Summary
여기에서, 우리는 초파리 배아 단백질 및 RNA의 검출 및 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다 수집에서 사전-포베딩 및 포매, 면역염색, 및 mRNA 를 계내 혼성화에 이르게 한다.
Abstract
칼슘 유도 칼슘 방출 신호 (CICR)는 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을합니다. 세포 증식 및 아폽토시스, 발달 및 노화, 뉴런 시냅스 가소성 및 재생에 이르기까지 모든 세포 활성은 Ryanodine 수용체 (RyRs)와 관련이 있습니다. 칼슘 신호 전달의 중요성에도 불구하고, 초기 개발에서 그 기능의 정확한 메커니즘은 불분명하다. 임신 기간이 짧은 유기체로서, 초파리 멜라노가스터의 배아는 발달 중에 CICR 관련 단백질 및 그들의 조절자의 분포 및 국소화를 조사하기위한 주요 연구 대상입니다. 그러나 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온으로 인해 유리 표면에 배아를 장착하기가 어려워 유용성이 제한됩니다. 이 연구에서는 초파리 배아를 슬라이드에 부착하는 것을 크게 향상시키는 실용적인 프로토콜과 성공적인 조직 화학, 면역 조직 화학 및 현장 혼성화를위한 세부 방법을 소개합니다. 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 방법 및 배아 사전 임베딩 방법은 초파리 배아 단백질 및 RNA 발현을 연구하는 데 수율을 극적으로 증가시킵니다. 이 접근법을 입증하기 위해, 우리는 초파리 멜라노가스터의 초기 배아 발달 동안 RyR의 잘 알려진 조절자 인 DmFKBP12 / Calstabin을 연구했습니다. 우리는 싱크로나이셜 배반배엽 단계에서 DmFKBP12를 확인하고 개발 중에 DmFKBP12의 동적 발현 패턴을 보고 하였다: 초기에는 세포융합 배반엽에서 고르게 분포된 단백질로서, 그 후 세포 배반배엽 동안 피질의 기저층으로 미리 국소화하고, 초기 위축에서 삼겜층 단계 동안 원시적 뉴런 및 소화 구조에 분배하기 전에. 이 분포는 RyR이 이러한 층에서 유래 한 중요한 장기 시스템에서 중요한 역할을 설명 할 수 있습니다 : 식도 하 및 식도 신경절, 복부 신경계 및 근골격계.
Introduction
칼슘 유도 칼슘 방출 신호전달(CICR)은 골격/평활근 및 심장 혈관 기능, 세포 증식 및 아폽토시스, 발달, 노화, 신경 시냅스 가소성 및 재생과 같은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다1,2,3,4,5,6 . 리아노딘 수용체 (RyRs) 및 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체 (IP3Rs)는 그들의 조절인자인 단백질 키나아제 A (PKA), Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II (CaMKII), FK506 결합 단백질 (FKBPs), 칼세퀘스트린 (CSQ), 트리아딘 및 junctin1,2,3,4,5,6에 의해 조절되는 칼슘 신호전달 경로의 주요 플레이어이다. . 이러한 단백질의 비정상적인 인간 발현 및 돌연변이는 부정맥7 및 종양원성 증식8,9과 같은 병리학적 생리학을 야기할 수 있다.
FKBPs는 RyRs에 의해 소포체(ER)로부터의 칼슘 방출을 조절한다. 이 과정은 수축 메커니즘에 필수적이며, 따라서 배아 RyRs1,2와 함께 칼슘 유도 칼슘 방출을 통해 미오신 액틴 수축에 의해 생성 된 모든 기계적 움직임을 담당합니다. 마우스 모델에서, RyR2 및 그 조절인자 FKBP12/Calstabin의 부족은 배아 발달 동안 또는 산후 초기 기간10,11,12에서 변함없이 치명적이다. FKBP12 / Calstabin 녹아웃 마우스는 배아 발달 중 불규칙한 여기 수축 결합 (EC) 및 뇌 부종으로 심각한 심장 결함을 나타냅니다. 이는 FKBP12/Calstabin이 심장 및 뇌 발달 모두에 중요한 RyR2 채널 발현을 조절하는 데 필수적인 역할을 한다는 것을 나타냅니다10.
RyR 실시 칼슘 스파크는 수정 된 메다카 난자의 접합체 형성 단계에서 처음 발견되었습니다13,14. 그러나 초기 배아 발달에서 칼슘 신호 전달의 기능에 대한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 초파리 멜라노가스터에서, DmFKBP12 S107 돌연변이체로부터 얻은 결과는 유충 발달과 건강한 수명에 대한이 유전자의 중요성을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공하며, 이는 산화 스트레스에 대한 기능에 기인합니다15,16. 최근에, 우리는 초기 초파리 멜라노가스터 개발 동안 FKBP12/Calstabin 단백질 및 메신저 RNA의 동적 국소화를 확인했다17. 이 방법론에 기술된 접근법을 사용하여, 우리는 세포융합 배반엽 (0-2 h), 세포 배반배엽 (2-3 h), 초기 gastrula (3-12 h), 및 후기 gastrula (12-24 h) 동안 D. melanogaster에서 FKBP12/Calstabin의 발현을 추적할 수 있었다. 이 논문에서, 우리는 고전적인 파라핀 절편을 위한 전-배아 임베딩, 배아 절편에 대한 예비코팅 슬라이드 처리, 조직-화학 염색 및 면역염색, 유전자 발현의 확인을 위한 mRNA 인-시츄 혼성화를 포함하는 이전 연구에서 모든 접근법의 상세한 프로토콜을 제시한다.
