Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

دراسة نشاط الببتيدات العصبية وغيرها من منظمات نظام الإخراج في البعوض البالغ

Published: August 24, 2021 doi: 10.3791/61849
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biology, York University
* These authors contributed equally

Summary

يحدد هذا البروتوكول المنهجيات الكامنة وراء فحص رامزي ، والأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات ، وتقنية القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات (SIET) ومقايسات الانكماش في المختبر ، المطبقة لدراسة نظام إفراز البعوض البالغ ، المكون من أنابيب Malpighian و hindgut ، لقياس معدلات إفراز الأيونات والسوائل بشكل جماعي ، والنشاط الانقباضي ، ونقل الأيونات عبر الظهارة.

Abstract

وتوفر دراسات فسيولوجيا الحشرات، ولا سيما في الأنواع التي هي ناقلات لمسببات الأمراض التي تسبب الأمراض في البشر والفقاريات الأخرى، الأساس لوضع استراتيجيات جديدة لمكافحة الآفات. هنا ، يتم وصف سلسلة من الطرق التي تستخدم بشكل روتيني لتحديد الأدوار الوظيفية للببتيدات العصبية والعوامل العصبية الأخرى (أي الأمينات الحيوية المنشأ) على نظام إفراز البعوض ، الزاعجة المصرية. يمكن أن تستمر أنابيب Malpighian (MTs) ، المسؤولة عن تكوين البول الأولي ، في العمل لساعات عند إزالتها من البعوض ، مما يسمح بقياسات إفراز السوائل بعد العلاجات الهرمونية. على هذا النحو ، فإن اختبار رامزي هو تقنية مفيدة لقياس معدلات الإفراز من MTs المعزولة. يمكن استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات (ISME) بالتتابع لقياس تركيزات الأيونات (أي Na + و K +) في السائل المفرز. يسمح هذا الفحص بقياس العديد من MTs في وقت معين ، وتحديد آثار الهرمونات والأدوية المختلفة. تستخدم تقنية القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات المسح ISME لقياس الجهد التمثيلي للنشاط الأيوني في الطبقة غير المتحركة المجاورة لسطح الأعضاء الناقلة للأيونات لتحديد النقل عبر الظهارة للأيونات في الوقت الفعلي تقريبا. يمكن استخدام هذه الطريقة لفهم دور الهرمونات وغيرها من المنظمين على امتصاص الأيونات أو إفرازها عبر الظهارة. تعد فحوصات تقلص الأمعاء الهندية أيضا أداة مفيدة لتوصيف الببتيدات العصبية النشطة عضليا ، والتي قد تعزز أو تقلل من قدرة هذا العضو على إزالة السوائل الزائدة والنفايات. بشكل جماعي ، توفر هذه الطرق نظرة ثاقبة حول كيفية تنظيم نظام الإخراج في البعوض البالغ. هذا مهم لأن التنسيق الوظيفي للأعضاء الإخراجية أمر بالغ الأهمية في التغلب على التحديات مثل إجهاد الجفاف بعد الإغلاق وقبل العثور على مضيف فقاري مناسب للحصول على وجبة دم.

Introduction

إن الحفاظ على مستويات الملح والماء في الحشرات يسمح لها بالنجاح في العديد من المنافذ الإيكولوجية والبيئية ، باستخدام مجموعة متنوعة من استراتيجيات التغذية1. طورت معظم الحشرات آليات لتنظيم تكوين الهيموليمف ضمن حدود ضيقة من أجل تحمل التحديات المختلفة المرتبطة ببيئتها الخاصة2. غالبا ما تواجه الحشرات الأرضية تحدي الحفاظ على المياه ويخضع نظام الإخراج لمضاد لإدرار البول لمنع فقدان الماء وبعض الأملاح الأساسية ، وبالتالي تجنب الجفاف. في المقابل ، يحدث إدرار البول عندما تتغذى الحشرة ويتم تحديها بالماء الزائد والأملاح المحتملة3,4. من خلال نظام الإخراج المتخصص والنشط للغاية ، طورت الحشرات آليات تنظيمية تعمل على مواجهة تحدياتها التنظيمية الأسموزية. في بعوضة الزاعجة المصرية البالغة ، يتكون نظام الإخراج من أنابيب Malpighian (MTs) و hindgut ، والأخيرة تتكون من الدقاق الأمامي والمستقيم الخلفي5. MTs هي المسؤولة عن توليد البول الأولي ، وعادة ما تكون غنية في كلوريد الصوديوم و / أو KCl. ثم يتم تعديل البول الأساسي من خلال العمليات الإفرازية والاستيعابية أثناء انتقاله إلى أسفل مجرى النبيب ودخوله إلى القناة الهضمية الخلفية5. يمكن أن تكون الفضلات النهائية مفرطة أو ناقصة التناضح إلى الهيموليمفاوية، اعتمادا على ظروف التغذية/البيئة، ويتم إثراؤها في النفايات السامة والنيتروجينية2.

تعد MTs مثالية لدراسة العديد من ميزات السائل الظهاري والنقل المذاب لأنها تقوم بمجموعة كبيرة ومتنوعة من وظائف النقل والإخراج2,6. من خلال التنظيم الهرموني2، تعمل MTs عن طريق إفراز الأيونات والمواد المذابة الأخرى من الدم إلى تجويف النبيب7، مما يوفر تدرجا تناضحيا يسمح بنقل المياه بواسطة aquaporins8,9، والذي يخلق بشكل جماعي البول الأساسي، قبل السفر نحو القناة الهضمية الخلفية المعاد امتصاصها2. وبالتالي ، من خلال جمع السائل المفرزة من MTs المعزولة ، يمكن للمرء أن يراقب باستمرار النقل عبر الظهارية للسوائل والأيونات. يوفر قياس معدل الإفراز وتكوين البول نظرة ثاقبة على الآليات المسؤولة عن نقل الأيونات والسوائل عبر الظهارة. إحدى الطرق الشائعة لدراسة معدلات إفراز السوائل هي فحص رامزي ، الذي قدمه رامزي لأول مرة في عام 195310. في هذه الطريقة ، يتم التعامل مع الطرف البعيد (المغلق) للأنبوب بهرمون (أو مركب اختبار / دواء آخر) ، في حين يتم لف النهاية القريبة (المفتوحة) حول دبوس في زيت البارافين المشبع بالماء ، والذي يفرز البول الأساسي ، ويتراكم كقطرة على طرف الدبوس. تستطيع MTs المعزولة البقاء على قيد الحياة والعمل لفترات طويلة (تصل إلى 24 ساعة) في ظل ظروف مختبرية محسنة ، مما يجعلها نماذج مناسبة وفعالة لقياس إفراز السوائل. تحتوي الحشرات على أنظمة دوران مفتوحة ، وبالتالي يتم تشريح MTs وإزالتها بسهولة لأنها عادة ما تطفو بحرية في الهيموليمفاوية 6. بالإضافة إلى ذلك ، باستثناء حشرات المن - التي تفتقر إلى MTs11 - يمكن أن يختلف عدد MTs في نوع معين من الحشرات اختلافا كبيرا من أربعة إلى مئات (خمسة في بعوض الزاعجة) مما يسمح بإجراء قياسات متعددة من حشرة واحدة.

تتكون MTs في بعوض الزاعجة ، بالاشتراك مع الحشرات الأخرى endopterygote ، من نوعين من الخلايا التي تشكل ظهارة بسيطة2,12 ؛ الخلايا الرئيسية الكبيرة ، التي تسهل النقل النشط للكاتيونات (أي Na + و K +) إلى التجويف ، والخلايا النجمية الرقيقة ، والتي تساعد في إفراز Cl- عبر الظهارة 13. لا يتم تعصيب MTs 2 ، وبدلا من ذلك يتم تنظيمها بواسطة العديد من الهرمونات بما في ذلك العوامل المدرة للبول والمضادة لإدرار البول ، مما يسمح بالتحكم في نقل الأيونات (بشكل رئيسي Na + و K + و Cl-) والمياه الملزمة بالتناضح2. درست العديد من الدراسات التنظيم الهرموني ل Aedes MTs لفهم دور عوامل الغدد الصماء في النقل عبر الظهارة14،15،16،17،18. كما هو موضح في النتائج التمثيلية ، توضح البروتوكولات الواردة هنا آثار العوامل الهرمونية المختلفة على MTs المعزولة من إناث البعوض A. aegypti البالغة ، بما في ذلك كل من مدر للبول ومكافحة مدر للبول (الشكل 1). يستخدم فحص رامزي لإثبات كيف أن الهرمون المضاد لإدرار البول ، AedaeCAPA-1 ، يمنع إفراز السوائل من MTs الذي يحفزه هرمون مدر للبول 31 (DH31) (الشكل 1).

وقد تطلب الحجم الأصغر للحشرات تطوير طرق دقيقة لقياس النشاط الأيوني والتركيزات في عينات السوائل، أو بالقرب من سطح الأنسجة المعزولة مثل MTs والأمعاء. وقد نفذت طرق مختلفة، بما في ذلك استخدام النظائر المشعة للأيونات(19)، التي تتطلب جمع قطرات السوائل المفرزة لقياس تركيزات الأيونات(20). عادة ما تفرز أنابيب الزاعجة المحفزة في المختبر ~ 0.5 nL / min21 ، وبالتالي فإن التعامل مع هذه الأحجام الصغيرة يمكن أن يشكل تحديا وربما يؤدي إلى خطأ عند النقل. ونتيجة لذلك ، تم استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات (ISMEs) على نطاق واسع لقياس تركيزات الأيونات في قطرات مفرزة من MTs في المختبر. في هذه الطريقة ، يتم وضع قطب مرجعي و ISME ، مملوء بمحلول الردم المناسب والأيونوفور ، في قطرة البول المفرزة لتحديد تركيزات الأيونات22. يستخدم هذا البروتوكول الحالي، المقتبس من دونيني وزملائه(23)، أيونوفور انتقائي Na+لقياس النشاط الأيوني في القطرات المفرزة من MTs المحفزة في بعوض الزاعجة البالغ. وبما أن الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات تقيس النشاط الأيوني، يمكن التعبير عن هذه البيانات على أنها تركيزات أيون بعد افتراض أن محاليل المعايرة والعينات التجريبية تشترك في نفس معامل النشاط الأيوني21 (الشكل 1B,C).

