp af en in vitro-co-kulturtilstand, NICO-1. Det højre rum i dette system består af en indsats, der indeholder OCSC'er med cellemediet. Det venstre rum består af en brønd indeholdende endotelceller og HUVEC'er med samme medium som i højre brønd.
Figur 2: Sammenligning af neovaskulariseringsaktiviteter induceret af OCSC'er. Over tid steg antallet af dannede vaskulære rør dramatisk ved samkultur med CSC2.
Figur 3: Den vaskulære dannelse af HUEhT-1-celler cokultur med CSC2 ved hjælp af NICO-1. HUEhT-1-celler dannede vaskulære rør under samdyrkningen med CSC2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver, hvordan man efterligner tumormikromiljøet af OCSC'er i en in vitro-indstilling. Den primære komponent i metoden udgør den meget reproducerbare kokulturmodel opnået ved hjælp af NICO-1-systemet, et indirekte Transwell-samkultursystem. Mange af de aktuelt tilgængelige kokulturmodeller undersøger virkningerne af direkte cellecellekontakt på kokulturerede cellepopulationer 12,13,14,15,16,17,18. Den enkleste model, der kan bruges til at undersøge virkningerne af samkultur, kan reproducere ved direkte blanding af to celletyper, og omfanget af heterotypiske og homotypiske interaktioner kan undersøges ved at ændre såtætheden for hver celletype og det relative såningsforhold for subpopulationerne19. Det er imidlertid vanskeligt direkte at bestemme OCSC'ers relative bidrag til eventuelle observerede virkninger af kokultur uafhængigt ved mikroskopi på grund af hver celles præcise usynlighed; Således ledsages disse undersøgelser ofte parallelt af betingede medieeksperimenter. For eksempel kan et adskilt kokultursystem anvendes i undersøgelser, hvor virkningerne af parakrin signalering på tumormikromiljø er af interesse19. Til sammenligning beskriver vi i den nuværende metode en model, der muliggør samtidig evaluering af virkningerne af celle-cellekontakt og parakrin signalering, som efterligner arkitekturen i det indfødte tumormikromiljø.
Angiogenese tjener som et kendetegn for kræft i æggestokkene og spiller en kritisk rolle i dens progression, som involverer interaktioner mellem kræftceller, endotelceller og det omgivende tumormikromiljø20. Bevacizumab er et vigtigt molekylært målretningslægemiddel, der er blevet bredt accepteret til brug i kombinationskemoterapi til avanceret ovariecancer21. Specifikt udgør bevacizumab et monoklonalt antistof mod vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF). VEGF bidrager til udviklingen af peritoneal carcinomatose og dannelse af maligne ascites i avanceret ovarie- eller peritoneal cancer ved at fremme neovaskularisering og forbedre vaskulær permeabilitet22. Derfor har VEGF-hæmning vist sig at hæmme ascitesproduktion og massiv tumorvækst på det metastatiske sted. Yderligere undersøgelse, der effektivt er rettet mod VEGF-stimulerede vaskulære endotelceller i tumormikromiljøniveauet, er således berettiget. Det kan dog være vanskeligt effektivt at udnytte prækliniske modeller, såsom musemodeller, til disse undersøgelser. For eksempel er det blevet rapporteret, at affiniteten af bevacizumab til human VEGF er høj, mens museproteinet er lavere23. Dette håndhæver en begrænsning med hensyn til anvendelsen af bevacizumab inden for eksperimenter designet til yderligere at undersøge dets anti-VEGF-mekanisme mod neovaskularisering i tumormikromiljøet som konstateret ved hjælp af musemodeller. En passende model med velkontrolleret arkitektur er derfor nødvendig for at rekapitulere komponenterne i in vivo tumormikromiljøet. I sådanne tilfælde bemærker vi, at vores in vitro-kokulturmodelsystem tillader live sporing af celleadfærd gennem kulturen af de patientafledte OCSC'er og endotelceller og giver mulighed for undersøgelse af disse individuelle celleunderpopulationer som reaktion på kokultur.
En bedre forståelse af OCSC'ernes rolle og deres vaskulære niche kan give ny indsigt i udviklingen af terapeutiske strategier for OCSC'er. Som det fremgår af de repræsentative eksperimenter, er modellens styrker, at den giver en undersøgelsesplatform, der ser ud til at være delvis kongruent med kliniske indstillinger, hvilket muliggør udvikling og test af bedre målrettede og effektive nye lægemidler. Yderligere undersøgelser er nødvendige med direkte klinisk replikation af vores resultater, der involverer et mere signifikant antal patientafledte OCSC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud til videnskabelig forskning C (bevilling nr. 19K09834 til K.N.) fra Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Kultur, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A.
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