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Protocol
1. 포도즙 한천 플레이트의 제조
- 한천 5g과 자당 5g을 증류수 150mL에 첨가한다. 한천과 자당이 완전히 용해 될 때까지 전자 레인지를 사용하여 삶으십시오. 100 % 포도 주스 50 mL와 용액을 함께 섞는다.
- 100% 프로피온산 1 mL를 첨가하여 최종 농도를 0.5% 프로피온산으로 만든다. 준비된 용액 25 mL를 각 플레이트에 붓는다. 한천이 응고된 후, 배지를 4°C에 보관한다.
2. 코팅 슬라이드
- 슬라이드를 세제로 전처리하십시오. 슬라이드를 수돗물로 3 번, 증류수로 한 번 씻으십시오. 이어서, 슬라이드를 45°C 오븐에서 2시간 동안 건조시켰다.
- 슬라이드를 약 450 mL의 이크로메이트 칼륨 황산 용액 (20 g의 디크로메이트 칼륨, 40 mL의 증류수 및 400 mL의 진한 황산)에 24 시간 동안 담그십시오. 슬라이드를 수돗물로 3 번, 증류수로 한 번 씻으십시오.
- 슬라이드를 45°C 오븐에서 두 시간 동안 건조시킨다. 95% 에탄올에 2시간 이상 담그십시오.
- 황산크롬칼륨 0.5g과 젤라틴 5g을 증류수 1L에 첨가한다. 사용 전에 60°C 수조에 녹인다. 크롬 명반 젤라틴은 장기간 동안 4°C에서 저장될 수 있다.
- 크롬 명반 젤라틴 10 μL를 슬라이드에 떨어뜨리고 용액으로 슬라이드의 전체 표면을 완전하고 고르게 덮는다. 젤라틴 측면이 있는 슬라이드를 42°C의 오븐에 48시간 동안 올려 놓는다. 제조된 슬라이드는 추후 사용을 위해 4°C에서 보관할 수 있다.
참고: 이 단계는 매우 중요한 단계입니다. 완전한 코팅이 필요합니다. 초파리와 그 배아의 경우,이 슬라이드 코팅 접근법은 폴리 라이신 코팅보다 더 효율적으로 보입니다.
3. 초파리 배아 임베딩
-
초파리 배아 수집
참고 : 우리는 초 파리 배아를 0-2 시간 (싱크 리얼 블라스토 배엽), 2-3 시간 (세포 배반엽), 3-12 시간 (초기 gastrula) 및 12-24 시간 (후기 gastrula)18의 4 기간에 수집했습니다. 각 기간에서 주요 배아 유형의 비율은 표 1에 나타내었다.- 플라스틱 수집 병에 400-500 마리의 파리를 넣고 효모 추출물이 들어있는 포도 주스 한천 접시로 병을 덮으십시오. 초파리 배아는 실온에서 포도 주스 한천 위에 놓여진다.
- 4 기간의 배아를 수집하고, 각 플레이트에 PBS 2 mL (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)를 부드럽게 첨가하여 배아를 부유시켰다. 약 200개의 배아를 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 2분 동안 얼음 위에 두어 배아를 정착시킨다.
- 사전 임베딩
- 초파리 배아 200개를 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 2 분 동안 보관하여 배아를 정착시킨 다음 피펫으로 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 튜브에 50% 표백제 1mL를 넣고 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.
참고 : 표백제는 신선하게 준비해야하며 표백제의 양은 수집 된 배아의 양에 따라 달라질 수 있습니다. - 여과지에 부어 배아를 부드럽게 모으고 매번 PBS 1 mL로 3 번 씻으십시오.
- 배아를 여과지로 약 5 mL의 n-헵탄으로 옮긴다.
- 혼합물을 신선한 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 메탄올 1 mL를 첨가하고 부드럽게 흔든다. 침강 후 배아를 수집하십시오.
- 상층액을 제거하고 배아를 PBS 1 mL로 3-5회 세척한다.
- 배아를 400μL의 Bouin 용액(71% 포화 피크르산, 24% 포르말린, 5% 아세트산)으로 30분 동안 고정시킵니다. 고정된 배아를 매번 5분 동안 PBS 1 mL에 3회 세척한다.
- 배아를 응집시키려면, 샘플을 고무 마개로 옮기고 PBS를 제거한다.
- 1.2% 아가로스-PBS 용액을 준비하고 용액을 60°C로 유지한다. 200 μL의 1.2% 아가로스-PBS 용액을 배아 상에 첨가하여 한천 블록에 고정시킨다.
- 스토퍼에서 블록을 꺼내 PBS에 저장하십시오.
