Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En protokol til immunohistokemi og RNA in situ-distribution inden for tidligt drosophila-embryo

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/61776
Automatic Translation
*1, *1, *2,3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,4, 1, 5, 6, 7, 3, 1
1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en protokol til påvisning og lokalisering af Drosophila embryoprotein og RNA fra indsamling til præindlejring og indlejring, immunstaining og mRNA in situ hybridisering.

Abstract

Calciuminduceret calciumfrigivelsessignalering (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske processer. Hver cellulær aktivitet fra celleproliferation og apoptose, udvikling og aldring til neuronal synaptisk plasticitet og regenerering har været forbundet med ryanodinreceptorer (RyR'er). På trods af vigtigheden af calciumsignalering er den nøjagtige mekanisme for dens funktion i tidlig udvikling uklar. Som en organisme med en kort svangerskabsperiode er embryonerne af Drosophila melanogaster primære forsøgspersoner til undersøgelse af distribution og lokalisering af CICR-associerede proteiner og deres regulatorer under udvikling. På grund af deres lipidrige embryoner og chitinrige chorion er deres anvendelighed imidlertid begrænset af vanskeligheden ved at montere embryoner på glasoverflader. I dette arbejde introducerer vi en praktisk protokol, der signifikant forbedrer fastgørelsen af Drosophila embryo på dias og detaljer metoder til vellykket histokemi, immunhistokemi og in situ hybridisering . Krom alun gelatine diasbelægningsmetode og embryo pre-embedding metode dramatisk øger udbyttet i studiet af Drosophila embryo protein og RNA ekspression. For at demonstrere denne tilgang studerede vi DmFKBP12 / Calstabin, en velkendt regulator af RyR under tidlig embryonal udvikling af Drosophila melanogaster. Vi identificerede DmFKBP12 så tidligt som det syncytiale blastodermstadium og rapporterer det dynamiske ekspressionsmønster af DmFKBP12 under udvikling: først som et jævnt fordelt protein i syncytial blastoderm, derefter foreløbigt lokaliseret til kælderlaget af cortex under cellulær blastoderm, før det fordeles i den primitive neuronale og fordøjelsesarkitektur under tre-ædelstenslagsfasen i tidlig gastrulation. Denne fordeling kan forklare den kritiske rolle, RyR spiller i de vitale organsystemer, der stammer fra disse lag: den suboøsofageale og supraesophageale ganglion, ventrale nervesystem og muskuloskeletale system.

Introduction

Calciuminduceret calciumfrigivelsessignalering (CICR) spiller en kritisk rolle i mange biologiske processer, såsom skelet/glat muskel og hjertevaskulær funktion, celleproliferation og apoptose, udvikling, aldring, neuronal synaptisk plasticitet og regenerering1,2,3,4,5,6 . Ryanodinreceptorer (RyR'er) og inositol 1,4,5-trisphosphatreceptorer (IP3R'er) er vigtige aktører i calciumsignalvejen, der styres af deres regulatorer proteinkinase A (PKA), Ca2+/calmodulinafhængig proteinkinase II (CaMKII), FK506-bindende proteiner (FKBP'er), calsequestrin (CSQ), triadin og junctin1,2,3,4,5,6 . Unormal menneskelig ekspression og mutationer i disse proteiner kan føre til patologisk fysiologi såsom arytmier7 og onkogen proliferation8,9.

FKBP'er regulerer calciumfrigivelsen fra den endoplasmatiske retikulære (ER) af RyRs. Denne proces er afgørende for sammentrækningsmekanismen og dermed ansvarlig for al mekanisk bevægelse genereret af myosin-actinkontraktion gennem calciuminduceret calciumfrigivelse sammen med embryonale RyRs1,2. I musemodeller er manglen på RyR2 og dens regulator FKBP12/Calstabin altid dødelig, enten under embryonal udvikling eller i den tidlige postnatale periode10,11,12. FKBP12/Calstabin knockout-mus udviser kritiske hjertefejl med uregelmæssig excitationskontraktionskobling (EC) og cerebralt ødem under embryonal udvikling. Dette indikerer, at FKBP12/Calstabin spiller en væsentlig rolle i reguleringen af RyR2-kanalekspression, hvilket er vigtigt både for hjerte- og cerebral udvikling10.

RyR-udførte calciumgnister blev oprindeligt opdaget i zygotdannelsesfasen af befrugtede Medaka-æg13,14. Der er imidlertid kun foretaget få undersøgelser af calciumsignaleringens funktion i den tidlige embryonale udvikling. I Drosophila melanogaster giver resultater opnået fra DmFKBP12 S107-mutanter stærke beviser, der understøtter betydningen af dette gen for larveudvikling og en sund levetid, hvilket tilskrives dets funktion mod oxidativ stress15,16. For nylig identificerede vi den dynamiske lokalisering af FKBP12/Calstabin-protein og messenger-RNA under den tidlige Udvikling af Drosophila melanogaster17. Ved hjælp af de tilgange, der er beskrevet i denne metode, var vi i stand til at spore ekspressionen af FKBP12 / Calstabin i D. melanogaster under syncytial blastoderm (0-2 timer), cellulær blastoderm (2-3 timer), tidlig gastrula (3-12 timer) og sen gastrula (12-24 timer). I dette papir præsenterer vi de detaljerede protokoller for hver tilgang i den foregående undersøgelse, herunder præ-embryoindlejring til klassisk paraffinsektionering, præ-coating diasbehandling til embryonale sektioner, histo-kemi farvning og immunfarvning og mRNA in-situ hybridisering til identifikation af genekspression.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tilberedning af druesaft agar plader

  1. Tilsæt 5 g agar og 5 g saccharose til 150 ml destilleret vand. Kog det ved hjælp af en mikrobølgeovn, indtil agar og saccharose er fuldt opløst. Bland 50 ml 100% druesaft og opløsningen sammen.
  2. Tilsæt 1 ml 100% propionsyre for at gøre den endelige koncentration til 0,5% propionsyre. Hæld 25 ml af den tilberedte opløsning i hver plade. Når agaren er størknet, opbevares mediet i 4 °C.

2. Belægning af dias

  1. Forbehandle dias med vaskemiddel. Vask diasene 3 gange med ledningsvand og en gang med destilleret vand. Tør derefter gliderne i en ovn på 45 °C i 2 timer.
  2. Dænk diasene i ca. 450 ml kaliumdichromat svovlsyreopløsning (20 g kaliumdichromat, 40 ml destilleret vand og 400 ml koncentreret svovlsyre) i 24 timer. Vask diasene 3 gange med ledningsvand og en gang med destilleret vand.
    1. Tør rutsjebanerne i en ovn på 45 °C i to timer. Sænk i 95% ethanol i mere end 2 timer.
  3. Der tilsættes 0,5 g chromkaliumsulfat og 5 g gelatine til 1 liter destilleret vand. Opløs i et 60 °C vandbad før brug. Krommalet gelatinen kan opbevares ved 4 °C i lange perioder.
  4. Slip 10 μL af kromalumlatineen på glideren, og dæk hele overfladen af diaset fuldt ud og jævnt med opløsningen. Anbring glideren med gelatinesiden op i en ovn ved 42 °C i 48 timer. De tilberedte dias kan opbevares ved 4 °C til senere brug.
    BEMÆRK: Dette er et kritisk skridt. Den komplette belægning er nødvendig. For bananflue og dens embryo synes denne diasbelægningsmetode mere effektiv end polylysinbelægning.

3. Drosophila embryo indlejring

  1. Drosophila embryo samling
    BEMÆRK: Vi indsamlede Drosophila embryoner i fire perioder på 0-2 timer (syncytial blastoderm), 2-3 timer (cellulær blastoderm), 3-12 timer (tidlig gastrula) og 12-24 timer (sen gastrula)18. Andelen af de vigtigste embryotyper i hver periode er vist i tabel 1.
    1. Læg 400-500 fluer i en plastikopsamlingsflaske og dæk flasken med druesaft agar plade indeholdende gærekstrakt. Drosophila embryoner lægges på druesaft agar ved stuetemperatur.
    2. Saml fire perioder med embryoner, tilsæt forsigtigt 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) til hver plade for at flyde embryonerne. Overfør ca. 200 embryoner til et 50 ml centrifugerør og opbevar det på is i 2 minutter for at slå embryonerne ned.
  2. Forindlejring
    1. Overfør 200 Drosophila embryoner til et 1,5 ml centrifugerør. Hold røret på is i 2 minutter for at slå embryonerne ned, og kassér derefter supernatanten med pipetten forsigtigt. Tilsæt 1 ml 50% blegemiddel i røret og ryst det forsigtigt i 2 minutter.
      BEMÆRK: Blegemidlet skal tilberedes frisk, og mængden af blegemiddel kan variere afhængigt af mængden af opsamlede embryoner.
    2. Saml forsigtigt embryoner ved hæld filterpapir på og vask dem 3 gange med 1 ml PBS ad gangen.
    3. Overfør embryonerne med filterpapir til ca. 5 ml n-heptan.
    4. Overfør blandingen til et nyt 1,5 ml centrifugerør. Tilsæt 1 ml methanol og ryst det forsigtigt. Saml embryoner efter sedimentering.
    5. Fjern supernatant og vask embryonerne i 1 ml PBS 3-5 gange.
    6. Fastgør embryonerne med 400 μL Bouins opløsning (71% mættet picrinsyre, 24% formalin, 5% eddikesyre) i 30 minutter. Vask de faste embryoner 3 gange i 1 ml PBS i 5 minutter hver gang.
    7. For at samle embryoner skal du overføre prøverne til en gummiprop og fjerne PBS.
    8. Der fremstilles 1,2 % agarose-PBS-opløsning, og opløsningen opbevares ved 60 °C. Tilsæt 200 μL 1,2% agarose-PBS-opløsning på embryoner for at fastgøre dem i en agarblok.
    9. Tag blokken ud af proppen, og opbevar blokken i PBS.
      BEMÆRK: Under præ-indlejring tilgang er pro-opvarmning afgørende for at lykkes. Vi anbefaler kraftigt, at centrifugerørene og mikropipettespidserne, som vil blive brugt i dette trin, skal være helt forvarme, før de tages i brug.
  3. Indlejring af paraffin
    1. Sænk den forindlejrede agarblok i 35% ethanol, 50% ethanol, 75% ethanol og 85% ethanol i 15 minutter hver. Dyp derefter 2 gange i 95% ethanol og 100% ethanol.
      BEMÆRKNINGER: Ca. 5-10x blokvolumen af hver efterfulgt af et klassificeret fikseringsmiddel i 15-30 minutter er nødvendigt afhængigt af antallet af embryoner i blokken.
    2. Nedsænk embryonblokken i 100% ethanol og xylen (1:1 forhold) opløsning i 15 min.
    3. Overfør blokken til xylen i 1 min. for at gøre embryovævet gennemsigtigt.
    4. Sænk blokken i xylen og paraffin (1:1 forhold) i 30 min.
    5. Sænk blokken i paraffin I, paraffin II og paraffin III i 2 timer hver gang.
    6. Fyld indlejringsboksen med paraffin på forhånd, og overfør derefter blokken forsigtigt og vandret til bunden af indlejringsboksen. Efter at paraffinen størkner naturligt, kan den størknede paraffinblok opbevares ved 4 °C.
      BEMÆRKNINGER: Den præindlejrede prøve kan bruges i kryosektion ved at følge følgende trin. Efter at embryonerne er præindlejret med agarose som beskrevet ovenfor, er prøverne simpelthen indlejret i OCT Compound. Bagefter kan kryosektion udføres i henhold til rutinemæssig kryosektionsprotokol. Derefter kan regelmæssige farvningsmetoder anvendes på sektionerne.

4. Hematoxylin-eosin farvning

  1. Forbered Drosophila embryo sektioner. Anbring forberedte sektioner i en ovn ved 60 °C i 15 minutter, og nedsænk derefter sektionerne i xylen 2 gange i 10 minutter hver. Sænk sektionerne en gang i 100% ethanol og xylen (1:1 forhold) i 2 min.
  2. Hydrat sektionerne i 100% ethanol I, 100% ethanol II, 95% ethanol, 85% ethanol, 75% ethanol, 50% ethanol og i destilleret vand i 3 minutter.
  3. Pletter sektionerne med hæmatoxylinopløsning i 2 minutter. Dyp diasene i 1% sur alkoholopløsning (1 ml saltsyre, 100 ml 70% ethanol) hurtigt og vask diasene i destilleret vand.
  4. Dyp diasene i 50% ethanol, 75% ethanol, 85% ethanol og 95% ethanol sekventielt.
  5. Pletter sektionerne med eosinopløsning i 1 min.
  6. Dehydrer diasene i 95% ethanol I, 95% ethanol II, 95% ethanol III, 100% ethanol I, 100% ethanol II og 100% ethanol III i 1 min hver gang.
  7. Ryd diasene i 100% xylen I, 100% xylen II og 100% xylen III i 5 minutter hver gang.
  8. Monter diasene med neutral balsam i henhold til producentens anvisninger.

5. Periodisk farvning af syre-sølvmetenamin

  1. Deparaffinisere og hydrere paraffinsektioner af Drosophila embryo til destilleret vand.
  2. Oxider sektionerne i 1% periodisk syre i 15 minutter ved stuetemperatur.
  3. Skyl diasene i destilleret vand 3 gange i 1 min hver.
  4. Inkubere lysbillederne i ca. 40 ml friskfiltreret sølvmethenaminarbejdsløsning (3% methenamin, 5% sølvnitrat, 5% natriumboratopløsning) i 1 time og 20 minutter ved 60 °C. Skyl derefter diasene i destilleret vand i 1 min.
  5. Tone lysbillederne i 0,2% guldchlorid i 2 min og skyl derefter diasene i destilleret vand i 1 min.
  6. Læg lysbillederne i 3% natriumthiosulfat i 3 min og skyl derefter diasene i destilleret vand i 1 min.
  7. Modbehold diasene i hæmatoxylin i 30 s. Vask rutsjebanerne i rindende postevand i 3-5 min.
  8. Dehydrer diasene i 70% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol I, 95% ethanol II, 95% ethanol III, 100% ethanol I og 100% ethanol II i 5 minutter hver.
  9. Ryd diasene i 100% xylen I, 100% xylen II og 100% xylen III i 5 minutter hver.
  10. Monter diasene i neutral balsam i henhold til producentens anvisninger.

6. Immunohistokemi

  1. Deparaffinisere og rehydrere paraffinsektioner af Drosophila embryo til PBS efter standardprotokollen19.
  2. Behandl dias med 0,3% H2O2 i methanol i 10 minutter ved stuetemperatur og undgå lys.
  3. Forvarm den relevante antigenhentningsbuffer til ca. 100 °C i en beholder med rutsjebanerne i grøntsagsdamperen. Beholderen skal også have låg. Sæt diasene i beholderen. Luk låget på damperen.
    1. Opbevar beholderen i damperen i 20 minutter fra dette punkt. Bemærk, at låget på glidebeholderen ikke bør strammes helt, så vanddamp kan komme ind under dampningsprocessen.
  4. Lad lysbillederne vende tilbage til stuetemperatur, før du forsigtigt skyller det i PBS-T (PBS med Tween-20, pH 7,2) 3 gange i 5 minutter hver, og skyl derefter diasene i PBS 3 gange i 1 minut hver.
  5. Bloker diasene med 1% bovin serumalbumin (BSA) i PBS i 60 minutter ved stuetemperatur.
  6. Inkuber lysbillederne med primært antistof (anti-FKBP12 ved 1:1000) natten over ved 4 °C eller ved stuetemperatur i 4 timer.
  7. Vask diasene i PBS-T 4 gange i 5 minutter hver.
  8. Påfør diasene med HRP-mærket polymer konjugeret med sekundære antistoffer (anti-kanin, 1: 5.000) i 90 minutter ved stuetemperatur. Gør dette i mørke for at undgå fotoblegning.
  9. Vask diasene i PBS-T 3 gange i 5 minutter hver.
  10. Inkuber lysbillederne med 5% 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) i 2-10 minutter, indtil reaktionsprodukternes farve er passende under mikroskop.
  11. Forbehold diasene i hæmatoxylin i 30 s og vask diasene i destilleret vand 2 gange i 5 minutter hver.
  12. Dehydrer diasene i 50% ethanol, 70% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol og 100% ethanol i 1 min hver.
  13. Ryd diasene i 100% xylen I, 100% xylen II og 100% xylen III i 5 minutter hver.
  14. Monter diasene i neutral balsam i henhold til producentens anvisninger.

7. In situ-hybridisering

BEMÆRK: Drosophila embryo sektioner blev fremstillet med 0,01% diethyl pyrocarbonat (DEPC) behandlet vand. Alt tilbehør, der anvendes til in situ-hybridisering , anvender DEPC-behandling natten over på forhånd.

  1. Riboprobe forberedelse
    1. Lineariser skabelon-DNA ved at skære på et restriktionsenzymsted nedstrøms fra den klonede indsats ved hjælp af et restriktionsenzym, der skaber 5 'udhæng. Efter linearisering renses skabelon-DNA'et via phenol/chloroformekstraktion og efterfølgende ethanoludfældning. Brug standardprotokoller.
    2. Tilsæt 1 μg renset skabelon-DNA til et RNase-frit centrifugerør. Placer centrifugerøret på is. Tilsæt nok DEPC-behandlet vand til det samlede volumen 13 μL.
      1. Derefter tilsættes følgende reagenser i rækkefølge: 2 μL 10x NTP-mærkningsblanding, 2 μL 10x transkriptionsbuffer, 1 μL beskytter RNase-hæmmer, 2 μL RNA-polymerase SP6 eller RNA-polymerase T7.
    3. Bland reaktionen ved pipettering og centrifuge inden for kort tid. Inkuber i 2 timer ved 37 °C.
      BEMÆRK: Længere inkubationer øger ikke udbyttet af mærket RNA. En kort drejning (~ 800 o / min) påført reaktionsrøret er kritisk nødvendig, før du fortsætter til næste trin. Dette spin gør det muligt for alt indhold, der kan generere fra inkubationen, at komme til bunden af røret.
    4. Tilsæt 2 μL RNase-fri DNase I for at fjerne skabelon-DNA og inkuber i 15 minutter ved 37 °C.
    5. Tilsæt 2 μL 200 mM EDTA (pH 8,0) for at stoppe reaktionen.
      BEMÆRK: DIG-mærkede RNA-sonder kan opbevares ved -15 til -25 ° C i ethanol i et år.
  2. Pre-hybridisering af Drosophila embryo sektion
    1. Anbring sektioner af Drosophila embryo i en 42 ° C ovn i 48 timer.
    2. Deparaffiniser diasene i 100% xylen i 10 minutter to gange.
    3. Hydratiser diasene ved sekventielt at nedsænke i 100% ethanol, 95% ethanol, 90% ethanol, 70% ethanol og 50% ethanol i 5 minutter.
    4. Inkuber lysbillederne i PBS i 5 min 3 gange for at fjerne den fikserende opløsning/Bouins opløsning fra vævet.
    5. Vask rutsjebanerne med 100 mmol/L glycin/PBS-opløsning 2 gange i 5 min hver.
    6. Vask rutsjebanerne med PBS 2 gange i 5 min hver.
    7. Inkuber lysbillederne med 0,3% Triton X-100 i PBS i 15 minutter for at permeabilisere membranerne.
    8. Vask diasene med PBS 3 gange i 5 min hver.
    9. Inkuber lysbillederne i 15 μg/ml RNasefri proteinase K i 30 minutter ved 37 °C.
    10. Inkuber lysbillederne med 4% paraformaldehyd i PBS i 3 minutter for at stoppe fordøjelsen.
    11. Vask rutsjebanerne med PBS 2 gange i 5 min hver.
    12. Inkuber lysbillederne i 100 mM triethanolaminbuffer (pH 8,0) med 0,25% (v/v) eddikesyreanhydrid 2 gange i 5 minutter hver.
    13. Tilsæt DEPC-vand i diasfugtighedskammeret. Tilsæt 20 μL præhybridiseringsopløsning (indeholdende 100 μg/ml laksesæd-DNA) på diasene. Sæt diasene ind i diasfugtighedskammeret. Inkuber lysbillederne ved 42 °C i 4 timer.
      BEMÆRK: Det er nødvendigt at sikre tætheden af låget på den våde kasse, og at den våde kasse altid holdes vandret for at forhindre fordampning og afvigelse fra vævet i præhybridiseringsopløsningen og den følgende hybridiseringsopløsning.
  3. Hybridisering af Drosophila embryo sektion
    1. Fjern præhybridiseringsopløsningen, og vask diasene med 0,2x SSC (150 mM natriumchlorid, 15 mM natriumcitrat, pH 7,0) 3 gange i 5 minutter hver. Tør overskydende 0,2x SSC af omkring vævsprøverne.
    2. Påfør 30 μL sondehybridiseringsopløsning (indeholdende 2-6 ng digoxinmærket RNA-sonde ved fortynding i præhybridiseringsopløsning) med en pipette. Inkuber lysbillederne i glidefugtighedskammeret ved 42 °C i ca. 20 timer.
      BEMÆRK: Vær sikker på hættetætheden som forslaget til den sidste note. Ellers vil udtørringen forårsaget af lækage af enten præhybridisering eller præhybridisering generere snavset baggrund, herunder pseudo-positiv i dias.
  4. Hybridisering
    1. Fjern hybridiseringsopløsningen, og vask gliderne med 4x SSC-opløsning 4 gange i 15 minutter hver ved 37 °C.
    2. Rutsjebanerne vaskes i 2x SSC-opløsning med 20 μg/ml RNase A i 30 minutter ved 37 °C.
    3. Vask rutsjebanerne i 1x SSC-opløsning i 15 min ved 37 °C.
    4. Vask rutsjebanerne i 0,5x SSC-opløsning i 15 min ved 37 °C.
    5. Vask rutsjebanerne i 0,1x SSC-opløsning i 15 minutter ved 37 °C.
    6. Vask diasene med PBS 3 gange i 5 min hver.
    7. Vask lysbillederne i vaskebuffer (100 mM maleinsyre, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) i 1 min.
    8. Inkuber lysbillederne i 100 ml frisklavet blokeringsopløsning (2% fåreserum i maleinsyrebuffer uden Tween 20) i 30 minutter.
    9. Inkuber lysbillederne i 20 ml antistofopløsning i 45 minutter.
      1. Centrifugering af antistoffet i 5 minutter ved 10.000 o / min i det originale hætteglas inden hver brug, og pipet den nødvendige mængde omhyggeligt fra overfladen. Fortynd anti-digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU/ml) i blokerende opløsning.
    10. Vask diasene i 100 ml vaskebuffer 2 gange i 15 minutter hver for at fjerne ubundet antistofkonjugat.
    11. Ligevægt gliderne i 20 ml detektionsbuffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) i 2-5 minutter.
    12. Inkuber lysbillederne med 10 ml frisklavet farvesubstratopløsning i diasfugtighedskammeret. Reaktionen begynder inden for få minutter og er afsluttet efter 16 timer. Ryst eller bland ikke, mens farven udvikler sig.
    13. Vask diasene med 50 ml destilleret vand i 5 minutter for at stoppe reaktionen.
    14. Tør prøven natten over i mørket.
    15. Dehydrer diasene i 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol, 100% ethanol I og 100% ethanol II i 3 min hver.
    16. Ryd diasene i 100% xylen I, 100% xylen II og 100% xylen III i 20 minutter hver.
    17. Monter diasene med neutral balsam.
    18. Dokumentér billeder og analyser med den omvendte mikroskopi og producentsoftware. Udfør distributionsanalyse ved hjælp af ImageJ i henhold til tætheden af positivt signal enten langs længdeaksen eller inden for differentiel zone af embryoner.
      BEMÆRK: Under inkubationen med den frisklavede farvesubstratopløsning i trin 7.4.12 kan reaktionsfarven ses selv med et bart øje. Denne observation af, hvordan farveudvikling kan inspiceres under stereoskop. Når reaktionsfarven er rimelig, og trinnet 7.4.13 kan udføres for at stoppe reaktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tallene beskriver protokoller, der bruges til at overvinde udfordringen med at fastgøre høje lipid- og chitinholdige chorion Drosophila-embryoner (tabel 1) til glasglideoverfladen til undersøgelse og eksperimentering. Ved hjælp af krommamelatine-diasbelægningsmetoden vist i figur 1 forbedrede vi fastgørelsen af Drosophila-embryoner på overfladen af dias, mens embryo-præindlejringsmetoden vist i figur 2 muliggør effektiv inspektion af den dynamiske fordeling af protein og RNA DmFKBP12 / Calstabin i alle fire tidlige udviklingsstadier (dvs. syncytial blastoderm, cellulær blastoderm, tidlig og sen gastrula af Drosophila embryoner). Figur 3 viser proteinfordelingen af antistof detekteret FKBP12 / Calstabin på syncytial og cellulær blastoderm stadier. Fra disse histokemiske resultater kan det ses, at FKBP12-ekspression er mindre polariseret i syncytial blastoderm (Paneler A til H) og derefter begynder at lokalisere sig i kældermembranen under trophektodermepitelet for at danne en gradient med mere udtryk, der findes i den forreste end de bageste poler (Paneler I til S). Til sidst bliver DmFKBP12/Calstabin-proteinet begrænset til visse arkitektoniske komponenter i det primitive embryonale væv med mindre ekstracellulær fordeling end den, der observeres i tidlige og sene gastrula embryonale stadier (figur 4). Interessant nok ledsages den ovenfor beskrevne dynamiske proteinfordeling ikke af tilsvarende mRNA-niveauer af DmFKBP12 (figur 5), hvilket indikerer, at proteinekspression er resultatet af en stadig ukendt molekylær mekanisme efter transkription. Den beskrevne metode til CAG-diasbelægning og præindlejring vil give os mulighed for yderligere at undersøge betydningen af DmFKBP12 i calciumsignalering og afdække denne stadig ukendte molekylære mekanisme, mens vi kombinerer andre teknikker såsom mikroinjektion RNA-interferens19.

I dette studie udvikler vi en kromalummelatine slide-coating og pre-embedding metode til histologi, histokemisk og immun-histologisk analyse af Drosophila embryoner på forskellige udviklingsstadier. Ved hjælp af denne præindlejringsmetode indsamles embryonerne effektivt til både kryo- og paraffinsektionering, der muliggør analyse af langsgående tværsnit. Dette gjorde det muligt for os at beskrive de udviklende ekspressionsmønstre for dette protein i afgørende udviklingsstadier, der forbinder ekspression af proteinet med udvikling af vigtige fysiologiske systemer som tarmen, hjernen og det forbindende nervesystem. Ved at anvende disse metoder var vi i stand til at undersøge de dynamiske fordelinger af RyR-regulerende protein og mRNA FKBP12 / Calstabin under udviklingen af Drosophila-embryoner i endelige stadier, herunder syncytial og cellulær blastoderm og tidlige og sene gastrulationsstadier. Vores data viste, at FKBP12/Calstabin-proteinet og dets RNA kan påvises meget tidligt i syncytialblastoderm. Efterhånden som embryoet udvikler sig, bliver FKBP12 tættere fordelt i basalcellelaget under blastodermens epitel. FKBP12/Calstabin-proteinet styrker derefter dynamisk dets ekspression og differentierer dets fordeling i embryonale muskelholdige væv, herunder stomodaeum, stomodaeum og posterior midgut rudiment. Disse fordelingsændringer fra begyndelsen af blastoderm til sene gastrulationsstadier er også beskrevet i det udviklende neuronale system, herunder neuroblaster, ventral nerve, supraøsofageal ganglion og hjerne. Mens disse dynamiske ændringer i FKBP12 / Calstabin antyder dets betydning i udviklingen, afspejles de ikke i mRNA-niveauer af proteinet, hvilket antyder en endnu ukendt regulator af proteinekspression, der stadig skal identificeres.

Figure 1
Figur 1: Skitse af kromalumgelatine (CAG)belægningsmetode til paraffinsektioner, der anvendes i immunologi og RNA in situ-hybridisering for at visualisere fordelingen af DmFKBP12-protein og mRNA i Drosophila-embryoner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skitse af præindlejringsmetode til ekspressionsprofil af FKBP12 og DmFKBP12 i udviklingen af Drosophila embryoner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Ekspressionsprofil af DmFKBP12-protein i syncytial og cellulær blastodermer af Drosophila-embryoet . (A-D) H & E farvning af syncytial blastoderm. Kvantificering af DmFKBP12-fordeling i tidlig syncytial blastoderm præsenteres i D. (E-G) Paneler præsenterer tidlig syncytial blastoderm, hvor kerner er under division. Kvantificering af DmFKBP12-fordeling i sen syncytial blastoderm præsenteres i H. (I-L) H & E farvning af den cellulære blastoderm. Kvalifikationen af DmFKBP12-fordeling i sen cellulær blastoderm præsenteres i L. (M-S) Paneler udviser fordelingen af DmFKBP12-protein i den cellulære blastoderm. O viser de større visninger af M-N. (P-R) Paneler præsenterer tidligere cellulær blastoderm vist i M-O. Kvantificeringer af DmFKBP12-fordeling i tidlig cellulær blastoderm præsenteres i S. Skalabjælken for A, E, I, M og P er 60 μm, for B, C, F, J, K, N, Q og R er 40 μm, og for G er O 20 μm. AP, forreste pol af æg; YK, æggeblomme; CN, spaltningskerne; PP, bageste pol af æg; BLD, blastoderm, kerner og celle; BM, Kældermembran. Data udtrykkes som middelværdi± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Datakvantificeringen blev udført med ImageJ. For det første blev de brune produkter forblevet i billedet sammen med fjernelse af alle andre farver. For det andet blev det brune billede ændret sort-hvidt og beregner dets densitet til kvantificering følgelig. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Ekspressionsprofil for DmFKBP12-protein i tidlige og sene gastrulationsstadier af Drosophila-embryoet . A, D og G viser H&E-farvning af Drosophila embryo på gastrulationsstadiet. B, C, E og F viser fordelingen af DmFKBP12 på det tidlige gastrulationsstadium. H, I og J-L viser fordelingen af DmFKBP12 på det sene gastrulationsstadium. Kvantificeringer af DmFKBP12-fordeling i tidlige gastrulae præsenteres i M. Skalabjælke for A, D, E og G er 80 μm, for B, C, F, H, I og J-L er 40 μm. PP, bageste pol af æg; NBL, neuroblaster; ST, stomodaeum; YK, æggeblomme; PMG, bageste midgut rudiment; BR, hjerne, supraesophageal ganglion; VNS, ventralt nervesystem; PV, proventriculus; MUS, muskel; MGC, midgut caecum; AMG, forreste midgut rudipighian; MMG, midterste midt i midten; TR, luftrør. Data udtrykkes som middelværdi± SEM. ns, ingen signifikant; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Datakvantificeringen blev udført med ImageJ 1.50d ved at forblive produktbrun og skifte til sort-hvid billede og efterfølgende ved tæthedsberegning af sort-hvid som beskrevet i den foregående figurforklaring. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: In situ-lokalisering af DmFKBP12 mRNA under embryonal udvikling af Drosophila-embryoet . A viser in situ-lokalisering af DmFKBP12 mRNA på syncytial blastoderm-stadiet, når FKBP12 mRNA blev udtrykt i embryonets cytoplasma. B og C viser in situ-lokalisering af DmFKBP12 mRNA på det cellulære blastodermstadium, når FKBP12 mRNA blev udtrykt i de indre grænser for blastodermceller. D og E udviser in situ-lokalisering af FKBP12 mRNA på det tidlige gastrulationsstadium. I løbet af dette stadium er det hovedsageligt lokaliseret i den udviklende tarm. F, G og H viser in situ-lokalisering af FKBP12 mRNA i det sene gastrulationsstadium, når mRNA'et udtrykkes i muskel og tarm. Jeg er positiv kontrol af DmFKBP12 mRNA. J er negativ kontrol af DmFKBP12 mRNA. Skalastang for A, C, E, G og I er 5 μm, for B, D, F, I og J er 10 μm. YK, æggeblomme; CN, spaltningskerne; BLD, blastoderm, kerner og celler; CF, forreste skrå kløft, cephalic fure. Klik her for at se en større version af denne figur.

Embryonale stadier 0-2 timer (%) 2-3 timer (%) 3-12 timer (%) 12-24 timer (%)
Syncytial blastoderm 90.8 0 0 0
Cellulær blastoderm 6.9 91.54 0 0
Tidlig gastrula 2.3 4.23 91.1 0
Sen gastrula 0 4.23 8.93 93.3

Tabel 1: Embryoopsamling af forskellige stadier i udviklingen af Drosophila melanogaster

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RyRs og IP3Rs medieret calciumsignalering er en grundlæggende vej i mange fysiologiske og patologiske processer hos både hvirveldyr og hvirvelløse dyr1,2,3,4. Hos mennesker fører punktmutationer, såsom CPVT-associeret R4496C-mutation, i RyR2-genet til calciumlækage fra det sarkoplasmatiske retikulum af kardiomyocyt, hvilket resulterer i hjertedysfunktion. Disse mutationer præsenterer som arytmi med stor risiko for pludselig hjertedød under fysisk aktivitet og er reproducerbare i musemodeller, der er konstrueret til at bære denne mutation. Under træningsforhold oplevede musene, der bar denne calciumlækagemutation, pludselig hjertedød, der ikke blev påvist af dens vildtypemoddele18,20,21,22. Overekspression af FKBP12, en RyRs-regulator, i hjertet svarede til høje kaliumkanaler forbundet hjertedød i musemodeller22,23, et fund, der svarede til fænotypen af FKBP12 knockout-mus10,11. Da pattedyr RyR'er, herunder RyR1, RyR 2 og RyR3 og deres regulator FKBP'er, er blevet godt undersøgt i over tre årtier, er de fleste procedurer involveret i kardiopatologi, skeletmuskulær dysfunktion og hjernefunktionspræstation efter tidlig udvikling plus onkogenese fokus for forskning24,25.

I modsætning til hos hvirveldyr, der har tre isoformer af RyR, har Drosophila fluer kun en RyR1,2,3,5. For nylig demonstrerede vi den kritiske funktion af Drosophila RyR (DmRyR) i de tidlige stadier af Drosophila embryonale udvikling. Vi afslørede DmRyR-udtryk på både translationelt og transkriptionelt niveau i Drosophila-embryoner under tidlig udvikling: det syncytiale blastodermstadium, blastodermstadiet og de tidlige gastrula-stadier. I alle fire faser blev DmFKBP12 mRNA fordelt jævnt i hele embryoet og forblev på samme niveau, mens genets proteinekspression var meget dynamisk med ekspressionsprofiler polariseret anteriorly og derefter fordelt i visse cellelag19. De metodologiske protokoller, vi brugte i denne publikation, var afgørende for evnen til at opnå en stor mængde repræsentative resultater.

Paraffinsektionering er en grundlæggende og praktisk teknik til histologisk påvisning af proteinekspression til kvantitativ analyse. Paraffinsektioner er et grundlæggende værktøj til at studere proteinekspression i det voksne insekt. Disse teknikker har imidlertid været vanskelige at replikere i udviklingen af insekter på grund af deres lipidrige embryo og chitinrige chorion, hvilket gør indlejring, konservering og diasmontering vanskelig. Lipiderne, der findes i embryoner, forstyrrer de kræfter, der muliggør fastgørelse af embryonale sektioner på overfladen af diaset. Mens chitin, der findes i korionen, præsenterer fysiske barrierer, der beskytter embryoet mod kemisk og mekanisk interferens, begrænser det også fastgørelser af embryonale prøver til glasrutschebaner. Mens disse egenskaber sikrer en højere overlevelsesrate for insektlarver, forhindrer det i høj grad evnen til at studere deres in situ-protein og mRNA-ekspression. Dette problem har været problemskudt på mange måder. Brugen af overfladevaskemiddel som Tween-20 løsner ofte Drosophila embryoner og reducerer antallet af embryoner, der er tilgængelige til undersøgelse. Denne teknik kræver inkubation i 20 timer for at afsløre mRNA til in situ-hybridisering , men løsner også prøverne fra diasene næsten helt. Teknikken her til at belægge glasglider med kromalumgelatine (CAG), inden immunohistokemi og anti-sense-specifik genkendelse for mRNA udfører, løser disse tekniske barrierer ved at forbedre fastgørelsen mellem embryoet og glasdiaset.

Ud over den CAG-forbedrede vedhæftning tillader de beskrevne Drosophila embryo pre-embedding teknikker høst af et stort antal præcist daterede Drosophila embryoner. Dette gjorde det muligt for os at rapportere det dynamiske udtryk for DmFKBP12/Calstabin på forskellige stadier af tidlig embryonal udvikling. Det tidligste stadium, vi var i stand til at studere ved hjælp af denne teknik, er syncytial blastoderm-stadiet, som viste mindre differentieret fordeling og et generelt lavere ekspressionsniveau. Ved at studere embryoner på de cellulære blastoderm- og gastrulastadier fandt vi, at det generelle niveau af DmFKBP12 / Calstabin steg, da embryoner udvikler sig og begynder at lokalisere, først til den forreste afstemning, derefter til bestemte lag i trelagsfasen. Resultaterne tyder på, at FKBP12 involveret i calciumsignalering spiller en kritisk rolle i den tidlige udvikling, og hvis differentiering spiller en vigtig rolle i Drosophila melanogaster-udviklingen .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (#31771377 / 31571273/31371256), Foreign Distinguished Scientist Program fra National Department of Education (#MS2014SXSF038), National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45), og XZ støttes af Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), Det naturvidenskabelige grundforskningsprogram Ungdomsprojekt fra Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-20°C Refrigerator Meiling Biology &Medical DW-YL270 Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator Thermo Forma 90 Series Used for regent storage
Agar Sigma-Aldrich WXBB6360V Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Roche 11093274910 For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator Shanghai Bluepard Instruments LRH-250 In-situ Hybridization
Bouin's solution Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69945460 Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge Eppendorf 540BH07808 In-situ Hybridization
Centrifuge tube Denville C-2170 Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10001018 Coating Slides
Constant temperature water bath Jintan Henfeng Instruments KW-1000DC Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System Dako K5007 In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC Sigma-Aldrich D5758 In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit Roche 11093274910 RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster Bloomington Stock Center BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven Tianjin Taiste Instruments 101-0AB For coating slides and paraffin embedding
Eosin Sigma-Aldrich 230251 Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 100092680 Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10010328 Coating Slides
Gold chloride Sigma-Aldrich 379948 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136 Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit Roche 11732668001 For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box Ningbo Jiangnan Instruments HWS For fly maintenance
LE Agarose HyAgarose 14190108029 Pre-embedding
Methanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10014108 Drosophila Embryo Collection
Microscope ZEISS Observer.A1 Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides MeVid Labware Manufacturing P105-2001 Coating Slides
Neutral Gum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10004160 Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 40026768 Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer Huahai science instrument HH-2508III In-situ Hybridization
Paraffin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69019461 Paraffin Embedding
pH/mV Meter Sartorius PB-10 For determing the pH value of a solution
Silver nitrate Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10018461 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter Thermo AFXI-0501-P In-situ Hybridization
Xylene Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10023418 Paraffin Embedding

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 183 Drosophila embryo paraffinsektion belægningsdias indlejring in situ-hybridisering DmFKBP12 / Calstabin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He,… More

Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He, B., Xiao, L., Yue, H., Wang, S., Sun, Y., Wu, Y., Wang, L., Ghartey-Kwansah, G., Jones, O. D., Bryant, J. L., Xu, M., Ma, J., Xu, X. A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (183), e61776, doi:10.3791/61776 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter