Summary
डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम सेल (ओसीएससी) कैंसर दीक्षा, पुनरावृत्ति, चिकित्सीय प्रतिरोध और मेटास्टेसिस के लिए जिम्मेदार हैं। ओसीएससी संवहनी आला को ओसीएससी के आत्म-नवीकरण को बढ़ावा देने के लिए माना जाता है, जिससे केमोरेसिस्टेंस होता है। यह प्रोटोकॉल विट्रो में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ओसीएससी संवहनी आला मॉडल स्थापित करने के लिए आधार प्रदान करता है।
Abstract
कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) एक सहायक आला में रहते हैं, जो आसन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं, वाहिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स से युक्त एक माइक्रोएन्वायरमेंट का गठन करते हैं। एंडोथेलियम के विकास में भाग लेने के लिए सीएससी की क्षमता एक महत्वपूर्ण विशेषता का गठन करती है जो सीधे ट्यूमरजेनिसिस और ट्यूमर मेटास्टेसिस के तंत्र की सामान्य समझ में योगदान देती है। इस काम का उद्देश्य डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम कोशिकाओं (ओसीएससी) की ट्यूमर-दीक्षा क्षमता की जांच करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पद्धति स्थापित करना है। यहां, हमने इन विट्रो सह-संस्कृति मॉडल एनआईसीओ -1 का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं और ओसीएससी के बीच नियोवैस्कुलराइजेशन तंत्र की जांच की। यह प्रोटोकॉल एक समय पाठ्यक्रम तरीके से ओसीएससी के आसपास के नियोवैस्कुलराइजेशन चरण के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। तकनीक ट्यूमर मेटास्टेसिस में ओसीएससी के एंजियोजेनेटिक गुणों के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।
Introduction
डिम्बग्रंथि का कैंसर दुनिया भर में महिलाओं में आठवां सबसे आम घातक है, जिसमें लगभग 300,000 नए निदान और अनुमानित 180,000 मौतें सालानाहैं। प्रारंभिक निदान में, डिम्बग्रंथि का कैंसर अक्सर गंभीर लक्षणों के साथ प्रस्तुत होता है, लगभग 75% रोगी पहले से ही चरण III-IV में होते हैं। तदनुसार, 5 साल की जीवित रहने की दर <30% है और स्त्री रोग संबंधी कैंसर2 में मृत्यु दर सबसे अधिक है, डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए उपचार की दक्षता नैदानिक कारकों पर अत्यधिक निर्भर है जैसे कि डिबल्किंग सर्जरी की सफल उपलब्धि, कीमोथेरेपी के प्रतिरोध और प्रारंभिक चिकित्सा के बाद पुनरावृत्ति।
डिम्बग्रंथि के कैंसर के ऊतकों को पदानुक्रमित रूप से व्यवस्थित किया जाता है, जिसमें सभी ट्यूमर घटक वंशज पैदा करने में समान रूप से सक्षम नहीं होते हैं। एक विषम ट्यूमर सेल आबादी को आत्म-नवीनीकृत और उत्पादन करने में सक्षम एकमात्र कोशिकाओं को कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) 3 का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता है। सीएससी आत्म-नवीकरण और ट्यूमर दीक्षा एक सहायक आला बनाए रखने के उद्देश्य से अपने ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को फिर से तैयार करने के लिए एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने के साथ होती है। हालांकि, पिछले मॉडलों का उपयोग इन विट्रो विश्लेषणों के लिए नहीं किया जा सका क्योंकि नैदानिक नमूनों से प्राप्त सीएससी की खेती की सीमित प्रजनन क्षमता के कारण कई पासिंग के बाद स्फेरॉइड के विघटन के कारण। हाल ही में, रोगियों से सीएससी की खेती करने के लिए प्रयोगात्मक तरीकों को कई अनुप्रयोगों 4,5,6,7 के लिए विकसित किया गया है। विशेष रूप से, सीरम-मुक्त माध्यम के साथ अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेटों में स्फेरॉइड बनाकर बढ़ने के लिए सीएससी की विशेषता का फायदा उठाकर, खेती किए गए सीएससी को स्टेम-सेल सतह मार्कर व्यक्त करने के लिए प्रेरित किया जाता है जो मल्टीलाइनेज भेदभाव क्षमता 8,9 के साथ सामान्य ट्यूमर कोशिकाओं में व्यक्त नहीं किया जाता है।
हाल के आंकड़ों से पता चला है कि पेरिटोनियम में प्रसार के रूप में देखे गए निष्क्रिय डिम्बग्रंथि (ओ) सीएससी की दृढ़ता आवर्तक ट्यूमर10 के रूप में उनके पुनर्जनन से जुड़ी है। ओसीएससी की आणविक और जैविक विशेषताओं को समझना इस प्रकार इन कोशिकाओं के प्रभावी लक्ष्यीकरण और उन्मूलन की अनुमति दे सकता है, जिसके परिणामस्वरूप संभावित ट्यूमर छूट हो सकती है। विशेष रूप से, एंजियोजेनेसिस11 में सीएससी भूमिकाओं की सेलुलर और आणविक यांत्रिक विशेषताओं के बारे में बहुत कम जाना जाता है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल में हमने सह-संस्कृति मॉडल का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं की एंजियोजेनिक संपत्ति की जांच करने के लिए एक इन विट्रो सेटिंग में रोगी-व्युत्पन्न ओसीएससी का उपयोग किया, जो नैदानिक सेटिंग में मेटास्टैटिक साइट पर सीएससी और एंडोथेलियल कोशिकाओं के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल कर सकता है। अंततः, जैसा कि नियोवैस्कुलराइजेशन ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस का समर्थन करने के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया का गठन करता है, इसके तंत्र की बेहतर समझ मेटास्टैटिक साइट पर ओसीएससी के लिए एक नवीन लक्ष्यीकरण चिकित्सा के विकास की अनुमति देगी।
यहां, हम सीएससी के आसपास के नियोवैस्कुलराइजेशन चरण को एक समय पाठ्यक्रम तरीके से देखने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल के लाभ में 3 डी सह-संस्कृति प्रणाली, एनआईसीओ -1 का उपयोग करके पूरी तरह से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जांच की अनुमति देना शामिल है, जिससे एंडोथेलियल सेल एंजियोजेनेसिस के दौरान ओसीएससी-व्युत्पन्न ट्यूमर-दीक्षा क्षमता के रोगियों पर प्रभावों के अवलोकन की अनुमति मिलती है।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं को मानव कल्याण के लिए आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत किया गया था। सभी रोगियों ने अपने नमूनों के अनुसंधान उपयोग के लिए लिखित सूचित सहमति प्रदान की, और इस अध्ययन के लिए ऊतकों के संग्रह और उपयोग को टेक्यो विश्वविद्यालय में मानव जीनोम, जीन विश्लेषण अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. स्तर 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट में डिम्बग्रंथि के कैंसर और जलोदर वाले रोगियों से डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम कोशिकाओं (ओसीएससी) का अलगाव और संस्कृति
- पैरासेंटेसिस के माध्यम से प्राप्त मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर जलोदर से कैंसर स्टेम कोशिकाओं को अलग करें। पर्याप्त संख्या में कैंसर स्टेम सेल लेने के लिए रोगियों से कम से कम 100-250 एमएल जलोदर एकत्र करें। इसके अतिरिक्त, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कैंसर स्टेम सेल मार्करों (यानी, ईपीकैम, कैलरेटिनिन, सीडी 133, सीडी 44, सीडी 45, एएलडीएच 1, और अक्टूबर 4) और डिम्बग्रंथि के कैंसर मार्करों (पैक्स -8, डब्ल्यूटी -1) की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का मूल्यांकन करें।
- मानव डिम्बग्रंथि के कैंसर का सेंट्रीफ्यूज जलोदर 24 घंटे के भीतर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर जलोदर होता है।
- सतह पर तैरने वाले को हटा दें और 2 एमएल ओसीएससी माध्यम और 8 एमएल 30% हिस्टोडेन्ज़ / फॉस्फेट बफर्ड खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) घोल जोड़ें।
- ओसीएससी माध्यम तैयार करें: स्टेमप्रो एचईएससी पूरक, डीएमईएम/एफ -12 के साथ एल-ग्लूटामाइन (ग्लूटामैक्स माध्यम), 25% बीएसए, 100 μM 2-mercaptoethanol, 8 ng / mL FGF BASIC, 10 μM इंसुलिन, और 20 μM Y-27632।
- सावधानीपूर्वक 15 एमएल ट्यूब में चरण 1.1.2 में सेल समाधान के लिए ओसीएससी माध्यम के 2 एमएल को ओवरले करें और बिना ब्रेकिंग के झूलते-बाल्टी रोटर में 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 450 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- ध्यान से ओसीएससी परत (इंटरफेज पर अबाधित) को ट्रांसफर पाइप द्वारा एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 15 एमएल तक पीबीएस से भरें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
- ओसीएससी माध्यम में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें और एक अल्ट्रा-लो-अटैचमेंट कल्चर डिश पर बीज करें; संस्कृतियों को 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए।
- हर तीन दिन में माध्यम बदलें। लगभग 1 मिनट के लिए संस्कृति पकवान को सावधानीपूर्वक खड़े करें, और सतह पर तैरने वाले के हिस्से को छोड़ दें और नया माध्यम जोड़ें।
- सीएससी का पारित होना
- 15 एमएल ट्यूब में ओसीएससी एकत्र करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरने वाले को हटा दें, पीबीएस से भरें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सुपरनैटेंट को हटा दें, प्रोटियोलिटिक और कोलेजनोलिटिक एंजाइमों (जैसे, एक्यूमैक्स) से युक्त सेल डिटेचमेंट समाधान के 1 एमएल जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं एकल निलंबन में हैं।
- पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, पीबीएस से भरें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सुपरनैटेंट को हटा दें और अल्ट्रा-लो-अटैचमेंट कल्चर व्यंजनों पर बाद में सीडिंग और 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखरखाव के लिए ओसीएससी माध्यम में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
2. एचयूईएचटी -1 एंडोथेलियल सेल कल्चर
- HUEHT-1 कोशिकाओं का पारित होना
- HUEHT-1 संस्कृति डिश से माध्यम निकालें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं।
- 0.025% ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम 2 के 5 एमएल जोड़ें, 15 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरने वाले को हटा दें, एचयूईएचटी -1 माध्यम में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, और कोलेजन-लेपित संस्कृति व्यंजनों पर कोशिकाओं को बीज दें, जिसके बाद 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखरखाव किया जाता है।
- हर तीन दिन में माध्यम बदलें।
3. एचयूईएचटी -1 कोशिकाओं का उपयोग करके ट्यूब गठन परख के लिए एनआईसीओ -1 कोकल्चर प्लेट की तैयारी
- बाह्य मैट्रिक्स-आधारित हाइड्रोगेल (मैट्रिगेल मैट्रिक्स) के साथ एनआईसीओ -1 और कोटिंग को इकट्ठा करें।
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एनआईसीओ -1 के एक तरफ इकट्ठा करें और बर्फ पर रखें।
- NICO-1 की सतह को 300 μL ठंडे PBS के साथ कवर करें और फिर बफर को हटा दें।
- 300 μL ठंडा बाह्य मैट्रिक्स-आधारित हाइड्रोगेल जोड़ें और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- समतुल्य करने के लिए, फिल्टर को 100% इथेनॉल के साथ डुबोएं, फिर 1 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 13 मिमी आईसीसीपी फिल्टर (0.6 μm) धोएं।
- एनआईसीओ -1 को इकट्ठा करें जिसमें ओ रिंग और समतुल्य फिल्टर के साथ शरीर के मुख्य भाग ए (दाएं कक्ष) और बी (बाएं कक्ष) शामिल हैं।
4. एनआईसीओ -1 प्रणाली पर एचयूईएचटी -1 कोशिकाओं और सीएससी को सीडिंग करना
- सेल मोनोलेयर को ट्रिप्सिनाइज करके और 2% भ्रूण बछड़े के सीरम के साथ एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करके एचयूईएचटी -1 सेल निलंबन तैयार करें।
- प्रत्येक बाह्य मैट्रिक्स-आधारित हाइड्रोगेल-लेपित अच्छी तरह से सेल निलंबन (1.5 x 10 5 कोशिकाओं) के 1.2 एमएल जोड़ें।
- दूसरे कुएं में पांच दिनों के लिए संवर्धित 1.5 एमएल ओसीएससी जोड़ें।
- 5% CO2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर एनआईसीओ -1 को इनक्यूबेट करें; ट्यूब गठन को शाखाओं की संख्या के माध्यम से मापा गया बाह्य मैट्रिक्स-आधारित हाइड्रोगेल पर माइक्रोस्कोप और नेटवर्क गठन के तहत देखा जा सकता है।
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Representative Results
हमने स्फेरॉइड के लिए दीर्घकालिक स्थिर संस्कृति करने के उद्देश्य से सर्जरी या पैरासेंटेसिस के दौरान उन्नत डिम्बग्रंथि के कैंसर वाले रोगियों से प्राप्त जलोदर तरल पदार्थ एकत्र किए। यहां, हम डिम्बग्रंथि सीएससी के दीर्घकालिक स्फेरॉइड संस्कृति के मामलों को प्रस्तुत करते हैं जिसे सीएससी 1 और सीएससी 2 कहा जाता है। दोनों सेल लाइनें एक ही निदान और हिस्टोलॉजिकल प्रोफाइल लेती हैं। ओसीएससी के आसपास एंडोथेलियल कोशिकाओं के नियोवैस्कुलराइजेशन को प्रेरित करने के लिए आवश्यक एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ बातचीत को अंतर्निहित ओसीएससी की यांत्रिक भूमिकाएं अज्ञात रहती हैं। इसलिए, हमने मेटास्टैटिक साइटों पर सीएससी संवहनी आला विकास की प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने का लक्ष्य रखा। हमने इन विट्रो कोकल्चर मॉडल एनआईसीओ -1 का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूईएचटी -1) और ओसीएससी के बीच बातचीत की जांच की। चित्रा 1 सीएससी 1 और सीएससी 2 द्वारा प्रेरित ट्यूब गठन गतिविधि की तुलना दिखाता है। सीएससी 2 (चित्रा 2 ए) के साथ सहसंस्कृति में समय के साथ गठित संवहनी ट्यूबों की संख्या में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई। सकारात्मक नियंत्रण के लिए, हम चित्रा 2 बी प्रस्तुत करते हैं जो सीएससी 2 की सह-संस्कृति के बिना वीईजीएफ (10 एनजी / एमएल) के उपचार के बाद एचयूईएचटी -1 की एंजियोजेनिक संपत्ति को दर्शाता है। अब हम परिणाम के अंतर्निहित विस्तृत तंत्र को स्पष्ट कर रहे हैं। चित्र 3 एनआईसीओ -1 का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ ओसीएससी के कोकल्चर मॉडल की प्रतिनिधि छवियां दिखाता है। HUEHT-1 कोशिकाओं को 20 घंटे के लिए CSC2 के साथ सह-संवर्धन किया गया था, और टाइम-लैप्स वीडियो छवि कैप्चर की गई थी। चित्रा 3 ए 20 घंटे के लिए सहसंस्कृति से पहले और बाद में सीएससी 2 के फेनोटाइप को दर्शाता है। चित्रा 3 बी एक ही समय में एचयूईएचटी -1 कोशिकाओं को सह-संवर्धन दिखाता है। यह उल्लेखनीय है कि HUEHT-1 कोशिकाओं ने CSC2 के साथ सहसंस्कृति के दौरान संवहनी ट्यूबों का निर्माण किया (चित्रा 3C: वीडियो क्लिप)
चित्रा 1: ओसीएससी संवहनी आला मॉडल। यांत्रिक भूमिकाएं जिनके द्वारा ओसीएससी एंडोथेलियल कोशिकाओं के ट्यूब गठन (वैस्कुलराइजेशन) को प्रेरित करते हैं, अज्ञात रहते हैं। हमने इन विट्रो सह-संस्कृति मोड, एनआईसीओ -1 का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूईएचटी -1) और ओसीएससी के बीच बातचीत की जांच की। इस प्रणाली का दाहिना डिब्बा एक सम्मिलित से बना है, जो सेल माध्यम के साथ ओसीएससी रखता है। बाएं डिब्बे में एंडोथेलियल कोशिकाओं और एचयूवीईसी युक्त एक कुआं होता है, जिसमें दाएं कुएं के समान माध्यम होता है।
चित्रा 2: ओसीएससी द्वारा प्रेरित नियोवैस्कुलराइजेशन गतिविधियों की तुलना। समय के साथ, सीएससी 2 के साथ सहसंस्कृति पर गठित संवहनी ट्यूबों की संख्या में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई।
चित्रा 3: एनआईसीओ -1 का उपयोग करके सीएससी 2 के साथ एचयूईएचटी -1 कोशिकाओं का संवहनी गठन। एचयूईएचटी -1 कोशिकाओं ने सीएससी 2 के साथ सहसंस्कृति के दौरान संवहनी ट्यूबों का गठन किया।
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Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि इन विट्रो सेटिंग में ओसीएससी के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल कैसे करें। विधि का प्राथमिक घटक एनआईसीओ -1 प्रणाली, एक अप्रत्यक्ष ट्रांसवेल सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सह-संस्कृति मॉडल का गठन करता है। वर्तमान में उपलब्ध कई कोकल्चर मॉडल सहसंस्कृति सेल आबादी 12,13,14,15,16,17,18 पर प्रत्यक्ष सेल-सेल संपर्क के प्रभावों की जांच करते हैं। सह-संस्कृति के प्रभावों की जांच के लिए उपयोग किया जाने वाला सबसे सरल मॉडल दो सेल प्रकारों के प्रत्यक्ष मिश्रण द्वारा पुन: उत्पन्न हो सकता है, और हेटरोटाइपिक और होमोटाइपिक इंटरैक्शन की सीमा की जांच प्रत्येक सेल प्रकार के सीडिंग घनत्व और उप-आबादी के सापेक्ष सीडिंग अनुपात को बदलकर की जासकती है। हालांकि, माइक्रोस्कोपी द्वारा स्वतंत्र रूप से कोकल्चर के किसी भी देखे गए प्रभाव के लिए ओसीएससी के सापेक्ष योगदान को सीधे निर्धारित करना प्रत्येक सेल की सटीक अदृश्यता के कारण मुश्किल है; इस प्रकार, इन अध्ययनों को अक्सर वातानुकूलित मीडिया प्रयोगों के समानांतर किया जाता है। उदाहरण के लिए, एक अलग कोकल्चर सिस्टम का उपयोग उन अध्ययनों में किया जा सकता है जिनमें ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट पर पैराक्रिन सिग्नलिंग के प्रभाव रुचिरखते हैं। इसकी तुलना में, वर्तमान विधि में हम एक मॉडल का वर्णन करते हैं जो सेल-सेल संपर्क और पैराक्रिन सिग्नलिंग के प्रभावों के एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देता है, जो देशी ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की वास्तुकला की नकल करता है।
एंजियोजेनेसिस डिम्बग्रंथि के कैंसर की पहचान के रूप में कार्य करता है और इसकी प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें कैंसर कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं और आसपास के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट20 के बीच बातचीत शामिल है। Bevacizumab एक प्रमुख आणविक लक्ष्यीकरण दवा है जिसे उन्नत डिम्बग्रंथि के कैंसर21 के लिए संयोजन कीमोथेरेपी में उपयोग के लिए व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है। विशेष रूप से, बेवासिजुमैब संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) के खिलाफ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का गठन करता है। वीईजीएफ पेरिटोनियल कार्सिनोमैटोसिस के विकास में योगदान देता है, और नियोवैस्कुलराइजेशन को बढ़ावा देकर और संवहनी पारगम्यता को बढ़ाकर उन्नत डिम्बग्रंथि या पेरिटोनियल कैंसर में घातक जलोदर का गठन करताहै। इसलिए, वीईजीएफ निषेध को मेटास्टैटिक साइट पर जलोदर उत्पादन और बड़े पैमाने पर ट्यूमर के विकास को रोकने के लिए दिखाया गया है। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट स्तर में वीईजीएफ-उत्तेजित संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से लक्षित करने वाली आगे की जांच इस प्रकार आवश्यक है। हालांकि, इन अध्ययनों के लिए माउस मॉडल जैसे प्रीक्लिनिकल मॉडल का प्रभावी ढंग से उपयोग करना मुश्किल हो सकता है। उदाहरण के लिए, यह बताया गया है कि मानव वीईजीएफ के लिए बेवासिजुमैब का संबंध अधिक है जबकि माउस प्रोटीन कासंबंध 23 से कम है। यह माउस मॉडल का उपयोग करके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में नियोवैस्कुलराइजेशन की ओर इसके एंटी-वीईजीएफ तंत्र की जांच करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों के भीतर बेवासिजुमैब के आवेदन के संबंध में एक सीमा को लागू करता है। इसलिए विवो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के घटकों को पुन: व्यवस्थित करने के लिए अच्छी तरह से नियंत्रित वास्तुकला के साथ एक उपयुक्त मॉडल की आवश्यकता होती है। ऐसे मामले में, हम ध्यान दें कि हमारा इन विट्रो कोकल्चर मॉडल सिस्टम रोगी-व्युत्पन्न ओसीएससी और एंडोथेलियल कोशिकाओं की संस्कृति में सेल व्यवहार की लाइव ट्रैकिंग की अनुमति देता है और कोकल्चर के जवाब में इन व्यक्तिगत सेल उप-आबादी के अध्ययन की अनुमति देता है।
ओसीएससी और उनके संवहनी आला की भूमिका को बेहतर ढंग से समझना ओसीएससी के लिए चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। जैसा कि प्रतिनिधि प्रयोगों में दिखाया गया है, मॉडल की ताकत यह है कि यह एक अध्ययन मंच प्रदान करता है जो नैदानिक सेटिंग्स के साथ आंशिक रूप से संगत प्रतीत होता है, जिससे बेहतर लक्षित और प्रभावी नवीन दवाओं के विकास और परीक्षण को सक्षम किया जा सकता है। हमारे परिणामों की प्रत्यक्ष नैदानिक प्रतिकृति के साथ आगे के अध्ययन की आवश्यकता है जिसमें रोगी-व्युत्पन्न ओसीएससी की अधिक महत्वपूर्ण संख्या शामिल है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को शिक्षा, विज्ञान और संस्कृति मंत्रालय, जापान से वैज्ञानिक अनुसंधान सी (केएन को अनुदान संख्या 19के09834) के लिए अनुदान-सहायता द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
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