참고 : 사전 임베딩 접근법 중에 프로 워밍은 성공을 위해 중요합니다. 우리는이 단계에서 사용될 원심 분리 튜브 및 마이크로 피펫 팁이 작동하기 전에 완전히 미리 따뜻해야한다고 강력히 제안합니다.
- 초파리 배아 200개를 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 2 분 동안 보관하여 배아를 정착시킨 다음 피펫으로 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 튜브에 50% 표백제 1mL를 넣고 2분 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.
- 파라핀 임베딩
- 미리 포매된 한천 블록을 각각 15분 동안 35% 에탄올, 50% 에탄올, 75% 에탄올 및 85% 에탄올에 담그십시오. 그런 다음 95 % 에탄올과 100 % 에탄올에 2 번 담그십시오.
참고 : 블록의 배아 수에 따라 각 블록 부피의 약 5-10 배에 이어 15-30 분 동안 등급이 매겨진 고정제가 필요합니다. - 배아 블록을 100% 에탄올 및 자일렌(1:1 비율) 용액에 15분 동안 담그십시오.
- 블록을 1분 동안 자일렌으로 옮겨 배아 조직을 투명하게 만든다.
- 블록을 자일렌과 파라핀 (1:1 비율)에 30분 동안 잠급니다.
- 블록을 파라핀 I, 파라핀 II 및 파라핀 III에 각각 2 h 동안 침지시킨다.
- 임베딩 박스를 미리 파라핀으로 채운 다음 블록을 부드럽게 수평으로 임베딩 박스 하단으로 옮깁니다. 파라핀이 자연적으로 응고된 후, 고형화된 파라핀 블록은 4°C에서 저장될 수 있다.
참고: 사전 내장된 샘플은 다음 단계에 따라 냉동 절제에 사용할 수 있습니다. 배아가 전술한 바와 같이 아가로오스로 미리 포매된 후에, 샘플은 단순히 OCT 화합물에 포매된다. 그 후, 냉동 절제술은 일상적인 냉동 절제 프로토콜에 따라 수행 될 수 있습니다. 이어서, 규칙적인 염색 접근법이 절편에 사용될 수 있다.
- 미리 포매된 한천 블록을 각각 15분 동안 35% 에탄올, 50% 에탄올, 75% 에탄올 및 85% 에탄올에 담그십시오. 그런 다음 95 % 에탄올과 100 % 에탄올에 2 번 담그십시오.
4. 헤마톡실린-에오신 염색
- 초파리 배아 섹션을 준비하십시오. 준비된 절편을 60°C의 오븐에 15분 동안 놓은 다음, 절편을 각각 10분 동안 2회 크실렌에 침수시킨다. 절편을 100% 에탄올과 자일렌(1:1 비율)에 1회 2분 동안 잠급니다.
- 절편을 100% 에탄올 I, 100% 에탄올 II, 95% 에탄올, 85% 에탄올, 75% 에탄올, 50% 에탄올 및 증류수에서 3분 동안 수화시킨다.
- 2 분 동안 헤마 톡실린 용액으로 절편을 얼룩지게하십시오. 슬라이드를 1% 산 알코올 용액(염산 1 mL, 70% 에탄올 100 mL)에 빠르게 담그고 슬라이드를 증류수로 세척한다.
- 슬라이드를 50% 에탄올, 75% 에탄올, 85% 에탄올 및 95% 에탄올에 순차적으로 담그십시오.
- 1 분 동안 에오신 용액으로 섹션을 얼룩지게하십시오.
- 슬라이드를 95% 에탄올 I, 95% 에탄올 II, 95% 에탄올 III, 100% 에탄올 I, 100% 에탄올 II 및 100% 에탄올 III에서 각각 1분 동안 탈수시킨다.
- 슬라이드를 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 매번 5분 동안 클리어합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 중립 balsam으로 슬라이드를 장착하십시오.
5. 주기적인 산-은 메테나민 염색
- 초파리 배아의 파라핀 부분을 증류수로 탈파라핀화하고 수화시킨다.
- 절편을 실온에서 15분 동안 1% 주기적 산으로 산화시킨다.
- 슬라이드를 증류수에서 각각 1분 동안 3회 헹구십시오.
- 슬라이드를 약 40 mL의 갓 여과된 은 메테나민 작업 용액(3% 메테나민, 5% 질산은, 5% 붕산나트륨 용액)에 넣고 60°C에서 1시간 및 20분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 1 분 동안 헹구십시오.
- 슬라이드를 0.2% 염화금으로 2분 동안 톤한 다음, 슬라이드를 증류수에서 1분 동안 헹구었다.
- 슬라이드를 3분 동안 3% 티오황산나트륨에 넣은 다음, 슬라이드를 증류수에서 1분 동안 헹구었다.
- 슬라이드를 헤마톡실린에서 30초 동안 반염색합니다. 달리기 수돗물에 슬라이드를 3-5 분 동안 씻으십시오.
- 슬라이드를 각각 5분 동안 70% 에탄올, 80% 에탄올, 95% 에탄올 I, 95% 에탄올 II, 95% 에탄올 III, 100% 에탄올 I, 및 100% 에탄올 II에서 탈수시킨다.
- 슬라이드를 각각 5분 동안 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 클리어합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 중립 balsam에 슬라이드를 장착하십시오.
6. 면역조직화학
- 초파리 배아의 파라핀 절편을 표준 프로토콜19에 따라 PBS로 탈파라핀화하고 재수화시킨다.
- 실온에서 10 분 동안 메탄올 중 0.3 % H2O2로 슬라이드를 처리하고 빛을 피하십시오.
- 적절한 항원 검색 버퍼를 식물성 증기선에서 슬라이드가 있는 용기 내에서 대략 100°C로 예열한다. 컨테이너에는 뚜껑도 있어야합니다. 슬라이드를 컨테이너에 넣습니다. 증기선의 뚜껑을 닫습니다.
- 이 시점부터 20 분 동안 용기를 증기선에 보관하십시오. 슬라이드 용기의 뚜껑을 완전히 조여서 김이 나는 과정에서 수증기가 들어갈 수 있도록해서는 안됩니다.
- 슬라이드를 실온으로 복귀시킨 후 PBS-T(PBS with Tween-20, pH 7.2)로 3회 5분 동안 부드럽게 헹구고, 슬라이드를 PBS로 각각 1분 동안 3회 헹구었다.
- 슬라이드를 실온에서 60분 동안 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단한다.
- 슬라이드를 1차 항체(1:1000에서 항-FKBP12)로 4°C에서 밤새 또는 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
- 슬라이드를 PBS-T로 각각 5분 동안 4회 세척한다.
- 슬라이드를 이차 항체(항토끼, 1:5,000)와 접합된 HRP 표지된 중합체와 함께 실온에서 90분 동안 적용한다. 사진 표백을 피하기 위해 어둠 속에서이 작업을 수행하십시오.
- 슬라이드를 PBS-T로 각각 5분 동안 3회 세척한다.
- 슬라이드를 5% 3,3'-디아미노벤지딘-테트라하이드로클로라이드(DAB)로 2-10분 동안 현미경 하에서 반응 생성물의 색상이 적절해질 때까지 인큐베이션한다.
- 슬라이드를 헤마톡실린으로 30초 동안 반염색하고 슬라이드를 증류수로 각각 5분 동안 2회 세척한다.
- 슬라이드를 각각 1분 동안 50% 에탄올, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올 및 100% 에탄올로 탈수시킨다.
- 슬라이드를 각각 5분 동안 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 클리어합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 중립 balsam에 슬라이드를 장착하십시오.
7. 현장 혼성화
참고: 초파리 배아 절편은 0.01% 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리수로 제조하였다. 현장 혼성화에 사용되는 모든 액세서리 는 DEPC 하룻밤 처리를 미리 적용합니다.
- 리보프로브 준비
- 주형 DNA를 선형화하여 5' 오버행을 생성하는 제한 효소를 사용하여 클로닝된 삽입물로부터 하류의 제한 효소 부위에서 절단한다. 선형화 후, 페놀/클로로포름 추출 및 후속 에탄올 침전을 통해 주형 DNA를 정제한다. 표준 프로토콜을 사용합니다.
- 정제된 주형 DNA 1 μg을 RNase가 없는 원심분리 튜브에 첨가한다. 원심 분리기 튜브를 얼음 위에 놓습니다. DEPC 처리된 물을 총 부피 13 μL에 충분히 첨가한다.
- 그런 다음 다음 시약을 순서대로 첨가한다: 2 μL의 10x NTP 표지 혼합물, 2 μL의 10x 전사 완충액, 1 μL의 보호기 RNase 억제제, 2 μL의 RNA 폴리머라제 SP6 또는 RNA 폴리머라제 T7.
- 피펫팅과 원심분리기로 반응을 짧게 혼합한다. 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 더 긴 인큐베이션은 표지된 RNA의 수율을 증가시키지 않는다. 반응 튜브에 적용된 짧은 스핀 (~ 800 rpm)은 다음 단계를 계속하기 전에 필요합니다. 이 스핀은 인큐베이션에서 생성 될 수있는 모든 내용물이 튜브의 바닥으로 올 수있게합니다. - 2 μL의 RNase-free DNase I을 첨가하여 주형 DNA를 제거하고 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 2 μL의 200 mM EDTA (pH 8.0)를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
참고: DIG 표지된 RNA 프로브는 1년 동안 에탄올 중에서 -15 내지 -25°C에서 저장될 수 있다.
- 초파리 배아 섹션의 사전 혼성화
- 초파리 배아의 절편을 42°C 오븐에 48시간 동안 놓는다.
- 슬라이드를 100% 자일렌에서 10분 동안 두 번 분리하십시오.
- 슬라이드를 5분 동안 100% 에탄올, 95% 에탄올, 90% 에탄올, 70% 에탄올 및 50% 에탄올에 순차적으로 침수시켜 수화시킨다.
- 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 3회 인큐베이션하여 조직으로부터 고정 용액/Bouin의 용액을 제거하였다.
- 슬라이드를 100 mmol/L 글리신/PBS 용액으로 각각 5분 동안 2회 세척한다.
- 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 2회 세척한다.
- 슬라이드를 PBS 중의 0.3% 트리톤 X-100으로 15분 동안 인큐베이션하여 멤브레인을 투과시킨다.
- 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척한다.
- 슬라이드를 15 μg/mL RNase-free 프로테이나제 K에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 슬라이드를 PBS 중의 4% 파라포름알데히드로 3분 동안 인큐베이션하여 소화를 정지시킨다.
- 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 2회 세척한다.
- 슬라이드를 100 mM 트리에탄올아민 완충액 (pH 8.0)에서 0.25% (v/v) 아세트산 무수물과 함께 각각 5분 동안 2회 인큐베이션한다.
- DEPC 물을 슬라이드 수분 챔버에 넣으십시오. 슬라이드에 20μL의 사전 혼성화 용액(연어 정자 DNA 100μg/mL 포함)을 추가합니다. 슬라이드를 슬라이드 수분 챔버에 넣으십시오. 슬라이드를 42°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
참고 : 젖은 상자의 뚜껑의 견고성을 보장하고 젖은 상자는 사전 혼성화 용액과 후속 하이브리드화 용액의 조직으로부터의 휘발 및 편차를 방지하기 위해 항상 수평으로 유지되어야합니다.
- 초파리 배아 섹션의 혼성화
- 예비 혼성화 용액을 제거하고 슬라이드를 각각 5분 동안 0.2x SSC(150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산나트륨, pH 7.0)로 3회 세척한다. 조직 샘플 주위의 0.2x 초과 SSC를 닦아냅니다.
- 30 μL의 프로브 혼성화 용액 (사전 혼성화 용액으로 희석하여 2-6 ng의 디곡신 표지 RNA 프로브 포함)을 피펫으로 적용하십시오. 슬라이드를 대략 20 h 동안 42°C에서 슬라이드 수분 챔버 내에서 인큐베이션한다.
참고 : 마지막 메모의 제안으로 캡 견고성을 확인하십시오. 그렇지 않으면, 사전 혼성화 또는 사전 혼성화의 누출로 인한 드라이업은 슬라이드에서 의사 양성을 포함한 더러운 배경을 생성합니다.
- 교 잡
- 혼성화 용액을 제거하고 슬라이드를 4x SSC 용액으로 37°C에서 각각 15분 동안 4회 세척한다.
- 슬라이드를 2x SSC 용액에서 20 μg/mL의 RNase A로 37°C에서 30분 동안 세척한다.
- 슬라이드를 37°C에서 15분 동안 1x SSC 용액으로 세척한다.
- 슬라이드를 37°C에서 15분 동안 0.5x SSC 용액으로 세척한다.
- 슬라이드를 37°C에서 15분 동안 0.1x SSC 용액으로 세척한다.
- 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척한다.
- 슬라이드를 세척 완충액 (100 mM 말레산, 150 mM NaCl, 0.3% (v/v) 트윈 20, pH 7.5)에서 1분 동안 세척한다.
- 슬라이드를 갓 제조된 블로킹 용액 100 mL(트윈 20이 없는 말레산 완충액 중 2% 양 혈청)에 30분 동안 인큐베이션한다.
- 슬라이드를 20 mL의 항체 용액에서 45분 동안 인큐베이션한다.
- 항체를 각 사용 전에 원래의 바이알에서 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 필요한 양을 표면으로부터 조심스럽게 피펫팅한다. 항-디곡시게닌-AP 1:5000 (150 mU/mL)을 블로킹 용액에 희석하십시오.
- 슬라이드를 100 mL의 세척 완충액으로 각각 15분 동안 2회 세척하여 결합되지 않은 항체 접합체를 제거하였다.
- 슬라이드를 2-5분 동안 20 mL의 검출 완충액 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5)에서 평형화시킨다.
- 슬라이드를 갓 준비된 컬러 기판 용액 10 mL와 함께 슬라이드 수분 챔버에서 인큐베이션한다. 반응은 몇 분 안에 시작되고 16 시간 후에 완료됩니다. 색상이 변하는 동안 흔들거나 섞지 마십시오.
- 슬라이드를 50 mL의 증류수로 5분 동안 세척하여 반응을 중지시킨다.
- 어둠 속에서 밤새 샘플을 말리십시오.
- 슬라이드를 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올 I 및 100% 에탄올 II에서 각각 3분 동안 탈수시킨다.
- 슬라이드를 각각 20분 동안 100% 자일렌 I, 100% 자일렌 II 및 100% 자일렌 III에서 클리어합니다.
- 중립 발삼으로 슬라이드를 장착하십시오.
- 반전된 현미경 및 제조업체 소프트웨어로 이미지를 문서화하고 분석합니다. ImageJ를 사용하여 세로 축을 따라 또는 배아의 차동 영역 내에서 양성 신호의 밀도에 따라 분포 분석을 수행합니다.
참고: 단계 7.4.12에서 갓 준비된 컬러 기판 용액과 함께 인큐베이션하는 동안, 반응 색상은 맨눈으로 볼 수 있다. 색상 발달이 어떻게 스테레오 스코프로 검사 될 수 있는지에 대한이 관찰. 일단 반응 색상이 합리적이면 단계 7.4.13을 수행하여 반응을 중지시킬 수 있다.
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Representative Results
도면은 시험 및 실험을 위해 높은 지질 및 키틴 함유 초파리 배아 (표 1)를 유리 슬라이드 표면에 부착시키는 문제를 극복하기 위해 사용되는 프로토콜을 설명합니다. 그림 1에 표시된 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 방법을 활용하여 슬라이드 표면에 초파리 배아의 부착을 강화했으며, 그림 2에 표시된 배아 사전 임베딩 방법을 사용하면 네 가지 초기 개발 단계 (즉, 세포 배반배엽, 세포 배반엽, 초파리 배아의 초기 및 후기 gastrula). 도 3은 세포융합 및 세포성 배반배엽 단계에서 검출된 FKBP12/Calstabin 항체의 단백질 분포를 보여준다. 이러한 조직화학적 결과로부터, FKBP12 발현은 동시성 배반배엽(패널 A 내지 H)에서 덜 편광되고, 이어서 트로피토배엽 상피 아래의 기저막 내에서 국소화되기 시작하여 후방극(패널 I 내지 S)보다 전방에서 더 많은 발현과 함께 구배를 형성한다는 것을 알 수 있다. 결국, DmFKBP12/Calstabin 단백질은 초기 및 후기 가스트룰라 배아 단계에서 관찰된 것보다 세포외 분포가 적은 원시 배아 조직의 특정 건축 성분으로 제한된다(그림 4). 흥미롭게도, 전술한 동적 단백질 분포는 DmFKBP12의 상응하는 mRNA 수준을 수반하지 않으며(도 5), 단백질 발현은 아직 알려지지 않은 전사 후 분자 메커니즘의 결과임을 나타낸다. CAG 슬라이드 코팅 및 사전 임베딩의 설명 된 방법은 우리가 칼슘 신호 전달에서 DmFKBP12의 중요성을 더 조사하고 마이크로 주입 RNA 간섭19와 같은 다른 기술을 결합하면서 아직 알려지지 않은 분자 메커니즘을 발굴 할 수있게 해줍니다.
이 연구에서, 우리는 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 및 다른 개발 단계에서 초파리 배아의 조직학, 조직 화학 및 면역 조직 학적 분석을위한 사전 임베딩 방법을 개발합니다. 이 사전 임베딩 방법을 사용하여, 배아는 종방향 단면의 분석을 허용하는 냉동 및 파라핀 단면화 둘 다를 위해 효과적으로 수집된다. 이를 통해 우리는 결정적인 발달 단계에서이 단백질의 진화하는 발현 패턴을 설명 할 수 있었으며, 단백질의 발현을 장, 뇌 및 연결 신경계와 같은 주요 생리 시스템의 발달과 연결했습니다. 이러한 방법을 사용함으로써, 우리는 동시성 및 세포 배모엽 및 초기 및 후기 gastrulation 단계를 포함한 최종 단계에서 초파리 배아의 발달 동안 단백질 및 mRNA FKBP12 / Calstabin을 조절하는 RyR 의 동적 분포를 조사 할 수있었습니다. 우리의 데이터는 FKBP12 / Calstabin 단백질과 그 RNA가 세포융합 배반엽에서 매우 일찍 검출 될 수 있음을 보여주었습니다. 배아가 발달함에 따라, FKBP12는 배반엽의 상피 아래의 기저 세포층에 더 조밀하게 분포된다. FKBP12 / Calstabin 단백질은 그 발현을 동적으로 강화하고 스토모다움, 스토모다움 및 후부 중추 기초를 포함한 배아 근육 함유 조직으로 분포를 분화시킵니다. 배반배엽의 시작부터 후기 위축 단계까지의 이러한 분포 변화는 또한 신경 아세포, 복부 신경, 식도 신경절 및 뇌를 포함한 발달하는 신경 시스템에 기술되어 있습니다. FKBP12 / Calstabin의 이러한 역동적 인 변화는 개발에서의 중요성을 암시하지만, 단백질의 mRNA 수준에 반영되지 않아 아직 밝혀지지 않은 단백질 발현 조절자를 암시합니다.
그림 1: 초파리 배아에서 DmFKBP12 단백질 및 mRNA의 분포를 시각화하기 위해 면역학 및 RNA 인-시츄 혼성화에 사용되는 파라핀 절편에 대한 크롬 명반 젤라틴(CAG) 코팅 방법의 스케치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 초파리 배아 발달에서 FKBP12 및 DmFKBP12의 발현 프로필에 대한 사전 임베딩 방법의 스케치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 초파리 배아의 세포융합 및 세포 배모세포에서 DmFKBP12 단백질의 발현 프로필. (A-D) 동기화 배반엽의 H&E 염색. 초기 세포융합 배반배엽에서의 DmFKBP12 분포의 정량화는 D. (E-G) 패널에서 제시되며, 핵이 분열되고 있는 초기 세포융합 배반배엽이 존재한다. 후기 세포융합 배반배엽에서의 DmFKBP12 분포의 정량화는 H로 제시된다. (I-L) 세포 배반엽의 H&E 염색. 후기 세포 배반배엽에서의 DmFKBP12 분포의 자격은 L. (M-S) 패널에 제시되어 세포 배반배엽에서 DmFKBP12 단백질의 분포를 나타낸다. O는 M-N의 더 큰 뷰를 보여줍니다. (P-R) 패널은 M-O에 나타난 초기 세포 배반엽을 존재한다. 초기 세포 배모엽에서의 DmFKBP12 분포의 정량화는 A, E, I, M 및 P에 대한 S. 스케일 바에 제시되어 60 μm이고, B, C, F, J, K, N, Q 및 R은 40 μm이고, G에 대해, O는 20 μm이다. YK, 노른자; CN, 절단 핵; PP, 계란의 후방 극; BLD, 블라스토덤, 핵 및 세포; BM, 기저막. 데이터는 평균± SEM으로 표현된다. *p<0.05, **p< 0.01, ***p<0.001이다. 데이터 정량화는 ImageJ로 수행되었다. 첫째, 갈색 제품은 다른 모든 색상을 제거하는 것과 함께 이미지에 남아 있습니다. 둘째, 갈색 이미지가 흑백으로 변경되어 결과적으로 정량화를 위해 밀도를 계산했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 초파리 배아의 초기 및 후기 위축적 단계에서 DmFKBP12 단백질의 발현 프로필. A, D 및 G는 위축 단계에서 초파리 배아의 H & E 염색을 보여줍니다. B, C, E 및 F는 초기 가스트레이션 단계에서 DmFKBP12의 분포를 표시합니다. H, I 및 J-L은 후기 가스트레이션 단계에서 DmFKBP12의 분포를 표시한다. 초기 가스질래에서의 DmFKBP12 분포의 정량화는 A, D, E 및 G에 대한 M. 스케일 바는 80 μm이고, B, C, F, H, I 및 J-L은 40 μm이다. NBL, 신경 아세포; ST, 스토모다움; YK, 노른자; PMG, 후부 중추 기초; BR, 뇌, 식도 신경절; VNS, 복부 신경계; PV, 입증 된 것; MUS, 근육; MGC, 중장암; AMG, 전방 중장 루디피기안; MMG, 중간 중장; TR, 기관지. 데이터는 평균± SEM. ns로 표현되며, 유의하지 않음; ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터 정량화는 ImageJ 1.50d로 제품 갈색을 유지하고 흑백 이미지로 변경하고, 이전 그림 범례에 설명 된대로 흑백의 밀도 계산에 의해 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 초파리 배아의 배아 발달 동안 DmFKBP12 mRNA의 계내 국소화 . A는 FKBP12 mRNA가 배아의 세포질에서 발현되었을 때 세포주배엽 단계에서 DmFKBP12 mRNA의 계내 국소화를 보여준다. B 및 C는 FKBP12 mRNA가 배반배엽 세포의 내부 한계에서 발현되었을 때 세포 배반엽 단계에서 DmFKBP12 mRNA의 계내 국소화를 보여준다. D 및 E는 초기 gastrulation 단계에서 FKBP12 mRNA의 계내 국소화를 나타낸다. 이 단계에서 주로 개발 창자에 국한됩니다. F, G 및 H는 mRNA가 근육 및 내장에서 발현될 때 후기 위태 단계에서 FKBP12 mRNA의 계내 국소화를 보여준다. I는 DmFKBP12 mRNA의 양성 대조군이다. J는 DmFKBP12 mRNA의 음성 대조군이다. A, C, E, G 및 I에 대한 스케일 바는 5 μm이고, B, D, F, I 및 J에 대해서는 10 μm이다. CN, 절단 핵; BLD, 배반배엽, 핵 및 세포; CF, 전방 비스듬한 구순구개, 두개 고랑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 배아 단계 | 0-2시간(%) | 2-3시간 (%) | 3-12시간 (%) | 12-24시간 (%) |
| 싱크로시얼 블라스토더름 | 90.8 | 0 | 0 | 0 |
| 세포 배반충 | 6.9 | 91.54 | 0 | 0 |
| 초기 가스트룰라 | 2.3 | 4.23 | 91.1 | 0 |
| 후기 가스트룰라 | 0 | 4.23 | 8.93 | 93.3 |
표 1: 초파리 멜라노가스터의 발달에 있는 다른 단계의 배아 수집
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Discussion
RyRs 및 IP3Rs 매개 칼슘 신호 전달은 척추 동물 및 무척추 동물 모두의 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정에서 근본적인 경로입니다1,2,3,4. 인간에서, RyR2 유전자에서 CPVT 관련 R4496C 돌연변이와 같은 점 돌연변이는 심근세포의 사르코플라스마 망상으로부터 칼슘 누출을 유발하여, 심장 기능 장애를 초래한다. 이러한 돌연변이는 신체 활동 중 갑작스런 심장 사망의 위험이 높은 부정맥으로 존재하며,이 돌연변이를 운반하도록 설계된 마우스 모델에서 재현 가능합니다. 운동 조건 하에서,이 칼슘 누출 돌연변이를 가진 마우스는 야생형 카운터 파트에 의해 입증되지 않은 심장 갑작스런 사망을 경험했습니다.18,20,21,22. 심장에서 RyRs 조절자인 FKBP12의 과발현은 마우스 모델22,23에서 심장 사망과 관련된 칼륨 채널의 높은 비율과 상응하였으며, 이는 FKBP12 녹아웃 마우스10,11의 표현형과 상응한다는 발견이다. RyR1, RyR 2 및 RyR3 및 그 조절자 FKBP를 포함한 포유류 RyRs가 30 년 이상 잘 연구되어 왔기 때문에 심장 병리학, 골격 근육 기능 장애 및 조기 발달 후 뇌 기능 성취와 종양발생과 관련된 대부분의 절차가 연구의 초점입니다.24,25.
RyR의 세 가지 이소형을 가진 척추 동물과는 달리, 초파리 파리는 단 하나의 RyR1,2,3,5를 가지고 있습니다. 최근에, 우리는 초파리 배아 발달의 초기 단계에서 초파리 RyR (DmRyR)의 중요한 기능을 시연했습니다. 우리는 초기 발달 동안 초파리 배아의 번역 및 전사 수준 모두에서 DmRyR 발현을 풀었습니다 : 동기화 된 배반엽 단계, 배반엽 단계 및 초기 gastrula 단계. 네 단계 모두에서, DmFKBP12 mRNA는 배아 전체에 고르게 분포되어 동일한 수준으로 유지되는 반면, 유전자의 단백질 발현은 발현 프로필이 전방으로 편광된 후 특정 세포층에 분포되어 매우 역동적이었다19. 이 간행물에서 활용 한 방법론 적 프로토콜은 많은 양의 대표 결과를 얻는 능력에 중요했습니다.
파라핀 절편은 정량 분석을 위한 단백질 발현의 조직학적 검출을 위한 기본적이고 실용적인 기술이다. 파라핀 섹션은 성인 곤충에서 단백질 발현을 연구하기위한 기본 도구입니다. 그러나 이러한 기술은 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온으로 인해 곤충 개발에서 복제하기가 어려웠으며 이로 인해 매립, 보존 및 슬라이드 장착이 어려워졌습니다. 배아에서 발견되는 지질은 배아 절편을 슬라이드 표면에 부착 할 수있는 힘을 방해합니다. 합창단에서 발견되는 키틴은 화학적 및 기계적 간섭으로부터 배아를 보호하는 물리적 장벽을 제시하지만 배아 샘플의 부착을 유리 슬라이드로 제한합니다. 이러한 특성은 곤충 유충의 더 높은 생존율을 보장하지만, 이는 현장 단백질 및 mRNA 발현을 연구하는 능력을 크게 방해합니다. 이 문제는 여러 가지 방법으로 문제 해결되었습니다. Tween-20과 같은 표면 세제의 사용은 종종 초파리 배아를 분리하고 연구에 사용할 수있는 배아의 수를 줄입니다. 이 기술은 계 내 혼성화를 위한 mRNA를 공개하기 위해 20시간 동안 인큐베이션을 필요로 하지만, 슬라이드로부터 샘플을 거의 완전히 분리한다. mRNA에 대한 면역조직화학 및 안티센스 특이적 인식을 수행하기 전에 크롬 명반 젤라틴(CAG)으로 유리 슬라이드를 코팅하는 기술은 배아와 유리 슬라이드 사이의 부착을 강화함으로써 이러한 기술적 장벽을 해결한다.
CAG 강화된 부착에 추가하여, 기술된 초 파리 배아 사전-매립 기술은 정확하게 연대화된 초파리 배아의 다수의 수확을 허용한다. 이를 통해 우리는 초기 배아 발달의 다양한 단계에서 DmFKBP12 / Calstabin 의 동적 발현을보고했습니다. 우리가이 기술을 사용하여 연구 할 수 있었던 가장 초기 단계는 덜 차별화 된 분포와 일반적으로 낮은 수준의 표현을 보여준 동기화 된 blastoderm 단계입니다. 세포 배반엽 및 gastrula 단계에서 배아를 연구함으로써, 우리는 배아가 발달하고 국한화되기 시작함에 따라 DmFKBP12 / Calstabin의 일반적인 수준이 증가한다는 것을 발견했습니다. 연구 결과는 칼슘 신호 전달에 관여하는 FKBP12 가 초기 발달에 중요한 역할을하고 초파리 멜라노가스터 발달에 중요한 역할을하는 분화를 시사한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (#31771377 / 31571273 / 31371256), 국립 교육부 (#MS2014SXSF038)의 외국 저명한 과학자 프로그램 (National Department of Education Central Universities Research Fund) (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45)의 지원을 받았으며 XZ는 우수 박사 학위 논문 기금 (#2019TS082 / 2019TS079), 산시 성 교육부의 핵심 프로그램 (#20JS138), 산시 성 과학 기술부의 자연 과학 기초 연구 프로그램 청소년 프로젝트 (#2020JQ-885).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
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