Summary
Aquí, describimos un protocolo para la detección y localización de la proteína embrionaria de Drosophila y el ARN desde la recolección hasta la preincrustación e incrustación, la inmunotinción y la hibridación in situ de ARNm.
Abstract
La señalización de liberación de calcio inducida por calcio (CICR) juega un papel crítico en muchos procesos biológicos. Todas las actividades celulares, desde la proliferación celular y la apoptosis, el desarrollo y el envejecimiento, hasta la plasticidad sináptica neuronal y la regeneración, se han asociado con los receptores de rianodina (RyR). A pesar de la importancia de la señalización del calcio, el mecanismo exacto de su función en el desarrollo temprano no está claro. Como organismo con un período gestacional corto, los embriones de Drosophila melanogaster son sujetos de estudio principales para investigar la distribución y localización de las proteínas asociadas a CICR y sus reguladores durante el desarrollo. Sin embargo, debido a sus embriones ricos en lípidos y corion rico en quitina, su utilidad está limitada por la dificultad de montar embriones en superficies de vidrio. En este trabajo, presentamos un protocolo práctico que mejora significativamente la unión del embrión de Drosophila en diapositivas y detallamos los métodos para una histoquímica, inmunohistoquímica e hibridación in situ exitosas. El método de recubrimiento deslizante de gelatina de alumbre de cromo y el método de preincrustación de embriones aumenta drásticamente el rendimiento en el estudio de la proteína embrionaria de Drosophila y la expresión de ARN. Para demostrar este enfoque, estudiamos DmFKBP12/Calstabina, un conocido regulador de RyR durante el desarrollo embrionario temprano de Drosophila melanogaster. Identificamos DmFKBP12 ya en la etapa de blastodermo sincitial e informamos el patrón de expresión dinámica de DmFKBP12 durante el desarrollo: inicialmente como una proteína distribuida uniformemente en el blastodermo sincitial, luego localizando preliminarmente en la capa basal de la corteza durante el blastodermo celular, antes de distribuirse en la arquitectura neuronal y de digestión primitiva durante la fase de la capa de tres gemas en la gastrulación temprana. Esta distribución puede explicar el papel crítico que desempeña RyR en los sistemas de órganos vitales que se originan en estas capas: el ganglio suboesofágico y supraesofágico, el sistema nervioso ventral y el sistema musculoesquelético.
Introduction
La señalización de liberación de calcio inducida por calcio (CICR) desempeña un papel fundamental en muchos procesos biológicos, como el músculo esquelético/liso y la función vascular cardíaca, la proliferación celular y la apoptosis, el desarrollo, el envejecimiento, la plasticidad sináptica neuronal y la regeneración1,2,3,4,5,6 . Los receptores de rianodina (RyR) y los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son actores importantes en la vía de señalización del calcio controlada por sus reguladores proteína quinasa A (PKA), proteína quinasa II dependiente de Ca2+ / calmodulina (CaMKII), proteínas de unión a FK506 (FKBP), calsequestrina (CSQ), triadina y junctina1,2,3,4,5,6 . La expresión humana anormal y las mutaciones en estas proteínas pueden conducir a fisiología patológica como arritmias7 y proliferación oncogénica8,9.
Los FKBP regulan la liberación de calcio del reticular endoplásmico (RE) por los RyRs. Este proceso es esencial para el mecanismo de contracción y, por lo tanto, responsable de todo el movimiento mecánico generado por la contracción de miosina-actina a través de la liberación de calcio inducida por calcio junto con los RyR embrionarios1,2. En modelos de ratón, la falta de RyR2 y su regulador FKBP12/Calstabina es invariablemente letal, ya sea durante el desarrollo embrionario o en el período postnatal temprano10,11,12. Los ratones knockout FKBP12/Calstabin exhiben defectos cardíacos críticos con acoplamiento irregular excitación-contracción (CE) y edema cerebral durante el desarrollo embrionario. Esto indica que FKBP12/Calstabina juega un papel esencial en la regulación de la expresión del canal RyR2, que es importante tanto para el desarrollo cardíaco como cerebral10.
Las chispas de calcio conducidas por RyR se descubrieron inicialmente en la fase de formación de cigotos de los huevos de Medaka fertilizados13,14. Sin embargo, se han realizado pocas investigaciones sobre la función de la señalización del calcio en el desarrollo embrionario temprano. En Drosophila melanogaster, los resultados obtenidos de los mutantes DmFKBP12 S107 proporcionan una fuerte evidencia que respalda la importancia de este gen para el desarrollo larvario y una vida saludable, lo que se atribuye a su función contra el estrés oxidativo15,16. Recientemente, identificamos la localización dinámica de la proteína FKBP12/Calstabina y el ARN mensajero durante el desarrollo temprano de Drosophila melanogaster17. Utilizando los enfoques descritos en esta metodología, pudimos rastrear la expresión de FKBP12/Calstabina en D. melanogaster durante el blastodermo sincitial (0-2 h), blastodermo celular (2-3 h), gastrula temprana (3-12 h) y gastrula tardía (12-24 h). En este artículo, presentamos los protocolos detallados de cada enfoque en el estudio anterior, incluida la incrustación preembrionaria para la sección clásica de parafina, el tratamiento con diapositivas de pre-recubrimiento para secciones embrionarias, la tinción histoquímica y la inmunotinción, y la hibridación in situ de ARNm para la identificación de la expresión génica.
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Protocol
1. Preparación de platos de agar de jugo de uva
- Añadir 5 g de agar y 5 g de sacarosa a 150 ml de agua destilada. Hervirlo con un microondas hasta que el agar y la sacarosa se disuelvan por completo. Mezcle 50 ml de jugo de uva 100% y la solución juntos.
- Añadir 1 ml de ácido propiónico al 100% para hacer la concentración final al 0,5% de ácido propiónico. Vierta 25 ml de la solución preparada en cada plato. Después de que el agar se haya solidificado, guarde el medio a 4 °C.
2. Revestimiento de diapositivas
- Pretratar diapositivas con detergente. Lave los toboganes 3 veces con agua del grifo y una vez con agua destilada. Luego secan los portaobjetos en un horno de 45 °C durante 2 h.
- Sumerja los portaobjetos en aproximadamente 450 ml de solución de ácido sulfúrico de dicromato de potasio (20 g de dicromato de potasio, 40 ml de agua destilada y 400 ml de ácido sulfúrico concentrado) durante 24 horas. Lave los toboganes 3 veces con agua del grifo y una vez con agua destilada.
- Seque los toboganes en un horno de 45 °C durante dos horas. Sumergir en etanol al 95% durante más de 2 h.
- Añadir 0,5 g de sulfato de cromo potasio y 5 g de gelatina a 1 L de agua destilada. Disolver en un baño de agua a 60 °C antes de su uso. La gelatina de alumbre cromado se puede almacenar a 4 °C durante largos períodos.
- Deje caer 10 μL de gelatina de alumbre cromado en la diapositiva y cubra completa y uniformemente toda la superficie de la diapositiva con la solución. Coloque el portaobjetos con el lado de gelatina hacia arriba en un horno a 42 °C durante 48 h. Las diapositivas preparadas se pueden almacenar a 4 °C para su uso posterior.
NOTA: Este es un paso crítico. El recubrimiento completo es necesario. Para la mosca de la fruta y su embrión, este enfoque de recubrimiento deslizante parece más eficiente que el recubrimiento de polilisina.
3. Incrustación de embriones de Drosophila
-
Colección de embriones de Drosophila
NOTA: Recolectamos embriones de Drosophila en cuatro períodos de 0-2 horas (blastodermo sincitial), 2-3 horas (blastodermo celular), 3-12 horas (gastrula temprana) y 12-24 horas (gastrula tardía)18. La proporción de los principales tipos de embriones en cada período se muestra en la Tabla 1.- Coloque 400-500 moscas en una botella de recolección de plástico y cubra la botella con el plato de agar de jugo de uva que contiene extracto de levadura. Los embriones de Drosophila se colocan en el agar de jugo de uva a temperatura ambiente.
- Recolectar cuatro períodos de embriones, agregando suavemente 2 mL de PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) a cada placa para flotar los embriones. Transfiera alrededor de 200 embriones a un tubo de centrífuga de 50 ml y manténgalo en hielo durante 2 minutos para asentar los embriones.
- Pre-incrustación
- Transfiera 200 embriones de Drosophila a un tubo centrífugo de 1,5 ml. Mantenga el tubo en hielo durante 2 minutos para asentar los embriones y luego deseche el sobrenadante con pipeta con cuidado. Añadir 1 ml de lejía al 50% en el tubo y agitarlo suavemente durante 2 min.
NOTA: El blanqueador debe prepararse fresco, y la cantidad de lejía puede variar dependiendo de la cantidad de embriones recolectados. - Recolecte suavemente los embriones vertiéndolos en papel de filtro y lávelos 3 veces con 1 ml de PBS en cada momento.
- Transfiera los embriones con papel de filtro a aproximadamente 5 ml de n-heptano.
- Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga fresco de 1,5 ml. Agregue 1 ml de metanol y agítelo suavemente. Recolectar embriones después de la sedimentación.
- Retire el sobrenadante y lave los embriones en 1 ml de PBS 3-5 veces.
- Fijar los embriones con 400 μL de solución de Bouin (71% de ácido pícrico saturado, 24% de formalina, 5% de ácido acético) durante 30 min. Lave los embriones fijos 3 veces en 1 ml de PBS durante 5 minutos cada vez.
- Para agregar embriones, transfiera las muestras a un tapón de goma y retire el PBS.
- Preparar la solución de agarosa-PBS al 1,2% y mantener la solución a 60 °C. Agregue 200 μL de solución de agarosa-PBS al 1,2% sobre los embriones para fijarlos en un bloque de agar.
- Saque el bloque del tapón y guárdelo en PBS.
NOTA: Durante el enfoque previo a la incrustación, el pro-calentamiento es fundamental para tener éxito. Sugerimos encarecidamente que los tubos de la centrífuga y las puntas de la micropipeta, que se utilizarán en este paso, deben calentarse completamente antes de operar.
- Transfiera 200 embriones de Drosophila a un tubo centrífugo de 1,5 ml. Mantenga el tubo en hielo durante 2 minutos para asentar los embriones y luego deseche el sobrenadante con pipeta con cuidado. Añadir 1 ml de lejía al 50% en el tubo y agitarlo suavemente durante 2 min.
- Incrustación de parafina
- Sumerja el bloque de agar preincrustado en etanol al 35%, etanol al 50%, etanol al 75% y etanol al 85% durante 15 minutos cada uno. Luego sumerja 2 veces en etanol al 95% y etanol al 100%.
NOTAS: Aproximadamente 5-10x de volumen de bloque de cada uno seguido de un fijador graduado durante 15-30 minutos es necesario dependiendo del número de embriones en el bloque. - Sumergir el bloque de embriones en solución 100% etanol y xileno (proporción 1:1) durante 15 min.
- Transfiera el bloque al xileno durante 1 minuto para que el tejido embrionario sea transparente.
- Sumerja el bloque en xileno y parafina (proporción 1:1) durante 30 min.
- Sumerja el bloque en parafina I, parafina II y parafina III durante 2 h cada vez.
- Llene la caja de incrustación con parafina de antemano y luego transfiera suave y horizontalmente el bloque a la parte inferior de la caja de incrustación. Después de que la parafina se solidifique naturalmente, el bloque de parafina solidificada se puede almacenar a 4 ° C.
NOTAS: La muestra preincrustada se puede utilizar en la crioseccion siguiendo los siguientes pasos. Después de que los embriones están preincrustados con agarosa como se describió anteriormente, las muestras simplemente se incrustan en el compuesto OCT. Posteriormente, la criosección se puede llevar a cabo de acuerdo con el protocolo de criosección de rutina. Posteriormente, se pueden utilizar enfoques de tinción regulares en las secciones.
- Sumerja el bloque de agar preincrustado en etanol al 35%, etanol al 50%, etanol al 75% y etanol al 85% durante 15 minutos cada uno. Luego sumerja 2 veces en etanol al 95% y etanol al 100%.
4. Tinción de hematoxilina-eosina
- Preparar secciones embrionarias de Drosophila . Coloque las secciones preparadas en un horno a 60 ° C durante 15 minutos y luego sumerja las secciones en xileno 2 veces durante 10 minutos cada una. Sumergir las secciones una vez en etanol al 100% y xileno (proporción 1:1) durante 2 min.
- Hidratar las secciones en 100% etanol I, 100% etanol II, 95% etanol, 85% etanol, 75% etanol, 50% etanol, y en agua destilada durante 3 min.
- Manche las secciones con solución de hematoxilina durante 2 min. Sumerja los portaobjetos en una solución de alcohol ácido al 1% (1 ml de ácido clorhídrico, 100 ml de etanol al 70%) rápidamente y lave los portaobjetos en agua destilada.
- Sumerja las diapositivas en etanol al 50%, etanol al 75%, etanol al 85% y etanol al 95% secuencialmente.
- Manche las secciones con solución de eosina durante 1 min.
- Deshidrate los portaobjetos en 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I, 100% etanol II y 100% etanol III durante 1 min cada vez.
- Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 5 minutos cada vez.
- Monte las diapositivas con bálsamo neutro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Tinción periódica de metenamina ácido-plata
- Desparafinar e hidratar las secciones de parafina del embrión de Drosophila en agua destilada.
- Oxidar las secciones en ácido periódico al 1% durante 15 min a temperatura ambiente.
- Enjuague los toboganes en agua destilada 3 veces durante 1 minuto cada uno.
- Incubar los portaobjetos en aproximadamente 40 ml de solución de trabajo de metenamina de plata recién filtrada (3% de metenamina, 5% de nitrato de plata, solución de borato de sodio al 5%) durante 1 h y 20 minutos a 60 °C. Luego enjuague los toboganes en agua destilada durante 1 min.
- Tonifica las diapositivas en cloruro de oro al 0,2% durante 2 min y luego enjuaga las diapositivas en agua destilada durante 1 min.
- Coloque los portaobjetos en tiosulfato de sodio al 3% durante 3 minutos y luego enjuague los portaobjetos en agua destilada durante 1 minuto.
- Contramanten las diapositivas en hematoxilina durante 30 s. Lave los toboganes en agua corriente del grifo durante 3-5 minutos.
- Deshidrate los portaobjetos en etanol al 70%, etanol al 80%, 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I y 100% etanol II durante 5 minutos cada uno.
- Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 5 minutos cada uno.
- Monte las diapositivas en bálsamo neutro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Inmunohistoquímica
- Desparafinar y rehidratar secciones de parafina del embrión de Drosophila a PBS siguiendo el protocolo estándar19.
- Trate los portaobjetos con 0,3% de H2O2 en metanol durante 10 min a temperatura ambiente y evite la luz.
- Precaliente el tampón de recuperación de antígenos apropiado a aproximadamente 100 °C en un recipiente con los portaobjetos en el vaporizador de verduras. El recipiente también debe tener una tapa. Coloque las diapositivas en el contenedor. Cierre la tapa del vaporizador.
- Mantenga el recipiente en el vaporizador durante 20 minutos desde este punto. Tenga en cuenta que la tapa del recipiente deslizante no debe apretarse por completo para que el vapor de agua pueda entrar durante el proceso de vaporización.
- Permita que las diapositivas vuelvan a temperatura ambiente antes de enjuagarlas suavemente en PBS-T (PBS con Tween-20, pH 7.2) 3 veces durante 5 minutos cada una, y luego enjuague las diapositivas en PBS 3 veces durante 1 minuto cada una.
- Bloquee los portaobjetos con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS durante 60 min a temperatura ambiente.
- Incubar los portaobjetos con anticuerpo primario (anti-FKBP12 a 1:1000) durante la noche a 4 °C o a temperatura ambiente durante 4 h.
- Lave las diapositivas en PBS-T 4 veces durante 5 minutos cada una.
- Aplique las diapositivas con polímero marcado con HRP conjugado con anticuerpos secundarios (anti-Conejo, 1:5.000) durante 90 min a temperatura ambiente. Haga esto en la oscuridad para evitar el blanqueamiento fotográfico.
- Lave las diapositivas en PBS-T 3 veces durante 5 minutos cada una.
- Incubar los portaobjetos con 5% 3,3'-diaminobenzidina-tetraclorhidrato (DAB) durante 2-10 min hasta que el color de los productos de reacción sea apropiado bajo microscopio.
- Contramante los portaobjetos en hematoxilina durante 30 s y lave los portaobjetos en agua destilada 2 veces durante 5 minutos cada uno.
- Deshidrate los portaobjetos en etanol al 50%, etanol al 70%, etanol al 90%, etanol al 95% y etanol al 100% durante 1 minuto cada uno.
- Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 5 minutos cada uno.
- Monte las diapositivas en bálsamo neutro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
7. Hibridación in situ
NOTA: Las secciones embrionarias de Drosophila se prepararon con agua tratada con 0,01% de dietil pirocarbonato (DEPC). Todos los accesorios utilizados para la hibridación in situ aplican de DEPC durante la noche con antelación.
- Preparación de ribosonda
- Linearice el ADN de la plantilla cortando en un sitio de enzima de restricción aguas abajo del inserto clonado utilizando una enzima de restricción que crea voladizos de 5 '. Después de la linealización, purifique el ADN de la plantilla mediante extracción de fenol / cloroformo y posterior precipitación de etanol. Utilice protocolos estándar.
- Agregue 1 μg de ADN de plantilla purificado a un tubo de centrífuga sin RNasa. Coloque el tubo de la centrífuga sobre hielo. Agregue suficiente agua tratada con DEPC al volumen total de 13 μL.
- Luego agregue los siguientes reactivos en orden: 2 μL de 10x mezcla de etiquetado NTP, 2 μL de tampón de transcripción 10x, 1 μL de inhibidor protector de RNasa, 2 μL de ARN polimerasa SP6 o ARN polimerasa T7.
- Mezclar la reacción mediante pipeteo y centrifugación en breve. Incubar durante 2 h a 37 °C.
NOTA: Las incubaciones más largas no aumentan el rendimiento del ARN marcado. Un giro corto (~ 800 rpm) aplicado en el tubo de reacción es crítico antes de continuar con el siguiente paso. Este giro permitirá que todo el contenido, que podría generarse a partir de la incubación, llegue al fondo del tubo. - Añadir 2 μL de DNasa I sin RNasa para eliminar el ADN de la plantilla e incubar durante 15 min a 37 °C.
- Añadir 2 μL de 200 mM de EDTA (pH 8.0) para detener la reacción.
NOTA: Las sondas de ARN marcadas con DIG se pueden almacenar a -15 a -25 °C en etanol durante un año.
- Prehibridación de la sección embrionaria de Drosophila
- Coloque las secciones del embrión de Drosophila en un horno de 42 °C durante 48 h.
- Desparafinar los portaobjetos en 100% xileno durante 10 min dos veces.
- Hidratar los portaobjetos sumergiéndolos secuencialmente en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 90%, etanol al 70% y etanol al 50% durante 5 min.
- Incubar los portaobjetos en PBS durante 5 min 3 veces para eliminar la solución fijadora/solución de Bouin del tejido.
- Lave los portaobjetos con 100 mmol/L de solución de glicina/PBS 2 veces durante 5 min cada uno.
- Lave las diapositivas con PBS 2 veces durante 5 minutos cada una.
- Incubar los portaobjetos con Tritón X-100 al 0,3% en PBS durante 15 min para permeabilizar las membranas.
- Lave las diapositivas con PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
- Incubar los portaobjetos en 15 μg/ml de proteinasa K libre de RNasa durante 30 minutos a 37 °C.
- Incubar los portaobjetos con paraformaldehído al 4% en PBS durante 3 min para detener la digestión.
- Lave las diapositivas con PBS 2 veces durante 5 minutos cada una.
- Incubar los portaobjetos en tampón de trietanolamina de 100 mM (pH 8.0) con anhídrido acético al 0.25% (v/v) 2 veces durante 5 min cada uno.
- Agregue agua DEPC en la cámara de humedad del portaobjetos. Añadir 20 μL de solución de prediridación (que contenga 100 μg/ml de ADN de espermatozoides de salmón) en los portaobjetos. Coloque las diapositivas en la cámara de humedad de la diapositiva. Incubar los portaobjetos a 42 °C durante 4 h.
NOTA: Es necesario asegurar la estanqueidad de la tapa de la caja húmeda y que la caja húmeda se mantenga siempre en horizontal para evitar la volatilización y la desviación del tejido de la solución de prehibridación y la solución de hibridación seguida.
- Hibridación de la sección embrionaria de Drosophila
- Retire la solución de prediridación y lave las diapositivas con 0,2 veces SSC (cloruro de sodio de 150 mM, citrato de sodio de 15 mM, pH 7,0) 3 veces durante 5 min cada una. Limpie el exceso de 0.2x SSC alrededor de las muestras de tejido.
- Aplique 30 μL de solución de hibridación de sonda (que contiene 2-6 ng de sonda de ARN marcada con digoxina diluyéndola en solución de prediridación) con una pipeta. Incubar los portaobjetos en la cámara de humedad del portaobjetos a 42 °C durante aproximadamente 20 h.
NOTA: Asegúrese de la estanqueidad de la tapa como sugerencia de la última nota. De lo contrario, el secado causado por la fuga de pre-hibridación o pre-hibridación generará fondo sucio incluyendo pseudo-positivo en diapositivas.
- Hibridación
- Retire la solución de hibridación y lave las diapositivas con 4x solución SSC 4 veces durante 15 min cada una a 37 °C.
- Lave los portaobjetos en 2x solución SSC con 20 μg/ml de RNasa A durante 30 min a 37 °C.
- Lave los portaobjetos en 1 solución SSC durante 15 min a 37 °C.
- Lave las diapositivas en solución 0.5x SSC durante 15 min a 37 °C.
- Lave los portaobjetos en solución 0.1x SSC durante 15 min a 37 °C.
- Lave las diapositivas con PBS 3 veces durante 5 minutos cada una.
- Lave los portaobjetos en tampón de lavado (100 mM de ácido maleico, 150 mM de NaCl, 0,3% (v/v) de Tween 20, pH 7,5) durante 1 min.
- Incubar los portaobjetos en 100 ml de solución de bloqueo recién preparada (suero de oveja al 2% en tampón de ácido maleico sin Tween 20) durante 30 minutos.
- Incubar los portaobjetos en 20 ml de solución de anticuerpos durante 45 minutos.
- Centrifugar el anticuerpo durante 5 min a 10.000 rpm en el vial original antes de cada uso, y pipetear la cantidad necesaria cuidadosamente desde la superficie. Diluir anti-digoxigenina-AP 1:5000 (150 mU/mL) en solución de bloqueo.
- Lave las diapositivas en 100 ml de tampón de lavado 2 veces durante 15 minutos cada una para eliminar el conjugado de anticuerpos no unidos.
- Equilibre las diapositivas en 20 mL de tampón de detección (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) durante 2-5 min.
- Incube los portaobjetos con 10 ml de solución de sustrato de color recién preparada en la cámara de humedad del portaobjetos. La reacción comienza en unos pocos minutos y se completa después de 16 h. No agite ni mezcle mientras se desarrolla el color.
- Lave los portaobjetos con 50 ml de agua destilada durante 5 minutos para detener la reacción.
- Seque la muestra durante la noche en la oscuridad.
- Deshidrate los portaobjetos en etanol al 70%, 80% etanol, 90% etanol, 95% etanol, 100% etanol I y 100% etanol II durante 3 min cada uno.
- Despeje las diapositivas en 100% xileno I, 100% xileno II y 100% xileno III durante 20 minutos cada uno.
- Monte las diapositivas con bálsamo neutro.
- Documente las imágenes y analícelas con la microscopía invertida y el software del fabricante. Realizar análisis de distribución utilizando ImageJ según densidad de señal positiva ya sea a lo largo del eje longitudinal o dentro de la zona diferencial de embriones.
NOTA: Durante la incubación con la solución de sustrato de color recién preparada en el paso 7.4.12, el color de reacción se puede ver incluso con un ojo desnudo. Esta observación sobre cómo se puede inspeccionar el desarrollo del color bajo estereoscopio. Una vez que el color de la reacción es razonable y se puede llevar a cabo el paso 7.4.13 para detener la reacción.
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Representative Results
Las figuras describen los protocolos utilizados para superar el desafío de unir embriones de Drosophila de corion con alto contenido de lípidos y quitina (Tabla 1) a la superficie del portaobjetos de vidrio para su examen y experimentación. Utilizando el método de recubrimiento deslizante de gelatina de alumbre de cromo que se muestra en la Figura 1, mejoramos la unión de embriones de Drosophila a la superficie de los portaobjetos, mientras que el método de preincrustación de embriones que se muestra en la Figura 2 permite una inspección eficiente de la distribución dinámica de proteínas y ARN DmFKBP12 / Calstabina en las cuatro etapas tempranas de desarrollo (es decir, blastodermo sincitial, blastodermo celular, gastrula temprana y tardía de los embriones de Drosophila). La Figura 3 muestra la distribución proteica del anticuerpo FKBP12/Calstabina detectado en los estadios sincitial y blastodermo celular. A partir de estos resultados histoquímicos, se puede ver que la expresión de FKBP12 está menos polarizada en el blastodermo sincitial (Paneles A a H), y luego comienza a localizarse dentro de la membrana basal debajo del epitelio del trofoectodermo para formar un gradiente con más expresión que se encuentra en los polos anterior que en el posterior (Paneles I a S). Eventualmente, la proteína DmFKBP12/Calstabina se restringe a ciertos componentes arquitectónicos de los tejidos embrionarios primitivos con menos distribución extracelular que la observada en etapas embrionarias tempranas y tardías de la gastrula (Figura 4). Curiosamente, la distribución dinámica de proteínas descrita anteriormente no está acompañada por los niveles correspondientes de ARNm de DmFKBP12 (Figura 5), lo que indica que la expresión de proteínas es el resultado de un mecanismo molecular post-transcripción aún desconocido. El método descrito de recubrimiento deslizante CAG y preincrustación nos permitirá sondear aún más la importancia de DmFKBP12 en la señalización de calcio y descubrir este mecanismo molecular aún desconocido mientras combinamos otras técnicas como la interferencia de ARN de microinyección19.
En este estudio, desarrollamos un método de recubrimiento deslizante y preincrustizamiento de gelatina de alumbre de cromo para el análisis histológico, histoquímico e inmunohistológico de embriones de Drosophila en diferentes etapas de desarrollo. Utilizando este método de preincrustación, los embriones se recolectan de manera efectiva para la sección de crio y parafina que permite el análisis de secciones transversales longitudinales. Esto nos permitió describir los patrones de expresión en evolución de esta proteína durante las etapas decisivas del desarrollo, vinculando la expresión de la proteína con el desarrollo de sistemas fisiológicos clave como el intestino, el cerebro y el sistema nervioso de conexión. Mediante el empleo de estos métodos, pudimos investigar las distribuciones dinámicas de la proteína reguladora de RyR y el ARNm FKBP12/Calstabina durante el desarrollo de embriones de Drosophila en etapas definitivas, incluyendo el blastodermo sincitial y celular, y las etapas de gastrulación temprana y tardía. Nuestros datos mostraron que la proteína FKBP12/Calstabina y su ARN se pueden detectar muy temprano en el blastodermo sincitial. A medida que el embrión se desarrolla, FKBP12 se distribuye más densamente en la capa de células basales debajo del epitelio del blastodermo. La proteína FKBP12/Calstabina fortalece dinámicamente su expresión y diferencia su distribución en tejidos embrionarios que contienen músculos, incluidos el estomodeo, el estomodeo y el rudimento del intestino medio posterior. Estos cambios en la distribución desde el comienzo del blastodermo hasta las etapas tardías de la gastrulación también se describen en el sistema neuronal en desarrollo, incluidos los neuroblastos, el nervio ventral, el ganglio supraesofágico y el cerebro. Si bien estos cambios dinámicos en FKBP12 / Calstabina insinúan su importancia en el desarrollo, no se reflejan en los niveles de ARNm de la proteína, lo que sugiere un regulador aún desconocido de la expresión de proteínas que aún no se ha identificado.
Figura 1: Boceto del método de recubrimiento de gelatina de alumbre de cromo (CAG) para secciones de parafina utilizadas en inmunología e hibridación in situ de ARN para visualizar la distribución de la proteína DmFKBP12 y el ARNm en embriones de Drosophila. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Boceto del método de preincrustación para el perfil de expresión de FKBP12 y DmFKBP12 en el desarrollo de embriones de Drosophila . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Perfil de expresión de la proteína DmFKBP12 en blastodermos sincitiales y celulares del embrión de Drosophila . (A-D) Tinción H&E del blastodermo sincitial. La cuantificación de la distribución de DmFKBP12 en el blastodermo sincitial temprano se presenta en D. (E-G) Los paneles presentan blastodermo sincitial temprano en el que los núcleos están bajo división. La cuantificación de la distribución de DmFKBP12 en blastodermo sincitial tardío se presenta en H. (I-L) Tinción H&E del blastodermo celular. La calificación de la distribución de DmFKBP12 en blastodermo celular tardío se presenta en L. (M-S) Los paneles exhiben la distribución de la proteína DmFKBP12 en el blastodermo celular. O muestra las vistas más grandes de M-N. (P-R) Los paneles presentan blastodermo celular anterior que se muestra en M-O. Las cuantificaciones de la distribución de DmFKBP12 en blastodermo celular temprano se presentan en S. La barra de escala para A, E, I, M y P es de 60 μm, para B, C, F, J, K, N, Q y R es de 40 μm, y para G, O es de 20 μm. AP, polo anterior del óvulo; YK, yema; CN: núcleo de escisión; PP: polo posterior de huevo; BLD, blastodermo, núcleos y células; BM, Membrana basal. Los datos se expresan como media± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. La cuantificación de los datos se realizó con ImageJ. En primer lugar, los productos marrones se mantuvieron en la imagen junto con la eliminación de todos los demás colores. En segundo lugar, la imagen marrón se cambió en blanco y negro y calculó su densidad para la cuantificación en consecuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Perfil de expresión de la proteína DmFKBP12 en estadios de gastrulación temprana y tardía del embrión de Drosophila. A, D y G muestran tinción H&E del embrión de Drosophila en la etapa de gastrulación. B, C, E y F muestran la distribución de DmFKBP12 en la etapa temprana de gastrulación. H, I y J-L muestran la distribución de DmFKBP12 en la etapa de gastrulación tardía. Las cuantificaciones de la distribución de DmFKBP12 en gastrulas tempranas se presentan en M. La barra de escala para A, D, E y G es de 80 μm, para B, C, F, H, I y J-L es de 40 μm. PP, polo posterior de huevo; NBL: neuroblastos; ST, stomodaeum; YK, yema; PMG: rudimento del intestino medio posterior; BR, cerebro, ganglio supraesofágico; VNS: sistema nervioso ventral; PV: proventrículo; MUS: músculo; MGC, ciego de intestino medio; AMG: rudipighian del intestino medio anterior; MMG: intestino medio; TR, tráquea. Los datos se expresan como media± SEM. ns, no significativa; ** p < 0,01, *** p < 0,001. La cuantificación de los datos se llevó a cabo con ImageJ 1.50d permaneciendo producto-marrón y cambiando a imagen en blanco y negro, y siguiendo por cálculo de densidad de blanco y negro como se describe en la leyenda de la figura anterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Localización in situ del ARNm DmFKBP12 durante el desarrollo embrionario del embrión de Drosophila. A muestra localización in situ del ARNm DmFKBP12 en la etapa de blastodermo sincitial cuando el ARNm FKBP12 se expresó en el citoplasma del embrión. B y C muestran localización in situ del ARNm DmFKBP12 en la etapa de blastodermo celular cuando el ARNm FKBP12 se expresó en los límites internos de las células blastodérmicas. D y E exhiben localización in situ del ARNm FKBP12 en la etapa temprana de gastrulación. Durante esta etapa, se localiza principalmente en el intestino en desarrollo. F, G y H muestran localización in situ del ARNm FKBP12 en la etapa de gastrulación tardía, cuando el ARNm se expresa en el músculo y el intestino. I es el control positivo del ARNm DmFKBP12. J es el control negativo del ARNm DmFKBP12. La barra de escala para A, C, E, G e I es de 5 μm, para B, D, F, I y J es de 10 μm. YK, yema; CN: núcleo de escisión; BLD, blastodermo, núcleos y células; FQ, hendidura oblicua anterior, surco cefálico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Estadios embrionarios | 0-2 horas (%) | 2-3 horas (%) | 3-12 horas (%) | 12-24 horas (%) |
| Blastodermo sincitial | 90.8 | 0 | 0 | 0 |
| Blastodermo celular | 6.9 | 91.54 | 0 | 0 |
| Gastrula temprana | 2.3 | 4.23 | 91.1 | 0 |
| Gastrula tardía | 0 | 4.23 | 8.93 | 93.3 |
Tabla 1: Colección embrionaria de diferentes etapas en el desarrollo de Drosophila melanogaster
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Discussion
La señalización de calcio mediada por RyRs e IP3Rs es una vía fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos de animales vertebrados e invertebrados1,2,3,4. En humanos, las mutaciones puntuales, como la mutación R4496C asociada a CPVT, en el gen RyR2 conducen a la fuga de calcio del retículo sarcoplásmico del cardiomiocito, lo que resulta en disfunción cardíaca. Estas mutaciones se presentan como arritmia con un alto riesgo de muerte súbita cardíaca durante la actividad física, y es reproducible en modelos de ratón diseñados para portar esta mutación. En condiciones de ejercicio, los ratones portadores de esta mutación de fuga de calcio experimentaron muerte súbita cardíaca no demostrada por sus contrapartes de tipo salvaje18,20,21,22. La sobreexpresión de FKBP12, un regulador de RyRs, en el corazón, se correspondió con altas tasas de muerte cardíaca asociada a canales de potasio en modelos de ratón22,23, hallazgo que se correspondió con el fenotipo de ratones knockout FKBP1210,11. Como los RyR de mamíferos, incluidos RyR1, RyR 2 y RyR3 y sus FKBPs reguladores, han sido bien estudiados durante más de tres décadas, la mayoría de los procedimientos involucrados en cardiopatología, disfunción muscular esquelética y logro de la función cerebral después del desarrollo temprano más la oncogénesis son el foco de la investigación24,25.
A diferencia de los vertebrados, que tienen tres isoformas de RyR, las moscas de Drosophila tienen solo un RyR1,2,3,5. Recientemente, demostramos la función crítica de Drosophila RyR (DmRyR) en las primeras etapas del desarrollo embrionario de Drosophila. Desentrañamos la expresión de DmRyR tanto a nivel traslacional como transcripcional en embriones de Drosophila durante el desarrollo temprano: la etapa de blastodermo sincitial, la etapa de blastodermo y las etapas tempranas de gastrula. En las cuatro etapas, el ARNm DmFKBP12 se distribuyó uniformemente por todo el embrión y se mantuvo en el mismo nivel, mientras que la expresión proteica del gen fue altamente dinámica con perfiles de expresión polarizados anteriormente y luego distribuidos en ciertas capas celulares19. Los protocolos metodológicos que utilizamos en esta publicación fueron críticos para la capacidad de obtener un alto volumen de resultados representativos.
El seccionamiento de parafina es una técnica básica y práctica para la detección histológica de la expresión proteica para el análisis cuantitativo. Las secciones de parafina son una herramienta fundamental para estudiar la expresión de proteínas en el insecto adulto. Sin embargo, estas técnicas han sido difíciles de replicar en insectos en desarrollo debido a su embrión rico en lípidos y corion rico en quitina, lo que dificulta la incrustación, la preservación y el montaje de deslizamientos. Los lípidos que se encuentran en los embriones interfieren con las fuerzas que permiten la unión de secciones embrionarias en la superficie del portaobjetos. Si bien la quitina que se encuentra en el corion presenta barreras físicas que protegen al embrión de interferencias químicas y mecánicas, también restringe la unión de muestras embrionarias a portaobjetos de vidrio. Si bien estas características aseguran una mayor tasa de supervivencia de las larvas de insectos, dificultan en gran medida la capacidad de estudiar su expresión de proteínas y ARNm in situ. Este problema ha sido solucionado de muchas maneras. El uso de detergente de superficie como Tween-20 a menudo separa los embriones de Drosophila y reduce el número de embriones disponibles para el estudio. Esta técnica requiere incubación durante 20 horas para revelar el ARNm para la hibridación in situ , pero también separa las muestras de las diapositivas casi por completo. La técnica aquí de recubrimiento de portaobjetos de vidrio con gelatina de alumbre cromado (CAG) antes de llevar a cabo la inmunohistoquímica y el reconocimiento específico anti-sentido para el ARNm resuelve estas barreras técnicas al mejorar la unión entre el embrión y el portaobjetos de vidrio.
Además de la unión mejorada CAG, las técnicas descritas de preincrustación de embriones de Drosophila permiten la cosecha de un gran número de embriones de Drosophila fechados con precisión. Esto nos permitió reportar la expresión dinámica de DmFKBP12/Calstabina en varias etapas del desarrollo embrionario temprano. La etapa más temprana que pudimos estudiar utilizando esta técnica es la etapa de blastodermo sincitial, que mostró una distribución menos diferenciada y un nivel de expresión generalmente más bajo. Al estudiar embriones en las etapas de blastodermo celular y gastrula, encontramos que el nivel general de DmFKBP12 / Calstabina aumentó a medida que los embriones se desarrollan y comienzan a localizarse, primero en la encuesta anterior, luego en ciertas capas en la etapa de tres capas. Los hallazgos sugieren que el FKBP12 involucrado en la señalización del calcio juega un papel crítico en el desarrollo temprano y cuya diferenciación juega un papel importante en el desarrollo de Drosophila melanogaster .
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (# 31771377 / 31571273 / 31371256), el Programa de Científicos Distinguidos Extranjeros del Departamento Nacional de Educación (#MS2014SXSF038), el Fondo de Investigación de universidades centrales del Departamento Nacional de Educación (#GK201301001/201701005 / GERP-17-45), y XZ cuenta con el apoyo del Fondo de Tesis Doctoral Sobresaliente (#2019TS082 / 2019TS079), Programa Clave del Departamento de Educación Provincial de Shaanxi (#20JS138), el Proyecto Juvenil del Programa de Investigación Básica en Ciencias Naturales del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Shaanxi (#2020JQ-885).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
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