تستخدم تقنية القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات (SIET) أيضا ISMEs لقياس تدرجات تركيز الأيونات في الطبقة غير المتحركة المجاورة للأعضاء أو الأنسجة أو الخلايا التي تنقل الأيونات. تقيس ISMEs تدرجات الجهد التي يمكن استخدامها بعد ذلك لحساب تدرجات تركيز الأيونات واتجاه وحجم تدفق الأيونات عبر العضو أو الأنسجة أو الخلية20. في هذه التقنية ، يتم تركيب ISME على مناور ثلاثي المحاور يتم التحكم فيه بواسطة محركات محوسبة صغيرة السائر بحيث يتم التحكم في موقعه ثلاثي الأبعاد إلى مستوى الميكرومتر 20. يتم قياس الفولتية عند نقطتين داخل الطبقة غير المتحركة باستخدام بروتوكول أخذ العينات المبرمج والتحكم فيه بواسطة برامج الكمبيوتر. عادة ما يتم فصل النقطتين بمسافة 20-100 ميكرومتر مع نقطة واحدة داخل 5-10 ميكرومتر من سطح العضو أو النسيج أو الخلية والنقطة الثانية على بعد 20-100 ميكرومتر إضافي. يتم حساب الفرق في حجم الجهد بين النقطتين للحصول على تدرج الجهد24,25,26 ، والذي يستخدم بعد ذلك لحساب تدرج التركيز وبالتالي التدفق الصافي باستخدام قانون فيك 24,27. هذه الطريقة مفيدة لتقييم نقل أيونات محددة عبر مناطق مختلفة من أمعاء الحشرات و MTs ، أو في نقاط زمنية محددة بعد التعرض لدقيق الدم أو العلاج. على سبيل المثال، يمكن استخدام SIET لفهم كيفية تنظيم العمليات الاستيعابية والإفرازية في نظام إفراز البعوض بواسطة الهرمونات28 بالإضافة إلى سلوكيات التغذية المختلفة وظروف التربية25. وكشفت الأعمال السابقة التي استخدمت فيها SIET عن مواقع تشارك في نقل الأيونات على طول الحليمات الشرجية ومستقيم اليرقات والبعوض البالغ24،28. ويقيس البروتوكول الحالي، الذي وصفه بالوزي وزملاؤه سابقا(26)، تدفق Na+ عبر ظهارة وسادة المستقيم في المستقيم الأنثوي البالغ (الشكل 2).

يتطلب الجزء الأخير من نظام إفراز البعوض حركة عضلية منسقة للمساعدة في خلط الطعام وإفراز النفايات26. يتم تمرير المنتجات غير القابلة للامتصاص من الهضم من الأمعاء الوسطى ، إلى جانب البول الأولي الذي تفرزه MTs ، عبر الصمام البوابي وتسليمها إلى القناة الهضمية الخلفية2. تبدأ تقلصات الأمعاء الخلفية التلقائية عند الصمام البوابي وتحدث في موجات تمعجية، والتي يتم نقلها فوق الدقاق من خلال التقلص المنسق للعضلات الدائرية والطولية المحيطة بالسطح القاعدي للخلايا الظهارية26. وأخيرا ، تساعد العضلات داخل المستقيم على دفع النفايات والقضاء عليها من خلال القناة الشرجية. على الرغم من أن حركة الأمعاء الخلفية للحشرات هي عضلية المنشأ ، تتطلب Ca2 + خارج الخلية لإنتاج تقلصات تلقائية ، يمكن أيضا تنظيم هذه العمليات عصبيا26،29،30. هذا التنظيم الخارجي من قبل الجهاز العصبي مهم بعد التغذية ، حيث يجب على الحيوان طرد النفايات من الأمعاء واستعادة توازن اللمف الدموي31. ونتيجة لذلك ، فإن إجراء الفحوصات الحيوية في المختبر لتحديد الببتيدات العصبية المحفزة للعضل أو المثبطة للعضل مفيد في تقييم كيفية تأثير المواد الكيميائية العصبية على حركة الأمعاء الخلفية. يستخدم البروتوكول الحالي ، الذي أجراه Lajevardi و Paluzzi28 ، تسجيلات الفيديو لفحص الحركة اللفائفية استجابة للببتيدات العصبية (الشكل 3). وبالمثل، يمكن أيضا استخدام محول القوة أو محول المعاوقة لمراقبة آثار الانقباضات من خلال برنامج الحصول على البيانات32،33. ومع ذلك ، فإن استخدام تقنية الفيديو يسمح لنا بتقييم العضو بصريا ومواصلة التحليل باستخدام مجموعة فرعية من المعلمات لتحديد دور الهرمونات على حركة الأمعاء الخلفية.

يمكن أن يساعد استخدام هذه التقنيات في توصيف العوامل التي تنظم وتنسق نقل السوائل والأيونات على طول نظام الإخراج إلى جانب حركية الأمعاء الخلفية. الأهم من ذلك ، يتم دعم وجود صلة وظيفية بين استجابة مدر للبول بواسطة MTs وحركية الأمعاء الخلفية ، حيث تم العثور على هرمونات مدرة للبول ، مثل DH31 و 5HT ، والتي تتميز بقدرتها على تحفيز إفراز السوائل بواسطة MTs ، لإظهار إجراءات myotropic على طول البعوض hindgut21,34,35 . تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية التنسيق الصارم بين MTs و hindgut خلال أحداث مثل إدرار البول بعد الأكل في الحشرات التي تتطلب التخلص السريع من النفايات.

هنا ، يتم وصف النهج التفصيلي وراء تقنية فحص رامزي لقياس معدل إفراز السوائل في البعوض ، A. aegypti ، واستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات لتحديد تركيزات Na + داخل السائل المفرز ل MTs ، والذي يسمح عند دمجه بتحديد معدلات نقل الأيونات عبر الظهارة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف تقنية القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات وفحوصات تقلص الأمعاء الخلفية لقياس تدفق الأيونات وحركيتها ، على التوالي ، مما يساعد على توضيح التنظيم الهرموني للأمعاء الخلفية (الشكل 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. صنع أطباق مبطنة بالسيليكون

ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة قبل التجارب. سيتم إعداد هذه الأطباق لإعداد طبق الفحص للتشريح ، ولتجارب فحص الانكماش.

  1. قم بتحضير السيليكون باستخدام مجموعة مطاط صناعي من السيليكون باتباع توصيات الشركة المصنعة. امزج المكونات السائلة المكونة من جزأين بنسبة 10 إلى 1. اخلطي بلطف ودقة عن طريق الانعكاس ولكن تأكدي من تقليل تكوين الفقاعة.
  2. صب مطاط السيليكون الصناعي في أطباق زراعة البوليسترين القياسية التي يمكن التخلص منها مقاس 60 مم على عمق يتراوح عادة بين 7-9 مم. قم بإعداد أكبر عدد ممكن من الأطباق حسب الحاجة. قم بإزالة أي فقاعات هواء باستخدام دبوس ناعم تحت المجهر بعد فترة وجيزة من صب السيليكون في الأطباق. ضع الأطباق في غرفة أو خزانة خالية من الغبار في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 48 ساعة على الأقل أو في الفرن عند 50 درجة مئوية لمدة 4 ساعات تقريبا للعلاج (تصلب) (الشكل 5A).

2. صنع طبق فحص رامزي

ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الطبق من تجربة إلى أخرى ، وبالتالي ، كرر هذه الخطوة فقط في حالة تلف الطبق أو كسره. يتم استخدام طبق منفصل للتشريح.

  1. باستخدام مشرط (مع احتياطات حادة قياسية) ، قم بإنشاء آبار في أحد أطباق بتري المطلية بالسيليكون لإعداد طبق الفحص ، عن طريق إزالة ما يكفي من السيليكون ، حوالي 5 مم ، من أعلى الطبق (يجب أن يتناسب هذا مع قطرة الاستحمام ~ 20 ميكرولتر). قبل ذلك ، استخدم علامة دائمة لتحديد المواقع تحت الطبق لملاحظة مكان صنع الآبار. يجب أن تكون الآبار على بعد ~ 1 سم ، وقطرها حوالي ~ 4 مم للسماح للنهاية البعيدة للنبيب بالتناسب. سيحتوي كل بئر على أنبوب واحد لإفراز السوائل ، وبالتالي فإن الطبق الذي يحتوي على 20 بئرا سيسمح بتحليل ما يصل إلى 20 MTs لكل تجربة.
  2. لتحضير دبابيس Minutien، ضع دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 0.1 مم على التوالي على قطعة من شريط وضع العلامات، عموديا على محور الشريط. باستخدام مقص ، قطع على طول الشريط ، وخلق نصفين متساويين من المسامير. استخدم نصف دبوس لكل بئر.
  3. باستخدام زوج حاد من الملقط ، أدخل كل نصف دبوس في طبق الفحص المطلي بالسيليكون ، بجانب كل بئر. اعتمادا على طول نبيب الحشرات ، أدخل نصف دبوس على مسافة تسمح للطرف البعيد من النبيب بالانغماس في ملحية الاستحمام والنهاية القريبة للالتفاف حول الدبوس. يمكن القيام بهذه الخطوة تحت المجهر لتصور الآبار بسهولة. يمكن إعادة استخدام المسامير ، ومع ذلك ، استبدال نصف دبوس في حالة تلفها أو فقدانها. (الشكل 5 باء)

3. صنع طبق SIET المطلي بالبولي إل ليسين

ملاحظة: هذه الخطوة مهمة للعضو للالتصاق بالجزء السفلي من الطبق أثناء قياسات SIET لضمان بقاء موقع القياس كما هو لكل عينة. يجب أن يتم إعداد هذه الأطباق قبل 2 أيام على الأقل من التجارب. يجب استخدام كل طبق مرة واحدة فقط عند تطبيق علاج معين. تخلص منه بعد كل عينة أو إذا كان معطف البولي إل-ليسين مخدوشا أو تالفا.

  1. لكل عينة، ضع طبق بتري 35 مم على سطح مستو. قم بإزالة الأغطية وماصة 70 ميكرولتر من بولي-إل-ليسين (0.1 ملغم/مل) في وسط كل طبق. ضع الأغطية مرة أخرى واترك بولي-L-lysine يجف (~ 48 ساعة) دون عائق.
  2. بمجرد أن يجف ، ضع علامة على قاع الطبق بدائرة تحدد معطف البولي إل-ليسين المجفف لتصور أفضل للمكان الذي يجب وضع فيه العضو المستأصل بعد التشريح. إذا لزم الأمر لتقليل أحجام المحاليل المالحة والمعالجة في التجارب ، استخدم مسدس غراء ساخن لتطويق طلاء poly-L-lysine ، مما يترك مساحة كافية للقطب الكهربائي للتحرك وأخذ قياسات الخلفية (~ 20-25 مم قطر الدائرة الملصقة يكفي). يمكن تخزين هذه الأطباق المغلفة إلى أجل غير مسمى في RT (الشكل 5C).

4. إعداد أطباق فحص رامزي والانكماش للتجارب

ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الطبق (شريطة الغسيل المناسب لإزالة المياه المالحة / العلاجات المستخدمة سابقا) ، وبالتالي كرر هذه الخطوة فقط في حالة تلف الطبق أو كسره. يتم استخدام طبق منفصل للتشريح. يتم تنفيذ هذه الخطوة في يوم التجربة.

  1. بالنسبة لطبق فحص الانقباض ، استخدم مشرطا (مع احتياطات حادة قياسية) ، وقم بإنشاء آبار في أحد أطباق بتري المغلفة بالسيليكون لإعداد طبق الفحص. قم بزاوية المشرط بطريقة تصبح الآبار على شكل مثلث لتسهيل تثبيت الأنسجة المشوهة على الحواف. يجب أن تكون الآبار كبيرة بما يكفي لاستيعاب ما يصل إلى 250 ميكرولتر وتناسب القناة الهضمية بأكملها (بدلا من الحفر بعمق كبير ، اجعل البئر أوسع إلى حوالي 0.5-1 سم) (الشكل 5D).
  2. بالنسبة للوحة رامزي ، استخدم ماصة واملأ آبارا تصل إلى 20 ميكرولتر من المحلول (18 ميكرولتر من 1X Aedes المالحة: وسط شنايدر المحضر في الخطوة 5.2 ، و 2 ميكرولتر من الهرمون / الدواء). بالنسبة للضوابط غير المحفزة ، املأ الآبار ب 20 ميكرولتر من 1X Aedes المالحة: وسط شنايدر. بمجرد ملء جميع الآبار ، صب الزيت المعدني المائي في طبق الفحص حتى يتم غمر الآبار ودبابيس Minutien. استخدم طرف ماصة 20 ميكرولتر لفرقعة أو إزالة فقاعات الهواء التي يمكن أن تتداخل مع القطرات المفرزة.

5. إعداد الحلول

  1. تحضير 2X الزاعجة المصرية المالحة و 10x الجلوكوز ، كما هو موضح في الجدول 1 ، مقتبس من Petzel وزملاؤه36. يجب تخزين حلول المخزون عند 4 درجات مئوية. اصنع مخزونا عاملا من 1X الزاعجة المصرية المالحة (الجدول 1) ، وخزنه عند 4 درجات مئوية. في يوم التجربة، اسمح للمخزون العامل بالوصول إلى RT قبل الاستخدام. تحضير طازجة إذا كان هناك أي دليل على نمو فطري أو بكتيري.
  2. لتحضير قطرة الاستحمام، اخلطي الزاعجة المالحة (من الخطوة 5.1) مع وسط شنايدر، بنسبة 1:1. إعداد في aliquots صغيرة ، وهذا يتوقف على مقدار ما هو مطلوب. احتفظ بوسط شنايدر في الثلاجة، وتخلص منه إذا كان هناك أي دليل على نمو فطري أو بكتيري. (يجب أن تتم هذه الخطوة في يوم التجربة).
  3. بالنسبة لقياسات تدفق Na+ باستخدام SIET، قم بإعداد محلول ملحي معدل خال من الزاعجة الخالية من Ca2+ (الجدول 2)، كما هو موضح سابقا26.

6. البعوض MTs وتشريح الأمعاء الخلفية

  1. لتشريح البعوض البالغ ، اجمع الخادرة في كوب صغير وضعها في جرة تحتوي على محلول السكروز للتغذية. لتحديد عمر البعوض ، عزل البعوض الفقس ووضعه في جرة مختلفة مع ملاحظة عمر وجنس البعوض للتشريح في المستقبل.
  2. ضع البعوض لفترة وجيزة لتشريحه على وسادة CO2 وانتظر حتى لا يستجيب. باستخدام ملقط ناعم ، التقط البعوضة من ساقها أو جناحها وضعها على طبق تشريح مطلي بالمطاط الصناعي السيليكوني تم إعداده في الخطوة 1. ضع البعوضة على جانب واحد (الجانب الجانبي لأعلى) ، وباستخدام دبوس Minutien ، ادخل إلى الصدر لتثبيت البعوضة في مكانها. اختياريا ، قم بإزالة الأجنحة والساقين من البعوض لتسهيل التشريح.
  3. باستخدام ماصة باستور ، أضف قطرة من محلول RT Aedes الملحي لغمر البعوض بالكامل في محلول ملحي. تأكد من أن التشريح كله تحت محلول ملحي (انظر الجدول 1 لجعل الزاعجة المالحة).
  4. ضع طبق التشريح تحت مجهر مجسم. قرصة الجزء الأخير من البطن مع ملقط ناعم وسحب ببطء بعيدا عن البعوض. يتم تسهيل هذه الخطوة من خلال النظر في وقت واحد تحت المجهر. يجب أن يتعرض الأمعاء الوسطى ، المرفقة ب MTs و hindgut ، (الشكل 6).
  5. بالنسبة لفحص رامزي ، قم بإزالة كل أنبوب بعناية من تقاطع منتصف الأمعاء الخلفية ، مع التأكد من عدم إتلاف الأعضاء. استخدم ملقط ناعم حاد لإزالة الأنابيب بشكل فردي - لا تستخدم الأنابيب التالفة للفحص. (راجع الخطوة 7 للإعداد.)
  6. بالنسبة ل SIET ، قم بتشريح القناة الهضمية الخلفية في محلول ملحي خال من الزاعجة الخالية من Ca2 + (الخطوة 5.3). تأكد من أن طبق poly-L-lysine يحتوي أيضا على حجم ثابت من محلول الزاعجة الملحي الخالي من Ca2 +. قم بإزالة البشرة بعناية من المستقيم ووضع القناة الهضمية الخلفية (يمكن إزالة أي أعضاء أخرى متصلة ، اعتمادا على ما يتم قياسه) في طبق poly-L-lysine. في حالة قياس انتقال الأيونات على طول ظهارة وسادة المستقيم ، ضع الجانب المواجه للدم من وسادة مستقيمية واحدة على الأقل لتكون في متناول القطب الدقيق (الشكل 7).
    1. باستخدام ملقط للاستيلاء على الطرف الخلفي ، اجلب القناة الهضمية الخلفية إلى أسفل الطبق (دون الإضرار بأي هياكل سيتم قياسها). بمجرد أن يلمس العضو معطف poly-L-lysine ، سوف يلتصق. هذه العينة التشريحية جاهزة للقياسات. (راجع الخطوات من 14 إلى 16 لإعداد SIET وقياساته.)
  7. بالنسبة لفحص تقلص الدقاق ، تأكد من أن الأمعاء الخلفية تظل متصلة بالأمعاء الوسطى أثناء التشريح (الشكل 4D). قم بإزالة MTs بعناية للحصول على رؤية دون عوائق للهند. سيتم نقل هذا العضو إلى طبق جديد معد كما هو موضح في الخطوة 4.1. (راجع الخطوة 17 للحصول على مقاطع فيديو المقايسة.)

7. إعداد فحص رامزي

  1. باستخدام طرف الملقط ، ارفع بعناية الطرف القريب (المفتوح) من النبيب عن طريق لفه فوق الملقط (لا تقرص النبيب) ، وانقله إلى بئر من طبق الفحص. يمكن أيضا القيام بهذه الخطوة باستخدام مجسات زجاجية دقيقة.
  2. بمجرد غمر النبيب في البئر ، التقط الطرف القريب من النبيب باستخدام الملقط ، وقم بإزالته من قطرة الاستحمام ، ولف النهاية حول الدبوس. لف النبيب حول الدبوس مرتين - وحافظ على طول النبيب المتبقي في قطرة الاستحمام متسقا مع الأنابيب الأخرى. عند هذه النقطة ، يجب أن تكون النهاية البعيدة للأنبوب في قطرة الاستحمام ، في حين أن النهاية القريبة ملفوفة حول الدبوس بعيدا عن قطرة الاستحمام مما يسمح للسائل المفرز بالتراكم على طرف الدبوس من النهاية القريبة المفتوحة.
  3. مباشرة بعد التفاف النبيب حول الدبوس ، لاحظ الآبار (على سبيل المثال ، A ، B ، C) ، والوقت (الذي سيكون وقت البدء عندما يبدأ السائل في إفرازه من النبيب) ، وأي معلومات تعريف أخرى (على سبيل المثال ، هرمون ، النمط الوراثي ، إلخ).
  4. تحتوي كل بعوضة على خمسة أنابيب ، وبالتالي كرر الخطوات 7.1-7.3 مع بقية الأنابيب. بالنسبة للعلاجات الضابطة والتجريبية ، قم بتقسيم الأنابيب الخمسة داخل العلاجات المختلفة. استمر في التشريح التالي ، حتى يتم ملء طبق الفحص بأكمله. مع الممارسة ، يجب أن تستغرق هذه التقنية عادة 2-3 دقائق لتشريح الأنابيب ، ونقلها إلى محلول الاستحمام الملحي ، والالتفاف حول الدبوس ، وبالتالي خلق فرق 2-3 دقائق في وقت البدء بين كل نبيب.
    ملاحظة: قبل البدء في التجربة، قم بمعايرة ميكرومتر العين للمجهر باستخدام ميكرومتر المرحلة تحت الهدف المحدد. يتم قياس القطرات المفرزة بشكل روتيني تحت تكبير إجمالي 40x-50x.
  5. بعد وقت الحضانة المخصص ، يمكن قياس القطيرة المفرزة. باستخدام ميكرومتر العين من المجهر ، قم بقياس وتسجيل قطر القطيرة المفرزة. احسب قطر (د) القطرة المفرزة بضرب قطر وحدة العين المقاسة بتحويل المعايرة (الجدول 3). احسب حجم القطرة المفرزة باستخدام المعادلة، V = πd3/6.
  6. لحساب معدل الإفراز (nL min-1) ، استخدم المعادلة ، معدل إفراز السائل = V / وقت الإفراز ، حيث V هو حجم القطيرة المفرزة المحسوبة في الخطوة 7.5 ، ويشير وقت الإفراز إلى فترة حضانة النبيب.

8. إعداد ISME

  1. ضع المتلاعبين المجهريين على جانبي المجهر المجسم لإعداد محطة ISME. يمكن تحقيق كلوريد الأسلاك الفضية عن طريق الانغماس في محلول من كلوريد الحديديك وخيط كل سلك فضي في كل حامل من حاملات الأقطاب الكهربائية الدقيقة (أو لحام الأسلاك على الكابلات المحورية ، إذا لزم الأمر). كرر هذه الخطوة كلما أصبحت الأسلاك الفضية غير مكلورة.
  2. قم بتوصيل الأسلاك الفضية بمكبر للصوت ، والذي سيقرأ على نظام الحصول على البيانات. قم بإعداد النظام ومعايرته وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في حالة زيادة التداخل الكهربائي ، استخدم قفص فاراداي المؤرض بشكل صحيح.

9. إعداد الأقطاب الكهربائية الدقيقة ل ISME و SIET

  1. باستخدام مجتذب ماصة P-97 Flaming Brown ، اسحب ~ 5-6 شعيرات شعرية زجاجية من البورسليكات غير الخيطية (القطر الخارجي 1.5 مم ، القطر الداخلي 1.12 مم ، الطول 100 مم) بطرف 1-5 ميكرومتر. سيتم استخدام هذه الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات. بالنسبة للأقطاب الكهربائية الدقيقة SIET ، يجب أن يكون للقطب الكهربائي الناتج فتحة طرف ~ 5 ميكرومتر ، تتميز بساق قصير.
  2. في غطاء المحرك ، ضع الأقطاب الكهربائية الدقيقة على صفيحة مسخنة (ضع بعناية حتى لا تكسر أطراف الأقطاب الكهربائية). يضاف ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان داخل طبق بتري زجاجي مقاس 15 سم ويقلب فوق الأقطاب الكهربائية الموجودة على السخان. استخدم ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان لتسييل الأقطاب الكهربائية الانتقائية للأيونات عن طريق إضافة طبقة كارهة للماء إلى جميع أسطح القطب ، مما يسمح له بالاحتفاظ بالأيونوفور الكارهة للماء37. يمكن ترك الأقطاب الكهربائية السيلانية غير المستخدمة لبضعة أسابيع ؛ لذلك ، يتم تنفيذ هذه الخطوة كل بضعة أسابيع ، أو للأقطاب الكهربائية المسحوبة حديثا.
    ملاحظة: توخ الحذر عند التعامل مع ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان - قابل للاشتعال والتآكل وسام، راجع MSDS للحصول على مناولة آمنة.
    1. أدر الموقد إلى 350 درجة مئوية واتركه في مكانه لمدة 75 دقيقة. استخدم نسبة 1: 2 من عدد الأقطاب الكهربائية الدقيقة إلى حجم (μL) من ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان لإضافته إلى طبق بتري الزجاجي. وبالتالي ، بالنسبة ل 10 أقطاب كهربائية دقيقة ، أضف 20 ميكرولتر من ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان.
  3. بعد 75 دقيقة ، أطفئ الصفيحة الساخنة. بعد أن تبرد الأقطاب الكهربائية والصفيحة الساخنة ، قم بإزالة طبق Petri الزجاجي ونقل الأقطاب الكهربائية (مع الملقط) إلى صندوق تخزين به طين صب. تأكد من أن طرف القطب الكهربائي يشير إلى الأعلى لمنع أي ضرر.
  4. لجعل الأقطاب الكهربائية المرجعية ل ISME ، اسحب ~ 4-5 أنابيب شعرية زجاجية من زجاج البورسليكات الخيطية (القطر الخارجي 1 مم ، القطر الداخلي 0.58 مم ، الطول 100 مم). هذه الأقطاب الكهربائية لا يجب أن تكون متجانسة. قم بالتسمية والتخزين في صندوق مماثل ، مع تجنب أي ضرر يلحق بالحافة.
  5. تصنع أقطاب SIET المرجعية من الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية (القطر الخارجي 2 مم ، القطر الداخلي 1.12 مم ، الطول 102 مم). تمتلئ الشعيرات الدموية ب 1 M KCl + 3٪ agar المنصهر ويجب تخزينها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على 1 M KCl (مغمور بالكامل) حتى الاستخدام. يمكن استخدامها بشكل متكرر حتى تبدأ الفقاعات في التكون أو إذا انكسر الآجار. إذا كان هناك أي مجال جوي ، فتخلص من الزجاج واستخدم زجاجا جديدا لضمان اكتمال الدائرة.

10. تحضير محاقن الردم

ملاحظة: تتم هذه الخطوة لإنشاء محاقن ذات رؤوس دقيقة لردم الأقطاب الكهربائية ل ISME.

  1. استخدم حقنة ذات طرف انزلاقي سعة 1 مل مع إبرة يمكن التخلص منها. تخلص من الإبرة واسحب المحقنة حتى علامة 1 مل. تحت الدخان ، قم بتشغيل موقد بنسن ، وقم بتسخين الطرف البلاستيكي للمحقنة حتى يبدأ في الذوبان. باستخدام زوج قديم من الملقط ، اضغط بعناية على طرف المحقنة المذاب واسحب لأسفل لتمديد الطرف.
  2. باستخدام المقص ، قم بقطع الطرف المذاب إلى الطول المطلوب ، مع ترك القطر صغيرا بما يكفي ليتناسب مع الأقطاب الكهربائية (انظر الرسم البياني). بعد أن تبرد المحقنة، اختبر ضغط المحقنة بالماء للتأكد من عدم وجود انسداد. قم بإنشاء حل لكل حل ردم مطلوب وقم بتسميته وفقا لذلك (الشكل 8).

11. ملء القطب الدقيق الانتقائي الأيوني والمرجعي ل ISME و SIET

ملاحظة: يمكن إعادة استخدام القطب الدقيق طالما أنه لا يزال يعمل (معايرة قبل كل تجربة). بالنسبة ل ISME ، يمكن القيام بهذه الخطوة أثناء احتضان MTs في فحص Ramsay.

  1. لصنع قطب كهربائي دقيق انتقائي Na + ، استخدم حقنة 1 مل التي تم إنشاؤها في الخطوة 10 لردم القطب الكهربائي مع 100 mM NaCl. تأكد من ملء محلول الردم حتى طرف القطب الكهربائي. إذا ظهرت فقاعات الهواء ، فقم بتحريك القطب الدقيق بلطف أو قم بإزالة المحلول وإعادة تعبئته. يجب أن يتم ذلك تحت مجهر مجسمي لتصور أفضل.
  2. تحت المجهر المجسم، اغمس طرف ماصة 10 ميكرولتر في محلول الأيونوفور الانتقائي Na+. اصطفاف القطب عموديا على الماصة ، ضع إصبعا قفازا فوق الجزء السفلي من الطرف لخلق ضغط وطرد قطرة صغيرة من الأيونوفور. عند النظر تحت هدف عال من المجهر ، المس بعناية قطرة الأيونوفور إلى طرف القطب الدقيق ، وتجنب كسر الطرف. عادة ، تمتلئ الأقطاب الكهربائية الدقيقة إلى الأمام بطول عمود كوكتيل الأيونوفور يتراوح بين 150-300 ميكرومتر ، حتى تكون حدود محلول الأيونوفور / الردم مسطحة.
    تنبيه: هذا الأيونوفور سام، راجع MSDS للمناولة الآمنة.
  3. في كوب صغير ، املأ منتصف الطريق ب 100 mM NaCl ، وضع بعض طين النمذجة في الداخل في الجزء العلوي من الدورق. بعد أن يتم أخذ Na+ ionophore ، ضع طرف القطب الكهربائي لأسفل على جدار الكأس ، واترك الطرف يجلس داخل كلوريد الصوديوم 100 mM ، واحتفظ ب ISME في الكأس حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
  4. لجعل القطب المرجعي ISME ، ردم قطب كهربائي مع 500 mM KCl لضمان ملء الحل إلى الطرف (اتبع نفس البروتوكول كما هو موضح أعلاه). تخزين KCl في دورق.

12. معايرة الأقطاب الكهربائية ل ISME

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة مباشرة قبل أخذ قياسات السائل المفرز (~ 10-15 دقيقة قبل). يجب إجراء المعايرة كل ~ 5-6 قياسات لضمان اتساق المنحدر.

  1. قم بتغطية أطراف القطب باستخدام محلول ~ 3.5٪ (ث / v) كلوريد البولي فينيل المذاب في رباعي هيدروفوران ، لتجنب إزاحة الأيونوفور عند غمره في زيت البارافين.
    تنبيه: هذا قابل للاشتعال، راجع MSDS للحصول على معالجة آمنة.
  2. لمعايرة قطب Na+ ، ضع قطرات 10 ميكرولتر من تركيزات كلوريد الصوديوم القياسية التالية على حافة طبق رامزي مع MTs المحتضنة: 200 mM NaCl و 20 mM + 180 mM LiCl. ضع القطرات القياسية على بعد 2 سم تقريبا ، مع التركيز العالي في الأعلى.
  3. أدخل كلا من القطب المرجعي والقطب الانتقائي الأيوني فوق أسلاك الفضة المكلورة واربطها بإحكام باستخدام حوامل الأقطاب الكهربائية المتصلة بالمتلاعبين الدقيقين. قم بتحريك كلا القطبين نحو قطرة كلوريد الصوديوم 200 mM باستخدام المتلاعبين الدقيقين ، مما يضمن عدم لمس أطراف القطب الكهربائي لأسفل الطبق. قم بتشغيل المقياس الكهربائي لبدء التسجيل واسمح للقراءة بالاستقرار.
  4. سجل القراءة واستمر إلى المعيار التالي (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). احسب المنحدر ، وإذا كانت قراءة القطب مستقرة وكان المنحدر ضمن النطاق ، فانتقل إلى استخدام القطب الكهربائي لقياسات القطيرات المفرزة. إذا كانت القراءة غير مستقرة ، أو لا تعطي تسجيلا أو منحدرا مناسبا ، أو تستغرق بعض الوقت لتحقيق التوازن ، فقم بإعداد قطب كهربائي جديد انتقائي للأيونات أو كسر طرف القطب المرجعي عن طريق تشغيل نسيج عبر الطرف. يجب أن يكون ميل Na+ ~ 58-60 mV38 ، على الرغم من أن النطاق المقبول هو 50-60 mV.

13. تسجيلات وحسابات ISME

  1. بعد قياسات معدل إفراز السائل (انظر الخطوة 7.7) ، حرك بعناية كل من القطب المرجعي والقطب الانتقائي الأيوني في القطرة المفرزة باستخدام المتلاعبين الدقيقين. قم بتشغيل التسجيل واسمح للقراءة بالاستقرار وتسجيل القيمة. كرر هذه الخطوة للقطرات الأخرى (كرر قياسات المعايرة كل 5-6 قياسات).
  2. يتم حساب تركيزات Cation باستخدام المعادلة الموضحة سابقا22,38 ، [ion] = [C] x 10ΔV / m ، حيث [C] هو التركيز في مليمول L-1 من محلول المعايرة المستخدم لمعايرة ISME ، ΔV هو التغير في الجهد بين الجهد المسجل من قطرة السائل المفرزة والجهد من نفس محلول المعايرة ، و m هو فرق الجهد بين المعايرتين القياسيتين ، وهو أيضا المنحدر.

14. إعداد SIET

ملاحظة: تم وصف نظام SIET سابقا27,39. لتقليل ضوضاء الخلفية ، يتم تثبيت قفص فاراداي حول المجهر الضوئي والمنصة. تستخدم التجارب المقدمة في هذه الورقة الإعدادات التالية على برنامج تقنية قطب المسح الضوئي الآلي (ASET) 2.0: فترة انتظار مدتها 4 ثوان للسماح للتدرجات الأيونية بإعادة تأسيس حركات القطب الدقيق التالية بالكامل ، مع تسجيل الجهد لمدة 0.5 ثانية بعد فترة الانتظار ، ومسافة رحلة تبلغ 100 ميكرومتر وثلاثة تكرارات لكل تسجيل. يمكن تعديل إعدادات معينة بواسطة المستخدم في ASET، حسب الحاجة.

  1. قم بتشغيل مكبر الصوت IPA-2 Ion/Polarographic ومجهر الضوء (مع كاميرا فيديو مرفقة) والكمبيوتر (أجهزة الكمبيوتر) المتصلة بكل من هذه ASET و cellSens.
  2. قم بإعداد الأقطاب الكهربائية الدقيقة والأقطاب الكهربائية المرجعية الموضحة في الخطوات 9.1-9.3 و 9.5 و 10 و 11.1-11.3. سيحتوي القطب الدقيق الانتقائي للأيون على Na + ionophore مع ردم NaCl 100 mM وسيتم دائما ملء القطب المرجعي (مع جسور agar) ب 3M KCl.
  3. ضع القطب الدقيق Na+-selective على حامل يتكون من سلك كلوريد الفضة (AgCl) وقم بتوصيله بمقبس موصل أنثوي. باستخدام حقنة ، املأ حامل القطب المرجعي ب 3 M KCl جديد (يمكن صنعه قبل يوم التجربة وتخزينه في RT).
    ملاحظة: بعد التجارب، اغسل حامل القطب المرجعي باستخدام ddH2O.
  4. قم بإزالة قطب مرجعي واحد من الكأس يحتوي على جميع الأقطاب الكهربائية المرجعية المغمورة في 3 M KCl ، ووضع إصبع واحد في أحد طرفيه وإمالة الشعيرات الدموية الزجاجية نحو هذا الإصبع لمنع سقوط الآجار. ضع جانبا بعناية في الحامل ، مع ضمان عدم تشكل فقاعات. إذا كانت هناك فقاعة ، فقم بإزالة القطب المرجعي ، وأعد ملء الحامل بمزيد من 3 M KCl وكرر. ضع حامل القطب الكهربائي في مقبس الموصل الأنثوي.

15. معايرة الأقطاب الكهربائية ل SIET

  1. بالنسبة لقياسات Na+، استخدم حلول NaCl 150 mM و 15 mM NaCl + 135 mM LiCl24. يجب أن يكون هناك فرق 10 أضعاف في تركيزات Na+ بين المحاللين ، بما في ذلك نطاق مستويات Na + (20 mM) في المالحة (الجدول 2).
  2. قم بتخزين حلول المعايرة في RT في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل و aliquot في طبق Petri عند إجراء التجربة. يتم التخلص من هذا الأليكوت في نهاية اليوم. إذا كان هناك أي دليل على وجود تلوث في محاليل المخزون ، فقم بالتخلص منها وصنعها بحلول جديدة.
  3. للمعايرة، قم بقياس محللي المعايرة (الخطوة 15.1) في أطباق بتري فردية مقاس 35 مم، وضعها على مرحلة المجهر. باستخدام مقابض الضبط اليدوية التي تتحكم في محركات السائر مع تحديد "تعطيل" في وحدة التحكم في حركة الكمبيوتر ، تأكد من وضع طرف القطب الدقيق داخل محلول المعايرة. لا تغمر الطرف بعيدا جدا ، لأنه قد ينكسر. إذا انكسر الطرف ، فقم بإعداد قطب دقيق جديد انتقائي للأيون وأعد معايرته.
    1. على الكمبيوتر المتصل بمكبر الصوت، افتح برنامج ASET. افتح إعدادات المعايرة. حدد Nernst Slope لنوع المعايرة، واضبط العينة لمدة 3 ثوان، وأدخل تركيزات محاليل المعايرة. على سبيل المثال ، بالنسبة لقياسات Na + ، أدخل 150 mM في المحلول 1 ، وضع طرف القطب الدقيق Na + الانتقائي والقطب المرجعي داخل محلول المعايرة هذا. يجب أن تكون قراءة الجهد على مكبر الصوت مستقرة. انقر فوق الحل 1 ، وانتظر حتى يتم تسجيل الجهد (بالميجافولت). بعد ذلك ، ضع القطب الدقيق والقطب المرجعي داخل محلول 15 mM NaCl + 135 mM LiCl ، وأدخل 15 mM في الحل 2 وانقر فوق الحل 2 للحصول على قراءة الجهد. سيكون المنحدر هو الفرق بين هذين الجهدين ، محسوبا في هذه الإعدادات. بعد المعايرة، انقر فوق موافق.
    2. يجب أن تكون منحدرات الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية Na + للتغير عشرة أضعاف في تركيز الأيونات حوالي 59.0 ± 1.624. إذا انحرف منحدر نيرنست بشكل كبير عن هذا النطاق ، فقم بإعداد قطب كهربائي دقيق جديد ، أو أليكوت معايير جديدة (لأنها قد تكون ملوثة). مطلوب المعايرة قبل كل 2-3 عينات، اعتمادا على استقرار الجهد. إذا أصبح الجهد غير مستقر وبدأ في التقلب ، فقم بإعداد قطب دقيق جديد انتقائي للأيونات.

16. قياسات SIET

ملاحظة: يجب دائما تبديل مفتاح المحرك الموجود في وحدة التحكم في حركة الكمبيوتر إلى تعطيل إلا عند معالجة القطب باستخدام مفاتيح الكمبيوتر من خلال ASET، أو أثناء تسجيلات القياس (عند هذه النقطة يجب تبديل المفتاح إلى تمكين).

  1. بعد المعايرة، قم بتشريح العضو (انظر الخطوة 6.6). ضع طبق بولي-إل-ليسين مع العينة المشوهة على مرحلة المجهر وأدخل طرف القطب المرجعي داخل المحلول الملحي. اغمر طرف القطب الدقيق الانتقائي الأيوني في المحلول الملحي مع الحرص على عدم كسر الطرف.
  2. استخدم مقابض الضبط اليدوية لضبط موضع القطب الدقيق أثناء النظر تحت المجهر الضوئي. اضبط الوضع الرأسي للقطب الدقيق بحيث يكون طرفه على نفس مستوى العضو أو الأنسجة. بمجرد الوصول إلى الموضع المطلوب ، أدر مفتاح المحرك إلى تمكين. في هذه المرحلة ، لا يمكن تشغيل محركات السائر إلا باستخدام برنامج الكمبيوتر.
  3. باستخدام مفاتيح أسهم الكمبيوتر، حرك القطب الدقيق أفقيا إلى موضع يبعد 3 مم عن الأنسجة لقياس تسجيلات الخلفية. أدخل الملاحظات بالضغط على F2. عندما تكون جاهزا، ابدأ التسجيل (بالضغط على F5). الحصول على خمسة قياسات للنشاط الأساسي. سيتم طرح متوسط نشاط الجهد في الخلفية لكل عينة من تدرجات الجهد المقاسة على طول الأنسجة لنفس العينة.
  4. حرك طرف القطب الصغير مرة أخرى بالقرب من الأنسجة ، مع الحرص على عدم اختراق العضو. قلل من حساسية ضربة المفتاح لوضع طرف القطب الدقيق 2 ميكرومتر مباشرة إلى اليمين ، عموديا على الأنسجة. احصل على ثلاثة تسجيلات في كل موقع على طول لوحة المستقيم لتحديد موقع أكبر نشاط أيوني. احصل على قياسات ملحية أساسية في الموقع الذي يعرض أكبر نشاط (موقع "النقطة الساخنة").
  5. قم بتبديل المحرك إلى تعطيل وإضافة العلاج المناسب إلى الطبق للحصول على الجرعة النهائية المطلوبة. بعد التطبيق ، قم بإنشاء ملاحظة جديدة (أي اسم العلاج والجرعة) ، وقم بتبديل المحرك مرة أخرى إلى تمكين وأخذ تسجيلات الجهد باستخدام F5. إذا كان الهدف هو مراقبة التغييرات بمرور الوقت ، فاستمر في أخذ القياسات على فترات زمنية محددة. يمكن إنشاء بروتوكولات متعددة لتطبيقات محددة باستخدام SIET ، اعتمادا على هدف الباحث.
  6. شاهد برنامج ASET يسجل الجهد في الموقع على طول الأنسجة واطرحه من الجهد على مسافة رحلة (الشكل 7) من 100 ميكرومتر بعيدا عن الأنسجة. وبما أن التسجيل الأول يؤخذ على الأنسجة، فإن فرق الجهد الموجب يشير إلى أن الجهد أعلى في الظهارة (الأنسجة) (الشكل 7A) منه بعيدا عن الظهارة (الشكل 7B)، وبالتالي يتم امتصاص الكاتيون. يشير تدرج الجهد السالب إلى إفراز الكاتيون.
  7. احصل على تسجيلات خلفية مرة أخرى بعد العلاج (على بعد 3 مم) واستخدمها عند حساب تدفق الأيونات بعد العلاج. قم بعمل مجموعة واحدة من تسجيلات الخلفية في "خط الأساس" ومجموعة واحدة بعد العلاج. قم بتبديل المحرك لتعطيل أي وقت لا يتم فيه ضبط القطب الدقيق باستخدام مفاتيح الكمبيوتر أو عندما لا يتم تسجيل الجهد. تصدير البيانات إلى ملف نصي وفتحها باستخدام Excel لإجراء كافة العمليات الحسابية.
  8. احسب التدفق الأيوني باستخدام المعادلات الموضحة سابقا24,26. يمكن التعبير عن التدفق الأيوني الصافي لكل معالجة كتغيير مطلق من قياسات التدفق الأيوني الأساسي. للتحقق من أهمية النتائج ، يمكن استخدام التحكم في السيارة (أي إضافة محلول ملحي وحده إلى الطبق بدلا من العلاج). يجب تقييم التغيرات في النقل الأيوني بعد العلاج الهرموني بالنسبة لأي تغييرات في الاستجابة لهذه السيطرة.

17. مقايسات تقلص الأمعاء الهندية

  1. املأ أحد الآبار في الطبق الموصوف في الخطوة 4.1 بحجم معروف من الزاعجة المالحة (الخطوة 5.1). بعد التشريح (الخطوة 6.7) ، انقل بعناية القناة الهضمية الخلفية المشوهة المرتبطة بالأمعاء الوسطى إلى البئر في الطبق الآخر ، مع التأكد من عدم قرصة العضو الذي يتم فحصه (الدقاق). اغمر الأمعاء في المحلول الملحي داخل البئر ، وضع دبابيس Minutien في الأمعاء الوسطى والمستقيم. من خلال القيام بذلك ، لا ينبغي أن يكون الدقاق تحت التوتر ، ويجب ملاحظة الانقباضات التلقائية ، التي تنشأ في الصمام البوابي في الدقاق الأمامي.
  2. قم بتوصيل كاميرا فيديو بمجهر مجسم، وسجل مقاطع الفيديو باستخدام برنامج التقاط فيديو (على سبيل المثال، INFINITY CAPTURE من Luminera). ضع الطبق الذي يحتوي على العضو التشريحي تحت المجهر وسجل لمدة 2 دقيقة. سيكون هذا هو شرط "خط الأساس".
  3. أضف حجما معروفا من 1X الزاعجة المالحة (الخطوة 5.1) إلى البئر لحساب أي تغييرات في الحركة اللفائفية عند زيادة الحجم داخل البئر. انتظر لمدة 1 دقيقة بعد التطبيق ، ثم سجل مرة أخرى لمدة 2 دقيقة. هذه هي الحالة "المالحة".
  4. أضف حجما معروفا من العلاج (من تركيز مخزون 10x للحصول على الجرعة المطلوبة في البئر). انتظر لمدة 1 دقيقة بعد التطبيق ، ثم سجل مرة أخرى لمدة 2 دقيقة. ستكون هذه هي حالة "العلاج".
  5. احفظ جميع مقاطع الفيديو وقم بتحويلها إلى MP4. للتحليل ، احسب عدد الانقباضات في فترات 2 دقيقة (تعرف بأنها موجة تمعجية تبدأ عند صمام البواب وتمتد في جميع أنحاء الدقاق). اقسم هذا الرقم على 2 دقيقة للحصول على معدل الانكماش. يمكن أيضا تقييم معلمات أخرى ، مثل فترة الانكماش أو الاسترخاء. بعد جمع البيانات الخام ، عبر عن كل معلمة بالنسبة للبيانات الخاصة بشروط "خط الأساس" لكل عينة. ارسم تغيير الطية ل "المالحة" و "العلاج" كلها بالنسبة إلى "خط الأساس".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يؤدي تطبيق DH31 ضد MTs غير المحفز إلى زيادة كبيرة في معدل إفراز السوائل ، مما يؤكد دوره كهرمون مدر للبول في بعوض الزاعجة (الشكل 1A). عندما يتم التعامل مع الأنابيب باستخدام AedaeCAPA-1 ، لوحظ انخفاض في معدل الإفراز في MTs المحفزة ب DH31. يوضح الشكل 1B استخدام الأقطاب الكهربائية الانتقائية للأيونات لقياس تركيزات Na + في القطرات المفرزة. لم يكن لعلاج DH31 على MTs أي تأثير على تركيز Na + في القطرة المفرزة ؛ ومع ذلك ، مع تطبيق AedaeCAPA-1 ، زاد تركيز Na + في السائل المفرز بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع الضوابط غير المحفزة ، أدى DH31 إلى معدل نقل Na + أكبر بكثير ، في حين ألغى AedaeCAPA-1 هذه الزيادة في الأنابيب المحفزة DH31 (الشكل 1C). توضح نتائج العينات هذه معا كيف يمكن قياس معدلات إفراز السوائل بعد تطبيق الهرمونات المدرة للبول والمضادة لإدرار البول وكذلك تركيز الأيونات داخل القطرات المفرزة. تم تشريح الإناث اللواتي تتراوح أعمارهن بين ثلاثة وستة أيام وتم تحليل ما بين 23-35 MTs للتجربة. تمت الإشارة إلى الفروق على أنها ذات دلالة إحصائية إذا كان p < 0.05 باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه واختبارات t غير المقترنة.

تم استخدام SIET لتقييم التغيرات في نقل Na + على طول ظهارة وسادة المستقيم لإناث البعوض البالغة. أظهرت معظم المستقيم غير المحفزة التي تم فحصها نقل Na+ الموجه بالدم (الامتصاص) ، وبالتالي تم فحص هذه المستحضرات فقط. ونظرا للتباين في نشاط خط الأساس، تم حساب الفرق في التدفق الأيوني، بعد تطبيق محلول ملحي أو ببتيد، بالنسبة إلى نشاط النقل الأولي في المياه المالحة. هذه القيم تؤدي إلى تغيير سلبي في التدفق الأيوني (تدفق الأيونات بعد العلاج - تدفق الأيونات في ظروف خط الأساس) ، على الرغم من أن جميع الأعضاء ظلت استيعابية بعد العلاجات. تم استخدام تناظرية ليوكوكينين (Drosokinin) لفحص التغيرات في امتصاص Na+ ، مما أدى إلى انخفاض أربعة أضعاف في امتصاص Na + مقارنة بالتحكم الملحي (الشكل 2).

لتقييم دور الببتيد النيوروبي ، pyrokinin-2 (PK2) ، على الحركة اللفائفية ، تم استخدام نظير Rhodnius prolixus ، والذي ثبت سابقا أنه ينشط مستقبل A. aegypti PK2 ، المخصب في لفائفي البعوض 28. بالنسبة لمستويات خط الأساس ، يمنع PK2 بشكل كبير الانقباضات اللفائفية (الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1: تأثير الببتيدات العصبية المدرة للبول والمضادة لإدرار البول على معدل إفراز السائل في المختبر ، وتركيز Na + ومعدل النقل من قبل الإناث البالغة A. aegypti MTs. ايداي تم تطبيق CAPA-1 (0.1 fM) على MTs الذي تم تحفيزه باستخدام DromeDH31 (25 نانومتر). (أ) تم احتضان MTs لمدة 60 دقيقة باستخدام neuropeptides و 120 دقيقة للعناصر التحكم غير المحفزة. (ب) تم قياس تركيزات Na+ في القطرة المفرزة باستخدام ISME واستخدمت القيم لحساب معدل النقل (C). تتم الإشارة إلى الأعمدة التي تختلف اختلافا كبيرا عن عناصر التحكم بنفس الحرف ، كما هو محدد بواسطة اختبار لاحق ANOVA و Bonferroni أحادي الاتجاه (n = 23-35). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التغيرات في نقل Na+ عبر ظهارة وسادة المستقيم الأنثوية التي تم قياسها باستخدام SIET. تم تسجيل امتصاص Na+ في ظروف ملحية أساسية غير محفزة ، تليها المعالجة إما بمحلول ملحي إضافي (التحكم في المركبة) أو 1 ميكرومتر Drosokinin (n = 10-12). تم قياس التغيرات في تدفق Na+ الموجه للدم لكل علاج. كان هناك انخفاض بمقدار أربعة أضعاف في امتصاص Na+ استجابة ل Drosokinin ، كما هو محدد من خلال اختبار t ثنائي الذيل غير مقترن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تغير في الحركة اللفائفية لإناث البعوض بعد استخدام المياه المالحة (مكافحة المركبات) وتطبيق RhoprPK2. تم تسجيل التغير في وتيرة الانكماش بعد كلا العلاجين لكل عينة بالنسبة لظروف خط الأساس (n = 32). روبر قلل PK2 من الحركة اللفائفية ، كما هو محدد من خلال اختبار t ثنائي الذيل المقترن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مخطط لفحص رامزي، واستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات (ISME)، وتقنية القطب الكهربائي الانتقائي الأيوني (SIET)، ومقايسات تقلص الأمعاء الخلفية. الرسوم التوضيحية للطرق الأربع المستخدمة لتحديد الأدوار الوظيفية لعوامل الغدد الصماء على نظام إفراز البعوض ، الزاعجة المصرية . (أ) يستخدم فحص رامزي لقياس معدلات إفراز السوائل في أنابيب Malpighian المعزولة. يتم لف الطرف القريب (المفتوح) للأنبوب حول دبوس ، محاط بالزيوت المعدنية ، بينما يتم غسل الطرف البعيد (المغلق) في محلول ملحي للمعالجة. بعد فترة زمنية محددة ، ستفرز النهاية القريبة البول الأساسي ، وتتراكم كقطرات على الدبوس. (ب) يوضع قطب مرجعي و ISME في القطرة المفرزة ، متصلة بنظام الحصول على البيانات ، لقياس تركيز الأيونات. (ج) يقيس SIET النقل الأيوني باستخدام قطب كهربائي دقيق انتقائي أيون يوضع بشكل عمودي على بعد ~ 2 ميكرومتر من العضو الملتصق بقاع طبق بولي - ل - ليسين. يشير اتجاه الأسهم الحمراء في هذا المخطط إلى أن Na+ يتم امتصاصه في المياه المالحة ، ويشار إليه بتسجيل جهد أكبر على طول الظهارة بالنسبة للمنطقة البعيدة عن سطح العضو. (د) يتم إجراء اختبارات تقلص القناة الهضمية الهندية باستخدام تسجيلات الفيديو لتقييم التغيرات في تردد الانقباض وطوله ومدة استرخاءه. في هذا المخطط ، يتم وضع الأعضاء داخل بئر ، ويتم إدخال دبوس معدني مباشرة في القناة الهضمية الوسطى والمستقيم للسماح للدقاق بالطفو والانقباض بحرية. تتم إضافة العلاجات إلى البئر لتقييم التغيرات في الحركة نوعيا وكميا. تم إنشاؤه باستخدام BioRender. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الأطباق المستخدمة في (أ) تشريح البعوض ، (ب) فحص رامزي ، (ج) SIET و (د) قياسات فحص الانقباض. A و B و D مغلفة بالكامل بالسيليكون ، في حين أن C مغلفة ب poly-L-lysine في الوسط. لإعداد الطبق المستخدم في فحص رامزي (B) ، يتم استخدام طبق بتري صغير مطلي بالسيليكون ، ويتم نحت آبار صغيرة ~ 4-5 مم على بعد 1 سم (يمكن نحت حوالي 20 بئرا / طبقا). يتم وضع دبابيس معدنية صغيرة بجانب كل بئر للتمسك بالنبيب المعزول لقياس معدل إفراز السوائل. يسمح طبق بولي إل-ليسين (C) للعضو بالالتصاق بالقاع أثناء قياسات SIET. تمتلئ الآبار الموجودة في طبق فحص الانقباض (D) بمحلول ملحي وأي علاجات تالية. تتم ملاحظة الجهاز المتعاقد الموجود داخل البئر باستخدام كاميرا فيديو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: نظام إفراز البعوض ، الزاعجة المصرية. بعد تناول وجبة الدم ، يتم تمرير المذابات والماء والمواد المغذية على طول القناة الهضمية ، والتي تشمل (على سبيل المثال لا الحصر) الأمعاء الوسطى ، والصمام البوابي ، و MTs ، و hindgut. الأمعاء الوسطى هي الموقع الرئيسي لهضم الطعام وامتصاص المغذيات. تنقل MTs الخمسة الماء والمذابات والنفايات من الهيموليمفاوية المحيطة وتفرز هذا البول الأولي في القناة الهضمية الخلفية ، وتتكون من الدقاق الأمامي والمستقيم الخلفي ، والأخير يتضمن أربعة (ذكر) أو ستة (أنثى) منصات المستقيم. يعمل الجزء الخلفي كموقع نهائي لإعادة الامتصاص قبل إفراز النفايات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: صور ثابتة لأمعاء البعوض الخلفية المشوهة أثناء قياسات SIET. لقياس النشاط الأيوني على طول ظهارة إحدى منصات المستقيم الستة، يتم وضع القطب الدقيق الانتقائي Na+على بعد 2 ميكرومتر من الأنسجة (A). يتم تسجيل الجهد في هذا الموقع قبل تحريك طرف القطب الدقيق على مسافة رحلة (Δx) تبلغ 100 ميكرومتر بعيدا عن هذه النقطة (B). يستخدم تدرج الجهد بين هاتين النقطتين لحساب تدرج التركيز وتدفق الأيونات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: محاقن الردم ل ISME و SIET. صورة للمحاقن المستخدمة لردم حلول كلوريد الصوديوم و KCl في الأقطاب الكهربائية الدقيقة. يظهر هذا أربعة محاقن ذات طرف انزلاقي سعة 1 مل مع إبر يمكن التخلص منها ، مع طرف ممتد معدل للسماح بالإدخال في قطب كهربائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2X الزاعجة المصرية المالحة
ل 500 مل:
في دورق ، أضف 400 مل من ddH2O ، ثم أضف المذابات التالية:
مكون الوزن (غ) التركيز النهائي (ملليمتر)
كلوريد الصوديوم 8.766 150
هيبس 5.957 25
كيه سي ال 0.253 3.4
ناوه 0.3 7.5
ناهكو3 0.151 1.8
إم جي إس أو 4 0.12 1
CaCl2-2H20 0.249 1.7
يحرك وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1
أضف ddH2O إلى الحجم النهائي البالغ 500 مل لجعل 2x الزاعجة المالحة
10X الجلوكوز
ل 500 مل:
في دورق ، أضف 450 مل من ddH2O ، ثم أضف:
مكون الوزن (غ) التركيز النهائي (ملليمتر)
الجلوكوز 4.5 5
حرك وأضف ddH2O إلى الحجم النهائي البالغ 500 مل
لجعل 1X الزاعجة المصرية المالحة:
ل 100 مل:
في دورق، أضف 40 مل من ddH2O، ثم أضف:
مكون الحجم (مل)
2x الزاعجة المالحة 10
يحرك المزيج ويضبط الرقم الهيدروجيني على 7.1
تصفية التعقيم

الجدول 1: صنع الزاعجة المصرية المالحة. لجعل الزاعجة المالحة ، قم بإعداد 2X Aedes saline و 10x glucose بشكل منفصل ، وتخزينها في ثلاجة 4 درجات مئوية. استخدم هذين الحلين لإعداد مخزون عامل (1x Aedes saline) ، يستخدم لتشريح الأنسجة ، وفحوصات رامزي ، وفحوصات الانقباض.

الزاعجة المصرية الخالية من الكالسيوم + NMDG
ل 500 مل:
في دورق ، أضف 400 مل من ddH2O ، ثم أضف المذابات التالية:
مكون الوزن (غ) التركيز النهائي (ملليمتر)
كلوريد الصوديوم 1.17 20
إن إم دي جي 25.38 130
هيبس 5.957 25
كيه سي ال 0.253 3.4
ناهكو3 0.151 1.8
إم جي إس أو 4 0.12 1
الجلوكوز 0.9 5
يحرك وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1
أضف ddH2O إلى الحجم النهائي البالغ 500 مل

الجدول 2: محلول ملحي معدل من الزاعجة المصرية يستخدم في قياسات SIET. يستخدم هذا الملح الخالي من Ca2+ لمنع تقلصات الأمعاء الخلفية التلقائية أثناء قياسات SIET. هذه المحلول الملحي محدد لقياس نقل Na+ ، لأنه يتكون من Na+ منخفض (20 mM) يتكون من استبدال متساوي المولات مع N-methyl-D-glucamine (NMDG) لتقليل ضوضاء الخلفية.

MTs محفزة بقيمة 31 درهما قطر القطيرة (وحدات) قطر القطيرة (أم) حجم القطيرات (um3) معدل الإفراز (nl / min)
n العلاج # 1 (60 دقيقة) العلاج # 1 (60 دقيقة) العلاج # 1 (60 دقيقة) العلاج # 1 (60 دقيقة)
1 16 313.73 16167692.56 0.27
2 14 274.51 10831090.91 0.18
3 17 333.33 19392547.25 0.32
4 13 254.90 8671977.67 0.14
5 14 274.51 10831090.91 0.18
6 22 431.37 42029685.15 0.70
7 15 294.12 13321768.16 0.22
8 16 313.73 16167692.56 0.27
9 20 392.16 31577524.53 0.53
دني 16.33333333 320.26 18776785.52 0.31
الأمراض المنقولة جنسيا ERR 0.06

الجدول 3: عينة من بيانات فحص رامزي. جدول يوضح بيانات العينات التي تم جمعها من MTs المحفزة DH31 من إناث البعوض البالغة. عند قياس قطر القطرة المفرزة ، قم أولا بالقياس باستخدام ميكرومتر العين المجهري المجسم ولاحظ القيمة. بعد ذلك ، اضرب قطر وحدة العين مع تحويل المعايرة الذي تم إجراؤه قبل التجربة للحصول على قطر القطرة بالميكرومتر. احسب حجم المعادلة بعد ذلك، باستخدام المعادلة المشار إليها في الخطوة 7.7، متبوعة بمعدل الإفراز، باستخدام المعادلة المشار إليها في الخطوة 7.8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عند تناول وجبة دم ، تواجه حشرات الهيماتوفاغوص تحدي المذابات الزائدة والماء في الهيموليمفاوية 2. للتعامل مع هذا ، لديهم نظام إفراز متخصص ، يتم التحكم فيه بإحكام بواسطة العوامل الهرمونية ، مما يسمح للحشرات بالبدء بسرعة في إدرار البول بعد البرانديال. يسمح فحص رامزي واستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات بقياس معدلات إفراز السوائل إلى جانب تركيزات الأيونات ومعدلات النقل في الحشرات المعزولة MTs. وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن هذه الأساليب ضمان التشريح السليم للحشرة MTs. يجب أن تتم إزالة كل نبيب من الحشرة بشكل فردي بعناية ، لأن أي ضرر يلحق بالنبيب سيؤدي إلى إفراز السائل من المسيل للدموع أو يؤدي إلى إعداد غير وظيفي. الزاعجة لا تفرز MTs بسهولة في عناصر التحكم غير المحفزة ، وبالتالي يمكن تطبيق الهرمونات والأدوية لتحفيز الإفراز. ومع ذلك ، حتى مع تطبيق مدر للبول أو تشريح دقيق ، قد تفشل بعض MTs في الإفراز في حالة تلفها (حتى لو لم تكن واضحة على الإطلاق مع الفحص البصري) ، وبالتالي قد يتعين إجراء جولات متعددة من الفحص. من أجل الاستخدام السليم للأقطاب الكهربائية الانتقائية للأيونات أثناء قياسات ISME و SIET ، تأكد من أن ميل المعايير ضمن النطاق الطبيعي المبلغ عنه للأيونوفور ، مما سيعطي القراءات الأكثر دقة. ومع ذلك ، إذا كانت القراءات غير مستقرة ، فقم بفحص القطب الكهربائي تحت المجهر للتأكد من أن الأيونوفور قد تم تناوله ولا يتسرب. يجب تحضير قطب كهربائي جديد إذا كانت هناك فقاعات هواء موجودة ، أو تم كسر الطرف ، أو لم يتم تناول الأيونوفور بشكل صحيح. إذا كانت حدود الأيونوفور / الردم محدبة ، فإن الأقطاب الكهربائية تكون ناقصة السيلان ويجب استخدام المزيد من ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان. إذا كانت الحدود مقعرة ، فإن الأقطاب الكهربائية تكون مفرطة في السيلان ، ويجب استخدام كمية أقل من ثنائي كلورو ثنائي ميثيل سيلان. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون بعض الأقطاب الكهربائية أقل استقرارا من غيرها ، مثل القطب الكهربائي الانتقائي Na + ، حيث يتدهور المنحدر بشكل أسرع مقارنة ب K + أو H +.

توفر هذه الأساليب فرصا غير محدودة لدراسة الآليات الكامنة وراء إفراز السوائل بواسطة MTs. نظرا للتطورات الحديثة في التحرير الجينومي ، يمكن استخدام الاستراتيجيات الجينية العكسية مثل تحرير الجينات CRISPR-Cas9 وتداخل الحمض النووي الريبي للتحقيق في الدور التنظيمي و / أو الوظيفي لجينات معينة يتم التعبير عنها في أعضاء الإخراج. وقد استخدمت الدراسات مثل هذه الأدوات لفهم التنظيم الهرموني في Aedes40 و Drosophila41 MTs. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل قطرة الاستحمام للنظر في الأدوار المحددة للهرمونات14،15،18،21،42 ، وأنظمة الرسول الثاني ، والأدوية على معدل الإفراز وتركيزات الأيونات. وقد طبقت هذه المنهجيات على مختلف الحشرات الأخرى مثل رودنيوس بروليكسوس38، وأنواع اليرقات والبعوض البالغ، وذبابة الفاكهة 41، وأنواع الذبابة (Hexagenia rigida)43. وبالمثل ، يمكن فحص أيونات مختلفة ، مثل Cl-و K + و H + و NH4 +.

أثناء قياسات SIET ، قد يكون هناك تباين بين كل عينة خلال ظروف خط الأساس. لا يزال من الممكن أن تنشأ الاختلافات عند التحكم في عمر البعوض وجنسه وحالة تغذيته ، خاصة عند فحص مناطق مختلفة من الأمعاء (أي مسافات معينة أمامية أو خلفية من تقاطع الدقاق المستقيم). يمكن تفسير هذه الاختلافات عن طريق التعبير عن تدفق الأيونات بعد المعالجة كتغيير بالنسبة لظروف خط الأساس. بمرور الوقت ، قد يتقلب نشاط الأيونات أيضا ، وبالتالي من المهم تقييم التغييرات مقارنة بالتحكم في السيارة (المالحة) ، كما هو موضح في النتائج المعروضة هنا. إذا بدأت قراءات الجهد في التقلب بشكل كبير ، فقم بإعداد قطب كهربائي دقيق جديد انتقائي للأيونات وأعد معايرته. يمكن أن يساعد استخدام محلول معايرة ثالث (مخفف 10 أضعاف من أدنى تركيز لمحلول المعايرة) في إنشاء منحدر Nernst أكثر دقة. نظرا لأن نشاط Na+ عادة ما يكون شديد التعرض لضوضاء الخلفية ، يتم استخدام محلول ملحي معدل من الزاعجة يتكون من Na+ أقل (الجدول 2). من المهم أيضا الحفاظ على مسافة من قفص فاراداي أثناء القياسات لتجنب التداخل وتقليل أي خلفية. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان العضو لا يزال ينتج تقلصات عفوية عند الالتزام بالبولي إل-ليسين في الجزء السفلي من الطبق ، فإن إضافة مخلب الكالسيوم إلى المحلول الملحي سيساعد بشكل أكبر على منع ذلك. عند فحص انتقال الأيونات على طول ظهارة وسادة المستقيم ، كما هو موضح في النتائج المعروضة هنا ، من المهم تحديد موقع "النقطة الساخنة" الذي يظهر أكبر نشاط أيوني عن طريق تحريك طرف القطب الدقيق بزيادات صغيرة على طول الجانب المواجه للدم من وسادة المستقيم. إذا لم تتمكن من اكتشاف أي تغييرات كبيرة في النشاط الأيوني ، فقد يكون العضو قد تضرر أو أن طرف القطب الدقيق ليس في نفس المستوى ثلاثي الأبعاد مثل فتحة وسادة المستقيم ، وبالتالي يجب تشريح بعوضة أخرى.

يمكن استخدام SIET في تجارب مختلفة ، مثل فحص نشاط الأيونات في البعوض الذي يتم تربيته في ظروف مختلفة25 أو تغذية أنظمة غذائية مختلفة (أي تغذية السكروز مقابل تغذية الدم مقابل عدم التغذية) ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتحديد آليات النقل الأيوني الحرجة بعد وجبة الدم. لذلك من المهم ضمان الحصول على القياسات من نفس الموقع بين العينات. على سبيل المثال ، يمكن أخذ القياسات من تقاطع الدقاق والمستقيم أو على مسافات محددة تقع أماميا من هذا الموقع (على طول الدقاق) أو خلفيا (على طول ظهارة المستقيم). يمكن أيضا الحصول على هذه القياسات على طول ظهارة وسادة المستقيم التي تتطلب وضعا مختلفا للعضو في الطبق. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم ملاحظة أن SIET لا يقتصر على قياس نشاط الأيونات فقط على طول القناة الهضمية الخلفية. يمكن أيضا فحص الأعضاء الأخرى ، بما في ذلك midgut و MTs. وبالمثل ، يمكن قياس التدفق K + و H + و NH4 + و Cl- باستخدام SIET25,44,45 ويمكن أخذ القياسات على فترات زمنية محددة بعد العلاج44. وقد استخدمت هذه التقنية على كل من البعوض اليرقي والبالغ26،44 ، وكذلك العديد من الحشرات الأخرى ، بما في ذلك Chironomus riparius46 و Trichoplusia ni45،47 و Hexagenia rigida43. يمكن استخدام هذه التجارب جنبا إلى جنب مع فحص رامزي و ISME للحصول على فهم أفضل لدور العلاجات المختلفة والعوامل البيئية على إفراز السوائل وتركيز الأيونات ونقل الأيونات.

وأخيرا، فإن مقايسات الانقباض مفيدة لتحديد العوامل العصبية الصماوية التي تؤثر على حركية الأمعاء. من الأهمية بمكان ألا يتلف العضو قيد الدراسة لأن هذا الفحص يعتمد على الحركات الناتجة عن العضلات. لذلك ، يجب استخدام الملقط فقط للاستيلاء على الهياكل المحيطة عند نقل الأعضاء إلى طبق الفحص. كما أن الإمساك بهذه الأعضاء المجاورة بدبوس داخل البئر يمنعها من التحرك والتأثير على حركة العضو المعزول الذي يتم فحصه. إذا لم يلاحظ أي تقلصات عفوية ، فقد تكون الأنسجة قد تضررت ، ويلزم تشريح جديد. وتشمل الطرق الأخرى المستخدمة عادة لفحص نشاط انقباض الأمعاء الحشرية استخدام محول القوة32 أو مراقب المعاوقة33. ويمكن أيضا استخدام هذه الطرق لقياس معدل الانكماش في الأمعاء الخلفية البعوض. ومع ذلك ، إذا كان الهدف هو فحص هذه التغييرات بصريا من خلال تسجيلات الفيديو ، فإن الطرق الموضحة في هذا البروتوكول ستكون مفيدة ويمكن استخدامها لمزيد من التحليل48.

ساعدت التقنيات الأربع الموضحة في هذا البروتوكول على استنتاج دور عدد من الببتيدات العصبية في نظام إفراز الحشرات المختلفة. ويمكن أن يوفر استخدام هذه الأساليب بالاقتران مع التقنيات الإضافية التي يستخدمها علماء فسيولوجيا الحشرات، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي والكيمياء النسيجية المناعية، فهما أكثر شمولا للمسارات الأساسية ونظم الإشارات، التي يمكن أن تكون بمثابة أهداف محتملة جديدة لمكافحة النواقل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

اي.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) Discovery Grants إلى AD و J-PP. حصلت AL و FS على جوائز NSERC CGS-M لدعم أبحاث الدراسات العليا الخاصة بهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringes Fisher Scientific 14955456
35 mm Petri dishes Corning Falcon (Fisher Scientific) C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes
(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)		 World Precision Instruments 1B100F-4 used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes
(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)		 World Precision Instruments 1B200F-4 used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes
(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)		 World Precision Instruments TW150-4 used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad Diamed GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution Sigma-Aldrich 41716
Faraday cage Custom Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride Sigma-Aldrich 157740
Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 91150-20
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-748A
Hydrated mineral oil Fisher Scientific 8042-47-5 Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera Luminera INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed) World Precision Instruments MMJL and MMJR Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light Fisher Scientific 0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel) Fine Science Tools 26002-10
Non-hardening modeling clay Sargent Art Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET) Olympus customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette Fisher Scientific 13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) Sigma-Aldrich A-005-M 84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81395
Scalpel Blade Fine Science Tools 10050-00
Scalpel Handle Fine Science Tools 10053-09
Schneider's Drosophila medium Sigma-Aldrich S0146
SIET system Applicable Electronics customized system Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire World Precision Instruments AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A Fluka 99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes Fisherbrand FB012921 Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer Nikon SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller Sutter Instruments FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Chemical Company NC9285739
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 401757
VWR advanced hotplate stirrer - aluminum VWR 9578 Specific brand is not important

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic factors in insects: the role of CAPA peptides. General and Comparative Endocrinology. 176, 300-308 (2012).
  2. Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. Journal of Experimental Biology. 206, 3845-3856 (2003).
  3. Bradley, T. J. Physiology of osmoregulation in mosquitoes. Annual Review of Entomology. 32, 439-462 (1987).
  4. Patrick, M. L., Aimanova, K., Sanders, H. R., Gill, S. S. P-type Na+/K+-ATPase and V-type H+-ATPase expression patterns in the osmoregulatory organs of larval and adult mosquito Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 209, 4638-4651 (2006).
  5. Coast, G. The endocrine control of salt balance in insects. General and Comparative Endocrinology. 152, 332-338 (2007).
  6. Maddrell, S. H. P., Overton, J. A. Methods for the study of fluid and solute transport and their control in insect Malpighian tubules. Methods in Enzymology. , 617-632 (1990).
  7. Beyenbach, K. W., Oviedo, A., Aneshansley, D. J. Malpighian tubules of Aedes aegypti: Five tubules, one function. Journal of Insect Physiology. 39, 639-648 (1993).
  8. Misyura, L., Yerushalmi, G. Y., Donini, A. A mosquito entomoglyceroporin, Aedes aegypti AQP5, participates in water transport across the Malpighian tubules of larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 3536-3544 (2017).
  9. Drake, L. L., Rodriguez, S. D., Hansen, I. A. Functional characterization of aquaporins and aquaglyceroporins of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 5, 7795 (2015).
  10. Ramsay, J. A. Active transport of water by the Malpighian tubules of the stick insect, Dixippus morosus (Orthoptera, Phasmidae). Journal of Experimental Biology. 31, 104-113 (1954).
  11. Jing, X., White, T. A., Yang, X., Douglas, A. E. The molecular correlates of organ loss: the case of insect Malpighian tubules. Biology Letters. 11, 20150154 (2015).
  12. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. T. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
  13. O'Connor, K. R., Beyenbach, K. W. Chloride channels in apical membrane patches of stellate cells of Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 204, 367-378 (2001).
  14. Ionescu, A., Donini, A. AedesCAPA-PVK-1 displays diuretic and dose dependent antidiuretic potential in the larval mosquito Aedes aegypti (Liverpool). Journal of Insect Physiology. 58, 1299-1306 (2012).
  15. Coast, G. M., Garside, C., Webster, S. G., Schegg, K. M., Schooley, D. A. Mosquito natriuretic peptide identified as a calcitonin-like diuretic hormone in Anopheles gambiae (Giles). Journal of Experimental Biology. 208, 3281-3291 (2005).
  16. Clark, T. M., Bradley, T. J. Additive effects of 5-HT and diuretic peptide on Aedes Malpighian tubule fluid secretion. Comparative Biochemistry and Physiology. 119, 599-605 (1998).
  17. Veenstra, J. A. Effects of 5-hydroxytryptamine on the Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 34, 299-304 (1988).
  18. Pollock, V. P., et al. Conservation of capa peptide-induced nitric oxide signalling in Diptera. Journal of Experimental Biology. 207, 4135-4145 (2004).
  19. Maddrell, S. H. P., Gardiner, B. O. C. The passive permeability of insect Malpighian tubules to organic solutes. Journal of Experimental Biology. 60, 641-652 (1974).
  20. O'Donnell, M. J. Too much of a good thing: How insects cope with excess ions or toxins in the diet. Journal of Experimental Biology. 212, 363-372 (2009).
  21. Sajadi, F., Curcuruto, C., Al Dhaheri, A., Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic action of a CAPA neuropeptide against a subset of diuretic hormones in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  22. Donini, A., O'Donnell, M. J., Orchard, I. Differential actions of diuretic factors on the Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 42-48 (2008).
  23. Donini, A., et al. Secretion of water and ions by Malpighian tubules of larval mosquitoes: Effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiological and Biochemical Zoology. 79, 645-655 (2006).
  24. Donini, A., O'Donnell, M. J. Analysis of Na+, Cl-, K+, H+ and NH4+ concentration gradients adjacent to the surface of anal papillae of the mosquito Aedes aegypti: Application of self-referencing ion-selective microelectrodes. Journal of Experimental Biology. 208, 603-610 (2005).
  25. Durant, A. C., Donini, A. Development of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito larvae in high ammonia sewage in septic tanks causes alterations in ammonia excretion, ammonia transporter expression, and osmoregulation. Scientific Reports. 9, (2019).
  26. Paluzzi, J. P. V., Vanderveken, M., O'Donnell, M. J. The heterodimeric glycoprotein hormone, GPA2/GPB5, regulates ion transport across the hindgut of the adult mosquito, Aedes aegypti. PLoS One. 9, 86386 (2014).
  27. Nguyen, H., Donini, A. Larvae of the midge Chironomus riparius possess two distinct mechanisms for ionoregulation in response to ion-poor conditions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299, 762-773 (2010).
  28. Lajevardi, A., Paluzzi, J. -P. V. Receptor characterization and functional activity of pyrokinins on the hindgut in the adult mosquito, Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 11, 490 (2020).
  29. Cook, B. J., Holman, G. M. The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology and Pharmacology. 80, 65-73 (1985).
  30. Robertson, L., Rodriguez, E. P., Lange, A. B. The neural and peptidergic control of gut contraction in Locusta migratoria: The effect of an FGLa/AST. Journal of Experimental Biology. 215, 3394-3402 (2012).
  31. Te Brugge, V. A., Schooley, D. A., Orchard, I. Amino acid sequence and biological activity of a calcitonin-like diuretic hormone (DH31) from Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 382-390 (2008).
  32. Lange, A. B., et al. The distribution and physiological effects of the myoinhibiting peptides in the kissing bug, Rhodnius prolixus. Frontiers in Neuroscience. 6, 98 (2012).
  33. Robertson, L., Chasiotis, H., Galperin, V., Donini, A. Allatostatin A-like immunoreactivity in the nervous system and gut of the larval midge Chironomus riparius: Modulation of hindgut motility, rectal K+ transport and implications for exposure to salinity. Journal of Experimental Biology. 217, 3815-3822 (2014).
  34. Kwon, H., Pietrantonio, P. V. Calcitonin receptor 1 (AedaeGPCRCAL1) hindgut expression and direct role in myotropic action in females of the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43, 588-593 (2013).
  35. Messer, A. C., Brown, M. R. Non-linear dynamics of neurochemical modulation of mosquito oviduct and hindgut contractions. Journal of Experimental Biology. 198, 2325-2336 (1995).
  36. Petzel, D. H., Berg, M. M., Beyenbach, K. W. Hormone-controlled cAMP-mediated fluid secretion in yellow-fever mosquito. The American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 253, 701-711 (1987).
  37. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the Drosophila melanogaster Malpighian tubule. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53144 (2015).
  38. Paluzzi, J. -P. V., Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Natriuresis and diuretic hormone synergism in R. prolixus upper Malpighian tubules is inhibited by the anti-diuretic hormone, RhoprCAPA-α2. Journal of Insect Physiology. 58, 534-542 (2012).
  39. Rheault, M. R., O'Donnell, M. J., Morris, C. E. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. Journal of Experimental Biology. 207, 2173-2184 (2004).
  40. Sajadi, F., et al. CAPA neuropeptides and their receptor form an anti-diuretic hormone signaling system in the human disease vector, Aedes aegypti. Scientific Reports. 10, 1755 (2020).
  41. Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. American Journal of Physiology. 303, 883-894 (2012).
  42. Yu, M. J., Beyenbach, K. W. Effects of leucokinin-VIII on Aedes Malpighian tubule segments lacking stellate cells. Journal of Experimental Biology. 207, 519-526 (2004).
  43. Nowghani, F., et al. Impact of salt-contaminated freshwater on osmoregulation and tracheal gill function in nymphs of the mayfly Hexagenia rigida. Aquatic Toxicology. 211, 92-104 (2019).
  44. D'Silva, N. M., O'Donnell, M. J. Mechanisms of transport of H+, Na+ and K+, across the distal gastric caecum of larval Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 121, 103997 (2020).
  45. Kolosov, D., O'Donnell, M. J. Malpighian tubules of caterpillars: blending RNAseq and physiology to reveal regional functional diversity and novel epithelial ion transport control mechanisms. Journal of Experimental Biology. 222, (2019).
  46. Jonusaite, S., Kelly, S. P., Donini, A. Tissue-specific ionomotive enzyme activity and K+ reabsorption reveal the rectum as an important ionoregulatory organ in larval Chironomus riparius exposed to varying salinity. Journal of Experimental Biology. 216, 3637-3648 (2013).
  47. O'Donnell, M. J., Ruiz-Sanchez, E. The rectal complex and Malpighian tubules of the cabbage looper (Trichoplusia ni): regional variations in Na+ and K+ transport and cation reabsorption by secondary cells. Journal of Experimental Biology. 218, 3206-3214 (2015).
  48. Simo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44, 819-826 (2014).

Tags

علم الأحياء ، العدد 174 ، الببتيدات العصبية ، أنابيب مالبيغيان ، الأمعاء الخلفية ، نظام الإخراج ، البعوض ، الزاعجة المصرية ، فحص رامزي ، فحص الإفراز ، SIET ، ISME ، النقل الأيوني ، الانقباضات
دراسة نشاط الببتيدات العصبية وغيرها من منظمات نظام الإخراج في البعوض البالغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini,… More

Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. P. V. Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito. J. Vis. Exp. (174), e61849, doi:10.3791/61849 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter