Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En protokoll for immunhiistokjemi og RNA in-situ distribusjon innen tidlig Drosophila embryo

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/61776
Automatic Translation
*1, *1, *2,3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,4, 1, 5, 6, 7, 3, 1
1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en protokoll for deteksjon og lokalisering av Drosophila embryoprotein og RNA fra innsamling til pre-embedding og innebygging, immunstaining og mRNA in situ hybridisering.

Abstract

Kalsiumindusert kalsiumutslippssignal (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske prosesser. Hver cellulær aktivitet fra celleproliferasjon og apoptose, utvikling og aldring, til nevronal synaptisk plastisitet og regenerering har vært forbundet med Ryanodine reseptorer (RyRs). Til tross for viktigheten av kalsiumsignalering, er den eksakte mekanismen for funksjonen i tidlig utvikling uklar. Som en organisme med en kort svangerskapsperiode er embryoene til Drosophila melanogaster hovedstudieemner for å undersøke distribusjon og lokalisering av CICR-tilknyttede proteiner og deres regulatorer under utvikling. Men på grunn av deres lipidrike embryoer og chitinrike korion, er deres nytte begrenset av vanskeligheten med å montere embryoer på glassflater. I dette arbeidet introduserer vi en praktisk protokoll som betydelig forbedrer vedlegget av Drosophila embryo på lysbilder og detaljmetoder for vellykket histokjemi, immunhiistokjemi og in-situ hybridisering. Den krom alum gelatin lysbilde-belegg metode og embryo pre-embedding metode dramatisk øker utbyttet i å studere Drosophila embryo protein og RNA uttrykk. For å demonstrere denne tilnærmingen studerte vi DmFKBP12/Calstabin, en kjent regulator av RyR under tidlig embryonal utvikling av Drosophila melanogaster. Vi identifiserte DmFKBP12 i så tidlig som det synytiale blastodermstadiet og rapporterte det dynamiske uttrykksmønsteret til DmFKBP12 under utvikling: først som et jevnt distribuert protein i synytial blastoderm, deretter foreløpig lokalisering til kjellerlaget av cortex under cellulær blastoderm, før distribusjon i den primitive nevronale og fordøyelsesarkitekturen under tre-perle lagfasen i tidlig gastrulation. Denne fordelingen kan forklare den kritiske rollen RyR spiller i de vitale organsystemene som stammer fra disse lagene: det suboøsofageale og supraesophageal ganglion, ventrale nervesystemet og muskel-skjelettsystemet.

Introduction

Kalsiumindusert kalsiumutløsningssignalering (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske prosesser, for eksempel skjelett/glatt muskel- og hjertevaskulær funksjon, celleproliferasjon og apoptose, utvikling, aldring, nevronal synaptisk plastisitet og regenerering1,2,3,4,5,6 . Ryanodine reseptorer (RyRs) og inositol 1,4,5-trisfosfat reseptorer (IP3Rs) er store aktører i kalsium signalveien kontrollert av sine regulatorer protein kinase A (PKA), Ca2 +/calmodulin-avhengig protein kinase II (CaMKII), FK506 bindende proteiner (FKBPs), calsequestrin (CSQ), triadin og junctin1,2,3,4,5,6 . Unormalt menneskelig uttrykk og mutasjoner i disse proteinene kan føre til patologisk fysiologi som arytmier7 og onkogen spredning8,9.

FKBPs regulerer kalsiumutslippet fra endoplasmic reticular (ER) av RyRs. Denne prosessen er avgjørende for sammentrekningsmekanismen, og dermed ansvarlig for all mekanisk bevegelse generert av myosin-aktinkontraksjon gjennom kalsiumindusert kalsiumutslipp sammen med embryonale RyRs1,2. I musemodeller er mangelen på RyR2 og regulatoren FKBP12 /Calstabin alltid dødelig, enten under embryonal utvikling eller i tidlig barselperiode10,11,12. FKBP12/Calstabin knockout mus viser kritiske hjertefeil med uregelmessig eksitasjon- sammentrekningskobling (EC) og cerebral ødem under embryonal utvikling. Dette indikerer at FKBP12/Calstabin spiller en viktig rolle i reguleringen av RyR2 kanaluttrykk, noe som er viktig både for hjerte- og hjerneutvikling10.

RyR utførte kalsium gnister ble først oppdaget i zygote formasjonsfasen av befruktede Medaka egg13,14. Det er imidlertid gjort få undersøkelser om funksjonen til kalsiumsignalering i tidlig embryonal utvikling. I Drosophila melanogaster gir resultater hentet fra DmFKBP12 S107 mutanter sterke bevis som støtter betydningen av dette genet for larvutvikling og en sunn levetid, som tilskrives dens funksjon mot oksidativt stress15,16. Nylig identifiserte vi den dynamiske lokaliseringen av FKBP12 / Calstabin protein og messenger RNA under tidlig Drosophila melanogaster utvikling17. Ved hjelp av tilnærmingene beskrevet i denne metoden, var vi i stand til å spore uttrykket av FKBP12 / Calstabin i D. melanogaster under synkron blastoderm (0-2 h), cellulær blastoderm (2-3 h), tidlig gastrula (3-12 timer) og sen gastrula (12-24 h). I dette dokumentet presenterer vi de detaljerte protokollene for hver tilnærming i forrige studie, inkludert pre-embryo innebygging for klassisk parafinseksjon, pre-belegg lysbildebehandling for embryonale seksjoner, histokjemifarging og immunostaining, og mRNA in-situ hybridisering for identifisering av genuttrykk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tilberedning av druejuice agarplater

  1. Tilsett 5 g agar og 5 g sukrose til 150 ml destillert vann. Kok den med en mikrobølgeovn til agaren og sukrose er helt oppløst. Bland 50 ml 100% druejuice og løsningen sammen.
  2. Tilsett 1 ml 100% propionsyre for å gjøre den endelige konsentrasjonen til 0,5% propionsyre. Hell 25 ml av den tilberedte løsningen i hver plate. Etter at agaren har størknet, oppbevar mediet i 4 °C.

2. Belegg lysbilder

  1. Forbehandle lysbilder med vaskemiddel. Vask lysbildene 3 ganger med vann fra springen og en gang med destillert vann. Tørk deretter skliene i en 45 °C ovn i 2 timer.
  2. Senk skliene i ca. 450 ml kaliumdikromatsulfinsyreoppløsning (20 g kaliumdikromat, 40 ml destillert vann og 400 ml konsentrert svovelsyre) i 24 timer. Vask lysbildene 3 ganger med vann fra springen og en gang med destillert vann.
    1. Tørk skliene i en 45 °C ovn i to timer. Fordyp deg i 95% etanol i mer enn 2 timer.
  3. Tilsett 0,5 g kromkaliumsulfat og 5 g gelatin til 1 liter destillert vann. Løs opp i et vannbad på 60 °C før bruk. Krom alum gelatin kan lagres ved 4 °C i lange perioder.
  4. Slipp 10 μL av alumgelatinet i krom på lysbildet og dekk helt og jevnt hele overflaten av lysbildet med løsningen. Plasser gliden med gelatinsiden opp i en ovn ved 42 °C i 48 timer. De forberedte lysbildene kan oppbevares ved 4 °C for senere bruk.
    MERK: Dette er et kritisk trinn. Det komplette belegget er nødvendig. For fruktflue og embryoet virker denne glidebeleggtilnærmingen mer effektiv enn polylyinbelegg.

3. Drosophila embryo innebygging

  1. Drosophila embryo samling
    MERK: Vi samlet Drosophila embryoer i fire perioder på 0-2 timer (synytial blastoderm), 2-3 timer (cellulær blastoderm), 3-12 timer (tidlig gastrula) og 12-24 timer (sen gastrula)18. Andelen av de viktigste embryotypene i hver periode er vist i tabell 1.
    1. Legg 400-500 fluer i en plastoppsamlingsflaske og dekk flasken med druejuice agarplaten som inneholder gjærekstrakt. Drosophila embryoer legges på druejuice agar ved romtemperatur.
    2. Samle fire perioder med embryoer, forsiktig legge 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) til hver plate for å flyte embryoene. Overfør ca 200 embryoer til et 50 ml sentrifugerør og hold det på is i 2 minutter for å slå ned embryoene.
  2. Forhåndsinnbygging
    1. Overfør 200 Drosophila embryoer til et 1,5 ml sentrifugerør. Hold røret på is i 2 minutter for å slå ned embryoene, og kast deretter supernatanten med pipette forsiktig. Tilsett 1 ml 50% blekemiddel i røret og rist det forsiktig i 2 min.
      MERK: Blekemiddelet skal tilberedes friskt, og mengden blekemiddel kan variere avhengig av mengden embryoer som samles inn.
    2. Samle forsiktig embryoer ved å helle på filterpapir og vask dem 3 ganger med 1 ml PBS til enhver tid.
    3. Overfør embryoene med filterpapir til ca. 5 ml n-heptan.
    4. Overfør blandingen til et friskt 1,5 ml sentrifugerør. Tilsett 1 ml metanol og rist det forsiktig. Samle embryoer etter sedimentering.
    5. Fjern supernatant og vask embryoene i 1 ml PBS 3-5 ganger.
    6. Fest embryoene med 400 μL av Bouins løsning (71% mettet picrinsyre, 24% formalin, 5% eddiksyre) i 30 min. Vask de faste embryoene 3 ganger i 1 ml PBS i 5 min hver gang.
    7. For å aggregere embryoer, overfør prøvene til en gummipropp og fjern PBS.
    8. Forbered 1,2% agarose-PBS løsning og hold løsningen ved 60 °C. Tilsett 200 μL 1,2% agarose-PBS-løsning på embryoer for å fikse dem i en agarblokk.
    9. Ta blokken ut fra stopperen og lagre blokken i PBS.
      MERK: Under innbyggingsmetoden er pro-oppvarming avgjørende for å lykkes. Vi anbefaler på det sterkeste at sentrifugerørene og mikropipettespissene, som skal brukes i dette trinnet, skal være helt forvarmende før bruk.
  3. Innebygging av parafin
    1. Senk den forhåndsinnbygde agarblokken i 35% etanol, 50% etanol, 75% etanol og 85% etanol i 15 minutter hver. Deretter dyppes 2 ganger i 95% etanol og 100% etanol.
      MERKNADER: Omtrent 5-10x blokkvolum av hver etterfulgt av et gradert fikseringsmiddel i 15-30 minutter er nødvendig avhengig av antall embryoer i blokken.
    2. Senk embryoblokken i 100% etanol og xylen (1:1 ratio) løsning i 15 min.
    3. Overfør blokken til xylen i 1 min for å gjøre embryovevet gjennomsiktig.
    4. Senk blokken ned i xylen og parafin (1:1-forhold) i 30 min.
    5. Senk blokken ned i parafin I, paraffin II og parafin III i 2 timer hver gang.
    6. Fyll innebyggingsboksen med parafin på forhånd, og overfør deretter blokken forsiktig og horisontalt til bunnen av innebyggingsboksen. Etter at parafinen størkner naturlig, kan den størkne parafinblokken lagres ved 4 °C.
      MERKNADER: Den forhåndsbygde prøven kan brukes i kryoseksjon ved å følge følgende trinn. Etter at embryoene er forhåndsinlagt med agarose som beskrevet ovenfor, er prøvene ganske enkelt innebygd i OCT Compound. Etterpå kan kryoseksjon utføres i henhold til rutinemessig kryoseksjonsprotokoll. Deretter kan vanlige fargingsmetoder brukes på seksjonene.

4. Hematoksylin-eosin farging

  1. Forbered Drosophila embryo seksjoner. Plasser forberedte seksjoner i en ovn ved 60 °C i 15 minutter og senk deretter seksjonene i xylen 2 ganger i 10 minutter hver. Senk seksjonene én gang i 100 % etanol og xylen (1:1-forhold) i 2 minutter.
  2. Hydrater seksjonene i 100% etanol I, 100% etanol II, 95% etanol, 85% etanol, 75% etanol, 50% etanol og i destillert vann i 3 min.
  3. Flekk seksjonene med hematoksylinoppløsning i 2 min. Dypp lysbildene i 1% syrealkoholoppløsning (1 ml saltsyre, 100 ml 70% etanol) raskt og vask lysbildene i destillert vann.
  4. Dypp lysbildene i 50% etanol, 75% etanol, 85% etanol og 95% etanol sekvensielt.
  5. Flekk seksjonene med eosinoppløsning i 1 min.
  6. Dehydrer lysbildene i 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I, 100% etanol II og 100% etanol III i 1 min hver gang.
  7. Fjern lysbildene i 100 % xylen I, 100 % xylen II og 100 % xylen III i 5 minutter hver gang.
  8. Monter lysbildene med nøytral balsam i henhold til produsentens anvisninger.

5. Periodisk syre-sølv methenamin farging

  1. Deparaffiniser og hydrer parafinseksjoner av Drosophila embryo til destillert vann.
  2. Oksider seksjonene i 1% periodisk syre i 15 min ved romtemperatur.
  3. Skyll lysbildene i destillert vann 3 ganger i 1 min hver.
  4. Inkuber lysbildene i ca. 40 ml nyfiltrert sølvmethenamin arbeidsløsning (3% methenamin, 5% sølvnitrat, 5% natriumskjeder løsning) i 1 t og 20 minutter ved 60 °C. Skyll deretter lysbildene i destillert vann i 1 min.
  5. Tone lysbildene i 0,2% gullklorid i 2 min og skyll deretter lysbildene i destillert vann i 1 min.
  6. Plasser lysbildene i 3% natriumtiosulfat i 3 min og skyll deretter lysbildene i destillert vann i 1 min.
  7. Motvirke lysbildene i hematoksylin i 30 s. Vask skliene i rennende vann fra springen i 3-5 min.
  8. Dehydrer lysbildene i 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I og 100% etanol II i 5 minutter hver.
  9. Fjern lysbildene i 100 % xylen I, 100 % xylen II og 100 % xylen III i 5 minutter hver.
  10. Monter skliene i nøytral balsam i henhold til produsentens anvisninger.

6. Immunohistokjemi

  1. Deparaffiniser og rehydrer parafinseksjoner av Drosophila embryo til PBS etter standardprotokollen19.
  2. Behandle lysbilder med 0,3% H2O2 i metanol i 10 min ved romtemperatur og unngå lys.
  3. Forvarm riktig antigengjenvinningsbuffer til omtrent 100 °C i en beholder med lysbildene i grønnsaksdamperen. Beholderen skal også ha et lokk. Legg lysbildene i beholderen. Lukk lokket på dampkokeren.
    1. Hold beholderen i dampkokeren i 20 minutter fra dette punktet. Vær oppmerksom på at lokket på skyvebeholderen ikke skal strammes helt slik at vanndamp kan komme inn under dampprosessen.
  4. La lysbildene gå tilbake til romtemperatur før du forsiktig skyller den i PBS-T (PBS med Tween-20, pH 7.2) 3 ganger i 5 minutter hver, og skyll deretter lysbildene i PBS 3 ganger i 1 min hver.
  5. Blokker lysbildene med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 60 minutter ved romtemperatur.
  6. Inkuber lysbildene med primært antistoff (anti-FKBP12 ved 1:1000) over natten ved 4 °C eller ved romtemperatur i 4 timer.
  7. Vask lysbildene i PBS-T 4 ganger i 5 minutter hver.
  8. Påfør lysbildene med HRP-merket polymer konjugert med sekundære antistoffer (antikanin, 1:5,000) i 90 min ved romtemperatur. Gjør dette i mørket for å unngå fotobleking.
  9. Vask lysbildene i PBS-T 3 ganger i 5 minutter hver.
  10. Inkuber lysbildene med 5% 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) i 2-10 min til fargen på reaksjonsprodukter er passende under mikroskop.
  11. Motvirke lysbildene i hematoksylin i 30 s og vask lysbildene i destillert vann 2 ganger i 5 min hver.
  12. Dehydrer lysbildene i 50% etanol, 70% etanol, 90% etanol, 95% etanol og 100% etanol i 1 min hver.
  13. Fjern lysbildene i 100 % xylen I, 100 % xylen II og 100 % xylen III i 5 minutter hver.
  14. Monter skliene i nøytral balsam i henhold til produsentens anvisninger.

7. In-situ hybridisering

MERK: Drosophila embryo seksjoner ble tilberedt med 0,01% dietyl pyrokarbonat (DEPC) behandlet vann. Alt tilbehør som brukes til in situ hybridisering gjelder DEPC-behandling over natten på forhånd.

  1. Riboprobe forberedelse
    1. Lineariser mal-DNA ved å kutte på et begrensningsenzymsted nedstrøms fra den klonede innsatsen ved hjelp av et begrensningsenzym som skaper 5' overheng. Etter linearisering renser du mal-DNA via fenol/kloroformutvinning og påfølgende etanolutfelling. Bruk standardprotokoller.
    2. Tilsett 1 μg renset mal-DNA til et RNase-fritt sentrifugerør. Plasser sentrifugerøret på isen. Tilsett nok DEPC-behandlet vann til det totale volumet 13 μL.
      1. Tilsett deretter følgende reagenser i rekkefølge: 2 μL 10x NTP-merkingsblanding, 2 μL 10x transkripsjonsbuffer, 1 μL beskytter RNase-hemmer, 2 μL RNA Polymerase SP6 eller RNA Polymerase T7.
    3. Bland reaksjonen ved pipettering og sentrifugering om kort tid. Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
      MERK: Lengre inkubasjoner øker ikke utbyttet av merket RNA. Et kort spinn (~ 800 rpm) som påføres reaksjonsrøret er avgjørende før du fortsetter til neste trinn. Dette spinnet vil tillate alt innhold, som kan generere fra inkubasjonen, å komme til bunnen av røret.
    4. Tilsett 2 μL RNase-fri DNase I for å fjerne mal-DNA og inkubere i 15 min ved 37 °C.
    5. Tilsett 2 μL 200 mM EDTA (pH 8.0) for å stoppe reaksjonen.
      MERK: DIG-merkede RNA-sonder kan oppbevares ved -15 til -25 °C i etanol i ett år.
  2. Pre-hybridisering av Drosophila embryo seksjon
    1. Plasser deler av Drosophila embryo i en 42 °C ovn i 48 timer.
    2. Deparaffiniser lysbildene i 100% xylen i 10 minutter to ganger.
    3. Hydrater lysbildene sekvensielt nedsenket i 100% etanol, 95% etanol, 90% etanol, 70% etanol og 50% etanol i 5 min.
    4. Inkuber lysbildene i PBS i 5 min 3 ganger for å fjerne den fikseringsløsningen / Bouins løsning fra vevet.
    5. Vask skliene med 100 mmol/L glycin/PBS-oppløsning 2 ganger i 5 minutter hver.
    6. Vask lysbildene med PBS 2 ganger i 5 minutter hver.
    7. Inkuber lysbildene med 0,3% Triton X-100 i PBS i 15 min for å permeabilisere membranene.
    8. Vask lysbildene med PBS 3 ganger i 5 minutter hver.
    9. Inkuber lysbildene i 15 μg/ml RNase-fri proteinase K i 30 minutter ved 37 °C.
    10. Inkuber lysbildene med 4% paraformaldehyd i PBS i 3 min for å stoppe fordøyelsen.
    11. Vask lysbildene med PBS 2 ganger i 5 minutter hver.
    12. Inkuber lysbildene i 100 mM trietanolaminbuffer (pH 8,0) med 0,25 % (v/v) eddiksyre 2 ganger i 5 minutter hver.
    13. Tilsett DEPC-vann i glidefuktighetskammeret. Tilsett 20 μL pre-hybridiseringsløsning (som inneholder 100 μg/ml laksesperm-DNA) på lysbildene. Sett glidene inn i glidefuktighetskammeret. Inkuber lysbildene ved 42 °C i 4 timer.
      MERK: Det er nødvendig å sikre tettheten av lokket på den våte boksen, og at den våte boksen alltid holdes i en horisontal for å forhindre volatilisering og avvik fra vevet til pre-hybridiseringsløsningen og den fulgte hybridiseringsløsningen.
  3. Hybridisering av Drosophila embryo seksjon
    1. Fjern pre-hybridiseringsløsningen og vask lysbildene med 0,2x SSC (150 mM natriumklorid, 15 mM natriumsitrat, pH 7,0) 3 ganger i 5 minutter hver. Tørk av overflødig 0,2x SSC rundt vevsprøvene.
    2. Påfør 30 μL sondehybridiseringsløsning (som inneholder 2-6 ng digoksinmerket RNA-sonde ved å fortynne i pre-hybridiseringsløsning) med en pipette. Inkuber lysbildene i glidefuktighetskammeret ved 42 °C i ca. 20 timer.
      MERK: Pass på at det er tetthet på hetten som antydningen til den siste tonen. Ellers vil tørkingen forårsaket av lekkasjen av enten pre-hybridisering eller pre-hybridisering generere skitten bakgrunn, inkludert pseudo-positiv i lysbilder.
  4. Hybridisering
    1. Fjern hybridiseringsløsningen og vask lysbildene med 4x SSC-oppløsning 4 ganger i 15 minutter hver ved 37 °C.
    2. Vask skliene i 2x SSC-oppløsning med 20 μg/ml RNase A i 30 min ved 37 °C.
    3. Vask skliene i 1x SSC-oppløsning i 15 min ved 37 °C.
    4. Vask skliene i 0,5x SSC-oppløsning i 15 min ved 37 °C.
    5. Vask skliene i 0,1x SSC-oppløsning i 15 min ved 37 °C.
    6. Vask lysbildene med PBS 3 ganger i 5 minutter hver.
    7. Vask lysbildene i vaskebuffer (100 mM malesyre, 150 mM NaCl, 0,3% (v / v) Tween 20, pH 7,5) i 1 min.
    8. Inkuber lysbildene i 100 ml nylaget blokkeringsløsning (2% saueserum i malesyrebuffer uten Tween 20) i 30 minutter.
    9. Inkuber lysbildene i 20 ml antistoffoppløsning i 45 minutter.
      1. Sentrifuger antistoffet i 5 min ved 10.000 o/min i det opprinnelige hetteglasset før hver bruk, og rør den nødvendige mengden forsiktig fra overflaten. Fortynn anti-digoksigenin-AP 1:5000 (150 mU/ml) i blokkeringsløsning.
    10. Vask lysbildene i 100 ml vaskebuffer 2 ganger i 15 minutter hver for å fjerne ubundet antistoffkonjugat.
    11. Likevekt lysbildene i 20 ml deteksjonsbuffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) i 2-5 min.
    12. Inkuber lysbildene med 10 ml nylaget fargesubstratløsning i glidefuktighetskammeret. Reaksjonen begynner i løpet av få minutter og er fullført etter 16 timer. Ikke rist eller bland mens fargen utvikler seg.
    13. Vask lysbildene med 50 ml destillert vann i 5 min for å stoppe reaksjonen.
    14. Tørk prøven over natten i mørket.
    15. Dehydrer lysbildene i 70% etanol, 80% etanol, 90% etanol, 95% etanol, 100% etanol I og 100% etanol II i 3 minutter hver.
    16. Fjern lysbildene i 100 % xylen I, 100 % xylen II og 100 % xylen III i 20 minutter hver.
    17. Monter lysbildene med nøytral balsam.
    18. Dokumenter bilder og analyser med den omvendte mikroskopi- og produsentprogramvaren. Utfør distribusjonsanalyse ved hjelp av ImageJ i henhold til tettheten av positivt signal enten langs langsgående akse eller innenfor differensialsone av embryoer.
      MERK: Under inkubasjonen med den nylagde fargesubstratløsningen i trinn 7.4.12 kan reaksjonsfargen ses selv med et bart øye. Denne observasjonen om hvordan fargeutvikling kan inspiseres under stereoskop. Når reaksjonsfargen er rimelig og trinnet 7.4.13 kan utføres for å stoppe reaksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figurene beskriver protokoller som brukes for å overvinne utfordringen med å feste høy lipid og chitinholdige chorion Drosophila-embryoer (tabell 1) til glasssklieoverflaten for undersøkelse og eksperimentering. Ved hjelp av krom alum gelatin lysbildebeleggmetoden vist i figur 1, forbedret vi vedlegget av Drosophila-embryoer på overflaten av lysbilder mens embryoets pre-embedding-metode vist i figur 2 muliggjør effektiv inspeksjon av den dynamiske fordelingen av protein og RNA DmFKBP12 / Calstabin i alle fire tidlige utviklingsstadier (dvs. synytial blastoderm, cellulær blastoderm, tidlig og sen gastrula av Drosophila embryoer). Figur 3 viser proteinfordelingen av antistoff påvist FKBP12 / Calstabin ved synytial og cellulær blastoderm stadier. Fra disse histokjemiske resultatene kan man se at FKBP12-uttrykket er mindre polarisert i synytial blastoderm (Panel A til H), og deretter begynner å lokalisere seg i kjellermembranen under trophectoderm epitelet for å danne en gradient med mer uttrykk som finnes i fremre enn bakre poler (Paneler I til S). Etter hvert blir DmFKBP12/Calstabin-proteinet begrenset til visse arkitektoniske komponenter i det primitive embryonale vevet med mindre ekstracellulær fordeling enn det som ble observert i tidlige og sene gastrula embryonale stadier (figur 4). Interessant nok er den ovenfor beskrevne dynamiske proteinfordelingen ikke ledsaget av tilsvarende mRNA-nivåer av DmFKBP12 (figur 5), noe som indikerer proteinuttrykk som et resultat av en fortsatt ukjent molekylær mekanisme etter transkripsjon. Den beskrevne metoden for CAG lysbildebelegg og pre-embedding vil tillate oss å ytterligere sondere viktigheten av DmFKBP12 i kalsiumsignalering og avdekke denne fortsatt ukjente molekylære mekanismen mens vi kombinerer andre teknikker som mikroinjeksjon RNA-interferens19.

I denne studien utvikler vi en krom alum gelatin lysbildebelegg og pre-embedding metode for histologi, histokjemisk og immun-histologisk analyse av Drosophila embryoer på ulike utviklingsstadier. Ved hjelp av denne pre-embedding metoden, blir embryoene effektivt samlet inn for både kryo- og parafinsnitt som muliggjør analyse av langsgående tverrsnitt. Dette tillot oss å beskrive de utviklende uttrykksmønstrene for dette proteinet i avgjørende utviklingsstadier, og koblet uttrykket av proteinet til utvikling av viktige fysiologiske systemer som tarmen, hjernen og det tilkoblede nervesystemet. Ved å bruke disse metodene kunne vi undersøke de dynamiske distribusjonene av RyR som regulerer protein og mRNA FKBP12/Calstabin under utviklingen av Drosophila-embryoer i definitive stadier, inkludert synytial og cellulær blastoderm, og tidlig og sen gastrulation stadier. Våre data viste at FKBP12/Calstabin-proteinet og dets RNA kan oppdages veldig tidlig i synytial blastoderm. Etter hvert som embryoet utvikler seg, blir FKBP12 tettere fordelt i basalcellelaget under epitelet i blastodermet. FKBP12/Calstabin-proteinet styrker deretter sitt uttrykk dynamisk og skiller fordelingen i embryonalt muskelholdig vev, inkludert stomodaeum, stomodaeum og bakre midgut rudiment. Disse distribusjonsendringene fra begynnelsen av blastoderm til sen gastrulation stadier er også beskrevet i utvikling nevronale systemet, inkludert nevroblaster, ventral nerve, supraesophageal ganglion og hjerne. Mens disse dynamiske endringene i FKBP12 /Calstabin antyder sin betydning i utviklingen, reflekteres de ikke i mRNA-nivåer av proteinet, noe som antyder en ennå ukjent regulator av proteinuttrykk som gjenstår å identifisere.

Figure 1
Figur 1: Skisse av krom alum gelatin (CAG)belegg metode for parafin-seksjoner som brukes i immunologi og RNA in-situ hybridisering for å visualisere fordelingen av DmFKBP12 protein og mRNA i Drosophila embryoer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skisse av pre-embedding metode for uttrykk profil av FKBP12 og DmFKBP12 i utvikling Drosophila embryoer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Uttrykksprofil for DmFKBP12-protein i synytiale og cellulære blastodermer av Drosophila-embryoet . (A-D) H&E farging av synytial blastoderm. Kvantifisering av DmFKBP12-distribusjon i tidlig synytial blastoderm presenteres i D. (E-G) Paneler presenterer tidlig synytial blastoderm der kjerner er under divisjon. Kvantifisering av DmFKBP12-distribusjon i sensynkron blastoderm presenteres i H. (I-L) H&E farging av cellulær blastoderm. Kvalifiseringen av DmFKBP12 distribusjon i sen cellulær blastoderm er presentert i L. (M-S) Paneler viser distribusjonen av DmFKBP12 protein i cellulær blastoderm. O viser den større utsikten over M-N. (P-R) Paneler presenterer tidligere cellulær blastoderm vist i M-O. Kvantifiseringer av DmFKBP12 distribusjon i tidlig cellulær blastoderm presenteres i S. Skala bar for A, E, I, M og P er 60 μm, for B, C, F, J, K, N, Q og R er 40 μm, og for G, O er 20 μm. AP, fremre pol av egg; YK, eggeplomme; CN, spalting kjerne; PP, bakre stang av egg; BLD, blastoderm, kjerner og celle; BM, Kjellermembran. Data uttrykkes som middelverdi± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Data kvantifiseringen ble utført med ImageJ. For det første ble de brune produktene forblitt i bildet sammen med å fjerne alle andre farger. For det andre ble det brune bildet endret svart-hvitt og beregner tettheten for kvantifisering følgelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Uttrykksprofil for DmFKBP12-protein i tidlige og sene gastrulation stadier av Drosophila embryo. A, D og G viser H&E farging av Drosophila embryo på gastrulation scenen. B, C, E og F viser fordelingen av DmFKBP12 på tidlig gastrulation stadium. H, jeg og J-L viser distribusjonen av DmFKBP12 på slutten av gastrulation scenen. Kvantifiseringer av DmFKBP12 distribusjon i tidlig gastrulae presenteres i M. Skala bar for A, D, E og G er 80 μm, for B, C, F, H, I og J-L er 40 μm. PP, bakre pol av egg; NBL, nevroblaster; ST, stomodaeum; YK, eggeplomme; PMG, bakre midgut rudiment; BR, hjerne, supraesophageal ganglion; VNS, ventralt nervesystem; PV, proventriculus; MUS, muskel; MGC, midgut caecum; AMG, fremre midgut rudipighian; MMG, midtre midgut; TR, luftrør. Data uttrykkes som middelmje± SEM. ns, ingen signifikant; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Data kvantifiseringen ble utført med ImageJ 1.50d ved å forbli produktbrun og endre til svart-hvitt bilde, og følge ved tetthet beregning av svart-hvitt som beskrevet i forrige figur legenden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Lokalisering av DmFKBP12 mRNA under embryonal utvikling av Drosophila-embryoet . A viser in-situ lokalisering av DmFKBP12 mRNA på synytial blastoderm scenen da FKBP12 mRNA ble uttrykt i cytoplasma av embryoet. B og C viser in-situ lokalisering av DmFKBP12 mRNA på cellulær blastoderm scenen da FKBP12 mRNA ble uttrykt i de indre grensene for blastoderm celler. D og E viser in-situ lokalisering av FKBP12 mRNA på tidlig gastrulation stadium. I løpet av dette stadiet er det hovedsakelig lokalisert i den utviklende tarmen. F, G og H viser in-situ lokalisering av FKBP12 mRNA på sen gastrulation scenen, når mRNA uttrykkes i muskel og tarm. Jeg er positiv kontroll over DmFKBP12 mRNA. J er negativ kontroll av DmFKBP12 mRNA. Skala bar for A, C, E, G og jeg er 5 μm, for B, D, F, I og J er 10 μm. YK, eggeplomme; CN, spalting kjerne; BLD, blastoderm, kjerner og celler; CF, fremre skrå kløft, cephalic fure. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Embryonale stadier 0-2 timer (%) 2-3 timer (%) 3-12 timer (%) 12-24 timer (%)
Synytial blastoderm 90.8 0 0 0
Cellulær blastoderm 6.9 91.54 0 0
Tidlig gastrula 2.3 4.23 91.1 0
Sen gastrula 0 4.23 8.93 93.3

Tabell 1: Embryosamling av ulike stadier i utviklingen av Drosophila melanogaster

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RyRs og IP3Rs mediert kalsiumsignalering er en grunnleggende vei i mange fysiologiske og patologiske prosesser av både virveldyr og hvirvelløse dyr1,2,3,4. Hos mennesker fører punktmutasjoner, som CPVT-assosiert R4496C-mutasjon, i RyR2-genet til kalsiumlekkasje fra sarkoplasmisk retikulum av kardiomyocytt, noe som resulterer i hjertedysfunksjon. Disse mutasjonene presenterer som arytmi med høy risiko for plutselig hjertedød under fysisk aktivitet, og er reproduserbar i musemodeller konstruert for å bære denne mutasjonen. Under treningsforhold opplevde musene som bærer denne kalsiumlekkasjemutasjonen hjerte plutselig død som ikke ble demonstrert av wildtype-tellerdelene18,20,21,22. Overekspression av FKBP12, en RyRs regulator, i hjertet, korresponderte med høye forekomster av kaliumkanaler assosiert hjertedød i musemodeller22,23, et funn som korresponderte med fenotypen av FKBP12 knockout mus10,11. Som pattedyr RyRs inkludert RyR1, RyR 2 og RyR3 og deres regulator FKBPs har blitt godt studert i over tre tiår, de fleste prosesser involvert i kardiopatologi, skjelett muskel dysfunksjon og hjernefunksjon prestasjon etter tidlig utvikling pluss onkogenese er fokus for forskning24,25.

I motsetning til i vertebrater, som har tre isoformer av RyR, har Drosophila fluer bare en RyR1,2,3,5. Nylig demonstrerte vi den kritiske funksjonen til Drosophila RyR (DmRyR) i de tidlige stadiene av Drosophila embryonal utvikling. Vi avdekket DmRyR-uttrykk både på translasjons- og transkripsjonsnivå i Drosophila-embryoer under tidlig utvikling: det synytiale blastoderm-stadiet, blastoderm-scenen og de tidlige gastrulastadiene. I alle fire stadiene ble DmFKBP12 mRNA fordelt jevnt over hele embryoet og forble på samme nivå, mens proteinuttrykket til genet var svært dynamisk med uttrykksprofiler polarisert fremre og deretter fordelt i visse cellelag19. De metodologiske protokollene vi benyttet i denne publikasjonen var avgjørende for evnen til å oppnå et høyt volum av representative resultater.

Paraffinseksjon er en grunnleggende og praktisk teknikk for histologisk påvisning av proteinuttrykk for kvantitativ analyse. Paraffinseksjoner er et grunnleggende verktøy for å studere proteinuttrykk i det voksne insektet. Imidlertid har disse teknikkene vært vanskelige å gjenskape i å utvikle insekter på grunn av deres lipidrike embryo og chitinrike korion, noe som gjør innebygging, bevaring og glidemontering vanskelig. Lipidene som finnes i embryoer forstyrrer kreftene som tillater festing av embryonale seksjoner på overflaten av lysbildet. Mens chitin funnet i koret presenterer fysiske barrierer som beskytter embryoet mot kjemiske og mekaniske forstyrrelser, begrenser det også vedlegg av embryonale prøver til glassskred. Selv om disse egenskapene sikrer en høyere overlevelsesrate for insektslarver, hindrer det i stor grad evnen til å studere in-situ protein og mRNA-uttrykk . Dette problemet har vært problematisk på mange måter. Bruk av overflatevaskemiddel som Tween-20 løsner ofte Drosophila-embryoer og reduserer antall embryoer som er tilgjengelige for studier. Denne teknikken krever inkubasjon i 20 timer for å avduke mRNA for in-situ hybridisering, men løsner også prøvene fra lysbildene nesten helt. Teknikken her for belegg glass lysbilder med krom alum gelatin (CAG) før du utfører immunhiistokjemi og anti-sans spesifikk anerkjennelse for mRNA løser disse tekniske barrierer ved å forbedre vedlegget mellom embryoet og glass lysbilde.

I tillegg til CAG forbedret vedlegg, den beskrevne Drosophila embryo pre-embedding teknikker tillate høsting av et stort antall nettopp datert Drosophila embryoer. Dette tillot oss å rapportere det dynamiske uttrykket til DmFKBP12 / Calstabin på ulike stadier av tidlig embryonal utvikling. Det tidligste stadiet vi var i stand til å studere ved hjelp av denne teknikken er det synytiale blastodermstadiet, som viste mindre differensiert fordeling og et generelt lavere uttrykksnivå. Ved å studere embryoer ved cellulær blastoderm og gastrula stadier, fant vi at det generelle nivået av DmFKBP12 / Calstabin økte etter hvert som embryoer utvikler seg og begynner å lokalisere, først til den fremre meningsmålingen, deretter til visse lag i trelagsfasen. Funnene tyder på at FKBP12 involvert i kalsiumsignalering spiller en kritisk rolle i tidlig utvikling og differensiering som spiller en viktig rolle i Drosophila melanogaster utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), Foreign Distinguished Scientist Program fra National Department of Education (#MS2014SXSF038), National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001 /201701005/GERP-17-45), og XZ støttes av Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), Naturvitenskapelig grunnforskningsprogram Ungdomsprosjekt ved Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-20°C Refrigerator Meiling Biology &Medical DW-YL270 Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator Thermo Forma 90 Series Used for regent storage
Agar Sigma-Aldrich WXBB6360V Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Roche 11093274910 For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator Shanghai Bluepard Instruments LRH-250 In-situ Hybridization
Bouin's solution Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69945460 Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge Eppendorf 540BH07808 In-situ Hybridization
Centrifuge tube Denville C-2170 Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10001018 Coating Slides
Constant temperature water bath Jintan Henfeng Instruments KW-1000DC Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System Dako K5007 In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC Sigma-Aldrich D5758 In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit Roche 11093274910 RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster Bloomington Stock Center BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven Tianjin Taiste Instruments 101-0AB For coating slides and paraffin embedding
Eosin Sigma-Aldrich 230251 Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 100092680 Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10010328 Coating Slides
Gold chloride Sigma-Aldrich 379948 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136 Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit Roche 11732668001 For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box Ningbo Jiangnan Instruments HWS For fly maintenance
LE Agarose HyAgarose 14190108029 Pre-embedding
Methanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10014108 Drosophila Embryo Collection
Microscope ZEISS Observer.A1 Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides MeVid Labware Manufacturing P105-2001 Coating Slides
Neutral Gum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10004160 Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 40026768 Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer Huahai science instrument HH-2508III In-situ Hybridization
Paraffin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69019461 Paraffin Embedding
pH/mV Meter Sartorius PB-10 For determing the pH value of a solution
Silver nitrate Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10018461 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter Thermo AFXI-0501-P In-situ Hybridization
Xylene Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10023418 Paraffin Embedding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 183 Drosophila embryo parafinseksjon beleggsklie innbygging in-situ hybridisering DmFKBP12/Calstabin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He,… More

Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He, B., Xiao, L., Yue, H., Wang, S., Sun, Y., Wu, Y., Wang, L., Ghartey-Kwansah, G., Jones, O. D., Bryant, J. L., Xu, M., Ma, J., Xu, X. A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (183), e61776, doi:10.3791/61776 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter