Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/61776
Automatic Translation
*1, *1, *2,3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,4, 1, 5, 6, 7, 3, 1
1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .

Abstract

איתות שחרור סידן המושרה בסידן (CICR) ממלא תפקיד קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים. כל פעילות תאית מהתפשטות תאים ואפופטוזיס, התפתחות והזדקנות, לפלסטיות סינפטית עצבית והתחדשות קושרו עם קולטני ריאנודין (RyRs). למרות החשיבות של איתות סידן, המנגנון המדויק של תפקידו בהתפתחות מוקדמת אינו ברור. כאורגניזם עם תקופת הריון קצרה, העוברים של Drosophila melanogaster הם נושאי מחקר עיקריים לחקר ההפצה והלוקליזציה של חלבונים הקשורים CICR והרגולטורים שלהם במהלך הפיתוח. עם זאת, בגלל העוברים העשירים בשומנים שלהם וכוריון עשיר בכיטין, התועלת שלהם מוגבלת על ידי הקושי של הרכבה עוברים על משטחי זכוכית. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול מעשי המגביר באופן משמעותי את ההתקשרות של עובר Drosophila על שקופיות ושיטות פירוט עבור היסטוכימיה מוצלחת, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה in-situ . שיטת ציפוי החלקת הג'לטין של אלום כרום ושיטת טרום ההטבעה של העובר מגדילה באופן דרמטי את התשואה בחקר חלבון העובר של דרוזופילה וביטוי RNA. כדי להדגים גישה זו, חקרנו DmFKBP12 / Calstabin, רגולטור ידוע של RyR במהלך התפתחות עוברית מוקדמת של Drosophila melanogaster. זיהינו את DmFKBP12 כבר בשלב blastoderm הסינכיטיאלי ולדווח על דפוס הביטוי הדינמי של DmFKBP12 במהלך הפיתוח: בתחילה כחלבון מבוזר באופן שווה ב blastoderm סינסיטיאלי, ולאחר מכן לוקליזציה מראש לשכבת המרתף של קליפת המוח במהלך blastoderm הסלולר, לפני הפצה בארכיטקטורה העצבית והעיכול הפרימיטיבית במהלך שלב שלוש אבני חן בשלב גסטרולציה מוקדמת. התפלגות זו עשויה להסביר את התפקיד הקריטי ש-RyR ממלא במערכות האיברים החיוניות שמקורן בשכבות אלה: הגנגליון התת-ושט והסופר-ושט, מערכת העצבים הגחונית ומערכת השלד והשרירים.

Introduction

איתות שחרור סידן המושרה בסידן (CICR) ממלא תפקיד קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים, כגון שרירי שלד/חלק ותפקוד כלי הדם הלבביים, התפשטות התאים ואפופטוזיס, פיתוח, הזדקנות, פלסטיות סינפטית עצבית והתחדשות1,2,3,4,5,6 . קולטני ריאנודין (RyRs) ואינוזיטול 1,4,5-קולטני טריספוספט (IP3Rs) הם שחקנים מרכזיים במסלול איתות הסידן הנשלט על ידי הרגולטורים שלהם חלבון קינאז A (PKA), Ca2 +/calmodulin תלוי חלבון קינאז II (CaMKII), חלבונים מחייבים FK506 (FKBPs), קלסקסטרין (CSQ), טריאדין, ו junctin1,2,3,4,5,6 . ביטוי אנושי חריג ומוטציות בחלבונים אלה יכולים להוביל לפיזיולוגיה פתולוגית כגון הפרעות קצב7 והתפשטות אונקוגנית8,9.

FKBPs לווסת את שחרור הסידן מן הרשתית אנדופלסמית (ER) על ידי RyRs. תהליך זה חיוני למנגנון ההתכווצות, ולכן אחראי לכל תנועה מכנית שנוצרת על ידי התכווצות מיוזין-אקטין באמצעות שחרור סידן המושרה בסידן יחד עם RyRs עוברי 1,2. במודלים של עכבר, היעדר RyR2 והרגולטור שלו FKBP12/Calstabin הוא תמיד קטלני, בין אם במהלך התפתחות עוברית או בתקופה שלאחר הלידה המוקדמת10,11,12. עכברי נוקאאוט FKBP12/Calstabin מציגים מומים לבביים קריטיים עם צימוד עירור-התכווצות לא סדיר (EC) ובצקת מוחית במהלך התפתחות עוברית. זה מצביע על כך FKBP12/Calstabin ממלא תפקיד חיוני בוויסות ביטוי ערוץ RyR2, אשר חשוב הן להתפתחות הלב והן להתפתחות המוחית10.

ניצוצות סידן שנערכו על ידי RyR התגלו בתחילה בשלב היווצרות הזיגוטה של ביצי מדאקה מופרות13,14. עם זאת, חקירות מעטות בוצעו על הפונקציה של איתות סידן בהתפתחות עוברית מוקדמת. ב Drosophila melanogaster, תוצאות שהתקבלו DmFKBP12 S107 מוטציות לספק ראיות חזקות התומכות בחשיבות של גן זה להתפתחות זחל ותוחלת חיים בריאה, אשר מיוחס לתפקודו נגד סטרס חמצוני 15,16. לאחרונה, זיהינו את הלוקליזציה הדינמית של חלבון FKBP12 / Calstabin ו- RNA שליח במהלך פיתוח מלנוגסטר דרוזופילה מוקדם17. באמצעות הגישות המתוארות במתודולוגיה זו, הצלחנו לעקוב אחר הביטוי של FKBP12 / Calstabin ב D. melanogaster במהלך blastoderm סינסיטיאלי (0-2 שעות), blastoderm הסלולר (2-3 שעות), gastrula מוקדם (3-12 שעות) ו gastrula מאוחר (12-24 שעות). במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקולים המפורטים של כל גישה במחקר הקודם, כולל הטמעה טרום-עוברית עבור חתך פרפין קלאסי, טיפול שקופיות טרום ציפוי עבור חלקים עובריים, היסטו-כימיה כתמים וחיסון, ו הכלאה mRNA in-situ לזיהוי ביטוי גנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת צלחות אגר מיץ ענבים

  1. מוסיפים 5 גרם אגר ו 5 גרם של סוכרוז ל 150 מ"ל של מים מזוקקים. מרתיחים אותו באמצעות מיקרוגל עד אגר וסוכרוז מומסים לחלוטין. מערבבים 50 מ"ל של 100% מיץ ענבים ואת הפתרון יחד.
  2. הוסף 1 מ"ל של 100% חומצה propionic כדי להפוך את הריכוז הסופי ל 0.5% חומצה propionic. יוצקים 25 מ"ל של הפתרון המוכן לתוך כל צלחת. לאחר אגר התגבש, לאחסן את המדיה ב 4 °C (70 °F).

2. שקופיות ציפוי

  1. טיפול מראש שקופיות עם חומר ניקוי. לשטוף את השקופיות 3 פעמים עם מי ברז ופעם עם מים מזוקקים. לאחר מכן יבש את השקופיות בתנור 45 °C (45 °F) במשך 2 שעות.
  2. לטבול את השקופיות בכ 450 מ"ל של פתרון חומצה גופרתית אשלגן dichromate (20 גרם של אשלגן dichromate, 40 מ"ל של מים מזוקקים, ו 400 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת) במשך 24 שעות. לשטוף את השקופיות 3 פעמים עם מי ברז ופעם עם מים מזוקקים.
    1. יבש את השקופיות בתנור 45 °C (45 °F) במשך שעתיים. יש לטבול ב-95% אתנול למשך יותר מ-2 שעות.
  3. מוסיפים 0.5 גרם של כרום אשלגן גופרתי ו 5 גרם של ג'לטין ל 1 L של מים מזוקקים. יש להמיס באמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס לפני השימוש. ג'לטין אלום כרום ניתן לאחסן ב 4 °C (50 °F) לתקופות ארוכות.
  4. טיפה 10 μL של ג'לטין אלום כרום על השקופית לכסות באופן מלא ושווה את כל פני השטח של השקופית עם הפתרון. מניחים את השקופית עם צד הג'לטין למעלה בתנור ב 42 °C (48 °F) במשך 48 שעות. ניתן לאחסן את השקופיות המוכנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
    הערה: זהו צעד קריטי. הציפוי המלא הוא הכרחי. עבור זבוב הפירות והעובר שלו, גישת ציפוי שקופיות זו נראית יעילה יותר מציפוי פולי-ליזין.

3. הטמעת עובר Drosophila

  1. אוסף עוברים של Drosophila
    הערה: אספנו עוברים Drosophila בארבע תקופות של 0-2 שעות (blastoderm סינסיטיאלי), 2-3 שעות (blastoderm הסלולר), 3-12 שעות (gastrula מוקדם) ו 12-24 שעות (gastrula מאוחר)18. החלק היחסי של סוגי העוברים העיקריים בכל תקופה מוצג בטבלה 1.
    1. מניחים 400-500 זבובים בבקבוק איסוף פלסטיק ומכסים את הבקבוק בצלחת אגר מיץ ענבים המכילה תמצית שמרים. עוברים Drosophila מונחים על אגר מיץ ענבים בטמפרטורת החדר.
    2. לאסוף ארבע תקופות של עוברים, בעדינות להוסיף 2 מ"ל של PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) לכל צלחת כדי לצוף העוברים. מעבירים כ-200 עוברים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ושומרים אותו על הקרח למשך 2 דקות כדי ליישב את העוברים.
  2. הטבעה מראש
    1. מעבירים 200 עוברים דרוזופילה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שמור את הצינור על קרח במשך 2 דקות כדי ליישב את העוברים, ולאחר מכן להשליך את supernatant עם pipette בזהירות. מוסיפים 1 מ"ל של 50% אקונומיקה בצינור ומנערים אותו בעדינות במשך 2 דקות.
      הערה: האקונומיקה צריכה להכין טרי, וכמות האקונומיקה עשויה להשתנות בהתאם לכמות העוברים שנאספו.
    2. לאסוף בעדינות עוברים על ידי לשפוך על נייר סינון ולשטוף אותם 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS בכל פעם.
    3. מעבירים את העוברים בנייר סינון לכ-5 מ"ל של n-heptane.
    4. מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל. מוסיפים 1 מ"ל של מתנול ומנערים אותו בעדינות. לאסוף עוברים לאחר משקע.
    5. הסר supernatant ולשטוף את העוברים ב 1 מ"ל של PBS 3-5 פעמים.
    6. תקן את העוברים עם 400 μL של הפתרון של Bouin (71% חומצה פיקרית רוויה, 24% פורמלין, 5% חומצה אצטית) במשך 30 דקות. לשטוף את העוברים הקבועים 3 פעמים ב 1 מ"ל של PBS במשך 5 דקות בכל פעם.
    7. כדי לצבור עוברים, להעביר את הדגימות לתוך פקק גומי ולהסיר את PBS.
    8. הכן פתרון אגרוז-PBS של 1.2% ושמור על הפתרון בטמפרטורה של 60 °C (60 °F). הוסף 200 μL של 1.2% agarose-PBS פתרון על עוברים כדי לתקן אותם לתוך בלוק אגר.
    9. הוציאו את הבלוק מהמעצור ואחסנו את הבלוק ב-PBS.
      הערה: במהלך גישת טרום ההטבעה, תמיכה בהתחממות היא קריטית להצלחה. אנו ממליצים בחום כי צינורות צנטריפוגה וטיפים micropipette, אשר ישמש בשלב זה צריך להיות חם לחלוטין לפני ההפעלה.
  3. הטבעת פרפין
    1. טבול את בלוק אגר מוטבע מראש ב 35% אתנול, 50% אתנול, 75% אתנול, ו 85% אתנול במשך 15 דקות כל אחד. לאחר מכן לטבול 2 פעמים ב 95% אתנול ו 100% אתנול.
      הערות: על 5-10x של נפח בלוק של כל אחד ואחריו קבוע מדורג במשך 15-30 דקות יש צורך בהתאם למספר העוברים בבלוק.
    2. טבול את בלוק העוברים בתמיסת 100% אתנול וקסילן (יחס של 1:1) למשך 15 דקות.
    3. מעבירים את הבלוק לקסילן למשך דקה אחת כדי להפוך את רקמת העובר לשקופה.
    4. הטביעו את הבלוק בקסילן ופרפין (יחס של 1:1) למשך 30 דקות.
    5. הטביעו את הבלוק בפרפין I, בפרפין II ובפרפין III במשך 2 שעות בכל פעם.
    6. מלא את תיבת ההטבעה בפרפין מראש ולאחר מכן העבר בעדינות ובאופק את הבלוק לתחתית תיבת ההטבעה. לאחר הפרפין להתמצק באופן טבעי, בלוק פרפין מוצק ניתן לאחסן ב 4 °C (60 °F).
      הערות: ניתן להשתמש בדגימה המוטבעת מראש בקריוזקציה על-ידי ביצוע השלבים הבאים. לאחר העוברים מוטבעים מראש עם agarose כמתואר לעיל, הדגימות פשוט מוטבעות במתחם OCT. לאחר מכן, cryosection יכול להתבצע על פי פרוטוקול cryosection שגרתי. לאחר מכן, ניתן להשתמש בגישות מכתימות רגילות בקטעים.

4. מכתים המטוקסילין-אאוזין

  1. הכן קטעי עובר Drosophila . מניחים חלקים מוכנים בתנור ב 60 °C (60 °F) במשך 15 דקות ולאחר מכן להטביע את החלקים בקסילן 2 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. הטביעו את החלקים פעם אחת ב-100% אתנול וקסילן (יחס של 1:1) למשך 2 דקות.
  2. לחות את החלקים 100% אתנול I, 100% אתנול II, 95% אתנול, 85% אתנול, 75% אתנול, 50% אתנול, ובמים מזוקקים במשך 3 דקות.
  3. מכתימים את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך 2 דקות. טובלים את השקופיות בתמיסת אלכוהול חומצית 1% (1 מ"ל של חומצה הידרוכלורית, 100 מ"ל של 70% אתנול) במהירות ושטפו את השקופיות במים מזוקקים.
  4. טובלים את השקופיות ב-50% אתנול, 75% אתנול, 85% אתנול ו-95% אתנול ברצף.
  5. מכתימים את החלקים בתמיסת אאוזין למשך דקה אחת.
  6. ייבשו את השקופיות ב-95% אתנול I, 95% אתנול II, 95% אתנול III, 100% אתנול I, 100% אתנול II ו-100% אתנול III למשך דקה אחת בכל פעם.
  7. נקה את השקופיות ב 100% קסילן I, 100% קסילן II, ו 100% קסילן III במשך 5 דקות בכל פעם.
  8. הר את השקופיות עם בלזם ניטרלי בהתאם להוראות היצרן.

5. כתמי מתנין חומצה-כסף תקופתיים

  1. להפוך את החלקים של פרפין ללא דופן ולהעניק לחות לעובר דרוזופילה למים מזוקקים.
  2. לחמצן את החלקים ב 1% חומצה תקופתית במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. שוטפים את השקופיות במים מזוקקים 3 פעמים במשך 1 דקות כל אחד.
  4. דגירה על השקופיות בכ 40 מ"ל של פתרון עבודה מת'אנמין כסף מסונן טרי (3% מתאנמין, 5% כסף חנקתי, 5% פתרון נתרן בוראט) במשך 1 שעות ו 20 דקות ב 60 °C (60 °F). לאחר מכן לשטוף את השקופיות במים מזוקקים במשך 1 דקה.
  5. טון השקופיות ב 0.2% זהב כלוריד במשך 2 דקות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות במים מזוקקים במשך 1 דקה.
  6. מניחים את השקופיות ב 3% נתרן thiosulfate במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות במים מזוקקים במשך 1 דקות.
  7. Counterstain השקופיות hematoxylin עבור 30 s. לשטוף את השקופיות במי ברז זורמים במשך 3-5 דקות.
  8. ייבשו את השקופיות ב-70% אתנול, 80% אתנול, 95% אתנול I, 95% אתנול II, 95% אתנול III, 100% אתנול I ו-100% אתנול II למשך 5 דקות כל אחד.
  9. נקה את השקופיות ב 100% קסילן I, 100% קסילן II ו 100% קסילן III במשך 5 דקות כל אחד.
  10. הר את השקופיות בבלזם ניטרלי בהתאם להוראות היצרן.

6. אימונוהיסטוכימיה

  1. Deparaffinize ו rehydrate paraffin קטעים של עובר Drosophila ל- PBS בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי19.
  2. לטפל במגלשות עם 0.3% H2O2 במתנול במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהימנע מאור.
  3. מחממים מראש את מאגר אחזור האנטיגן המתאים לכ-100 מעלות צלזיוס במיכל עם השקופיות בספינת הקיטור הירקות. המיכל צריך להיות גם מכסה. שים את השקופיות במיכל. סגור את המכסה של ספינת הקיטור.
    1. שמור את המיכל בסיר הקיטור במשך 20 דקות מנקודה זו. שים לב כי המכסה של מיכל השקופית לא צריך להיות מהודק לחלוטין כך אדי מים יכולים להיכנס במהלך תהליך אידוי.
  4. אפשר לשקופיות לחזור לטמפרטורת החדר לפני שטיפה עדינה ב- PBS-T (PBS עם Tween-20, pH 7.2) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת, ולאחר מכן שטפו את השקופיות ב- PBS 3 פעמים במשך דקה אחת כל אחת.
  5. חסום את השקופיות עם אלבומין סרום בקר 1% (BSA) ב- PBS למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לדגור על השקופיות עם נוגדן ראשוני (אנטי FKBP12 בשעה 1:1000) לילה ב 4 °C (60 °F) או בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות.
  7. לשטוף את השקופיות PBS-T 4 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  8. החל את השקופיות עם HRP שכותרתו פולימר מצומד עם נוגדנים משניים (אנטי ארנב, 1:5,000) במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. עשה זאת בחושך כדי להימנע מהלבנת תמונות.
  9. לשטוף את השקופיות PBS-T 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  10. לדגור על השקופיות עם 5% 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) במשך 2-10 דקות עד הצבע של מוצרי תגובה מתאים תחת מיקרוסקופ.
  11. נגד השקופיות hematoxylin עבור 30 s לשטוף את השקופיות במים מזוקקים 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  12. לייבש את השקופיות ב 50% אתנול, 70% אתנול, 90% אתנול, 95% אתנול, ו 100% אתנול במשך 1 דקה כל אחד.
  13. נקה את השקופיות ב 100% קסילן I, 100% קסילן II ו 100% קסילן III במשך 5 דקות כל אחד.
  14. הר את השקופיות בבלזם ניטרלי בהתאם להוראות היצרן.

7. הכלאה בתוך מקום

הערה: קטעי עובר Drosophila הוכנו עם 0.01% דיאתיל pyrocarbonate (DEPC) מים שטופלו. כל האביזרים המשמשים בהכלאה במקום להחיל טיפול לילה DEPC מראש.

  1. הכנת ריבופרוב
    1. ליניאריזציה DNA תבנית על ידי חיתוך באתר אנזים הגבלה במורד הזרם מן להוסיף משובט באמצעות אנזים הגבלה שיוצר 5 ' overhangs. לאחר ליניאריזציה, לטהר את התבנית DNA באמצעות מיצוי פנול / כלורופורם, ומשקעים אתנול הבאים. השתמש בפרוטוקולים רגילים.
    2. הוסף 1 מיקרוגרם של DNA תבנית מטוהרת לצינור צנטריפוגה ללא RNase. מניחים את צינור הצנטריפוגה על קרח. הוסף מספיק מים שטופלו DEPC לנפח הכולל 13 μL.
      1. לאחר מכן להוסיף את ריאגנטים הבאים לפי הסדר: 2 μL של תערובת תיוג NTP 10x, 2 μL של מאגר שעתוק 10x, 1 μL של מעכב RNase מגן, 2 μL של RNA פולימראז SP6 או RNA פולימראז T7.
    3. מערבבים את התגובה על ידי צנרת וצנטריפוגה תוך זמן קצר. דגירה עבור 2 שעות ב 37 °C (50 °F).
      הערה: דגירה ארוכה יותר אינה מגדילה את התפוקה של RNA שכותרתו. ספין קצר (~ 800 סל"ד) המוחל על צינור התגובה הוא קריטי הכרחי לפני שתמשיך לשלב הבא. ספין זה יאפשר לכל התוכן, אשר יכול ליצור מן הדגירה, לבוא לתחתית הצינור.
    4. הוסף 2 μL של DNase חינם RNase I כדי להסיר DNA תבנית ודגור במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F).
    5. הוסף 2 μL של 200 mM EDTA (pH 8.0) כדי לעצור את התגובה.
      הערה: ניתן לאחסן בדיקות RNA בעלות תווית DIG בטמפרטורה של -15 עד -25 °C (65 °F) באתנול למשך שנה אחת.
  2. טרום הכלאה של סעיף העובר Drosophila
    1. מניחים חלקים של עובר Drosophila בתנור 42 °C (42 °F) במשך 48 שעות.
    2. הפוך את השקופיות ל-100% קסילן למשך 10 דקות פעמיים.
    3. לחות את השקופיות על ידי טבילה רציפה 100% אתנול, 95% אתנול, 90% אתנול, 70% אתנול, ו 50% אתנול במשך 5 דקות.
    4. לדגור על השקופיות PBS במשך 5 דקות 3 פעמים כדי להסיר את הפתרון הקבוע / הפתרון של Bouin מן הרקמה.
    5. לשטוף את השקופיות עם 100 mmol / L גליצין / PBS פתרון 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    6. לשטוף את השקופיות עם PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    7. לדגור על השקופיות עם 0.3% טריטון X-100 ב PBS במשך 15 דקות כדי לחלחל את הממברנות.
    8. לשטוף את השקופיות עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    9. דגירה את השקופיות ב 15 מיקרוגרם / מ"ל חלבון ללא RNase K במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F).
    10. לדגור על השקופיות עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 3 דקות כדי לעצור את העיכול.
    11. לשטוף את השקופיות עם PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    12. דגירה את השקופיות במאגר טריאתנולמין 100 מ"מ (pH 8.0) עם 0.25% (v/ v) אצטית אנהידריד 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    13. הוסיפו מי DEPC לתא הלחות של המגלשה. הוסף 20 μL של פתרון טרום הכלאה (המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל של DNA זרע סלמון) על השקופיות. שים את השקופיות לתוך תא הלחות שקופית. לדגור על השקופיות ב 42 °C (4 °F) עבור 4 שעות.
      הערה: יש צורך להבטיח את ההידוק של המכסה של הקופסה הרטובה וכי התיבה הרטובה נשמרת תמיד אופקית כדי למנוע תנודתיות וחריגה מן הרקמה של פתרון טרום הכלאה ואת פתרון הכלאה אחריו.
  3. הכלאה של סעיף העובר Drosophila
    1. הסר את פתרון טרום הכלאה ולשטוף את השקופיות עם 0.2x SSC (150 mM נתרן כלורי, 15 מ"מ נתרן ציטראט, pH 7.0) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד. לנגב עודף 0.2x SSC סביב דגימות הרקמה.
    2. החל 30 μL של פתרון הכלאה בדיקה (המכיל 2-6 ng של דיגוקסין שכותרתו RNA בדיקה על ידי דילול בפתרון טרום הכלאה) עם פיפטה. דגירה את השקופיות בתא לחות שקופית ב 42 °C (65 °F) עבור כ 20 שעות.
      הערה: ודא על הידוק המכסה כהצעה של ההערה האחרונה. אחרת, הייבוש שנגרם מדליפה של טרום הכלאה או טרום הכלאה תיצור רקע מלוכלך כולל פסאודו חיובי בשקופיות.
  4. הכלאה
    1. הסר את פתרון ההיברידיזציה ולשטוף את השקופיות עם פתרון SSC 4x 4 פעמים במשך 15 דקות כל אחד ב 37 °C (50 °F).
    2. לשטוף את השקופיות בתמיסת SSC 2x עם 20 מיקרוגרם / מ"ל של RNase A במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F).
    3. לשטוף את השקופיות בתמיסת SSC 1x במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F).
    4. לשטוף את השקופיות בתמיסת SSC 0.5x במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F).
    5. לשטוף את השקופיות בתמיסת SSC 0.1x במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F).
    6. לשטוף את השקופיות עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    7. לשטוף את השקופיות במאגר כביסה (100 מ"מ חומצה גברית, 150 מ"מ NaCl, 0.3% (v / v) Tween 20, pH 7.5) במשך 1 דקות.
    8. לדגור על השקופיות ב 100 מ"ל של פתרון חסימה טרי מוכן (2% סרום כבשים במאגר חומצה maleic ללא Tween 20) במשך 30 דקות.
    9. לדגור על השקופיות ב 20 מ"ל של פתרון נוגדנים במשך 45 דקות.
      1. צנטריפוגה הנוגדן במשך 5 דקות ב 10,000 סל"ד בבקבוקון המקורי לפני כל שימוש, וצינור את הכמות הדרושה בזהירות מפני השטח. לדלל אנטי-digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU / mL) בפתרון חסימה.
    10. לשטוף את השקופיות ב 100 מ"ל של חוצץ כביסה 2 פעמים במשך 15 דקות כל אחד כדי להסיר מצומד נוגדנים מאוגדים.
    11. שיווי משקל את השקופיות ב 20 מ"ל של מאגר זיהוי (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) במשך 2-5 דקות.
    12. דגרו את השקופיות עם 10 מ"ל של פתרון מצע צבע טרי מוכן בתא לחות שקופית. התגובה מתחילה בתוך כמה דקות והיא הושלמה לאחר 16 שעות. אין לנער או לערבב בזמן התפתחות הצבע.
    13. לשטוף את השקופיות עם 50 מ"ל של מים מזוקקים במשך 5 דקות כדי לעצור את התגובה.
    14. ייבשו את הדגימה למשך הלילה בחושך.
    15. מייבשים את השקופיות ב-70% אתנול, 80% אתנול, 90% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול I ו-100% אתנול II למשך 3 דקות כל אחד.
    16. נקה את השקופיות ב 100% קסילן I, 100% קסילן II ו 100% קסילן III במשך 20 דקות כל אחד.
    17. הר את השקופיות עם בלזם ניטרלי.
    18. תעד תמונות וניתח באמצעות המיקרוסקופיה ההפוכה ותוכנת היצרן. בצע ניתוח הפצה באמצעות ImageJ על פי צפיפות של אות חיובי לאורך ציר אורך או בתוך אזור דיפרנציאלי של עוברים.
      הערה: במהלך הדגירה עם פתרון מצע הצבעים שהוכן זה עתה בשלב 7.4.12, ניתן לראות את צבע התגובה אפילו בעין חשופה. תצפית זו על איך פיתוח צבע ניתן לבדוק תחת סטריאוסקופ. ברגע שצבע התגובה סביר וניתן לבצע את השלב 7.4.13 כדי לעצור את התגובה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדמויות מתארות פרוטוקולים המשמשים להתגבר על האתגר של חיבור עוברי שומנים גבוהים המכילים שומנים וכיטין Drosophila (טבלה 1) למשטח שקופית הזכוכית לבדיקה וניסויים. תוך שימוש בשיטת ציפוי השקופיות של אלום כרום ג'לטין המוצגת באיור 1, שיפרנו את החיבור של עוברים Drosophila על פני השטח של שקופיות בעוד שיטת טרום ההטבעה של העובר המוצגת באיור 2 מאפשרת בדיקה יעילה של ההתפלגות הדינמית של חלבון ורנ"א DmFKBPP12/Calstabin בכל ארבעת שלבי הפיתוח המוקדמים (כלומר, blastoderm סינסיטיאלי, blastoderm תאי, גסטרולה מוקדמת ומאוחרת של עוברי הדרוסופילה ). איור 3 מראה את התפלגות החלבון של נוגדנים שזוהו FKBP12 / Calstabin בשלבים סינסיטיאליים ותאיים blastoderm. מתוצאות היסטוכימיות אלה, ניתן לראות כי ביטוי FKBP12 מקוטב פחות ב blastoderm סינכרוני (לוחות A עד H), ולאחר מכן מתחיל לוקליזציה בתוך קרום המרתף מתחת לאפיתל trophectoderm כדי ליצור שיפוע עם ביטוי רב יותר נמצא הקדמי מאשר הקטבים האחוריים (לוחות I to S). בסופו של דבר, חלבון DmFKBP12/Calstabin מוגבל לרכיבים ארכיטקטוניים מסוימים של הרקמות העובריות הפרימיטיביות עם התפלגות חוץ-תאית פחות מזו שנצפתה בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחרים (איור 4). מעניין לציין שהתפלגות החלבון הדינמית המתוארת לעיל אינה מלווה ברמות mRNA מקבילות של DmFKBPP12 (איור 5), מה שמצביע על כך שביטוי החלבון הוא תוצאה של מנגנון מולקולרי שעדיין לא ידוע לאחר שעתוק. השיטה המתוארת של ציפוי שקופיות CAG והטבעה מראש תאפשר לנו לחקור עוד יותר את החשיבות של DmFKBPP12 באיתות סידן ולחשוף מנגנון מולקולרי זה עדיין לא ידוע תוך שילוב טכניקות אחרות כגון הפרעות RNA מיקרו הזרקה19.

במחקר זה, אנו מפתחים כרום אלום ג'לטין ציפוי שקופיות ושיטת טרום הטמעה עבור היסטולוגיה, ניתוח היסטוכימי ומערכת החיסון-היסטולוגית של עוברים Drosophila בשלבי פיתוח שונים. בשיטה זו טרום הטמעה, העוברים נאספים ביעילות הן עבור חתך קריו והן עבור חתך פרפין המאפשר ניתוח של חתכים קוויים. זה איפשר לנו לתאר את דפוסי הביטוי המתפתחים עבור חלבון זה בשלבים התפתחותיים מכריעים, המקשרים את הביטוי של החלבון להתפתחות של מערכות פיזיולוגיות מרכזיות כגון המעיים, המוח ומערכת העצבים המחברת. על ידי שימוש בשיטות אלה, הצלחנו לחקור את ההפצות הדינמיות של חלבון ויסות RyR ו- mRNA FKBP12 / Calstabin במהלך הפיתוח של עוברים Drosophila בשלבים סופיים, כולל blastoderm סינסיטיאלי ותאי, ושלבי גסטרולציה מוקדמים ומאוחרים. הנתונים שלנו הראו כי חלבון FKBP12 / Calstabin ו RNA שלה ניתן לזהות מוקדם מאוד ב blastoderm סינסיטיאלי. ככל שהעובר מתפתח, FKBP12 הופך להיות מופץ בצפיפות רבה יותר בשכבת תאי הבסיס מתחת לאפיתל של הבלסטודרם. חלבון FKBP12/Calstabin מחזק באופן דינמי את ההבעה שלו ומבדיל את תפוצתו לרקמות עובריות המכילות שרירים, כולל הסטמודיאום, הסטומדיאום ותשתית מידגוט אחורית. שינויים אלה הפצה מתחילת blastoderm לשלבי גסטרולציה מאוחר מתוארים גם במערכת העצבית המתפתחת כולל נוירובלסטים, עצב הגחון, גנגליון על-הוושט והמוח. בעוד שינויים דינמיים אלה FKBP12 / Calstabin מרמזים על חשיבותו בפיתוח, הם אינם באים לידי ביטוי ברמות mRNA של החלבון, רומז על רגולטור לא ידוע עדיין של ביטוי חלבון שנותר לזהות.

Figure 1
איור 1: שרטוט של שיטת ציפוי ג'לטין אלום כרום (CAG) עבור מקטעי פרפין המשמשים בהכלאה אימונולוגית ורנ"א in-situ כדי לדמיין את ההפצה של חלבון DmFKBP12 ו- mRNA בעוברי דרוזופילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שרטוט של שיטת הטמעה מוקדמת לפרופיל ביטוי של FKBP12 ו- DmFKBP12 בפיתוח עוברים של Drosophila . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פרופיל ביטוי של חלבון DmFKBP12 בבלסטודרמה סינסיטית ותאית של העובר דרוזופילה . (א-ד) כתמי H&E של הבלסטודרם הסינכיטיאלי. כימות של הפצת DmFKBP12 ב blastoderm סינכרוני מוקדם מוצג D. (E-G) לוחות להציג blastoderm סינסיטיאלי מוקדם שבו גרעינים נמצאים תחת חלוקה. כימות של הפצת DmFKBP12 ב blastoderm סינכרוני מאוחר מוצגים ב - H. (I-L) מכתים H&E של blastoderm הסלולר. ההסמכה של הפצת DmFKBP12 ב blastoderm הסלולר המאוחר מוצג L. (M-S) לוחות להציג את ההפצה של חלבון DmFKBP12 ב blastoderm הסלולר. O מציג את הנופים הגדולים יותר של M-N. (P-R) פאנלים מציגים פיצוץ תאי מוקדם יותר המוצג ב - M-O. כימותים של הפצת DmFKBP12 ב blastoderm הסלולר מוקדם מוצג S. סרגל קנה מידה עבור A, E, I, M ו- P הוא 60 מיקרומטר, עבור B, C, F, J, K, N, Q ו - R הוא 40 מיקרומטר, ועבור G, O הוא 20 מיקרומטר. AP, מוט קדמי של ביצה; YK, חלמון; CN, גרעין מחשוף; PP, מוט אחורי של ביצה; BLD, blastoderm, גרעינים ותא; BM, קרום מרתף. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע± SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. כימות הנתונים בוצע באמצעות ImageJ. ראשית, המוצרים החומים נותרו בתמונה יחד עם הסרת כל הצבעים האחרים. שנית, התמונה החומה שונתה בשחור-לבן וחשבה את צפיפותה לכימות כתוצאה מכך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: פרופיל ביטוי של חלבון DmFKBP12 בשלבי גסטרולציה מוקדמים ומאוחרים של העובר דרוזופילה . A, D ו - G להראות H&E כתמים של עובר Drosophila בשלב גסטרולציה. B, C, E ו - F מציגים את ההפצה של DmFKBP12 בשלב גסטרולציה מוקדם. H, I ו - J-L מציגים את ההפצה של DmFKBP12 בשלב הגסטרוקציה המאוחר. כימותים של הפצת DmFKBP12 ב gastrulae מוקדם מוצגים בר סולם M. עבור A. Scale בר עבור A, D, E ו - G הוא 80 מיקרומטר, עבור B, C, F, H, I ו - J-L הוא 40 מיקרומטר. PP, מוט אחורי של ביצה; NBL, נוירובלסטים; ST, סטומודיאום; YK, חלמון; PMG, בסיס מידגוט אחורי; BR, מוח, גנגליון על-הוושט; VNS, מערכת העצבים הגחונית; PV, פרובנטריקולוס; MUS, שריר; MGC, caecum midgut; AMG, מידגוט רודיפייאני קדמי; MMG, אמצע התיכון; טי.אר, קנה הנשימה. הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע± SEM. ns, אין משמעותי; ** p < 0.01, *** p < 0.001. כימות הנתונים בוצע עם ImageJ 1.50d על ידי השארת מוצר-חום ושינוי לתמונה בשחור-לבן, ובעקבות חישוב צפיפות של שחור-לבן כמתואר באגדת הדמות הקודמת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: לוקליזציה פנימית של DmFKBP12 mRNA במהלך התפתחות עוברית של העובר דרוזופילה. מראה לוקליזציה in-situ של DmFKKBPP12 mRNA בשלב blastoderm סינסיטיאלי כאשר FKBP12 mRNA בא לידי ביטוי ציטופלסמה של העובר. B ו- C להראות לוקליזציה in-situ של DmFKBPP12 mRNA בשלב blastoderm הסלולר כאשר FKBP12 mRNA בא לידי ביטוי בגבולות הפנימיים של תאי blastoderm. D ו- E מציגים לוקליזציה בתוך סיטו של FKBP12 mRNA בשלב גסטרולציה מוקדם. בשלב זה, הוא מקומי בעיקר במעיים המתפתחים. F, G ו- H מראים לוקליזציה in-situ של FKBP12 mRNA בשלב gastrulation המאוחר, כאשר mRNA בא לידי ביטוי בשריר ובמעיים. אני שליטה חיובית של DmFKBP12 mRNA. J הוא שליטה שלילית של DmFKBP12 mRNA. סרגל קנה מידה עבור A, C, E, G ואני הוא 5 מיקרומטר, עבור B, D, F, I ו- J הוא 10 מיקרומטר. YK, חלמון; CN, גרעין מחשוף; BLD, blastoderm, גרעינים ותאים; CF, שסוע אלכסוני קדמי, תלם צפלי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שלבים עובריים 0-2 שעות (%) 2-3 שעות (%) 3-12 שעות (%) 12-24 שעות (%)
blastoderm סינסיטיאלי 90.8 0 0 0
בלסטודרם סלולרי 6.9 91.54 0 0
גסטרולה מוקדמת 2.3 4.23 91.1 0
גסטרולה מאוחרת 0 4.23 8.93 93.3

טבלה 1: אוסף עוברים של שלבים שונים בפיתוח של Drosophila melanogaster

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RyRs ו- IP3Rs מתווך סידן איתות הוא מסלול בסיסי בתהליך פיזיולוגי ופתולוגי רבים של בעלי חוליות וחסרי חוליות כאחד 1,2,3,4. אצל בני אדם, מוטציות נקודתיות, כגון מוטציה R4496C הקשורה ל- CPVT, בגן RyR2 מובילות לדליפת סידן מהרשת הסרקופלסמית של קרדיומיוציט, וכתוצאה מכך לתפקוד לקוי של הלב. מוטציות אלה מוצגות כהפרעות קצב עם סיכון גבוה למוות לבבי פתאומי במהלך פעילות גופנית, והוא ניתן לשחזור במודלים של עכברים שנועדו לשאת מוטציה זו. בתנאי פעילות גופנית, העכברים הנושאים מוטציה זו של דליפת סידן חוו מוות פתאומי לבבי שלא הוכח על ידי חלקי הנגד הפראיים שלו18,20,21,222. ביטוי יתר של FKBP12, רגולטור RyRs, בלב, התכתב עם שיעורים גבוהים של ערוצי אשלגן הקשורים מוות לבבי במודלים עכבר22,23, ממצא שהתכתב עם פנוטיפ של עכברים נוקאאוט FKBP1212 10,11. כמו יונקים RyRs כולל RyR1, RyR 2and RyR3 ואת FKBPs הרגולטור שלהם נחקרו היטב במשך למעלה משלושה עשורים, רוב ההליכים המעורבים קרדיופתולוגיה, תפקוד שרירי השלד והישגים תפקוד המוח לאחר התפתחות מוקדמת בתוספת oncogenesis הם המוקד של מחקר24,25.

שלא כמו בחולייתנים, שיש להם שלושה איזופורמים של RyR, זבובי Drosophila יש רק אחד RyR1,2,3,5. לאחרונה, הדגמנו את הפונקציה הקריטית של Drosophila RyR (DmRyR) בשלבים המוקדמים של התפתחות עוברית Drosophila. חשפנו את ביטוי DmRyR הן ברמה התרגומית והן ברמה התמלולית בעוברי דרוזופילה במהלך ההתפתחות המוקדמת: שלב הבלסטודה הסינכיטאלי, שלב הבלסטודרמה ושלבי הגסטרולה המוקדמים. בכל ארבעת השלבים, DmFKBPP12 mRNA הופץ באופן שווה בכל העובר ונשאר באותה רמה, בעוד ביטוי החלבון של הגן היה דינמי מאוד עם פרופילי ביטוי מקוטבים חזיתית ולאחר מכן הופץ בשכבות תאים מסוימות19. הפרוטוקולים המתודולוגיים בהם השתמשנו בפרסום זה היו קריטיים ליכולת להשיג כמות גדולה של תוצאות מייצגות.

חלוקת פרפין היא טכניקה בסיסית ומעשית לגילוי היסטולוגי של ביטוי חלבון לניתוח כמותי. מקטעי פרפין הם כלי בסיסי לחקר ביטוי חלבון בחרק הבוגר. עם זאת, טכניקות אלה היו קשה לשכפל בפיתוח חרקים בשל העובר העשיר בשומנים שלהם chorion עשיר כיטין עשיר, אשר להפוך הטמעה, שימור, הרכבה שקופית קשה. השומנים שנמצאו בעוברים מפריעים לכוחות המאפשרים חיבור של חלקים עובריים על פני השטח של השקופית. בעוד כיטין שנמצא בכוריון מציג מחסומים פיזיים המגינים על העובר מפני הפרעות כימיות ומכאניות, הוא גם מגביל קבצים מצורפים של דגימות עובריות למגלשות זכוכית. בעוד מאפיינים אלה מבטיחים שיעור הישרדות גבוה יותר של זחלי חרקים, זה מאוד מעכב את היכולת ללמוד את החלבון in-situ שלהם ואת ביטוי mRNA. בעיה זו כבר בעייתית בדרכים רבות. השימוש בחומרי ניקוי משטח כגון Tween-20 מנתק לעתים קרובות עוברים Drosophila ומפחית את מספר העוברים הזמינים למחקר. טכניקה זו דורשת דגירה במשך 20 שעות כדי לחשוף mRNA עבור הכלאה in-situ , אבל גם מנתק את הדגימות מן השקופיות כמעט לחלוטין. הטכניקה כאן של ציפוי שקופיות זכוכית עם ג'לטין אלום כרום (CAG) לפני ביצוע immunohistochemistry וזיהוי ספציפי אנטי חוש עבור mRNA פותר מחסומים טכניים אלה על ידי שיפור הקשר בין העובר לבין שקופית הזכוכית.

בנוסף לקובץ המצורף המשופר של CAG, טכניקות טרום הטמעה טרום הטמעה של Drosophila המתוארות מאפשרות קציר של מספר גדול של עוברים דרוזופילה מתוארכים במדויק. זה איפשר לנו לדווח על הביטוי הדינמי של DmFKBP12 / Calstabin בשלבים שונים של התפתחות עוברית מוקדמת. השלב המוקדם ביותר שהצלחנו ללמוד באמצעות טכניקה זו הוא שלב blastoderm סינסיטיאלי, אשר הראה התפלגות מובחנת פחות ורמה נמוכה יותר בדרך כלל של ביטוי. על ידי לימוד עוברים בשלבי הבלסטודה התאית וגאסטרולה, מצאנו כי הרמה הכללית של DmFKBP12/ Calstabin גדלה ככל שעוברים מתפתחים ומתחילים לוקליזציה, תחילה לסקר הקדמי, ולאחר מכן לשכבות מסוימות בשלב שלוש השכבות. הממצאים מראים כי FKBP12 מעורב איתות סידן ממלא תפקיד קריטי בהתפתחות מוקדמת ואת הבידול של אשר ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות Melanogaster Drosophila .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (#31771377/ 31571273/31371256), תוכנית המדען המכובד הזר מהמחלקה הלאומית לחינוך (#MS2014SXSF038), הקרן הלאומית לחקר האוניברסיטאות המרכזיות של המחלקה הלאומית לחינוך (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), ו-XZ נתמכת על ידי קרן תזת הדוקטורט המצטיין (#2019TS082/2019TS079), תוכנית המפתח של מחלקת החינוך המחוזית שאאנשי (#20JS138), פרויקט הנוער של תוכנית המחקר הבסיסית למדעי הטבע של המחלקה למדע וטכנולוגיה במחוז שאאנשי (#2020JQ-885).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-20°C Refrigerator Meiling Biology &Medical DW-YL270 Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator Thermo Forma 90 Series Used for regent storage
Agar Sigma-Aldrich WXBB6360V Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Roche 11093274910 For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator Shanghai Bluepard Instruments LRH-250 In-situ Hybridization
Bouin's solution Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69945460 Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge Eppendorf 540BH07808 In-situ Hybridization
Centrifuge tube Denville C-2170 Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10001018 Coating Slides
Constant temperature water bath Jintan Henfeng Instruments KW-1000DC Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System Dako K5007 In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC Sigma-Aldrich D5758 In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit Roche 11093274910 RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster Bloomington Stock Center BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven Tianjin Taiste Instruments 101-0AB For coating slides and paraffin embedding
Eosin Sigma-Aldrich 230251 Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 100092680 Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10010328 Coating Slides
Gold chloride Sigma-Aldrich 379948 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136 Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit Roche 11732668001 For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box Ningbo Jiangnan Instruments HWS For fly maintenance
LE Agarose HyAgarose 14190108029 Pre-embedding
Methanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10014108 Drosophila Embryo Collection
Microscope ZEISS Observer.A1 Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides MeVid Labware Manufacturing P105-2001 Coating Slides
Neutral Gum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10004160 Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 40026768 Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer Huahai science instrument HH-2508III In-situ Hybridization
Paraffin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69019461 Paraffin Embedding
pH/mV Meter Sartorius PB-10 For determing the pH value of a solution
Silver nitrate Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10018461 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter Thermo AFXI-0501-P In-situ Hybridization
Xylene Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10023418 Paraffin Embedding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 183 עובר Drosophila סעיף פרפין שקופית ציפוי הטמעה הכלאה in-situ DmFKBPP12/Calstabin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He,… More

Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He, B., Xiao, L., Yue, H., Wang, S., Sun, Y., Wu, Y., Wang, L., Ghartey-Kwansah, G., Jones, O. D., Bryant, J. L., Xu, M., Ma, J., Xu, X. A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (183), e61776, doi:10.3791/61776 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter