Summary
Stamceller från äggstockscancer (OCSC) är ansvariga för cancerinitiering, återfall, terapeutisk resistens och metastasering. OCSC-vaskulär nisch anses främja självförnyelse av OCSC, vilket leder till kemoresistans. Detta protokoll utgör grunden för att upprätta en reproducerbar OCSC-vaskulär nischmodell in vitro.
Abstract
Cancerstamceller (CSC) finns i en stödjande nisch och utgör en mikromiljö bestående av intilliggande stromaceller, kärl och extracellulär matris. CSC: s förmåga att delta i utvecklingen av endotel utgör en viktig egenskap som direkt bidrar till den allmänna förståelsen av mekanismerna för tumorigenes och tumörmetastaser. Syftet med detta arbete är att etablera en reproducerbar metodik för att undersöka tumörinitieringsförmågan hos äggstockscancerstamceller (OCSC). Häri undersökte vi neovaskulariseringsmekanismen mellan endotelceller och OCSC tillsammans med de morfologiska förändringarna av endotelceller med hjälp av in vitro-samodlingsmodellen NICO-1. Detta protokoll möjliggör visualisering av neovaskulariseringssteget som omger OCSC på ett tidsförloppssätt. Tekniken kan ge insikt om de angiogenetiska egenskaperna hos OCSC vid tumörmetastaser.
Introduction
Äggstockscancer är den åttonde vanligaste maligniteten hos kvinnor i världen, med cirka 300 000 nya diagnoser och uppskattningsvis 180 000 dödsfall årligen1. Vid första diagnosen uppvisar äggstockscancer ofta svåra symtom, med cirka 75% av patienterna redan i steg III-IV. Följaktligen är 5-årsöverlevnaden <30% och dödligheten är den högsta bland gynekologisk cancer2, med effektiviteten i behandlingen för äggstockscancer som är mycket beroende av kliniska faktorer som framgångsrik prestation av debulkingkirurgi, resistens mot kemoterapi och återfall efter den första behandlingen.
Äggstockscancervävnader är hierarkiskt organiserade, med inte alla tumörkomponenter som är lika kapabla att generera ättlingar. De enda celler som kan förnya sig själv och producera en heterogen tumörcellspopulation anses representera cancerstamceller (CSC)3. CSC-självförnyelse och tumörinitiering åtföljs av främjande av angiogenes för att omforma sin tumörmikromiljö i syfte att upprätthålla en stödjande nisch. Tidigare modeller kunde dock inte användas för in vitro-analyser på grund av den begränsade reproducerbarheten av att odla CSC härledda från kliniska prover på grund av störningen av sfäroider efter flera passationer. På senare tid har experimentella metoder för att odla CSC från patienter utvecklats för flera applikationer 4,5,6,7. I synnerhet, genom att utnyttja egenskaperna hos CSC för att växa genom att bilda sfäroider i ultralåga fästplattor med serumfritt medium, induceras de odlade CSC: erna att uttrycka en stamcellsytmarkör som inte uttrycks i normala tumörceller med multilineagedifferentieringspotential 8,9.
Nya data har visat att persistensen av vilande äggstockar (O) CSC visualiserade som spridning vid bukhinnan är associerad med deras regenerering som återkommande tumörer10. Att förstå de molekylära och biologiska egenskaperna hos OCSC kan således möjliggöra effektiv inriktning och utrotning av dessa celler, vilket resulterar i potentiell tumörremission. I synnerhet är lite känt om de cellulära och molekylära mekanistiska egenskaperna hos CSC: s roller i angiogenes11. Därför använde vi i detta protokoll patient-härledda OCSC i en in vitro-miljö för att undersöka den angiogena egenskapen hos endotelceller med hjälp av samodlingsmodellen, som kan efterlikna tumörmikromiljön hos CSC och endotelceller på den metastatiska platsen i den kliniska miljön. I slutändan, eftersom neovaskularisering utgör en kritisk process som är nödvändig för att stödja tumörtillväxt och metastasering, kommer en bättre förståelse av dess mekanism att möjliggöra utvecklingen av en ny inriktningsterapi för OCSC på den metastatiska platsen.
Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera neovaskulariseringssteget som omger CSC: erna på ett tidskurssätt. Fördelen med protokollet inkluderar att tillåta helt reproducerbara undersökningar med hjälp av 3D-samodlingssystemet, NICO-1, vilket möjliggör observation av effekterna på patienter av den OCSC-härledda tumörinitieringsförmågan under endotelcellsangiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes enligt det protokoll som godkänts av etikkommittén för mänsklig välfärd. Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke för forskningsanvändning av sina prover, och insamling och användning av vävnader för denna studie godkändes av Human Genome, Gene Analysis Research Ethics Committee vid Teikyo University.
1. Isolering och odling av stamceller från äggstockscancer (OCSC) från patienter med äggstockscancer och ascites i ett nivå 2 biosäkerhetsskåp
- Isolera cancerstamceller från humana äggstockscancer ascites erhållna via paracentes. Samla minst 100-250 ml ascites från patienter för att ta tillräckligt antal cancerstamceller. Dessutom utvärdera uttrycksprofilerna för cancerstamcellsmarkörer (dvs. EpCAM, Calretinin, CD133, CD44, CD45, ALDH1 och Oct4) och äggstockscancermarkörer (pAX-8, WT-1) genom flödescytometri.
- Centrifugera humana äggstockscancer ascites vid 300 x g i 10 min vid rumstemperatur inom 24 timmar efter ascites aspiration.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 2 ml OCSC-medium och 8 ml 30 % Histodenz/fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7.4).
- Förbered OCSC-medium: StemPro hESC-tillskott, DMEM⁄F-12 med L-glutamin (GlutaMAX-medium), 25% BSA, 100 μM 2-merkaptoetanol, 8 ng / mL FGF BASIC, 10 μM insulin och 20 μM Y-27632.
- Lägg försiktigt över 2 ml OCSC-medium till celllösningen i steg 1.1.2 i ett 15 ml rör och centrifugera vid 450 x g i 20 minuter vid rumstemperatur i en svängande skopa utan bromsning.
- Överför försiktigt OCSC-skiktet (ostört vid interfasen) till ett nytt 15 ml rör genom överföringspipett.
- Fyll med PBS upp till 15 ml. Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i OCSC-medium och frö på en odlingsskål med ultralåg fastsättning; Kulturer bör bibehållas vid 37 °C i 5 %CO2.
- Byt medium var tredje dag. Ställ försiktigt kulturskålen i cirka 1 minuter och kassera en del av supernatanten och tillsätt det nya mediet.
- Passage av CSC
- Samla OCSC i ett 15 ml rör och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten, fyll med PBS och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten, tillsätt 1 ml av cellavskiljningslösningen bestående av proteolytiska och kollagenolytiska enzymer (t.ex. AccuMax) och inkubera vid 37 °C i 10 minuter.
- Blanda väl genom pipettering och inkubera vid 37 °C i 5 min. Se till att cellerna är i en enda suspension.
- Blanda väl genom pipettering, fyll med PBS och centrifugera vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i OCSC-medium för efterföljande sådd på odlingsskålar med ultralåg bindning och underhåll vid 37 °C i 5 %CO2.
2. HUEhT-1 endotelcellodling
- Passage av HUEhT-1-celler
- Ta bort mediet från HUEhT-1-odlingsskålen och tvätta cellerna med PBS.
- Tillsätt 1 ml 0,025% trypsin och inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 5 ml endotelcellstillväxtmedium 2, samla celler i ett 15 ml rör och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten, återsuspendera cellpelleten i HUEhT-1-medium och frö cellerna på kollagenbelagda odlingsskålar följt av underhåll vid 37 ° C i 5%CO2.
- Byt medium var tredje dag.
3. Beredning av NICO-1-odlingsplattan för rörbildningsanalys med användning av HUEhT-1-celler
- Montera NICO-1 och beläggning med den extracellulära matrisbaserade hydrogelen (Matrigel Matrix).
- Montera ena sidan av NICO-1 enligt tillverkarens instruktioner och håll på is.
- Täck ytan på NICO-1 med 300 μL kall PBS och ta sedan bort bufferten.
- Tillsätt 300 μl kyld extracellulär matrisbaserad hydrogel och inkubera vid 37 °C i 60 minuter.
- För att jämställa, sänk ner filtret med 100% etanol och tvätta sedan ett 13 mm ICCP-filter (0,6 μm) med PBS i 1 min.
- Montera NICO-1 inklusive både huvudkroppsdelarna A (höger kammare) och B (vänster kammare) tillsammans med O-ringen och det jämviktade filtret.
4. Sådd av HUEhT-1-celler och CSC till NICO-1-systemet
- Förbered HUEhT-1-cellsuspensioner genom att trypsinisera cellmonolagren och återsuspendera cellerna i endotelcellstillväxtmedium med 2% fosterkalvserum.
- Tillsätt 1,2 ml av cellsuspensionen (1,5 x 105 celler) till varje extracellulär matrisbaserad hydrogelbelagd brunn.
- Tillsätt 1,5 ml OCSC odlade i fem dagar till den andra brunnen.
- Inkubera NICO-1 vid 37 °C i 5 %CO2. Rörbildning kan observeras under mikroskopet och nätverksbildning på extracellulär matrisbaserad hydrogel mätt med hjälp av antalet grenar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi samlade ascitesvätskor erhållna från patienter med avancerad äggstockscancer under kirurgi eller paracentes i syfte att utföra en långsiktig stabil kultur för sfäroider. Här presenterar vi fall av en långsiktig sfäroidkultur av äggstocks-CSC som kallas CSC1 och CSC2. Båda cellinjerna har samma diagnos och histologiska profiler. De mekanistiska rollerna hos OCSC som ligger till grund för interaktionen med endotelceller som är nödvändiga för att inducera neovaskularisering av endotelceller som omger OCSC förblir okända. Därför syftade vi till att klargöra processerna för CSC-vaskulär nischutveckling på de metastatiska platserna. Vi undersökte interaktionen mellan endotelceller (HUEhT-1) och OCSC med hjälp av in vitro-odlingsmodellen NICO-1. Figur 1 visar en jämförelse av rörbildningsaktivitet inducerad av CSC1 och CSC2. Antalet bildade kärlrör ökade dramatiskt över tiden i samkulturen med CSC2 (figur 2A). För den positiva kontrollen presenterar vi figur 2B som visar den angiogena egenskapen hos HuEhT-1 efter behandling av VEGF (10 ng/ml) utan samodling av CSC2. Vi klargör nu den detaljerade mekanism som ligger till grund för resultatet. Figur 3 visar representativa bilder av coculture modell av OCSC med endotelceller med hjälp av NICO-1. HUEhT-1-celler odlades med CSC2 i 20 timmar och time-lapse-videobilden togs. Figur 3A visar fenotypen för CSC2 före och efter kokultur i 20 timmar. Figur 3B visar HUEhT-1-celler som odlas samtidigt. Det är anmärkningsvärt att HUEhT-1-celler bildade vaskulära rör under samodlingen med CSC2 (Figur 3C: Videoklipp)
Figur 1: OCSCs vaskulära nischmodell. De mekanistiska roller genom vilka OCSC inducerar rörbildning (vaskularisering) av endotelceller förblir okända. Vi undersökte interaktionen mellan endotelceller (HUEhT-1) och OCSC med hjälp av ett in vitro-samodlingsläge, NICO-1. Det högra facket i detta system består av en insats som håller OCSC med cellmediet. Det vänstra facket består av en brunn som innehåller endotelceller och HUVECs med samma medium som i höger brunn.
Figur 2: Jämförelse av de neovaskulariseringsaktiviteter som induceras av OCSC. Med tiden ökade antalet bildade kärlrör dramatiskt vid samodling med CSC2.
Figur 3: Den vaskulära bildningen av HUEhT-1-celler samkultur med CSC2 med NICO-1. HUEhT-1-celler bildade kärlrör under samodlingen med CSC2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver hur man efterliknar tumörmikromiljön hos OCSC i en in vitro-miljö. Den primära komponenten i metoden utgör den mycket reproducerbara cokulturmodellen erhållen med hjälp av NICO-1-systemet, ett indirekt Transwell-samodlingssystem. Många av de för närvarande tillgängliga cokulturmodellerna undersöker effekterna av direkt cell-cellkontakt på cocultured cellpopulationer 12,13,14,15,16,17,18. Den enklaste modellen som kan användas för att undersöka effekterna av samodling kan reproduceras genom direkt blandning av två celltyper, och omfattningen av heterotypiska och homotypiska interaktioner kan undersökas genom att ändra sådddensiteterna för varje celltyp och det relativa såddförhållandet för delpopulationerna19. Det är emellertid svårt att direkt bestämma de relativa bidragen från OCSC till eventuella observerade effekter av samkultur oberoende genom mikroskopi på grund av varje cells exakta osynlighet; Således åtföljs dessa studier ofta parallellt av konditionerade medieexperiment. Till exempel kan ett segregerat samodlingssystem användas i studier där effekterna av parakrin signalering på tumörmikromiljö är av intresse19. I jämförelse beskriver vi i den nuvarande metoden en modell som möjliggör samtidig utvärdering av effekterna av cell-cellkontakt och parakrin signalering, som efterliknar arkitekturen i den ursprungliga tumörmikromiljön.
Angiogenes fungerar som ett kännetecken för äggstockscancer och spelar en kritisk roll i dess progression, vilket involverar interaktioner mellan cancerceller, endotelceller och den omgivande tumörmikromiljön20. Bevacizumab är ett viktigt molekylärt målsökande läkemedel som har varit allmänt accepterat för användning i kombinationskemoterapi för avancerad äggstockscancer21. Specifikt utgör bevacizumab en monoklonal antikropp mot vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF). VEGF bidrar till utvecklingen av peritoneal karcinomatos och bildandet av maligna ascites vid avancerad äggstocks- eller peritonealcancer genom att främja neovaskularisering och förbättra vaskulär permeabilitet22. Därför har VEGF-hämning visat sig hämma ascitesproduktion och massiv tumörtillväxt vid den metastatiska platsen. Ytterligare undersökning som effektivt riktar sig mot VEGF-stimulerade vaskulära endotelceller i tumörmikromiljönivån är således motiverad. Det kan dock vara svårt att effektivt använda prekliniska modeller, såsom musmodeller, för dessa studier. Till exempel har det rapporterats att affiniteten hos bevacizumab för humant VEGF är hög medan den för musproteinet är lägre23. Detta upprätthåller en begränsning med avseende på tillämpningen av bevacizumab inom experiment som är utformade för att ytterligare undersöka dess anti-VEGF-mekanism mot neovaskularisering i tumörmikromiljön som fastställts med hjälp av musmodeller. En lämplig modell med välkontrollerad arkitektur behövs därför för att rekapitulera komponenterna i in vivo-tumörmikromiljön. I sådana fall noterar vi att vårt in vitro-coculture-modellsystem tillåter levande spårning av cellbeteende under hela kulturen av patient-härledda OCSC och endotelceller och möjliggör studier av dessa enskilda cellunderpopulationer som svar på samodling.
En bättre förståelse av OCSC: s roll och deras vaskulära nisch kan ge nya insikter för att utveckla terapeutiska strategier för OCSC. Som framgår av de representativa experimenten är modellens styrkor att den ger en studieplattform som delvis verkar vara kongruent med kliniska miljöer, vilket möjliggör utveckling och testning av bättre riktade och effektiva nya läkemedel. Ytterligare studier behövs med direkt klinisk replikation av våra resultat som involverar ett mer betydande antal patient-härledda OCSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag-i-stöd för vetenskaplig forskning C (bidrag nr 19K09834 till K.N.) från ministeriet för utbildning, vetenskap och kultur, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T.
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A.
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
