Summary
Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSC) sind verantwortlich für Krebsentstehung, Rezidiv, therapeutische Resistenz und Metastasen. Es wird angenommen, dass die OCSC-Gefäßnische die Selbsterneuerung von OCSCs fördert, was zu Chemoresistenz führt. Dieses Protokoll bildet die Grundlage für die Etablierung eines reproduzierbaren OCSC-Gefäßnischenmodells in vitro.
Abstract
Krebsstammzellen (CSCs) befinden sich in einer unterstützenden Nische und bilden eine Mikroumgebung, die aus benachbarten Stromazellen, Gefäßen und extrazellulärer Matrix besteht. Die Fähigkeit von CSCs, an der Entwicklung von Endothel teilzunehmen, stellt ein wichtiges Merkmal dar, das direkt zum allgemeinen Verständnis der Mechanismen der Tumorgenese und Tumormetastasierung beiträgt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine reproduzierbare Methodik zu etablieren, um die Tumorinitiationsfähigkeit von Eierstockkrebsstammzellen (OCSCs) zu untersuchen. Hier untersuchten wir den Neovaskularisationsmechanismus zwischen Endothelzellen und OCSCs sowie die morphologischen Veränderungen von Endothelzellen mit dem in vitro Kokulturmodell NICO-1. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung des Neovaskularisationsschritts, der die OCSCs umgibt. Die Technik kann Aufschluss über die angiogenetischen Eigenschaften von OCSCs bei Tumormetastasen geben.
Introduction
Eierstockkrebs ist die achthäufigste bösartige Erkrankung bei Frauen weltweit, mit etwa 300.000 neuen Diagnosen und geschätzten 180.000 Todesfällen proJahr1. Bei der Erstdiagnose zeigt sich Eierstockkrebs oft mit schweren Symptomen, wobei sich etwa 75% der Patientinnen bereits im Stadium III-IV befinden. Dementsprechend beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate <30% und die Sterblichkeitsrate ist die höchste bei gynäkologischen Krebserkrankungen2, wobei die Effizienz der Behandlung von Eierstockkrebs stark von klinischen Faktoren wie der erfolgreichen Durchführung einer Debulking-Operation, der Resistenz gegen Chemotherapie und dem Wiederauftreten nach der Ersttherapie abhängt.
Eierstockkrebsgewebe sind hierarchisch organisiert, wobei nicht alle Tumorkomponenten gleichermaßen in der Lage sind, Nachkommen zu erzeugen. Die einzigen Zellen, die in der Lage sind, sich selbst zu erneuern und eine heterogene Tumorzellpopulation zu produzieren, gelten als Krebsstammzellen (CSCs)3. Die Selbsterneuerung des CSC und die Tumorinitiierung werden von der Förderung der Angiogenese begleitet, um ihre Tumormikroumgebung umzugestalten, um eine unterstützende Nische zu erhalten. Bisherige Modelle konnten jedoch nicht für In-vitro-Analysen verwendet werden, da die Kultivierung von CSCs aus klinischen Proben aufgrund der Störung von Sphäroiden nach mehrfachem Durchgang nur begrenzt reproduzierbar ist. In jüngerer Zeit wurden experimentelle Methoden zur Kultivierung von CSCs von Patienten für mehrere Anwendungen entwickelt 4,5,6,7. Insbesondere durch die Ausnutzung der Eigenschaft von CSCs, durch Bildung von Sphäroiden in ultraniedrigen Bindungsplatten mit serumfreiem Medium zu wachsen, werden die kultivierten CSCs dazu gebracht, einen Stammzelloberflächenmarker zu exprimieren, der in normalen Tumorzellen mit Multilineage-Differenzierungspotential nicht exprimiert wird 8,9.
Neuere Daten haben gezeigt, dass die Persistenz ruhender ovarieller (O)CSCs, visualisiert als Verbreitung am Peritoneum, mit ihrer Regeneration als rezidivierende Tumoren assoziiert ist10. Das Verständnis der molekularen und biologischen Merkmale von OCSCs kann daher eine effektive Ausrichtung und Eradikation dieser Zellen ermöglichen, was zu einer möglichen Tumorremission führt. Insbesondere ist wenig über die zellulären und molekular-mechanistischen Merkmale der CSC-Rollen in der Angiogenesebekannt 11. Daher haben wir im vorliegenden Protokoll patientenabgeleitete OCSCs in einer In-vitro-Umgebung verwendet, um die angiogene Eigenschaft von Endothelzellen unter Verwendung des Kokulturmodells zu untersuchen, das die Tumormikroumgebung von CSCs und Endothelzellen an der metastatischen Stelle im klinischen Umfeld nachahmen kann. Da die Neovaskularisation einen kritischen Prozess darstellt, der zur Unterstützung des Tumorwachstums und der Metastasierung notwendig ist, wird ein besseres Verständnis ihres Mechanismus die Entwicklung einer neuartigen zielgerichteten Therapie für OCSCs an der metastatischen Stelle ermöglichen.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den Neovaskularisationsschritt um die CSCs zeitlich zu visualisieren. Der Vorteil des Protokolls besteht darin, vollständig reproduzierbare Untersuchungen mit dem 3D-Kokultursystem NICO-1 zu ermöglichen, wodurch die Auswirkungen der OCSC-abgeleiteten Tumorinitiierungsfähigkeit während der Endothelzellangiogenese auf Patienten beobachtet werden können.
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Protocol
Alle Verfahren wurden gemäß dem Protokoll durchgeführt, das von der Ethikkommission für das Wohlergehen der Menschen genehmigt wurde. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung für die Verwendung ihrer Proben in der Forschung, und die Entnahme und Verwendung von Geweben für diese Studie wurde vom Human Genome, Gene Analysis Research Ethics Committee der Teikyo University genehmigt.
1. Isolierung und Kultur von Eierstockkrebs-Stammzellen (OCSCs) von Patientinnen mit Eierstockkrebs und Aszites in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe 2
- Isolieren Sie Krebsstammzellen aus humanem Eierstockkrebsaszitese, der durch Parazentese gewonnen wird. Sammeln Sie mindestens 100-250 ml Aszites von Patienten, um eine ausreichende Anzahl von Krebsstammzellen zu entnehmen. Zusätzlich können die Expressionsprofile von Krebsstammzellmarkern (d. H. EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 und Oct4) und Eierstockkrebsmarkern (pAX-8, WT-1) durch Durchflusszytometrie ausgewertet werden.
- Zentrifugieren Sie den menschlichen Eierstockkrebs Aszites bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur innerhalb von 24 h nach Aszitesaspiration.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml OCSC-Medium und 8 ml 30% Histodenz/phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) hinzu.
- OCSC-Medium vorbereiten: StemPro hESC-Ergänzung, DMEM⁄F-12 mit L-Glutamin (GlutaMAX-Medium), 25% BSA, 100 μM 2-Mercaptoethanol, 8 ng/mL FGF BASIC, 10 μM Insulin und 20 μM Y-27632.
- 2 mL OCSC-Medium werden der Zelllösung in Schritt 1.1.2 vorsichtig in einem 15-ml-Röhrchen überlagert und bei 450 x g 20 min bei Raumtemperatur in einem Schaufelrotor ohne Bremsen zentrifugiert.
- Übertragen Sie die OCSC-Schicht (ungestört an der Interphase) vorsichtig in ein neues 15-ml-Röhrchen mittels Transferpipette.
- Mit PBS bis zu 15 ml füllen. Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in OCSC-Medium und säen Sie auf einer Kulturschale mit extrem niedriger Bindung; Kulturen sollten bei 37 °C in 5% CO2 gehalten werden.
- Wechseln Sie das Medium alle drei Tage. Stellen Sie die Kulturschale vorsichtig für ca. 1 Minute auf, verwerfen Sie einen Teil des Überstands und fügen Sie das neue Medium hinzu.
- Verabschiedung von CSCs
- OCSCs in einem 15-ml-Röhrchen sammeln und bei 200 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Den Überstand entfernen, mit PBS füllen und bei 200 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml der Zellablösungslösung aus proteolytischen und kollagenolytischen Enzymen (z. B. AccuMax) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 min.
- Durch Pipettieren gut mischen und bei 37 °C 5 min inkubieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen in einer einzigen Suspension befinden.
- Gut durch Pipettieren mischen, mit PBS füllen und bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in OCSC-Medium für die anschließende Aussaat auf Kulturschalen mit extrem niedriger Bindung und die Wartung bei 37 °C in 5%CO2.
2. HUEhT-1 Endothelzellkultur
- Passage von HUEhT-1-Zellen
- Entfernen Sie das Medium aus der HUEhT-1-Kulturschale und waschen Sie die Zellen mit PBS.
- Fügen Sie 1 ml 0,025% Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 3 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 5 ml Endothelzellwachstumsmedium 2 hinzu, sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in HUEhT-1-Medium und säen Sie die Zellen auf kollagenbeschichteten Kulturschalen, gefolgt von einer Wartung bei 37 °C in 5%CO2.
- Wechseln Sie das Medium alle drei Tage.
3. Vorbereitung der NICO-1 Kokulturplatte für den Röhrchenbildungstest mit HUEhT-1-Zellen
- NICO-1 zusammensetzen und mit dem extrazellulären Hydrogel auf Matrixbasis (Matrigel-Matrix) beschichten.
- Nico-1 auf einer Seite nach den Anweisungen des Herstellers montieren und auf Eis halten.
- Decken Sie die Oberfläche von NICO-1 mit 300 μL kaltem PBS ab und entfernen Sie dann den Puffer.
- Fügen Sie 300 μL gekühltes Hydrogel auf Basis der extrazellulären Matrix hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 60 min.
- Um das Gleichgewicht zu erreichen, tauchen Sie den Filter mit 100% Ethanol ein und waschen Sie dann einen 13 mm ICCP-Filter (0,6 μm) mit PBS für 1 min.
- Montieren Sie den NICO-1 einschließlich der beiden Hauptkörperteile A (rechte Kammer) und B (linke Kammer) zusammen mit dem O-Ring und dem ausgeglichenen Filter.
4. Aussaat von HUEhT-1-Zellen und CSCs auf das NICO-1-System
- Herstellung von HUEhT-1-Zellsuspensionen durch Trypsinisierung der Zellmonoschichten und Resuspendierung der Zellen im Endothelzellwachstumsmedium mit 2% fetalem Kälberserum.
- Fügen Sie 1,2 ml der Zellsuspension (1,5 x 105 Zellen) zu jeder extrazellulären Matrix-basierten Hydrogel-beschichteten Vertiefung hinzu.
- Fügen Sie 1,5 ml OCSCs, die fünf Tage lang kultiviert wurden, in die andere Vertiefung hinzu.
- NICO-1 bei 37 °C in 5%CO2 inkubieren; Die Tubusbildung kann unter dem Mikroskop beobachtet werden und die Netzwerkbildung auf extrazellulärem Matrix-basiertem Hydrogel, gemessen anhand der Anzahl der Zweige.
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Representative Results
Wir sammelten Aszitesflüssigkeiten, die von Patienten mit fortgeschrittenem Eierstockkrebs während einer Operation oder Parazentese gewonnen wurden, um eine langzeitstabile Kultur für Sphäroide durchzuführen. Hier stellen wir Fälle einer langfristigen Sphäroidkultur von ovariellen CSCs vor, die als CSC1 und CSC2 bezeichnet werden. Beide Zelllinien tragen die gleichen diagnostischen und histologischen Profile. Die mechanistische Rolle von OCSCs, die der Interaktion mit Endothelzellen zugrunde liegen, die notwendig ist, um die Neovaskularisation von Endothelzellen, die die OCSCs umgeben, zu induzieren, bleibt unbekannt. Daher wollten wir die Prozesse der CSC-Gefäßnischenentwicklung an den metastatischen Stellen klären. Wir untersuchten die Interaktion zwischen Endothelzellen (HUEhT-1) und OCSCs mit dem in vitro Kokulturmodell NICO-1. Abbildung 1 zeigt einen Vergleich der durch CSC1 und CSC2 induzierten Schlauchbildungsaktivität. Die Anzahl der gebildeten Gefäßschläuche nahm im Laufe der Zeit in der Kokultur mit CSC2 dramatisch zu (Abbildung 2A). Für die Positivkontrolle präsentieren wir Abbildung 2B , die die angiogene Eigenschaft von HuEhT-1 nach der Behandlung von VEGF (10 ng/ml) ohne Co-Kultur von CSC2 zeigt. Wir klären jetzt den detaillierten Mechanismus, der dem Ergebnis zugrunde liegt. Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder des Kokulturmodells von OCSC mit Endothelzellen unter Verwendung des NICO-1. HUEhT-1-Zellen wurden 20 Stunden lang mit CSC2 kokultiviert und das Zeitraffer-Videobild wurde aufgenommen. Abbildung 3A zeigt den Phänotyp von CSC2 vor und nach der Kokultur für 20 Stunden. Abbildung 3B zeigt gleichzeitig kokultivierte HUEhT-1-Zellen. Bemerkenswert ist, dass HUEhT-1-Zellen während der Kokultur mit CSC2 Gefäßschläuche bildeten (Abbildung 3C: Videoclip)
Abbildung 1: OCSCs vaskuläres Nischenmodell. Die mechanistischen Rollen, durch die OCSCs die Röhrenbildung (Vaskularisation) von Endothelzellen induzieren, sind noch unbekannt. Wir untersuchten die Interaktion zwischen Endothelzellen (HUEhT-1) und OCSCs mit einem in vitro Kokulturmodus, NICO-1. Das rechte Fach dieses Systems besteht aus einem Einsatz, der OCSCs mit dem Zellmedium hält. Das linke Kompartiment besteht aus einer Vertiefung, die Endothelzellen und HUVECs mit dem gleichen Medium wie in der rechten Vertiefung enthält.
Abbildung 2: Vergleich der durch OCSCs induzierten Neovaskularisationsaktivitäten. Im Laufe der Zeit nahm die Anzahl der gebildeten Gefäßschläuche bei Kokultur mit CSC2 dramatisch zu.
Abbildung 3: Die vaskuläre Bildung von HUEhT-1-Zellen Kokultur mit CSC2 unter Verwendung von NICO-1. HUEhT-1-Zellen bildeten während der Kokultur mit CSC2 Gefäßröhren.
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Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie die Tumormikroumgebung von OCSCs in einer In-vitro-Umgebung nachgeahmt werden kann. Die Hauptkomponente der Methode bildet das hochreproduzierbare Kokulturmodell, das mit dem NICO-1-System, einem indirekten Transwell-Kokultursystem, erhalten wurde. Viele der derzeit verfügbaren Kokulturmodelle untersuchen die Auswirkungen eines direkten Zell-Zell-Kontakts auf kokultivierte Zellpopulationen 12,13,14,15,16,17,18. Das einfachste Modell, das zur Untersuchung der Auswirkungen der Kokultur verwendet werden kann, kann sich durch die direkte Vermischung zweier Zelltypen reproduzieren, und das Ausmaß heterotypischer und homotypischer Interaktionen kann durch Veränderung der Seeding-Dichte jedes Zelltyps und des relativen Seeding-Verhältnisses der Subpopulationen untersucht werden19. Die direkte Bestimmung der relativen Beiträge von OCSCs zu beobachteten Effekten der Kokultur unabhängig voneinander durch Mikroskopie ist jedoch aufgrund der genauen Unsichtbarkeit jeder Zelle schwierig; So werden diese Studien oft parallel von konditionierten Medienexperimenten begleitet. Zum Beispiel kann ein segregiertes Kokultursystem in Studien verwendet werden, in denen die Auswirkungen der parakrinen Signalübertragung auf die Tumormikroumgebung von Interesse sind19. Im Vergleich dazu beschreiben wir in der vorliegenden Methode ein Modell, das eine gleichzeitige Bewertung der Effekte von Zell-Zell-Kontakt und parakriner Signalübertragung ermöglicht, die die Architektur der nativen Tumormikroumgebung nachahmen.
Die Angiogenese dient als Kennzeichen von Eierstockkrebs und spielt eine entscheidende Rolle bei seiner Progression, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen, Endothelzellen und der umgebenden Tumormikroumgebung beinhaltet20. Bevacizumab ist ein wichtiges molekulares Targeting-Medikament, das weithin für den Einsatz in der Kombinationschemotherapie bei fortgeschrittenem Eierstockkrebs akzeptiert wurde21. Insbesondere stellt Bevacizumab einen monoklonalen Antikörper gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) dar. VEGF trägt zur Entwicklung von Peritonealkarzinomatose und zur Bildung von malignem Aszites bei fortgeschrittenem Eierstock- oder Peritonealkarzinom bei, indem es die Neovaskularisation fördert und die vaskuläre Permeabilität verbessert22. Daher wurde gezeigt, dass die VEGF-Hemmung die Aszitesproduktion und das massive Tumorwachstum an der metastatischen Stelle hemmt. Weitere Untersuchungen, die effektiv auf VEGF-stimulierte vaskuläre Endothelzellen in der Tumormikroumgebung abzielen, sind daher gerechtfertigt. Es kann jedoch schwierig sein, präklinische Modelle, wie z. B. Mausmodelle, für diese Studien effektiv zu nutzen. Zum Beispiel wurde berichtet, dass die Affinität von Bevacizumab für humanes VEGF hoch ist, während die des Mausproteins niedriger ist23. Dies erzwingt eine Einschränkung in Bezug auf die Anwendung von Bevacizumab in Experimenten, die darauf abzielen, seinen Anti-VEGF-Mechanismus zur Neovaskularisation in der Tumormikroumgebung weiter zu untersuchen, wie er anhand von Mausmodellen ermittelt wurde. Ein geeignetes Modell mit gut kontrollierter Architektur wird daher benötigt, um die Komponenten der in vivo Tumormikroumgebung zu rekapitulieren. In diesem Fall stellen wir fest, dass unser In-vitro-Kokultur-Modellsystem die Live-Verfolgung des Zellverhaltens während der gesamten Kultur der patientenabgeleiteten OCSCs und Endothelzellen ermöglicht und die Untersuchung dieser einzelnen Zellsubpopulationen als Reaktion auf die Kokultur ermöglicht.
Ein besseres Verständnis der Rolle von OCSCs und ihrer vaskulären Nische könnte neue Erkenntnisse für die Entwicklung therapeutischer Strategien für OCSCs liefern. Wie in den repräsentativen Experimenten gezeigt, liegen die Stärken des Modells darin, dass es eine Studienplattform bietet, die teilweise deckungsgleich mit klinischen Settings zu sein scheint und die Entwicklung und Erprobung gezielterer und wirksamerer neuartiger Medikamente ermöglicht. Weitere Studien sind mit direkter klinischer Replikation unserer Ergebnisse mit einer signifikanteren Anzahl von patientenabgeleiteten OCSCs erforderlich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research C (Grant no. 19K09834 to K.N.) des japanischen Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und Kultur unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A.
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
