Summary
Hier beschrijven we een protocol voor detectie en lokalisatie van Drosophila embryo-eiwit en RNA van verzameling tot pre-embedding en embedding, immunostaining en mRNA in situ hybridisatie.
Abstract
Calcium geïnduceerde calciumafgiftesignalering (CICR) speelt een cruciale rol in veel biologische processen. Elke cellulaire activiteit van celproliferatie en apoptose, ontwikkeling en veroudering, tot neuronale synaptische plasticiteit en regeneratie zijn in verband gebracht met Ryanodine-receptoren (RyRs). Ondanks het belang van calciumsignalering is het exacte mechanisme van zijn functie in vroege ontwikkeling onduidelijk. Als organisme met een korte draagtijd zijn de embryo's van Drosophila melanogaster de belangrijkste proefpersonen voor het onderzoeken van de distributie en lokalisatie van CICR-geassocieerde eiwitten en hun regulatoren tijdens de ontwikkeling. Vanwege hun lipiderijke embryo's en chitinerijke chorion wordt hun nut echter beperkt door de moeilijkheid om embryo's op glazen oppervlakken te monteren. In dit werk introduceren we een praktisch protocol dat de hechting van drosophila-embryo op dia's aanzienlijk verbetert en gedetailleerde methoden voor succesvolle histochemie, immunohistochemie en in-situ hybridisatie. De chroomalum gelatine slide-coating methode en embryo pre-embedding methode verhoogt dramatisch de opbrengst bij het bestuderen van Drosophila embryo-eiwit en RNA-expressie. Om deze aanpak aan te tonen, bestudeerden we DmFKBP12/Calstabin, een bekende regulator van RyR tijdens de vroege embryonale ontwikkeling van Drosophila melanogaster. We identificeerden DmFKBP12 al in de syncytiele blastodermfase en rapporteerden het dynamische expressiepatroon van DmFKBP12 tijdens de ontwikkeling: aanvankelijk als een gelijkmatig verdeeld eiwit in het syncytiele blastoderm, vervolgens preliminaal lokaliserend naar de kelderlaag van de cortex tijdens cellulair blastoderm, voordat het zich verspreidde in de primitieve neuronale en spijsverteringsarchitectuur tijdens de drie-gem laagfase in vroege gastrulatie. Deze verdeling kan de cruciale rol verklaren die RyR speelt in de vitale orgaansystemen die afkomstig zijn van deze lagen: het subo-oesofageale en supra-oesofageale ganglion, ventraal zenuwstelsel en het bewegingsapparaat.
Introduction
Calcium geïnduceerde calciumafgiftesignalering (CICR) speelt een cruciale rol in veel biologische processen, zoals skelet- / gladde spieren en cardiale vasculaire functie, celproliferatie en apoptose, ontwikkeling, veroudering, neuronale synaptische plasticiteit en regeneratie1,2,3,4,5,6 . Ryanodinereceptoren (RyRs) en inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptoren (IP3R's) zijn belangrijke spelers in de calciumsignaleringsroute die wordt gecontroleerd door hun regulatoren eiwitkinase A (PKA), Ca2 + / calmodulin-afhankelijk eiwitkinase II (CaMKII), FK506-bindende eiwitten (FKBPs), calsequestrin (CSQ), triatidine en junctin1, 2,3,4,5,6 . Abnormale menselijke expressie en mutaties in deze eiwitten kunnen leiden tot pathologische fysiologie zoals aritmieën7 en oncogene proliferatie8,9.
FKBPs reguleren de calciumafgifte uit de endoplasmatische reticulaire (ER) door RyRs. Dit proces is essentieel voor het mechanisme van contractie en dus verantwoordelijk voor alle mechanische bewegingen die worden gegenereerd door myosine-actinecontractie door calcium-geïnduceerde calciumafgifte samen met embryonale RyRs1,2. In muismodellen is het ontbreken van RyR2 en zijn regulator FKBP12 /Calstabin steevast dodelijk, hetzij tijdens de embryonale ontwikkeling of in de vroege postnatale periode10,11,12. FKBP12/Calstabin knock-out muizen vertonen kritieke hartafwijkingen met onregelmatige excitatie-contractiekoppeling (EC) en hersenoedeem tijdens de embryonale ontwikkeling. Dit geeft aan dat FKBP12/Calstabin een essentiële rol speelt bij het reguleren van RyR2-kanaalexpressie, wat belangrijk is voor zowel de cardiale als de cerebrale ontwikkeling10.
RyR uitgevoerde calciumvonken werden aanvankelijk ontdekt in de zygote-vormingsfase van bevruchte Medaka-eieren13,14. Er zijn echter weinig onderzoeken uitgevoerd naar de functie van calciumsignalering in de vroege embryonale ontwikkeling. In Drosophila melanogaster leveren de resultaten verkregen van DmFKBP12 S107-mutanten sterk bewijs ter ondersteuning van het belang van dit gen voor de ontwikkeling van larven en een gezonde levensduur, die wordt toegeschreven aan zijn functie tegen oxidatieve stress15,16. Onlangs identificeerden we de dynamische lokalisatie van FKBP12 / Calstabin-eiwit en boodschapper-RNA tijdens de vroege ontwikkeling van Drosophila melanogaster17. Met behulp van de benaderingen die in deze methodologie worden beschreven, konden we de expressie van FKBP12 / Calstabin in D. melanogaster volgen tijdens het syncytiele blastoderm (0-2 uur), cellulair blastoderm (2-3 uur), vroege gastrula (3-12 uur) en late gastrula (12-24 uur). In dit artikel presenteren we de gedetailleerde protocollen van elke benadering in de vorige studie, inclusief pre-embryo-inbedding voor klassieke paraffinesectie, pre-coating diabehandeling voor embryonale secties, histo-chemie kleuring en immunostaining, en mRNA in-situ hybridisatie voor identificatie van genexpressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van druivensap agar borden
- Voeg 5 g agar en 5 g sucrose toe aan 150 ml gedestilleerd water. Kook het in de magnetron tot de agar en sucrose volledig zijn opgelost. Meng 50 ml 100% druivensap en de oplossing door elkaar.
- Voeg 1 ml 100% propionzuur toe om de uiteindelijke concentratie tot 0,5% propionzuur te maken. Giet 25 ml van de bereide oplossing in elke plaat. Nadat de agar is gestold, bewaart u de media in 4 °C.
2. Coating dia's
- Voorbehandeling glijdt met reinigingsmiddel. Was de glaasjes 3 keer met kraanwater en één keer met gedestilleerd water. Droog vervolgens de glaasjes 2 uur in een oven van 45 °C.
- Dompel de dia's gedurende 24 uur onder in ongeveer 450 ml kaliumdichromaat zwavelzuuroplossing (20 g kaliumdichromaat, 40 ml gedestilleerd water en 400 ml geconcentreerd zwavelzuur). Was de glaasjes 3 keer met kraanwater en één keer met gedestilleerd water.
- Droog de glaasjes twee uur in een oven van 45 °C. Dompel meer dan 2 uur onder in 95% ethanol.
- Voeg 0,5 g chroomkaliumsulfaat en 5 g gelatine toe aan 1 l gedestilleerd water. Los voor gebruik op in een waterbad van 60 °C. De chroomalumgelatine kan langdurig bij 4 °C worden bewaard.
- Laat 10 μL van de chroomalumgelatine op de dia vallen en bedek het volledige oppervlak van de dia volledig en gelijkmatig met de oplossing. Plaats de dia met de gelatinezijde naar boven in een oven bij 42 °C gedurende 48 uur. De voorbereide platen kunnen bij 4 °C worden bewaard voor later gebruik.
OPMERKING: Dit is een cruciale stap. De volledige coating is noodzakelijk. Voor fruitvlieg en zijn embryo lijkt deze diacoatingbenadering efficiënter dan poly-lysinecoating.
3. Inbedding van drosophila-embryo's
-
Drosophila embryo collectie
OPMERKING: We verzamelden Drosophila-embryo's in vier perioden van 0-2 uur (syncytieel blastoderm), 2-3 uur (cellulair blastoderm), 3-12 uur (vroege gastrula) en 12-24 uur (late gastrula)18. Het aandeel van de belangrijkste embryotypen in elke periode is weergegeven in tabel 1.- Doe 400-500 vliegen in een plastic opvangfles en dek de fles af met de druivensap agarplaat met gistextract. Drosophila-embryo's worden bij kamertemperatuur op de druivensap-agar gelegd.
- Verzamel vier perioden embryo's en voeg voorzichtig 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) toe aan elke plaat om de embryo's te laten drijven. Breng ongeveer 200 embryo's over in een centrifugebuis van 50 ml en houd deze gedurende 2 minuten op ijs om de embryo's te laten bezinken.
- Vooraf insluiten
- Breng 200 Drosophila-embryo's over in een centrifugebuis van 1,5 ml. Houd de buis 2 minuten op ijs om de embryo's te laten bezinken en gooi het supernatant voorzichtig met pipet weg. Voeg 1 ml 50% bleekmiddel toe in de tube en schud het voorzichtig gedurende 2 minuten.
OPMERKING: Het bleekmiddel moet vers worden bereid en de hoeveelheid bleekmiddel kan variëren afhankelijk van de hoeveelheid embryo's die worden verzameld. - Verzamel embryo's voorzichtig door ze op filterpapier te gieten en was ze 3 keer met 1 ml PBS per keer.
- Breng de embryo's met filterpapier terug tot ongeveer 5 ml n-heptaan.
- Breng het mengsel over in een verse centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 1 ml methanol toe en schud het voorzichtig. Verzamel embryo's na sedimentatie.
- Verwijder supernatant en was de embryo's 3-5 keer in 1 ml PBS.
- Fixeer de embryo's met 400 μL Bouin's oplossing (71% verzadigd picrinezuur, 24% formaline, 5% azijnzuur) gedurende 30 min. Was de vaste embryo's 3 keer in 1 ml PBS gedurende 5 minuten elke keer.
- Om embryo's te aggregeren, brengt u de monsters over in een rubberen stop en verwijdert u de PBS.
- Bereid 1,2% agarose-PBS-oplossing en bewaar de oplossing bij 60 °C. Voeg 200 μL 1,2% agarose-PBS-oplossing toe aan embryo's om ze in een agarblok te fixeren.
- Haal het blok uit de stop en bewaar het blok in PBS.
OPMERKING: Tijdens de pre-embedding-benadering is pro-warming van cruciaal belang voor succes. We raden ten zeerste aan dat de centrifugebuizen en micropipette-tips, die in deze stap worden gebruikt, volledig voorverwarmd zijn voordat ze worden gebruikt.
- Breng 200 Drosophila-embryo's over in een centrifugebuis van 1,5 ml. Houd de buis 2 minuten op ijs om de embryo's te laten bezinken en gooi het supernatant voorzichtig met pipet weg. Voeg 1 ml 50% bleekmiddel toe in de tube en schud het voorzichtig gedurende 2 minuten.
- Paraffine inbedding
- Dompel het vooraf ingebedde agarblok gedurende 15 minuten onder in 35% ethanol, 50% ethanol, 75% ethanol en 85% ethanol. Dompel vervolgens 2 keer in 95% ethanol en 100% ethanol.
OPMERKINGEN: Ongeveer 5-10x blokvolume van elk gevolgd door een gegradeerd fixatief gedurende 15-30 minuten is nodig, afhankelijk van het aantal embryo's in het blok. - Dompel het embryoblok gedurende 15 minuten onder in 100% ethanol en xyleen (1:1 verhouding) oplossing.
- Breng het blok gedurende 1 minuut over op xyleen om het embryoweefsel transparant te maken.
- Dompel het blok onder in xyleen en paraffine (1:1 verhouding) gedurende 30 minuten.
- Dompel het blok onder in paraffine I, paraffine II en paraffine III gedurende 2 uur elke keer.
- Vul het insluitvak vooraf met paraffine en breng het blok vervolgens voorzichtig en horizontaal over naar de onderkant van het insluitvak. Nadat de paraffine op natuurlijke wijze stolt, kan het gestolde paraffineblok bij 4 °C worden bewaard.
OPMERKINGEN: Het vooraf ingesloten monster kan worden gebruikt in cryosectie door de volgende stappen te volgen. Nadat de embryo's vooraf zijn ingebed met agarose zoals hierboven beschreven, worden de monsters eenvoudigweg ingebed in OCT Compound. Daarna kan cryosectie worden uitgevoerd volgens het routinematige cryosectieprotocol. Vervolgens kunnen regelmatige kleuringsbenaderingen op de secties worden gebruikt.
- Dompel het vooraf ingebedde agarblok gedurende 15 minuten onder in 35% ethanol, 50% ethanol, 75% ethanol en 85% ethanol. Dompel vervolgens 2 keer in 95% ethanol en 100% ethanol.
4. Hematoxyline-eosine kleuring
- Bereid Drosophila embryo secties voor. Plaats bereide secties gedurende 15 minuten in een oven bij 60 °C en dompel de secties vervolgens 2 keer gedurende 10 minuten onder in xyleen. Dompel de secties eenmaal in 100% ethanol en xyleen (1:1 verhouding) gedurende 2 minuten onder.
- Hydrateer de secties in 100% ethanol I, 100% ethanol II, 95% ethanol, 85% ethanol, 75% ethanol, 50% ethanol en in gedestilleerd water gedurende 3 minuten.
- Kleur de secties met hematoxyline-oplossing gedurende 2 minuten. Dompel de glaasjes snel in 1% zure alcoholoplossing (1 ml zoutzuur, 100 ml 70% ethanol) en was de glaasjes in gedestilleerd water.
- Doop de glaasjes achtereenvolgens in 50% ethanol, 75% ethanol, 85% ethanol en 95% ethanol.
- Kleur de secties met eosine-oplossing gedurende 1 min.
- Droog de glaasjes uit in 95% ethanol I, 95% ethanol II, 95% ethanol III, 100% ethanol I, 100% ethanol II en 100% ethanol III gedurende telkens 1 minuut.
- Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende 5 minuten elke keer.
- Monteer de glijbanen met neutrale balsem volgens de instructies van de fabrikant.
5. Periodieke zuur-zilver methenamine kleuring
- Deparaffiniseren en hydrateren van paraffinesecties van Drosophila embryo tot gedestilleerd water.
- Oxideer de secties in 1% periodiek zuur gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel de glaasjes 3 keer in gedestilleerd water gedurende 1 min.
- Incubeer de glaasjes in ongeveer 40 ml vers gefilterde zilvermethenamine werkoplossing (3% methenamine, 5% zilvernitraat, 5% natriumboraatoplossing) gedurende 1 uur en 20 minuten bij 60 °C. Spoel de glaasjes vervolgens gedurende 1 min af in gedestilleerd water.
- Toon de glaasjes gedurende 2 minuten in 0,2% goudchloride en spoel de glaasjes vervolgens gedurende 1 min af in gedestilleerd water.
- Plaats de glaasjes gedurende 3 min in 3% natriumthiosulfaat en spoel de glaasjes vervolgens gedurende 1 min af in gedestilleerd water.
- Counterstain de dia's in hematoxyline voor 30 s. Was de glijbanen gedurende 3-5 minuten in stromend kraanwater.
- Droog de glaasjes uit in 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol I, 95% ethanol II, 95% ethanol III, 100% ethanol I en 100% ethanol II gedurende elk 5 minuten.
- Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende elk 5 minuten.
- Monteer de glaasjes in neutrale balsem volgens de instructies van de fabrikant.
6. Immunohistochemie
- Paraffinesecties van Drosophila-embryo deparaffiniseren en rehydrateren tot PBS volgens het standaardprotocol19.
- Behandel dia's met 0,3% H2O2 in methanol gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en vermijd licht.
- Verwarm de juiste antigeenophaalbuffer tot ongeveer 100 °C in een container met de glaasjes in de groentestomer. De container moet ook een deksel hebben. Doe de dia's in de container. Sluit het deksel van de stomer.
- Houd de container vanaf dit punt 20 minuten in de stomer. Merk op dat het deksel van de schuifcontainer niet volledig moet worden aangedraaid, zodat waterdamp tijdens het stomen kan binnendringen.
- Laat de dia's terugkeren naar kamertemperatuur voordat u deze voorzichtig spoelt in PBS-T (PBS met Tween-20, pH 7,2) 3 keer gedurende 5 minuten elk, en spoel de dia's vervolgens 3 keer in PBS gedurende 1 minuut elk.
- Blokkeer de dia's met 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de dia's met primair antilichaam (anti-FKBP12 om 1:1000) 's nachts bij 4 °C of bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
- Was de dia's in PBS-T 4 keer gedurende 5 minuten elk.
- Breng de dia's met HRP-gelabeld polymeer geconjugeerd met secundaire antilichamen (anti-Konijn, 1:5.000) gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur aan. Doe dit in het donker om te voorkomen dat foto's bleken.
- Was de dia's in PBS-T 3 keer gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer de dia's met 5% 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) gedurende 2-10 minuten totdat de kleur van reactieproducten geschikt is onder microscoop.
- Houd de glaasjes 30 s in hematoxyline en was de glaasjes 2 keer gedurende 5 minuten in gedestilleerd water.
- Droog de glaasjes uit in 50% ethanol, 70% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol gedurende elk 1 minuut.
- Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende elk 5 minuten.
- Monteer de glaasjes in neutrale balsem volgens de instructies van de fabrikant.
7. In-situ hybridisatie
OPMERKING: Drosophila embryo secties werden bereid met 0,01% diethyl pyrocarbonaat (DEPC) behandeld water. Alle accessoires die worden gebruikt voor in situ hybridisatie passen DEPC 's nachts behandeling vooraf toe.
- Riboprobe voorbereiding
- Lineariseer sjabloon-DNA door te knippen op een restrictie-enzymplaats stroomafwaarts van de gekloonde insert met behulp van een restrictie-enzym dat 5 'overhangen creëert. Na linearisatie zuivert u het sjabloon-DNA via fenol / chloroform-extractie en daaropvolgende ethanolprecipitatie. Gebruik standaardprotocollen.
- Voeg 1 μg gezuiverd sjabloon-DNA toe aan een RNase-vrije centrifugebuis. Plaats de centrifugebuis op ijs. Voeg voldoende DEPC-behandeld water toe aan het totale volume 13 μL.
- Voeg vervolgens de volgende reagentia toe in volgorde: 2 μL 10x NTP-etiketteringsmengsel, 2 μL 10x transcriptiebuffer, 1 μL protector RNase-remmer, 2 μL RNA Polymerase SP6 of RNA Polymerase T7.
- Meng de reactie door te pipetteren en centrifugeer kort. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Langere incubaties verhogen de opbrengst van gelabeld RNA niet. Een korte spin (~ 800 rpm) toegepast op de reactiebuis is van cruciaal belang voordat u doorgaat naar de volgende stap. Met deze spin kan alle inhoud, die uit de incubatie kan ontstaan, naar de bodem van de buis komen. - Voeg 2 μL RNase-vrije DNase I toe om sjabloon-DNA te verwijderen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Voeg 2 μL van 200 mM EDTA (pH 8,0) toe om de reactie te stoppen.
OPMERKING: DIG-gelabelde RNA-sondes kunnen gedurende één jaar bij -15 tot -25 °C in ethanol worden bewaard.
- Pre-hybridisatie van drosophila embryo sectie
- Plaats delen van het Drosophila-embryo gedurende 48 uur in een oven van 42 °C.
- Deparaffiniseer de glaasjes tweemaal in 100% xyleen gedurende 10 minuten.
- Hydrateer de glaasjes door ze gedurende 5 minuten achtereenvolgens onder te dompelen in 100% ethanol, 95% ethanol, 90% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol.
- Incubeer de dia's in PBS gedurende 5 min 3 keer om de fixatieve oplossing / Bouin's oplossing uit het weefsel te verwijderen.
- Was de glaasjes met 100 mmol/L glycine/PBS-oplossing 2 keer gedurende 5 minuten elk.
- Was de dia's met PBS 2 keer gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer de dia's met 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten om de membranen te permeabiliseren.
- Was de dia's met PBS 3 keer gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer de glaasjes in 15 μg/ml RNase-vrij proteïnase K gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Incubeer de glaasjes met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 3 minuten om de spijsvertering te stoppen.
- Was de dia's met PBS 2 keer gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer de dia's in 100 mM triethanolamine buffer (pH 8,0) met 0,25% (v/v) azijnzuuranhydride 2 keer gedurende 5 minuten elk.
- Voeg DEPC-water toe aan de vochtkamer van de dia. Voeg 20 μL pre-hybridisatieoplossing (met 100 μg/ml zalmsperma-DNA) toe aan de dia's. Plaats de dia's in de schuifvochtkamer. Incubeer de glijbanen bij 42 °C gedurende 4 uur.
OPMERKING: Het is noodzakelijk om de dichtheid van het deksel van de natte doos te waarborgen en dat de natte doos altijd horizontaal wordt gehouden om vervluchtiging en afwijking van het weefsel van de pre-hybridisatieoplossing en de gevolgde hybridisatieoplossing te voorkomen.
- Hybridisatie van drosophila embryo sectie
- Verwijder de pre-hybridisatieoplossing en was de dia's met 0,2x SSC (150 mM natriumchloride, 15 mM natriumcitraat, pH 7,0) 3 keer gedurende 5 minuten elk. Veeg overtollige 0,2x SSC rond de weefselmonsters af.
- Breng 30 μL sondehybridisatieoplossing (met 2-6 ng digoxine-gelabelde RNA-sonde door verdunning in pre-hybridisatieoplossing) aan met een pipet. Incubeer de glaasjes in de schuifvochtkamer bij 42 °C gedurende ongeveer 20 uur.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de dop strak is als de suggestie van de laatste noot. Anders zal de opdroging veroorzaakt door het lekken van pre-hybridisatie of pre-hybridisatie vuile achtergrond genereren, inclusief pseudo-positieve in dia's.
- Kruising
- Verwijder de hybridisatieoplossing en was de glaasjes met 4x SSC-oplossing 4 keer gedurende 15 minuten elk bij 37 °C.
- Was de glaasjes in 2x SSC-oplossing met 20 μg/ml RNase A gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Was de glaasjes gedurende 15 min in 1x SSC-oplossing op 37 °C.
- Was de glaasjes gedurende 15 minuten in 0,5x SSC-oplossing op 37 °C.
- Was de glaasjes gedurende 15 minuten in 0,1x SSC-oplossing op 37 °C.
- Was de dia's met PBS 3 keer gedurende 5 minuten elk.
- Was de glaasjes in wasbuffer (100 mM maleïnezuur, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) gedurende 1 min.
- Incubeer de glaasjes in 100 ml vers bereide blokkerende oplossing (2% schapenserum in maleïnezuurbuffer zonder Tween 20) gedurende 30 minuten.
- Incubeer de dia's in 20 ml antilichaamoplossing gedurende 45 minuten.
- Centrifugeer het antilichaam gedurende 5 minuten bij 10.000 tpm in de oorspronkelijke injectieflacon vóór elk gebruik en pipetteer de benodigde hoeveelheid zorgvuldig van het oppervlak. Verdun anti-digoxigenine-AP 1:5000 (150 mU/ml) in blokkerende oplossing.
- Was de glaasjes in 100 ml wasbuffer 2 keer gedurende 15 minuten elk om ongebonden antilichaamconjugaat te verwijderen.
- Breng de dia's in evenwicht in 20 ml detectiebuffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) gedurende 2-5 minuten.
- Incubeer de dia's met 10 ml vers bereide kleursubstraatoplossing in de diavochtkamer. De reactie begint binnen enkele minuten en is na 16 uur voltooid. Niet schudden of mengen terwijl de kleur zich ontwikkelt.
- Was de glaasjes gedurende 5 minuten met 50 ml gedestilleerd water om de reactie te stoppen.
- Droog het monster een nacht in het donker.
- Droog de glaasjes uit in 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol I en 100% ethanol II gedurende elk 3 minuten.
- Verwijder de dia's in 100% xyleen I, 100% xyleen II en 100% xyleen III gedurende elk 20 minuten.
- Monteer de glijbanen met neutrale balsem.
- Documenteer afbeeldingen en analyseer met de omgekeerde microscopie en fabrikantsoftware. Voer distributieanalyse uit met ImageJ op basis van de dichtheid van het positieve signaal langs de lengteas of binnen de differentiële zone van embryo's.
OPMERKING: Tijdens de incubatie met de vers bereide kleursubstraatoplossing in stap 7.4.12 kan de reactiekleur zelfs met een met het blote oog worden gezien. Deze observatie over hoe kleurontwikkeling kan worden geïnspecteerd onder stereoscoop. Zodra de reactiekleur redelijk is en de stap 7.4.13 kan worden uitgevoerd om de reactie te stoppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De cijfers beschrijven protocollen die worden gebruikt om de uitdaging van het bevestigen van hoge lipide- en chitinebevattende chorion Drosophila-embryo's (tabel 1) aan het glasplaatoppervlak te overwinnen voor onderzoek en experimenten. Met behulp van de chroomalum gelatine slide-coating methode getoond in figuur 1, hebben we de hechting van Drosophila embryo's op het oppervlak van dia's verbeterd, terwijl de embryo pre-embedding methode getoond in figuur 2 zorgt voor een efficiënte inspectie van de dynamische verdeling van eiwit en RNA DmFKBP12 / Calstabin in alle vier de vroege ontwikkelingsstadia (d.w.z. syncytieel blastoderm, cellulair blastoderm, vroege en late gastrula van de Drosophila embryo's). Figuur 3 toont de eiwitverdeling van antilichaam gedetecteerd fKBP12 / Calstabin in de syncytiele en cellulaire blastodermstadia. Uit deze histochemische resultaten kan worden afgeleid dat FKBP12-expressie minder gepolariseerd is in syncytieel blastoderm (panelen A tot H) en vervolgens begint te lokaliseren in het keldermembraan onder het trophectoderm-epitheel om een gradiënt te vormen met meer expressie in de voorste dan de achterste polen (panelen I tot S). Uiteindelijk wordt het DmFKBP12/Calstabin-eiwit beperkt tot bepaalde architecturale componenten van de primitieve embryonale weefsels met minder extracellulaire verdeling dan die waargenomen in vroege en late gastrula embryonale stadia (figuur 4). Interessant is dat de hierboven beschreven dynamische eiwitverdeling niet gepaard gaat met overeenkomstige mRNA-niveaus van DmFKBP12 (figuur 5), wat aangeeft dat eiwitexpressie het resultaat is van een nog onbekend moleculair mechanisme na transcriptie. De beschreven methode van CAG slide-coating en pre-embedding zal ons in staat stellen om het belang van DmFKBP12 in calciumsignalering verder te onderzoeken en dit nog onbekende moleculaire mechanisme op te graven terwijl we andere technieken zoals micro-injectie RNA-interferentie combineren19.
In deze studie ontwikkelen we een chroom aluin gelatine slide-coating en pre-embedding methode voor histologie, histochemische en immuun-histologische analyse van Drosophila embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia. Met behulp van deze pre-embedding methode worden de embryo's effectief verzameld voor zowel cryo- als paraffinesectie die de analyse van longitudinale doorsneden mogelijk maakt. Dit stelde ons in staat om de evoluerende expressiepatronen voor dit eiwit tijdens beslissende ontwikkelingsstadia te beschrijven, waarbij expressie van het eiwit werd gekoppeld aan de ontwikkeling van belangrijke fysiologische systemen zoals de darm, de hersenen en het verbindende zenuwstelsel. Door deze methoden te gebruiken, waren we in staat om de dynamische distributies van RyR-regulerend eiwit en mRNA FKBP12 / Calstabin te onderzoeken tijdens de ontwikkeling van Drosophila-embryo's in definitieve stadia, inclusief het syncytiele en cellulaire blastoderm, en vroege en late gastrulatiestadia. Onze gegevens toonden aan dat het FKBP12 / Calstabin-eiwit en zijn RNA zeer vroeg in het syncytiele blastoderm kunnen worden gedetecteerd. Naarmate het embryo zich ontwikkelt, wordt FKBP12 dichter verdeeld in de basale cellaag onder het epitheel van het blastoderm. Het FKBP12/Calstabin-eiwit versterkt vervolgens dynamisch de expressie en differentieert de verdeling ervan in embryonale spierbevattende weefsels, waaronder het stomodaeum, stomodaeum en het achterste midgut rudiment. Deze verdelingsveranderingen van het begin van blastoderm tot late gastrulatiestadia worden ook beschreven in het zich ontwikkelende neuronale systeem, waaronder neuroblasten, ventrale zenuw, supra-oesofageale ganglion en hersenen. Hoewel deze dynamische veranderingen in FKBP12 / Calstabin wijzen op het belang ervan in de ontwikkeling, worden ze niet weerspiegeld in mRNA-niveaus van het eiwit, wat wijst op een nog onbekende regulator van eiwitexpressie die nog moet worden geïdentificeerd.
Figuur 1: Schets van chroomaluingelatine (CAG)coatingmethode voor paraffine-secties die worden gebruikt in immunologie en RNA in-situ hybridisatie om de verdeling van DmFKBP12-eiwit en mRNA in Drosophila-embryo's te visualiseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schets van de pre-embedding methode voor expressieprofiel van FKBP12 en DmFKBP12 bij de ontwikkeling van Drosophila embryo's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Expressieprofiel van DmFKBP12-eiwit in syncytiele en cellulaire blastodermen van het Drosophila-embryo . (A-D) H&E kleuring van het syncytiele blastoderm. Kwantificering van DmFKBP12-verdeling in vroeg syncytieel blastoderm wordt gepresenteerd in D. (E-G) Panelen presenteren vroeg syncytieel blastoderm waarin kernen worden verdeeld. Kwantificering van DmFKBP12-verdeling in laat syncytieel blastoderme wordt gepresenteerd in H. (I-L) H&E kleuring van het cellulaire blastoderm. De kwalificatie van DmFKBP12-distributie in laatcellulair blastoderm wordt gepresenteerd in L. (M-S) Panelen tonen de distributie van DmFKBP12-eiwit in het cellulaire blastoderm. O toont de grotere weergaven van M-N. (P-R) Panelen presenteren eerder cellulair blastoderm getoond in M-O. Kwantificeringen van DmFKBP12-verdeling in vroege cellulaire blastoderm wordt gepresenteerd in S. Schaalbalk voor A, E, I, M en P is 60 μm, voor B, C, F, J, K, N, Q en R is 40 μm, en voor G is O 20 μm. AP, voorste pool van ei; YK, dooier; CN, splitsingskern; PP, achterste paal van ei; BLD, blastoderm, kernen en cel; BM, Kelder membraan. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Het kwantificeren van de gegevens werd uitgevoerd met ImageJ. Ten eerste bleven de bruine producten in beeld samen met het verwijderen van alle andere kleuren. Ten tweede werd het bruine beeld zwart-wit veranderd en berekende de dichtheid voor kwantificering bijgevolg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Expressieprofiel van DmFKBP12-eiwit in vroege en late gastrulatiestadia van het Drosophila-embryo . A, D en G tonen H &E-kleuring van Drosophila-embryo in het gastrulatiestadium. B, C, E en F geven de verdeling van DmFKBP12 weer in het vroege gastrulatiestadium. H, I en J-L geven de verdeling van DmFKBP12 weer in het late gastrulatiestadium. Kwantificeringen van DmFKBP12-verdeling in vroege gastrulae worden gepresenteerd in M. Schaalbalk voor A, D, E en G is 80 μm, voor B, C, F, H, I en J-L is 40 μm. PP, achterste pool van ei; NBL, neuroblasten; ST, stomodaeum; YK, dooier; PMG, achterste midgut rudiment; BR, hersenen, supra-oesofageaal ganglion; VNS, ventraal zenuwstelsel; PV, proventriculus; MUS, spier; MGC, midgut caecum; AMG, anterieur midgut rudipighian; MMG, middenmiddendgut; TR, luchtpijp. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde± SEM. ns, geen significant; ** p < 0,01, *** p < 0,001. De gegevenskwantificering werd uitgevoerd met ImageJ 1.50d door productbruin te blijven en te veranderen in zwart-witbeeld, en gevolgd door dichtheidsberekening van zwart-wit zoals beschreven in de vorige figuurlegende. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: In-situ lokalisatie van DmFKBP12 mRNA tijdens de embryonale ontwikkeling van het Drosophila embryo. Een in-situ lokalisatie van DmFKBP12 mRNA toont in het syncytiele blastodermstadium wanneer FKBP12 mRNA tot expressie kwam in het cytoplasma van het embryo. B en C tonen in-situ lokalisatie van DmFKBP12 mRNA in het cellulaire blastodermstadium wanneer FKBP12 mRNA tot expressie kwam in de binnengrenzen van blastodermcellen. D en E vertonen in-situ lokalisatie van FKBP12 mRNA in het vroege gastrulatiestadium. Tijdens deze fase is het voornamelijk gelokaliseerd in de zich ontwikkelende darm. F, G en H tonen in-situ lokalisatie van FKBP12 mRNA in het late gastrulatiestadium, wanneer het mRNA tot expressie komt in de spier en darm. Ik ben positieve controle van DmFKBP12 mRNA. J is negatieve controle van DmFKBP12 mRNA. Schaalbalk voor A, C, E, G en I is 5 μm, voor B, D, F, I en J is 10 μm. YK, dooier; CN, splitsingskern; BLD, blastoderm, kernen en cellen; CF, anterieure schuine spleet, cefalische groef. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Embryonale stadia | 0-2 uur (%) | 2-3 uur (%) | 3-12 uur (%) | 12-24 uur (%) |
| Syncytieel blastoderm | 90.8 | 0 | 0 | 0 |
| Cellulair blastoderm | 6.9 | 91.54 | 0 | 0 |
| Vroege gastrula | 2.3 | 4.23 | 91.1 | 0 |
| Late gastrula | 0 | 4.23 | 8.93 | 93.3 |
Tabel 1: Embryoverzameling van verschillende stadia in de ontwikkeling van Drosophila melanogaster
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RyRs en IP3Rs gemedieerde calciumsignalering is een fundamentele route in veel fysiologische en pathologische processen van zowel gewervelde als ongewervelde dieren1,2,3,4. Bij mensen leiden puntmutaties, zoals CPVT-geassocieerde R4496C-mutatie, in het RyR2-gen tot calciumlekkage uit het sarcoplasmatisch reticulum van cardiomyocyten, wat resulteert in cardiale disfunctie. Deze mutaties presenteren zich als aritmie met een hoog risico op plotselinge hartdood tijdens fysieke activiteit en zijn reproduceerbaar in muismodellen die zijn ontworpen om deze mutatie te dragen. Onder inspanningsomstandigheden ervoeren de muizen die deze calciumlekmutatie droegen een cardiale plotselinge dood die niet werd aangetoond door de wildtype-tegendelen18,20,21,22. Overexpressie van FKBP12, een RyRs-regulator, in het hart, kwam overeen met hoge percentages kaliumkanalen geassocieerde hartdood in muismodellen22,23, een bevinding die overeenkwam met het fenotype van FKBP12 knock-out muizen10,11. Aangezien zoogdier-RyR's, waaronder RyR1, RyR 2 en RyR3 en hun regulator FKBPs, al meer dan drie decennia goed zijn bestudeerd, zijn de meeste procedures die betrokken zijn bij cardiopathologie, skeletspierdisfunctie en hersenfunctieprestaties na vroege ontwikkeling plus oncogenese de focus van onderzoek24,25.
In tegenstelling tot gewervelde dieren, die drie isovormen van RyR hebben, hebben Drosophila-vliegen slechts één RyR1,2,3,5. Onlangs hebben we de kritische functie van Drosophila RyR (DmRyR) aangetoond in de vroege stadia van de embryonale ontwikkeling van Drosophila. We ontrafelden DmRyR-expressie op zowel translationeel als transcriptioneel niveau in Drosophila-embryo's tijdens de vroege ontwikkeling: het syncytiele blastodermstadium, het blastodermstadium en de vroege gastrula-stadia. In alle vier de stadia werd DmFKBP12-mRNA gelijkmatig over het embryo verdeeld en bleef het op hetzelfde niveau, terwijl de eiwitexpressie van het gen zeer dynamisch was met expressieprofielen die anterieur werden gepolariseerd en vervolgens in bepaalde cellagen werden verdeeld19. De methodologische protocollen die we in deze publicatie gebruikten, waren van cruciaal belang voor het vermogen om een groot aantal representatieve resultaten te verkrijgen.
Paraffine sectioning is een basis en praktische techniek voor de histologische detectie van eiwitexpressie voor kwantitatieve analyse. Paraffinesecties zijn een fundamenteel hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitexpressie in het volwassen insect. Deze technieken zijn echter moeilijk te repliceren bij het ontwikkelen van insecten vanwege hun lipiderijke embryo en chitinerijke chorion, die inbedding, conservering en diamontage moeilijk maken. De lipiden in embryo's interfereren met de krachten waardoor embryonale secties op het oppervlak van de dia kunnen worden bevestigd. Hoewel de chitine in het chorion fysieke barrières vertoont die het embryo beschermen tegen chemische en mechanische interferentie, beperkt het ook de aanhechtingen van embryonale monsters aan glazen dia's. Hoewel deze kenmerken zorgen voor een hogere overlevingskans van insectenlarven, belemmert het sterk het vermogen om hun in-situ eiwit- en mRNA-expressie te bestuderen. Dit probleem is op vele manieren verholpen. Het gebruik van oppervlaktewasmiddel zoals Tween-20 maakt Drosophila-embryo's vaak los en vermindert het aantal embryo's dat beschikbaar is voor onderzoek. Deze techniek vereist incubatie gedurende 20 uur om mRNA voor in-situ hybridisatie te onthullen, maar maakt ook de monsters bijna volledig los van de dia's. De techniek hier om glasglijbanen te coaten met chroomaluingelatine (CAG) voordat immunohistochemie en anti-zintuigspecifieke herkenning voor mRNA worden uitgevoerd, lost deze technische barrières op door de hechting tussen het embryo en de glasplaat te verbeteren.
Naast de CAG-verbeterde hechting, maken de beschreven Drosophila-embryo pre-embedding-technieken de oogst van grote aantallen nauwkeurig gedateerde Drosophila-embryo's mogelijk. Dit stelde ons in staat om de dynamische expressie van DmFKBP12/Calstabin in verschillende stadia van vroege embryonale ontwikkeling te rapporteren. Het vroegste stadium dat we met deze techniek konden bestuderen, is het syncytiele blastodermstadium, dat een minder gedifferentieerde verdeling en een over het algemeen lager expressieniveau vertoonde. Door embryo's in de cellulaire blastoderm- en gastrulastadia te bestuderen, ontdekten we dat het algemene niveau van DmFKBP12 / Calstabin toenam naarmate embryo's zich ontwikkelen en beginnen te lokaliseren, eerst naar de voorste poll, vervolgens naar bepaalde lagen in het drielaagse stadium. De bevindingen suggereren dat de FKBP12 die betrokken is bij calciumsignalering een cruciale rol speelt in de vroege ontwikkeling en waarvan de differentiatie een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van Drosophila melanogaster .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (#31771377 / 31571273/31371256), het Foreign Distinguished Scientist Program van het National Department of Education (#MS2014SXSF038), het National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) en XZ wordt ondersteund door Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), het Natural Science Basic Research Program Youth Project van Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J.
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
