Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות מאחורי בדיקת רמזי, מיקרואלקטרודים סלקטיביים יונים, סריקת טכניקת אלקטרודה סלקטיבית יון (SIET) ובדיקות התכווצות במבחנה, המיושמים לחקר מערכת הפרשת היתושים הבוגרת, המורכבת מצינורות Malpighian והינדגוט, כדי למדוד באופן קולקטיבי שיעורי הפרשת יונים ונוזלים, פעילות התכווצות והובלת יונים טרנס-אפיתל.
Abstract
מחקרים על פיזיולוגיית חרקים, במיוחד באותם מינים שהם וקטורים של פתוגנים הגורמים למחלות בבני אדם ובעלי חוליות אחרים, מספקים את הבסיס לפיתוח אסטרטגיות חדשניות להדברה. כאן, סדרה של שיטות מתוארות כי הם מנוצלים באופן שגרתי כדי לקבוע את התפקידים התפקודיים של neuropeptides וגורמים עצביים אחרים (כלומר, אמינים ביוגניים) על מערכת ההפרשה של היתוש, Aedes aegypti. הצינוריות המלפיגיות (MTs), האחראיות על היווצרות שתן ראשונית, יכולות להמשיך לתפקד במשך שעות כאשר הן מוסרות מהיתוש, ומאפשרות מדידות הפרשת נוזלים בעקבות טיפולים הורמונליים. ככזה, בדיקת רמזי היא טכניקה שימושית למדידת שיעורי הפרשה מ- MTs מבודדים. מיקרואלקטרודים סלקטיביים של יון (ISME) יכולים לשמש ברצף למדידת ריכוזי יונים (כלומר, Na+ ו- K +) בנוזל המופרש. בדיקה זו מאפשרת מדידה של מספר MTs בזמן נתון, קביעת ההשפעות של הורמונים שונים ותרופות. טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של סריקת יון משתמשת ב- ISME כדי למדוד נציג מתח של פעילות יונית בשכבה הלא מסודרת הסמוכה לפני השטח של איברים המעבירים יון כדי לקבוע הובלה טרנס-אפיתלאלית של יונים בזמן אמת. שיטה זו יכולה לשמש כדי להבין את התפקיד של הורמונים ורגולטורים אחרים על ספיגת יונים או הפרשה על פני אפיתליה. בדיקות התכווצות הינדגוט הן גם כלי שימושי לאפיון נוירופפטידים מיואקטיביים, שעשויים לשפר או להפחית את היכולת של איבר זה להסיר עודפי נוזלים ופסולת. באופן קולקטיבי, שיטות אלה מספקות תובנה כיצד מערכת ההפרשה מוסדרת יתושים בוגרים. זה חשוב כי תיאום פונקציונלי של איברי הפרשה הוא קריטי להתגבר על אתגרים כגון מתח ייבוש לאחר עיקול ולפני מציאת מארח חוליות מתאים כדי לקבל קמח דם.
Introduction
שמירה על רמות המלח והמים בחרקים מאפשרת להם להצליח בנישות אקולוגיות וסביבתיות רבות, תוך שימוש במגוון אסטרטגיות האכלה1. רוב החרקים פיתחו מנגנונים לווסת את הרכב המולימפה שלהם בתוך גבולות צרים על מנת לעמוד באתגרים השונים הקשורים לסביבתם המסוימת2. חרקים יבשתיים מתמודדים לעתים קרובות עם האתגר של חיסכון במים ומערכת ההפרשה עוברת אנטי diuresis כדי למנוע אובדן מים וכמה מלחים חיוניים, ולכן, הימנעות התייבשות. לעומת זאת, diuresis מתרחשת כאשר החרק ניזון והוא מאותגר עם עודף מים וייתכן מלחים 3,4. באמצעות מערכת ההפרשה המיוחדת והפעילה ביותר שלהם, חרקים פיתחו מנגנוני רגולציה הפועלים כדי להתמודד עם האתגרים האוסמורגולטוריים שלהם. אצל יתושי Aedes aegypti למבוגרים, מערכת ההפרשה מורכבת מהצינורות המלפיגיים (MTs) וההינדגוט, שהאחרון שבהם מורכב מאילום הקדמי ופי הטבעת האחורית5. MTs אחראים על יצירת שתן ראשוני, בדרך כלל עשיר NaCl ו / או KCl. השתן העיקרי משתנה לאחר מכן באמצעות תהליכי הפרשה ו reabsorptive כפי שהוא נוסע במורד הזרם של הצינור ונכנס hindgut5. הצואה הסופית יכולה להיות היפר-או היפוסמוטית להמולימפה, בהתאם לתנאי האכלה/סביבה, והיא מועשרת בפסולת רעילה וחנקנית2.
MTs הם אידיאליים לחקר תכונות רבות של נוזל אפיתל ותחבורה solute כפי שהם מבצעים מגוון גדול של פונקציות תחבורה הפרשה2,6. באמצעות ויסות הורמונלי2, MTs פונקציה על ידי הפרשת יונים ומסיסים אחרים מן הדם לתוך לומן צינור7, מתן שיפוע אוסמוטי המאפשר מים להיות מועברים על ידי aquaporins8,9, אשר באופן קולקטיבי יוצר את השתן העיקרי, לפני נסיעה לכיוון hindgut reabsorptive2. לכן, על ידי איסוף הנוזל המופרש מ MTs מבודדים, אפשר לפקח ברציפות על הובלה transepithelial של נוזל ויונים. מדידת קצב ההפרשה והרכב השתן מספקים תובנה על מנגנונים האחראים על יון transepithelial והובלת נוזלים. שיטה פופולרית לחקר שיעורי הפרשת נוזלים היא בדיקת רמזי, שהוצגה לראשונה על ידי רמזי בשנת 195310. בשיטה זו, הקצה הדיסטלי (הסגור) של הצינור מטופל עם הורמון (או תרכובת בדיקה אחרת / תרופה), בעוד הקצה הפרוקסימלי (הפתוח) עטוף סביב סיכה בשמן פרפין רווי מים, אשר מפריש את השתן העיקרי, מצטבר כטיפה על קצה הסיכה. MTs מבודדים מסוגלים לשרוד ולתפקד לתקופות ארוכות (עד 24 שעות) בתנאי הפריה חוץ גופית ממוטבים, מה שהופך אותם למודלים מתאימים ויעילים למדידת הפרשת נוזלים. לחרקים יש מערכות דם פתוחות, ולכן MTs מנותחים בקלות ומוסרים כפי שהם בדרך כלל צפים בחופשיות haemolymph6. בנוסף, למעט כנימות – חסרות MTs11 – מספר ה- MTs11 במין חרק נתון יכול להשתנות במידה ניכרת מארבע למאות (חמישה יתושי Aedes) המאפשרים מדידות מרובות מחרק אחד.
MTs יתושים Aedes, במשותף עם חרקים אנדופטריגוטה אחרים, מורכבים משני סוגי תאים היוצרים אפיתל פשוט2,12; תאים עיקריים גדולים, המאפשרים הובלה פעילה של cations (כלומר, Na + ו- K +) לתוך הלומן, ותאי סטלה דקים, אשר מסייעים בהפרשת Cl-epithelial transepithelial13. MTs אינם innervated2, ובמקום זאת מווסתים על ידי מספר הורמונים כולל גורמים משתן ואנטי משתן, המאפשרים שליטה על הובלת יונים (בעיקר Na +, K +, ו- Cl-) ומים מחויבים osmotically2. מחקרים רבים בחנו את הרגולציה ההורמונלית של Aedes MTs כדי להבין את תפקידם של גורמים אנדוקריניים על תחבורה transepithelial14,15,16,17,18. כפי שניתן לראות בתוצאות הייצוגיות, הפרוטוקולים כאן מדגימים את ההשפעות של גורמים הורמונליים שונים על MTs מבודדים מנקבה בוגרת יתושים A. aegypti, כולל הן שליטה משתן והן שליטה אנטי משתן (איור 1). בדיקת Ramsay משמשת כדי להדגים כיצד הורמון אנטי משתן, AedaeCAPA-1, מעכב הפרשת נוזלים של MTs מגורה על ידי הורמון משתן 31 (DH31) (איור 1).
הגודל הקטן יותר של חרקים דרש פיתוח של שיטות מיקרו למדידת פעילות יונית וריכוזים בדגימות נוזלים, או ליד פני השטח של רקמות מבודדות כגון MTs ומעיים. שיטות שונות יושמו, כולל שימוש radioisotopes של ions19, אשר דורש איסוף של טיפות נוזל מופרש למדידה של ריכוזי יונים20. צינורות Aedes מגורה במבחנה בדרך כלל להפריש ~ 0.5 nL / min21, ובכך טיפול של כרכים קטנים כאלה יכול להוות אתגר, פוטנציאל להציג שגיאה בעת ההעברה. כתוצאה מכך, מיקרואלקטרודים סלקטיביים יונים (ISMEs) שימשו בהרחבה למדידת ריכוזי יונים בטיפות מופרשות של MTs במבחנה. בשיטה זו, אלקטרודה התייחסות ISME, מלא פתרון מילוי גב מתאים ionophore, ממוקמים לתוך טיפת שתן מופרשת כדי לקבוע ריכוזי יון22. הותאם מדוניני ועמיתיו23, פרוטוקול נוכחי זה משתמש ionophore Na +-סלקטיבי כדי למדוד פעילות יונים בטיפות מופרשות מ MTs מגורה יתושי Aedes למבוגרים. מאחר שמיקרואלקטרודים סלקטיביים של יונים מודדים פעילות יונים, נתונים אלה יכולים לבוא לידי ביטוי כריכוזי יונים בעקבות ההנחה שפתרונות הכיול והדגימות הניסיוניות חולקים את אותו מקדם פעילות יונים21 (איור 1B,C).
טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של סריקת היונים (SIET) עושה שימוש גם ב- ISMEs כדי למדוד שיפועי ריכוז יונים בשכבה הלא מסודרת הסמוכה לאיברים, רקמות או תאים המעבירים יונים. ISMEs למדוד שיפועי מתח אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לחשב את שיפועי ריכוז היונים ואת הכיוון ואת הגודל של שטף יונים על פני האיבר, הרקמה, או התא20. בטכניקה זו, ISME מותקן על מניפולטור שלושה צירים הנשלט על ידי מנועי מיקרו-צעד ממוחשבים, כך מיקומו התלת-ממדי נשלט לרמת המיקרומטר20. מתחים נמדדים בשתי נקודות בתוך השכבה הלא מסודרת באמצעות פרוטוקול דגימה המתוכנת ונשלט על ידי תוכנת מחשב. שתי הנקודות מופרדות בדרך כלל על ידי מרחק של 20-100 מיקרומטר עם נקודה אחת בתוך 5-10 מיקרומטר מפני השטח של האיבר, הרקמה או התא והנקודה השנייה במרחק של 20-100 מיקרומטר נוספים. ההבדל בגודל המתחים בין שתי הנקודות מחושב כדי לקבל שיפוע מתח24,25,26, אשר משמש לאחר מכן לחישוב שיפוע הריכוז ולאחר מכן השטף נטו באמצעות Law24,27 של פיק. שיטה זו שימושית להערכת הובלת יונים ספציפיים על פני אזורים שונים של המעיים חרקים MTs, או בנקודות זמן ספציפיות לאחר חשיפה לקמח דם או טיפול. לדוגמה, ניתן להשתמש ב- SIET כדי להבין כיצד תהליכי ספיגה והפרשה במערכת הפרשת יתושים מוסדרים על ידי הורמונים28, כמו גם התנהגויות האכלה שונות ותנאי גידול25. עבודה קודמת שהשתמשה ב-SIET חשפה אתרים המעורבים בהובלת יונים לאורך הפפילות האנאליות ופי הטבעת של יתושים זחליים ומבוגרים24,28. הפרוטוקול הנוכחי, שתואר בעבר על ידי פאלוצי ועמיתיו26, מודד את שטף Na+ על פני אפיתליה של כרית פי הטבעת הנשית הבוגרת (איור 2).
החלק האחרון של מערכת הפרשת יתושים דורש תנועה שרירית מתואמת כדי לעזור לערבב מזון ולהפריש פסולת26. מוצרים בלתי נספגים של עיכול מן midgut, יחד עם שתן ראשוני המופרש על ידי MTs, מועברים דרך שסתום pyloric ונמסרים hindgut2. התכווצויות הינדגוט ספונטניות מתחילות בשסתום הפילורי ומתרחשות בגלים פריסטלטיים, המועברים מעל האיליום באמצעות התכווצות מתואמת של שרירים מעגליים ואורך המקיפים את פני השטח הבסיסיים של תאי אפיתל26. לבסוף, השרירים בתוך פי הטבעת לעזור להניע ולחסל פסולת דרך התעלה אנאלית. למרות תנועתיות הינדגוט חרקים היא מיוגנית, הדורשת Ca2+ חוץ תאית לייצר התכווצויות ספונטניות, תהליכים אלה יכולים להיות מוסדרים גם נוירונים26,29,30. ויסות אקסוגני זה על ידי מערכת העצבים חשוב לאחר האכלה, כמו החיה חייבת לגרש פסולת מהמעיים ולשחזר איזון haemolymph31. כתוצאה מכך, ביצוע ביו-אסאיות במבחנה כדי לזהות נוירופפטידים מיוסטימולטוריים או myoinhibitory שימושי בהערכת האופן שבו נוירוכימיקלים משפיעים על תנועתיות הינדגוט. הפרוטוקול הנוכחי, המבוצע על ידי Lajevardi ו- Paluzzi28, משתמש בהקלטות וידאו כדי לבחון תנועתיות אילאלית בתגובה לנוירופפטידים (איור 3). באופן דומה, מתמר כוח או ממיר עכבה עשוי לשמש גם כדי לבחון עקבות של התכווצויות באמצעות תוכנת רכישת נתונים32,33. עם זאת, באמצעות טכנולוגיית וידאו מאפשר לנו להעריך חזותית את האיבר ולנתח עוד באמצעות קבוצת משנה של פרמטרים כדי לזהות את התפקיד של הורמונים על תנועתיות hindgut.
שימוש בטכניקות אלה יכול לעזור לאפיין גורמים המסדירים ומתאמים הובלת נוזלים ויונים לאורך מערכת ההפרשה יחד עם תנועתיות הינדגוט. חשוב לציין, קשר פונקציונלי בין התגובה משתן על ידי MTs ותנועתיות hindgut נתמך, כמו הורמונים משתן, כגון DH31 ו 5HT, מאופיין ביכולתם לעורר הפרשת נוזלים על ידי MTs, נמצאו גם להפגין פעולות מיוטרופיות לאורך היתוש hindgut21,34,35 . ממצאים אלה מדגישים את החשיבות של תיאום מחמיר בין MTs והינדגוט במהלך אירועים כגון diuresis שלאחר פראנדיאל בחרקים הדורשים חיסול פסולת מהירה.
להלן, הגישה המפורטת מאחורי טכניקת הבדיקה Ramsay כדי למדוד את קצב הפרשת הנוזלים יתוש, A. aegypti, ואת השימוש במיקרואלקטרודים סלקטיביים יון כדי לקבוע את ריכוזי Na + בתוך הנוזל המופרש של MTs מתוארים, אשר בשילוב מאפשר שיעורי הובלת יונים transepithelial להיקבע. בנוסף, טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של סריקת היונים ובדיקות התכווצות ההינדגוט מתוארות כדי למדוד שטף יונים ותנועתיות, בהתאמה, מה שעוזר להבהיר את הרגולציה ההורמונלית של ההינדגוט (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מנות מצופות סיליקון
הערה: שלב זה צריך להיעשות לפני הניסויים. מנות אלה ייעשו כדי להכין את צלחת הבדיקה עבור ניתוחים, לניסויים בדיקת התכווצות.
- הכינו את הסיליקון באמצעות ערכת אלסטומר סיליקון בהתאם להמלצות היצרן. מערבבים את הרכיבים הנוזליים בשני חלקים ביחס של 10 ל-1. מערבבים בעדינות וביסודיות על ידי היפוך אך הקפידו למזער את היווצרות הבועה.
- יוצקים את אלסטומר הסיליקון לתוך מנות תרבית פוליסטירן חד פעמיות סטנדרטיות 60 מ"מ לעומק של 7-9 מ"מ בדרך כלל. הכינו כמה שיותר מנות לפי הצורך. הסר כל בועות אוויר באמצעות סיכה עדינה מתחת למיקרוסקופ זמן קצר לאחר שפיכת סיליקון לתוך כלים. מניחים את הכלים בתא או בארון נטול אבק בטמפרטורת החדר (RT) למשך 48 שעות לפחות או בתנור בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך כ-4 שעות לריפוי (התקשות) (איור 5A).
2. הכנת מנת האסיון של רמזי
הערה: ניתן להשתמש מחדש במנה מניסוי לניסוי, ולכן, חזור על שלב זה רק אם המנה פגומה או נשברת. מנה נפרדת משמשת לניתוחים.
- באמצעות אזמל (עם אמצעי זהירות חדים סטנדרטיים), ליצור בארות באחת מנות פטרי מצופה סיליקון כדי להכין את צלחת הבדיקה, על ידי הסרת מספיק של הסיליקון, על ~ 5 מ"מ, מהחלק העליון של המנה (זה צריך להתאים ~ 20 טיפת רחצה μL). לפני כן, השתמש בטוש קבוע כדי לסמן את העמדות מתחת למנה כדי לציין היכן להכין את הבארות. הבארות צריכות להיות ~ 1 ס"מ זה מזה, עם קוטר של ~ 4 מ"מ כדי לאפשר את הקצה הדיסטלי של הצינור להתאים. כל באר תכיל צינורית אחת להפרשת נוזלים, וכך מנה המכילה 20 בארות תאפשר לנתח עד 20 MTs לכל ניסוי.
- כדי להכין את סיכות Minutien, למקם את סיכות נירוסטה 0.1 מ"מ בשורה על פיסת סרט תיוג, בניצב לציר של הקלטת. באמצעות מספריים, לחתוך לאורך הסרט, יצירת חצאים שווים של הסיכות. השתמש בחצי סיכה עבור כל באר.
- בעזרת זוג מלקחיים קהים, הכנס כל חצי סיכה לצלחת הבדיקה מצופה הסיליקון, לצד כל באר. בהתאם לאורך של צינור החרק, להכניס את חצי הסיכה במרחק שיאפשר את הקצה הדיסטלי של הצינור לטבול מלוח הרחצה ואת הקצה הפרוקסימלי לעטוף סביב הסיכה. שלב זה יכול להיעשות תחת מיקרוסקופ כדי לדמיין בארות בקלות. עם זאת, ניתן להשתמש מחדש בסיכות, עם זאת, להחליף את חצי הסיכה אם ניזוק או אבד. (איור 5B)
3. הכנת צלחת SIET מצופה פולי-L-ליזין
הערה: שלב זה חשוב לאיבר להיצמד לתחתית המנה במהלך מדידות SIET המבטיחות שמקום המדידה יישאר זהה עבור כל דגימה. הכנת מנות אלה צריכה להיעשות לפחות 2 ימים לפני הניסויים. כל מנה צריכה לשמש רק פעם אחת בעת החלת טיפול מסוים. יש להיפטר בעקבות כל דגימה או אם מעיל הפולי-L-ליזין נשרט או פגום.
- לכל דגימה, מניחים צלחת פטרי 35 מ"מ על משטח שטוח. הסר את המכסים ואת pipette 70 μL של פולי-L-ליזין (0.1 מ"ג / מ"ל) במרכז כל מנה. מניחים את המכסים בחזרה על ולתת פולי-L-ליזין יבש (~ 48 שעות) ללא הפרעה.
- לאחר הייבוש, מסמנים את תחתית המנה עם עיגול המתאר את מעיל פולי-L-ליזין מיובש כדי לדמיין טוב יותר היכן האיבר המוגזם צריך להיות ממוקם לאחר ניתוחים. במידת הצורך כדי למזער כמויות של תמיסת מלח ופתרונות טיפול בניסויים, להשתמש באקדח דבק חם כדי להקיף את ציפוי פולי-L-ליזין, משאיר מספיק מקום עבור האלקטרודה לזוז ולקחת מדידות רקע (~ 20-25 מ"מ קוטר של המעגל המודבק מספיק). ניתן לאחסן את הכלים המצופים האלה ללא הגבלת זמן ב-RT (איור 5C).
4. הכנת מנות רמזי והתכווצות לניסויים
הערה: ניתן להשתמש מחדש במנה (בתנאי שטיפה מתאימה להסרת תמיסת מלח / טיפולים שהיו בשימוש בעבר), ובכך לחזור על שלב זה רק אם הצלחת ניזוקה או נשברת. מנה נפרדת משמשת לניתוחים. שלב זה מבוצע ביום הניסוי.
- עבור צלחת בדיקת התכווצות, להשתמש באזמל (עם אמצעי זהירות חדים סטנדרטיים), ליצור בארות באחת מנות פטרי מצופה סיליקון כדי להכין את צלחת הבדיקה. זווית האזמל באופן שהבארות הופכות בצורת משולש כדי להקל על הצמדת הרקמה המנותחת בקצוות. בארות צריכות להיות גדולות מספיק כדי להכיל עד 250 μL ולהתאים את כל תעלת המזונות (במקום לחפור עמוק מדי, להפוך את הבאר רחבה יותר לכ-0.5-1 ס"מ) (איור 5D).
- עבור צלחת Ramsay, להשתמש פיפטה ולמלא בארות עד 20 μL של פתרון (18 μL של 1X Aedes מלוחים :המדיום של שניידר מוכן בשלב 5.2, ו 2 μL של הורמון / תרופה). עבור פקדים לא מגורה, מלא בארות עם 20 μL של תמיסת מלח 1X Aedes :המדיום של שניידר. לאחר שכל הבארות מתמלאות, יוצקים שמן מינרלי מיובש לתוך צלחת הבדיקה עד שהבארות וסיכות המינוטין שקועות. השתמש קצה פיפטה 20 μL כדי פופ או להסיר בועות אוויר שעלולות להפריע טיפות מופרשות.
5. הכנת פתרונות
- הכינו תמיסת מלח Aedes aegypti 2X וגלוקוז 10x, כמתואר בטבלה 1, המותאמת מ-Petzel ועמיתיה 36. פתרונות מלאי צריכים להיות מאוחסנים ב 4 °C (65 °F). הפוך מניות עבודה של 1X Aedes aegypti מלוחים (שולחן 1), ולאחסן ב 4 °C (60 °F). ביום הניסוי, אפשרו למניות העובדות להגיע ל- RT לפני השימוש. הכן טרי אם יש ראיות כלשהן של צמיחה פטרייתית או חיידקית.
- להכנת טיפת הרחצה, יש לערבב את תמיסת מלח Aedes (משלב 5.1) עם המדיום של שניידר, ביחס של 1:1. היכונו ב aliquots קטן, תלוי כמה נחוץ. שמור את המדיום של שניידר במקרר, להשליך אם יש ראיות לצמיחה פטרייתית או חיידקית. (שלב זה צריך להיעשות ביום הניסוי).
- עבור מדידות שטף Na+ באמצעות SIET, להכין תמיסת מלח Aedes שונה + חינם (טבלה 2), כפי שתואר בעבר26.
6. יתושים MTs וחיתוך hindgut
- עבור ניתוחי יתושים למבוגרים, לאסוף גולם בכוס קטנה ומניחים בצנצנת המכילה תמיסת סוכרוז להאכלה. כדי לקבוע את גיל היתושים, לבודד יתושים בקעו ומניחים בצנצנת אחרת המציינת את הגיל והמין של יתושים לניתוחים עתידיים.
- מניחים בקצרה יתושים לניתוח על כרית CO2 וממתינים עד שלא מגיבים. בעזרת מלקחיים עדינים, הרימו את היתוש מרגלו או מכנפתו והניחו על צלחת ניתוח מצופה אלסטומר מסיליקון שהוכנה בשלב 1. מניחים את היתוש בצד אחד (בצד לרוחב למעלה), ועם סיכת Minutien, לשפד לתוך בית החזה כדי לאבטח את היתוש במקום. לחלופין, הסר כנפיים ורגליים מיתושים לניתוח קל יותר.
- בעזרת פיפטה פסטר, מוסיפים טיפה של תמיסת מלח RT Aedes כדי לטבול את היתוש במלואו מלוחים. ודאו שהניתוח נמצא תחת תמיסת מלח (ראו טבלה 1 להכנת תמיסת מלח של Aedes ).
- מניחים את צלחת הניתוח מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקופי. צבוט את מקטע הבטן האחרון עם מלקחיים עדינים ומתרחק באיטיות מהיתוש. שלב זה מתאפשר על ידי התבוננות בו זמנית מתחת למיקרוסקופ. יש לחשוף את מידגוט, המחובר ל-MTs וההינדגוט (איור 6).
- לבדיקת רמזי, יש להסיר בזהירות כל צינורית מצומת מידגוט-הינדגוט, תוך הקפדה שלא לפגוע באיברים. השתמש מלקחיים עדינים חדים כדי להסיר את הצינורות בנפרד - לא להשתמש בצינורות פגומים לבדיקה. (ראה שלב 7 עבור ההתקנה.)
- עבור SIET, לנתח את hindgut ב Ca2 + חינם Aedes מלוחים (שלב 5.3). ודא כי צלחת פולי-L-ליזין יש גם נפח קבוע של Ca2 + חינם Aedes מלוחים . בזהירות להסיר את הציפורן מפי הטבעת ומניחים את hindgut (יכול להסיר כל איברים מחוברים אחרים, בהתאם למה שנמדד) לתוך צלחת פולי-L-ליזין. אם מודדים הובלת יונים לאורך אפיתליה של כרית פי הטבעת, מקם את הצד הפונה להמולימפה של כרית רקטלית אחת לפחות כדי להיות נגיש למיקרואלקטרודה (איור 7).
- באמצעות מלקחיים כדי לתפוס את הקצה האחורי ביותר, להביא את hindgut עד לתחתית המנה (מבלי לפגוע במבנים שיימדדו). ברגע שהאיבר נוגע במעיל פולי-L-ליזין, הוא יידבק. דגימה זו המנותחת מוכנה למדידות. (ראה שלבים 14-16 עבור כיוונון ומדידות של SIET).
- לבדיקת התכווצות האילום, ודאו שההינדגוט נשאר מחובר למידגוט במהלך הניתוח (איור 4D). הסר בזהירות את MTs כדי לקבל מבט ללא הפרעה של hindgut. איבר זה יועבר למנה חדשה שהוכנה כמתואר בשלב 4.1. (ראה שלב 17 להשגת סרטוני בדיקה.)
7. הקמת בדיקת רמזי
- בעזרת קצה המלקחיים, הרימו בזהירות את הקצה הפרוקסימלי (הפתוח) של הצינור על ידי וילונות אותו על המלקחיים (לא צובטים את הצינורית), והעבירו לבאר של צלחת הבדיקה. שלב זה יכול להיעשות גם באמצעות בדיקות זכוכית עדינות.
- לאחר הצינור שקוע בבאר, להרים את הקצה הפרוקסימלי של הצינור עם מלקחיים, להסיר אותו מן טיפת הרחצה, ולעטוף את הקצה סביב הסיכה. עוטפים את הצינור סביב הסיכה פעמיים – ושומרים על אורך הצינורות שנותרו בטיפת הרחצה בקנה אחד עם הצינורות האחרים. בשלב זה, הקצה הדיסטלי של הצינור צריך להיות בטיפת הרחצה, בעוד הקצה הפרוקסימלי עטוף סביב הסיכה הרחק טיפת הרחצה ומאפשר לנוזל המופרש להצטבר על קצה הסיכה מהקצה הפרוקסימלי הפתוח.
- מיד לאחר הצינור עטוף סביב הסיכה, הערה למטה הבארות (למשל, A, B, C), הזמן (אשר יהיה זמן ההתחלה של כאשר הנוזל יתחיל להיות מופרש מן הצינור), וכל מידע מזהה אחר (למשל, הורמון, גנוטיפ, וכו ').
- לכל יתוש יש חמש טובולות, ולכן חזור על שלבים 7.1-7.3 עם שאר הצינורות. לטיפולי בקרה וניסויים, לפצל את חמשת הצינורות בתוך הטיפולים השונים. ממשיכים עם הניתוח הבא, עד שכל צלחת הבדיקה מתמלאת. עם תרגול, טכניקה זו צריכה לקחת בדרך כלל 2-3 דקות כדי לנתח את הצינורות, להעביר אותם מלוחים רחצה, ולעטוף סביב הסיכה, ובכך ליצור הבדל של 2-3 דקות בזמן ההתחלה בין כל צינורית.
הערה: לפני תחילת הניסוי, כייל את המיקרומטר העין של המיקרוסקופ עם מיקרומטר במה תחת המטרה שנבחרה. טיפות מופרשות נמדדות באופן שגרתי תחת הגדלה כוללת של 40x-50x. - לאחר זמן הדגירה המוקצב, ניתן למדוד את הטיפה המופרשת. באמצעות מיקרומטר העין של המיקרוסקופ, למדוד ולתעד את הקוטר של טיפה מופרשת. חשב את הקוטר (ד) של הטיפה המופרשת על-ידי הכפלת קוטר יחידת העין הנמדד על-ידי המרת הכיול (טבלה 3). חשב את עוצמת הקול של הטיפה המופרשת באמצעות המשוואה, V = πd3/6.
- כדי לחשב את קצב ההפרשה (nL min-1), השתמש במשוואה, קצב הפרשת נוזלים = זמן V/ הפרשה, כאשר V הוא נפח הטיפה המופרשת המחושב בשלב 7.5, וזמן ההפרשה מתייחס לתקופת הדגירה של הצינורית.
8. הגדרת ISME
- מקם מיקרו-מניפולטורים משני צדי הסטרייאומיקרומיקרוסקופ כדי להתקין את תחנת ISME. כלוריזציה של חוטי הכסף ניתן להשיג על ידי טבילה בתמיסה של כלוריד ברזלי חוט כסף חוט כסף לתוך כל אחד ממחזיקי microelectrode (או הלחמת החוטים על הכבלים קואקסיאליים, במידת הצורך). חזור על שלב זה בכל פעם שחוטי הכסף הופכים ללא כלורידים.
- חבר את חוטי הכסף למגבר, אשר יקרא למערכת רכישת נתונים. הגדר וכייל את המערכת בהתאם להוראות היצרן. במקרה של הפרעה חשמלית מוגברת, השתמש בכלוב פאראדיי מקורקע כראוי.
9. הכנת המיקרואלקטרודים עבור ISME ו- SIET
- באמצעות משיכת פיפטה חומה בוערת P-97, למשוך ~ 5-6 נימי זכוכית borosilicate לא מסוננים (קוטר חיצוני 1.5 מ"מ, קוטר פנימי 1.12 מ"מ, אורך 100 מ"מ) עם קצה של 1-5 מיקרומטר. אלה ישמשו מיקרואלקטרודים סלקטיביים יון. עבור microelectrodes SIET, האלקטרודה המתקבלת צריכה להיות פתח קצה של ~ 5 מיקרומטר, המאופיין שוק קצר.
- בברדס, מניחים את המיקרואלקטרודים על פלטה חשמלית (מניחים בזהירות כדי לא לשבור את קצות האלקטרודות). מוסיפים dichlorodimethylsilane בתוך צלחת פטרי זכוכית 15 ס"מ ולהפוך מעל האלקטרודות על הכיריים. השתמש dichlorodimethylsilane כדי סילאן אלקטרודות סלקטיביות יון על ידי הוספת מעיל הידרופובי לכל המשטחים של האלקטרודה, המאפשר לו לשמור על ionophore הידרופובי37. אלקטרודות סילאן שאינן בשימוש ניתן להשאיר במשך כמה שבועות; לכן, שלב זה מבוצע כל כמה שבועות, או עבור אלקטרודות שנמשכו לאחרונה.
הערה: היזהר בעת טיפול dichlorodimethylsilane – דליק, מאכל, רעיל, ראה MSDS לטיפול בטוח.- להפוך את hotplate ל 350 °C (50 °F) ולהשאיר במקום במשך 75 דקות. השתמש ביחס של 1:2 של מספר microelectrodes לנפח (μL) של dichlorodimethylsilane להוסיף על צלחת פטרי זכוכית. לכן, עבור 10 microelectrodes, להוסיף 20 μL של dichlorodimethylsilane.
- לאחר 75 דקות, לכבות את הצלחת החמה. לאחר שהאלקטרודות והצלחת החמה התקררו, הסירו את צלחת הפטרי הזכוכית והעבירו את האלקטרודות (עם מלקחיים) לתיבת אחסון עם חימר יציקה. ודא הקצה של האלקטרודה מצביע למעלה כדי למנוע כל נזק.
- כדי להפוך את אלקטרודות הייחוס עבור ISME, למשוך ~ 4-5 צינורות נימי זכוכית בורוסיליקט חוט (קוטר חיצוני 1 מ"מ, קוטר פנימי 0.58 מ"מ, אורך 100 מ"מ). האלקטרודות האלה לא חייבות להיות מסולקות. סמן ואחסן בקופסה דומה, תוך הימנעות מכל נזק לקצה.
- אלקטרודות ייחוס SIET עשויות נימי זכוכית סטנדרטיים (קוטר חיצוני 2 מ"מ, קוטר פנימי 1.12 מ"מ, אורך 102 מ"מ). הנימים מלאים מותך 1 M KCl + 3% אגר ויש לאחסן בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל המכיל 1 M KCl (שקוע לחלוטין) עד השימוש. הם יכולים לשמש שוב ושוב עד בועות להתחיל להיווצר או אם אגר נשבר. אם יש מרחב אווירי כלשהו, להיפטר מהכוס ולהשתמש אחד חדש כדי להבטיח כי המעגל הושלם.
10. הכנת מזרקי המילוי האחורי
הערה: שלב זה נעשה כדי ליצור מזרקים בעלי קצה דק למילוי אלקטרודות עבור ISME.
- השתמש מזרק קצה החלקה 1 מ"ל עם מחט חד פעמית. להשליך את המחט ולמשוך בחזרה את המזרק עד סימן 1 מ"ל. מתחת לאדים, הפעילו את מבער הבונסן, וחממו את קצה הפלסטיק של המזרק עד שהוא מתחיל להינמס. בעזרת זוג מלקחיים ישנים, צובטים בזהירות את קצה המזרק המומס ומושכים מטה כדי למתוח את הקצה.
- באמצעות מספריים, לחתוך את הקצה המומס לאורך הרצוי, משאיר את הקוטר קטן מספיק כדי להתאים בתוך האלקטרודות (ראה תרשים). לאחר שהמזרק התקרר, בדוק את הלחץ של המזרק עם מים כדי להבטיח שאין חסימה. צרו פתרון למילוי רקע נדרש ותייגו בהתאם (איור 8).
11. מילוי המיקרו-אלקטרוניקה של יון סלקטיבי והפניה עבור ISME ו- SIET
הערה: ניתן להשתמש מחדש במיקרואלקטרודה כל עוד הוא עדיין עובד (כייל לפני כל ניסוי). עבור ISME, צעד זה יכול להיעשות בזמן MTs הם דגירה בבדיקת רמזי.
- ליצירת מיקרו-אלקטרוניקה סלקטיבית של Na+-סלקטיבית, השתמשו במזרק 1 מ"ל שנוצר בשלב 10 למילוי אלקטרודה עם 100 מ"מ NaCl. ודאו שתמיסת המילוי האחורית מתמלאת עד קצה האלקטרודה. אם מופיעות בועות אוויר, הזיזו בעדינות את המיקרו-בחירה או הסירו את התמיסה ומלאו מחדש. זה צריך להיעשות תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי כדי לדמיין טוב יותר.
- תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, לטבול קצה פיפטה 10 μL לתוך פתרון ionophore Na + סלקטיבי. בשורה את האלקטרודה בניצב לפיפטה, מניחים אצבע בכפפה מעל תחתית הקצה כדי ליצור לחץ ולגרש טיפה קטנה של ionophore. צפייה תחת מטרה גבוהה של מיקרוסקופ, בזהירות לגעת טיפת ionophore לקצה microelectrode, הימנעות שבירת הקצה. בדרך כלל, microelectrodes הם קדימה מלא עם אורך טור קוקטייל ionophore של בין 150-300 מיקרומטר, עד גבול פתרון ionophore / backfill הוא שטוח.
אזהרה: היונופור הזה רעיל, ראה MSDS לטיפול בטוח. - בכוס קטנה, התמלאו באמצע הדרך עם 100 מ"מ NaCl, והניחו קצת חימר דוגמנות על החלק הפנימי בחלק העליון של הכוס. לאחר שה-Na+ ionophore נלקח, הניחו את האלקטרודה על קיר הכוס, הניחו את הקצה בתוך 100 מ"מ NaCl, ושמרו את ISME בכוס עד שהוא יהיה מוכן לשימוש.
- כדי להפוך את אלקטרודת הייחוס ISME, למלא בחזרה אלקטרודה עם 500 mM KCl להבטיח כי הפתרון מלא עד הקצה (בצע את אותו פרוטוקול כמו לעיל). אחסן את KCl בכוס.
12. כיול אלקטרודות עבור ISME
הערה: שלב זה מבוצע ממש לפני נטילת מדידות של הנוזל המופרש (~ 10-15 דקות לפני). כיול צריך להיעשות כל ~ 5-6 מדידות כדי להבטיח כי השיפוע הוא עקבי.
- מצפים את קצות האלקטרודה באמצעות תמיסה של ~ 3.5% (w / v) פוליוויניל כלוריד מומס טטרהידרופורן, כדי למנוע תזוזה של היונופור כאשר שקוע בשמן פרפין.
אזהרה: זה דליק, ראה MSDS לטיפול בטוח. - כדי לכייל את האלקטרודה Na+ , מניחים 10 טיפות μL של הריכוזים הסטנדרטיים הבאים NaCl על קצה צלחת רמזי עם MTs הדגירה: 200 מ"מ NaCl ו 20 מ"מ + 180 מ"מ LiCl. מניחים את הטיפות הסטנדרטיות ~ 2 ס"מ זה מזה, עם ריכוז גבוה יותר על גבי.
- הכנס הן אלקטרודה התייחסות והן אלקטרודה סלקטיבית-יונים מעל חוטי הכסף הכלורידים והידק אותם בבטחה באמצעות מחזיקי אלקטרודה המחוברים למיקרו-מניפולטורים. נווט את שתי האלקטרודות לכיוון טיפת NaCl של 200 מ"מ באמצעות המיקרו-מניפולטורים, והבטיח כי קצות האלקטרודה לא יגעו בתחתית המנה. הפעל את האלקטרומטר כדי להתחיל להקליט ולאפשר לקריאה להתייצב.
- הקלט את הקריאה והמשיך לסטנדרט הבא (20 מ"מ NaCl + 180 mM LiCl). חשב את השיפוע, ואם קריאת האלקטרודה יציבה והשיפוע נמצא בטווח, המשך להשתמש באלקטרודה למדידות טיפה מופרשות. אם הקריאה אינה יציבה, לא נותנת הקלטה או שיפוע מתאימים, או לוקח זמן כדי שיווי משקל, להכין אלקטרודה סלקטיבית יון חדשה או לשבור את קצה עצם אלקטרודת הייחוס על ידי הפעלת רקמה על פני הקצה. השיפוע עבור Na + צריך להיות ~ 58-60 mV38, אם כי טווח מקובל הוא 50-60 mV.
13. הקלטות וחישובים של ISME
- לאחר המדידות של קצב הפרשת הנוזלים (ראה שלב 7.7), העבר בזהירות הן את ההפניה והן את האלקטרודה הסלקטיבית של היונים לטיפת המופרשת באמצעות המיקרו-מניפולטורים. הפעל את ההקלטה ואפשר לקריאה לייצב ולהקליט ערך. חזור על שלב זה עבור הטיפות האחרות (חזור על מדידות כיול כל ~ 5-6 מדידות).
- ריכוזי הקטינות מחושבים באמצעות המשוואה שתוארה קודם לכן 22,38, [יון] = [C] x 10ΔV/m, כאשר [C] הוא הריכוז ב- mmol L-1 של פתרון הכיול המשמש לכיול ISME, ΔV הוא השינוי במתח בין המתח שנרשם מטיפת הנוזל המופרשת לבין המתח של אותו פתרון כיול, ו- m הוא הפרש המתח בין שני הכיולים הסטנדרטיים, שהוא גם השיפוע.
14. הגדרת SIET
הערה: מערכת SIET תוארה בעבר 27,39. כדי להפחית רעשי רקע, כלוב פאראדיי מותקן סביב מיקרוסקופ האור והבמה. ניסויים המוצגים במאמר זה משתמשים בהגדרות הבאות בתוכנת טכניקת אלקטרודה סריקה אוטומטית (ASET) 2.0: תקופת המתנה של 4 שניות כדי לאפשר מעברי צבע של יונים לבסס מחדש באופן מלא את תנועות המיקרואלקטרודה הבאות, כאשר המתח נרשם במשך 0.5 שניות לאחר תקופת ההמתנה, מרחק טיול של 100 מיקרומטר ושלוש חזרות על כל הקלטה. ניתן לשנות הגדרות מסוימות על-ידי המשתמש ב-ASET, לפי הצורך.
- הפעל את מגבר ה-IPA-2 Ion/Polarographic, את מיקרוסקופ האור (עם מצלמת וידאו מחוברת) ואת המחשבים המחוברים לכל אחד מה-ASET והתאים הפועלים.
- הכן מיקרואלקטרודים ואלקטרודות ייחוס המתוארות בשלבים 9.1-9.3, 9.5, 10 ו- 11.1– 11.3. המיקרואלקטרודה הסלקטיבית של היונים תכיל את Na+ ionophore עם מילוי גב של 100 מ"מ NaCl ואלקטרודת הייחוס (עם גשרי אגר) תמיד תתמלא ב-3 M KCl.
- הניחו את המיקרו-אלקטרוסטרודה הסלקטיבית Na+ על המחזיק המורכב מחוט כלוריד כסוף (AgCl) וחברו אותו לשקע מחבר נשי. באמצעות מזרק, מלאו את מחזיק אלקטרודת הייחוס ב-3 M KCl טריים (ניתן לבצע לפני יום הניסוי ולאחסן אותו ב-RT).
הערה: לאחר הניסויים, לשטוף את מחזיק אלקטרודת הייחוס עם ddH2O. - הסר אלקטרודת ייחוס אחת מהכוס המכילה את כל אלקטרודות הייחוס שקועות ב 3 M KCl, הצבת אצבע אחת בקצה אחד והטיית נימי הזכוכית לכיוון אצבע זו כדי למנוע את אגר לנשור. בזהירות למקם קצה אחד לתוך המחזיק, להבטיח כי לא נוצרות בועות. אם יש בועה, להסיר את אלקטרודת הייחוס, למלא מחדש את המחזיק עם יותר 3 M KCl ולחזור. מקם את מחזיק האלקטרודה בשקע המחבר הנשי.
15. כיול אלקטרודות עבור SIET
- עבור מדידות Na+ , השתמש בפתרונות NaCl של 150 מ"מ ו- 15 מ"מ NaCl + 135 מ"מM LiCl24. צריך להיות הבדל של פי 10 בריכוזי Na+ בין שני הפתרונות, המקיפים את טווח רמות Na + (20 מ"מ) בתמיסת המלח (טבלה 2).
- יש לאחסן פתרונות כיול ב-RT בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ו-aliquot בצלחת פטרי בעת ביצוע הניסוי. האליקוט הזה מסולק בסוף היום. אם יש ראיות לזיהום בפתרונות המלאי, להיפטר ולעשות פתרונות חדשים.
- כדי לכייל, יש להוסיף את שני פתרונות הכיול (שלב 15.1) לצלחות פטרי בודדות בקוטר 35 מ"מ, ולהניח אותן על במת המיקרוסקופ. באמצעות ידיות הכוונון הידניות השולטות במנועי הצעד עם "השבתה" שנבחרה ביחידת בקרת התנועה של המחשב, ודא שקצה המיקרו-אלקטרודה ממוקם בתוך פתרון הכיול. אין להטביע את הקצה רחוק מדי, כפי שהוא עלול להישבר. אם הקצה נשבר, הכינו מיקרואלקטרודה סלקטיבית-יונים חדשה וכיילו מחדש.
- במחשב המחובר למגבר, פתח את תוכנת ASET. פתח את הגדרות הכיול. בחר שיפוע Nernst עבור סוג הכיול, הגדר את המדגם למשך 3 שניות והזן את הריכוזים של פתרונות הכיול. לדוגמה, עבור מדידות Na+ , הזן 150 mM בפתרון 1, מקם את קצה המיקרואלקטרודה Na +-סלקטיבית ואלקטרודה התייחסות בתוך פתרון כיול זה. קריאת המתח על המגבר צריכה להיות יציבה. לחץ על פתרון 1, המתן לרישום מתח (ב- mV). לאחר מכן, מקם את microelectrode ואלקטרודה התייחסות בתוך פתרון 15 mM NaCl + 135 mM LiCl, הזן 15 מ"מM בפתרון 2 ולחץ על פתרון 2 כדי לקבל את קריאת המתח. השיפוע יהיה ההבדל בין שני מתחים אלה, המחושב בהגדרות אלה. לאחר הכיול, לחץ על אישור.
- מדרונות עבור מיקרואלקטרודים סלקטיביים של Na+-סלקטיביים לשינוי פי עשרה בריכוז היונים צריכים להיות בסביבות 59.0 ± 1.624. אם מדרון Nernst סוטה מאוד מטווח זה, להכין microelectrode חדש, או aliquot סטנדרטים חדשים (כפי שהם עשויים להיות מזוהמים). כיול נדרש לפני כל 2-3 דגימות, בהתאם ליציבות המתח. אם המתח הופך להיות לא יציב ומתחיל להשתנות, הכן מיקרואלקטרודה סלקטיבית-יונים חדשה.
16. מדידות SIET
הערה: תמיד יש להחליף את מתג המנוע ביחידת בקרת התנועה של המחשב ל'השבת', למעט בעת מניפולציה של האלקטרודה באמצעות מקשי מחשב באמצעות ASET, או במהלך הקלטות מדידה (בשלב זה יש להחליף את המפתח ל'הפוך לזמין').
- לאחר הכיול, לנתח את האיבר (ראה שלב 6.6). מניחים את צלחת הפולי-L-ליזין עם הדגימה המנותחת על במת המיקרוסקופ ומכניסים את קצה אלקטרודת הייחוס בתוך תמיסת המלח. הטביעו את קצה המיקרואלקטרודה הסלקטיבית של היונים במלוח המלח ודואגים לא לשבור את הקצה.
- השתמש בידיות הכוונון הידניות כדי להתאים את מיקום המיקרו-אלקטרוניקה בעת התבוננות מתחת למיקרוסקופ האור. התאם את המיקום האנכי של המיקרואלקטרודה כך שהקצה שלו נמצא באותו מישור כמו האיבר או הרקמה. פעם אחת במיקום הרצוי, סובב את מתג המנוע ל'הפוך לזמין'. בשלב זה, ניתן להפעיל את מנועי הצעד רק באמצעות תוכנת המחשב.
- באמצעות מקשי החצים של המחשב, הזז את המיקרואלקטרודה אופקית למיקום המרוחק 3 מ"מ מהרקמה כדי למדוד הקלטות רקע. הוסף הערות על-ידי הקשה על F2. כאשר אתה מוכן, התחל להקליט (על-ידי הקשה על F5). השג חמש מדידות של פעילות רקע. פעילות מתח הרקע הממוצעת עבור כל דגימה תחוסר משיפועי המתח הנמדדים לאורך הרקמה עבור אותה דגימה.
- הזז את קצה microelectrode בחזרה קרוב לרקמה, נזהר לא לנקב את האיבר. להפחית את הרגישות keyhit למקם את קצה microelectrode 2 מיקרומטר ישירות ימינה, בניצב לרקמה. השג שלוש הקלטות בכל אתר לאורך כרית רקטלית כדי לזהות את האתר של פעילות היונים הגדולה ביותר. קבל מדידות מלוחות בסיסיות באתר המציגות את הפעילות הגדולה ביותר (אתר "הנקודה החמה").
- החליפו את המנוע לנטרל והוסיפו את הטיפול המתאים לצלחת כדי לקבל את המנה הרצויה הסופית. לאחר היישום, צור הערה חדשה (כלומר, שם טיפול ומינון), העבר את המנוע בחזרה להפעלה ובצע הקלטות מתח באמצעות F5. אם המטרה היא להתבונן בשינויים לאורך זמן, המשך לבצע מדידות במרווחי זמן ספציפיים. ניתן ליצור פרוטוקולים מרובים עבור יישומים ספציפיים באמצעות SIET, בהתאם למטרת החוקר.
- צפו בתוכנת ASET מתעדת את המתח באתר לאורך הרקמה ומפחיתה אותו מהמתח במרחק טיול (איור 7) של 100 מיקרומטר מהרקמה. מכיוון שההקלטה הראשונה נלקחת ברקמה, הבדל מתח חיובי מצביע על כך שהמתח גבוה יותר באפיתל (רקמה) (איור 7A) מאשר הרחק מהאפיתל (איור 7B), ולכן הקיטון נספג. שיפוע מתח שלילי מעיד על הפרשת קטטה.
- קבל הקלטות רקע שוב לאחר הטיפול (3 מ"מ משם) ולהשתמש אלה בעת חישוב שטף יונים לאחר הטיפול. צור ערכה אחת של הקלטות רקע ב-"baseline" ובקבוצה אחת לאחר הטיפול. העבר את המנוע ללא זמין בכל פעם שהמיקרו-אלקטרודה אינו מותאם באמצעות מפתחות המחשב או כאשר המתח אינו מוקלט. יצא את הנתונים לקובץ טקסט ופתח באמצעות Excel כדי לבצע את כל החישובים.
- חשב שטף יונים באמצעות משוואות שתוארו קודם לכן 24,26. שטף היונים נטו עבור כל טיפול יכול לבוא לידי ביטוי כשינוי מוחלט ממדידות שטף היונים הבסיסיות. כדי לאמת את משמעות התוצאות, ניתן להשתמש בבקרת רכב (כלומר, הוספת תמיסת מלח לבד לצלחת במקום טיפול). שינויים בהובלה יונים בעקבות הטיפול ההורמונלי יש להעריך ביחס לכל שינוי בתגובה לבקרה זו.
17. בדיקות התכווצות הינדגוט
- מלאו את אחת הבארות במנה המתוארת בשלב 4.1 עם נפח ידוע של תמיסת מלח Aedes (שלב 5.1). לאחר הניתוח (שלב 6.7), מעבירים בזהירות את ההידגוט המנותח המחובר לבאר בצלחת השנייה, ומקפידים לא לצבוט את האיבר הנבדק (ileum). הטביעו את המעיים בתמיסה בתוך הבאר, והניחו סיכות מינוטין לתוך מידגוט ופי הטבעת. על ידי כך, האילום לא צריך להיות תחת מתח, התכווצויות ספונטניות, שמקורן בשסתום פילורי באיליאום הקדמי, יש לראות.
- חבר מצלמת וידאו למיקרוסקופ סטריאוסקופי, והקלט סרטונים באמצעות תוכנת לכידת וידאו (לדוגמה, לכידת INFINITY של Luminera). מניחים את המנה המכילה את האיבר המנותח מתחת למיקרוסקופ ומקליטים במשך 2 דקות. זה יהיה התנאי "בסיסי".
- הוסף נפח ידוע של תמיסת מלח 1X Aedes (שלב 5.1) לבאר כדי להסביר את כל השינויים בתנועתיות ileal על הגדלת נפח בתוך הבאר. המתן דקה אחת לאחר היישום, ולאחר מכן הקלט שוב במשך 2 דקות. זהו מצב "תמיסת מלח".
- הוסף נפח ידוע של טיפול (מריכוז מלאי 10x כדי לקבל את המינון הרצוי בבאר). המתן דקה אחת לאחר היישום, ולאחר מכן הקלט שוב במשך 2 דקות. זה יהיה מצב "הטיפול".
- שמור את כל הסרטונים והמר אותם ל- MP4. כדי לנתח, לספור את מספר הצירים במרווחים של 2 דקות (מוגדר כגל פריסטלטי ייזום בשסתום פילורי ונמשך לאורך האילום). חלק את המספר הזה ב-2 דקות כדי לקבל את שיעור ההתכווצות. ניתן גם להעריך פרמטרים אחרים, כגון התכווצות או משך הרפיה. לאחר איסוף נתונים גולמיים, בטא כל פרמטר ביחס לנתונים עבור תנאים "בסיסיים" עבור כל מדגם. התווה את הקיפול-שינוי עבור "מלוחים" ו "טיפול" כל יחסית "קו הבסיס".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יישום DH31 נגד MTs לא מגורה גורם לעלייה משמעותית בשיעור הפרשת הנוזלים, המאשר את תפקידו כהורמון משתן יתושי Aedes (איור 1A). כאשר טובולות מטופלות ב-AedaeCAPA-1, נצפתה ירידה בשיעור ההפרשה ב-MTs מגורה DH31. איור 1B מדגים את השימוש באלקטרודות סלקטיביות ליונים כדי למדוד ריכוזי Na+ בטיפות המופרשות. טיפול DH31 על MTs לא הייתה השפעה על ריכוז Na + בטיפת המופרשת; עם זאת, עם היישום של AedaeCAPA-1, ריכוז Na + בנוזל המופרש גדל באופן משמעותי. בנוסף, בהשוואה לבקרות לא מגרות, DH31 הוביל לקצב הובלה גדול משמעותית של Na+ , ואילו AedaeCAPA-1 ביטלה עלייה זו בצינורות מגורים DH31 (איור 1C). יחד, תוצאות מדגם אלה להדגים כיצד שיעורי הפרשת נוזלים בעקבות יישום של הורמונים משתן ואנטי משתן ניתן למדוד, כמו גם את ריכוז היונים בתוך טיפות מופרשות. נקבות בנות שלושה עד שישה ימים נותחו ובין 23-35 MTs נותחו לניסוי. ההבדלים צוינו כמשמעותיים סטטיסטית אם p < 0.05 באמצעות ANOVA חד כיווני ובדיקות t לא מזווגות.
ה- SIET שימש להערכת שינויים בהובלה של Na+ לאורך אפיתליה כרית רקטלית של יתושים נקבות בוגרות. רוב הרקטות הלא מגורות שנבדקו הציגו הובלת Na+ (קליטה) מכוונת המולימפה, ולכן רק הכנות אלה נבדקו. בשל שונות בפעילות הבסיסית, ההבדל בשטף היונים, בעקבות יישום מלוחים או פפטיד, ביחס לפעילות הובלה ראשונית מלוחים חושב. ערכים אלה מניבים שינוי שלילי בשטף היונים (שטף היונים לאחר הטיפול – שטף יונים בתנאי בסיס), אם כי כל האיברים נותרו ספיגה לאחר טיפולים. אנלוגי לאוקוקינין (Drosokinin) שימש לבחינת שינויים בספיגת Na+ , מה שהביא לירידה של פי ארבעה בספיגת Na+ בהשוואה לשליטה מלוחה (איור 2).
כדי להעריך את התפקיד של נוירופפטיד, pyrokinin-2 (PK2), על תנועתיות ileal, נעשה שימוש באנלוגי של רודניוס פרוליקסוס , אשר הוכח בעבר להפעיל את קולטן A. aegypti PK2, מועשר ileum28 יתוש. ביחס לרמות הבסיסיות, PK2 מעכב באופן משמעותי התכווצויות ileal (איור 3).
איור 1: ההשפעה של נוירופפטידים משתן ואנטי משתן על שיעור הפרשת נוזל הפריה חוץ גופית, ריכוז Na + ושיעור תחבורה על ידי נקבה בוגרת A. aegypti MTs. Aedae CAPA-1 (0.1 fM) הוחל על MTs מגורה עם DromeDH31 (25 ננומטר). (א) MTs היו דגירה במשך 60 דקות עם neuropeptides ו 120 דקות עבור פקדים unstimulated. (B) ריכוזי Na+ בטיפת הנפרשת נמדדו באמצעות ISME וערכים שימשו לחישוב קצב ההובלה (C). עמודות שונות באופן משמעותי מפקדים מסומנות באותה אות, כפי שנקבעה על-ידי ANOVA ובונפרוני חד-כיווניים לאחר הבדיקה (n = 23-35). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שינויים בהובלה של Na+ על פני אפיתליה של כרית פי הטבעת הנשית שנמדדה באמצעות SIET. ספיגת Na+ נרשמה בתנאי תמיסת מלח בסיסיים לא מגורשים, ואחריה טיפול עם תמיסת מלח נוספת (בקרת רכב) או 1 מיקרומטר דרוסוקינין (n = 10-12). שינויים בשטף Na+ בהכוונת המולימפה נמדדו עבור כל טיפול. חלה ירידה של פי ארבעה בספיגת Na+ בתגובה לדרוסוקינין, כפי שנקבע על ידי בדיקת T דו-זנבית לא מזווגת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שינוי בתנועתיות האיליאלית של נקבות היתושים בעקבות תמיסת מלח (בקרת רכב) ויישום RhoprPK2. השינוי בתדירות ההתכווצות בעקבות שני הטיפולים נרשם עבור כל מדגם ביחס לתנאי הבסיס (n = 32). Rhopr PK2 ירד תנועתיות ileal, כפי שנקבע על ידי מבחן t דו זנבי מזווג. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סכמטי של בדיקת רמזי, שימוש במיקרואלקטרודים סלקטיביים של יונים (ISME), טכניקת האלקטרודה הסלקטיבית של יונים סורקים (SIET) ובדיקות התכווצות הינדגוט. איורים של ארבע השיטות המשמשות לקביעת התפקידים התפקודיים של גורמים אנדוקריניים במערכת ההפרשה של היתוש, Aedes aegypti. ( A) בדיקת רמזי משמשת למדידת שיעורי הפרשת נוזלים בצינורות מאלפיגיים מבודדים. הקצה הפרוקסימלי (הפתוח) של הצינור עטוף סביב סיכה, מוקף בשמן מינרלי, בעוד הקצה הדיסטלי (הסגור) שטוף בתמיסת המלח הטיפולית. לאחר פרק זמן מוגדר, הקצה הפרוקסימלי יפריש את השתן העיקרי, המצטבר כטיפות על הסיכה. (ב) אלקטרודת ייחוס ו- ISME ממוקמים בטיפת הפרידה המופרשת, המחוברת למערכת רכישת נתונים, כדי למדוד ריכוז יונים. (ג) ה- SIET מודד הובלת יונים באמצעות מיקרואלקטרודה סלקטיבית-יונים הממוקמת בניצב ~ 2 מיקרומטר מהאיבר הנדבק לתחתית צלחת פולי-L-ליזין. הכיוון של החצים האדומים בסכמטי זה מציין כי Na + נספג לתוך מלוחים, המצוין על ידי הקלטת מתח גדולה יותר לאורך האפיתל ביחס לאזור הרחק מפני השטח של האיבר. (ד) בדיקות התכווצות הינדגוט מתבצעות באמצעות הקלטות וידאו כדי להעריך שינויים בתדירות ההתכווצות, באורך ובמשך ההרפיה. בסכמטי זה, האיברים ממוקמים בתוך באר, וסיכת מתכת מוכנסת ישירות לתוך midgut ופי הטבעת כדי לאפשר ileum לצוף בחופשיות ולהתכווץ. טיפולים מתווספים לבאר כדי להעריך שינויים בתנועתיות הן מבחינה איכותית והן מבחינה כמותית. נוצר באמצעות BioRender. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מנות המשמשות (A) לניתוח יתושים, (B) בדיקת רמזי, (ג) מדידות בדיקת התכווצות של SIET ו-(D). A, B ו- D מצופים לחלוטין בסיליקון, ואילו C מצופה פולי-L-ליזין במרכז. כדי להכין את המנה המשמשת את אסאי רמזי (B), צלחת פטרי קטנה מצופה סיליקון מנוצלת, ובארות קטנות ~ 4-5 מ"מ מגולפות זו מזו 1 ס"מ (סביב ~ 20 בארות ניתן לגולף / צלחת). סיכות מתכת Minutien ממוקמים ליד כל באר כדי להחזיק את הצינור המבודד כדי למדוד את קצב הפרשת נוזלים. צלחת פולי-L-ליזין (C) מאפשרת לאיבר להיצמד לתחתית במהלך מדידות SIET. הבארות בצלחת בדיקת הכיווץ (D) מלאות בתמיסת מלח ובטיפולים הבאים. האיבר המתכווץ הממוקם בתוך הבאר נצפה באמצעות מצלמת וידאו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מערכת ההפרשה של יתוש, Aedes aegypti. לאחר בדיקת דם, מסיסים, מים וחומרים מזינים מועברים לאורך תעלת המזונות, הכוללת (אך אינה מוגבלת) את מידגוט, שסתום פילורי, MTs והינדגוט. midgut הוא האתר העיקרי לעיכול מזון וספיגת חומרים מזינים. חמשת הח"כים מעבירים מים, מסיסים ופסולת מההמולימפה שמסביב ומפרישים את השתן העיקרי הזה לתוך ההינדגוט, המורכב מפי הטבעת הקדמית והפי הטבעת האחורית, שהאחרון שבהם כולל ארבעה (זכר) או שישה (נקבה) רפידות רקטליות. ההיפגוט משמש כאתר הספיגה הסופי לפני שהפסולת מופרשת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונות סטילס של יתוש ניתח במהלך מדידות SIET. כדי למדוד את פעילות היונים לאורך האפיתליה של אחד מששת הרפידות הפי הטבעתיות, המיקרואלקטרודה של Na+-סלקטיבית ממוקמת במרחק של 2 מיקרומטר מהרקמה (A). מתח נרשם באתר זה לפני קצה microelectrode מועבר במרחק טיול (Δx) של 100 מיקרומטר מנקודה זו (B). שיפוע המתח בין שתי נקודות אלה משמש לחישוב שיפוע הריכוז ושטף היונים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מזרקי המילוי האחורי של ISME ו-SIET. תמונה של המזרקים המשמשים למילוי פתרונות NaCl ו- KCl לתוך microelectrodes. זה מראה ארבעה מזרקי קצה החלקה 1 מ"ל עם מחטים חד פעמיות, עם קצה מתוח שונה כדי לאפשר החדרה לתוך אלקטרודה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| 2X Aedes aegypti מלוחים | ||
| עבור 500 מ"ל: | ||
| בכוס, הוסף 400 מ"ל של ddH2O ולאחר מכן הוסף את המסיסים הבאים: | ||
| רכיב | משקל (גר') | ריכוז סופי (mM) |
| NaCl | 8.766 | 150 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| KCl | 0.253 | 3.4 |
| נאו | 0.3 | 7.5 |
| NahCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| CaCl2-2H20 | 0.249 | 1.7 |
| מערבבים ומתאימים את רמת החומציות ל-7.1 | ||
| הוסף ddH2O לנפח הסופי של 500 מ"ל כדי להפוך את תמיסת מלח Aedes 2x | ||
| פי 10 גלוקוז | ||
| עבור 500 מ"ל: | ||
| בכוס, הוסף 450 מ"ל של ddH2O ולאחר מכן הוסף: | ||
| רכיב | משקל (גר') | ריכוז סופי (mM) |
| גלוקוז | 4.5 | 5 |
| מערבבים ומוסיפים ddH2O לנפח הסופי של 500 מ"ל | ||
| כדי להפוך 1X Aedes aegypti מלוחים: | ||
| עבור 100 מ"ל: | ||
| בכוס, הוסף 40 מ"ל של ddH2O ולאחר מכן הוסף: | ||
| רכיב | עוצמת קול (מ"ל) | |
| 2 תמיסת מלח Aedes | 10 | |
| מערבבים, מכווננים את רמת החומציות ל-7.1 | ||
| סינון עיקור | ||
טבלה 1: הכנת תמיסת מלח Aedes aegypti . כדי להפוך את תמיסת מלח Aedes , בנפרד להכין 2X Aedes מלוחים ו 10x גלוקוז, לאחסן במקרר 4 °C (65 °F). השתמש בשני פתרונות אלה כדי להכין מלאי עובד (1x תמיסת מלח Aedes ), המשמש לניתוח רקמות, בדיקות רמזי, ובדיקות התכווצות.
| תמיסת מלח Aedes aegypti ללא סידן + NMDG | ||
| עבור 500 מ"ל: | ||
| בכוס, הוסף 400 מ"ל של ddH2O ולאחר מכן הוסף את המסיסים הבאים: | ||
| רכיב | משקל (גר') | ריכוז סופי (mM) |
| NaCl | 1.17 | 20 |
| NMDG | 25.38 | 130 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| KCl | 0.253 | 3.4 |
| NahCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| גלוקוז | 0.9 | 5 |
| מערבבים ומתאימים את רמת החומציות ל-7.1 | ||
| הוספת ddH2O לנפח הסופי של 500 מ"ל | ||
טבלה 2: תמיסת מלח Aedes aegypti שונה המשמשת למדידות SIET. תמיסת מלח זו ללא Ca2+ משמשת למניעת התכווצויות ספונטניות במהלך מדידות SIET. תמיסת מלח זו ספציפית למדידת הובלת Na+ , שכן היא מורכבת מ- Na+ מופחתת (20 מ"מ) המורכבת מהחלפה של שיווימולר עם N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG) כדי להפחית את רעשי הרקע.
| MTs מגורה DH31 | קוטר טיפה (יחידות) | קוטר טיפה (אום) | נפח נפתח (um3) | תעריף הפרשה (nl/min) |
| n | טיפול מס' 1 (60 דקות) | טיפול מס' 1 (60 דקות) | טיפול מס' 1 (60 דקות) | טיפול מס' 1 (60 דקות) |
| 1 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 2 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 3 | 17 | 333.33 | 19392547.25 | 0.32 |
| 4 | 13 | 254.90 | 8671977.67 | 0.14 |
| 5 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 6 | 22 | 431.37 | 42029685.15 | 0.70 |
| 7 | 15 | 294.12 | 13321768.16 | 0.22 |
| 8 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 9 | 20 | 392.16 | 31577524.53 | 0.53 |
| התכוון | 16.33333333 | 320.26 | 18776785.52 | 0.31 |
| STD ERR | 0.06 |
טבלה 3: נתוני בדיקת רמזי לדוגמה. טבלה המציגה נתונים לדוגמה שנאספו מ- MTs מגורה DH31 מיתושים נקבות בוגרות. בעת מדידת הקוטר של טיפה מופרשת, תחילה למדוד עם מיקרומטר העין stereomicroscope ולשים לב למטה את הערך. לאחר מכן, להכפיל את קוטר יחידת העין עם המרת הכיול שנערך לפני הניסוי כדי לקבל את הקוטר של טיפה במיקרומטר. חשב את נפח המשוואה לאחר מכן, באמצעות המשוואה שצוינה בשלב 7.7, ואחריה את קצב ההפרשה, באמצעות המשוואה שצוינה בשלב 7.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאשר בולעים ארוחה דם, חרקי הממטופג מתמודדים עם האתגר של מסיסים עודפים ומים בהמולימפ2 שלהם. כדי להתמודד עם זה, יש להם מערכת הפרשה מיוחדת, אשר נשלטת היטב על ידי גורמים הורמונליים, המאפשר חרקים ליזום במהירות diuresis שלאחר פראנדיאל. בדיקת רמזי ושימוש במיקרואלקטרודים סלקטיביים של יונים מאפשרים מדידה של שיעורי הפרשת נוזלים יחד עם ריכוזי יונים ושיעורי הובלה ב- MTs חרקים מבודדים. צעדים קריטיים בגישות אלה כוללים הבטחת ניתוח נכון של MTs החרקים. הסרה בנפרד של כל צינור מהחרק חייבת להיעשות בזהירות, שכן כל נזק לצינור יגרום להפריש את הנוזל מהקרע או להוביל להכנה לא פונקציונלית. אאדס MTs אינם מפרישים בקלות בבקרות לא מגורה, ולכן הורמונים ותרופות עשויים להיות מיושמים כדי לעורר הפרשה. עם זאת, גם עם יישום משתן או ניתוחים זהירים, כמה MTs עשוי להיכשל להפריש אם פגום (גם אם בכלל לא ברור עם בדיקה חזותית), ולכן סיבובים מרובים של הבדיקה ייתכן שיהיה צורך להתבצע. לשימוש נכון באלקטרודות סלקטיביות של יונים במהלך מדידות ISME ו- SIET, ודא כי השיפוע של התקנים נמצא בטווח הנורמלי המדווח עבור היונופור, אשר ייתן את הקריאות המדויקות ביותר. עם זאת, אם הקריאות אינן יציבות, בדוק את האלקטרודה מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר היונופור נלקח ואינו דולף. אלקטרודה חדשה צריכה להיות מוכנה אם יש בועות אוויר נוכחים, הקצה שבור, או ionophore לא נלקח כראוי. אם גבול היונופור/מילוי העורק הוא קמור, האלקטרודות אינן סילאניות ויש להשתמש ביותר דיכלורודימתילסילאן. אם הגבול קעור, האלקטרודות הן סילאן יתר על המידה, ויש להשתמש בפחות דיכלורודימתילסילאן. בנוסף, אלקטרודות מסוימות עשויות להיות פחות יציבות מאחרות, כגון אלקטרודה Na +-סלקטיבית, לפיה השיפוע מתדרדר מהר יותר בהשוואה ל- K + או H +.
גישות אלה מספקות הזדמנויות בלתי מוגבלות לחקר המנגנונים העומדים מאחורי הפרשת נוזלים על ידי ה- MTs. עקב ההתקדמות האחרונה בעריכה גנומית, ניתן להשתמש באסטרטגיות גנטיות הפוכות כגון CRISPR-Cas9 לעריכת גנים והפרעות RNA כדי לחקור את התפקיד הרגולטורי ו/או התפקודי של גנים ספציפיים המבוטאים באיברים מפרישים. מחקרים השתמשו בכלים כאלה כדי להבין את הרגולציה ההורמונלית Aedes40 ו Drosophila41 MTs. בנוסף, טיפת הרחצה עשויה להשתנות כדי להסתכל על התפקידים הספציפיים של הורמונים14,15,18,21,42, מערכות שליח שני, וסמים על שיעור הפרשה וריכוזי יונים. מתודולוגיות אלה יושמו בחרקים שונים אחרים כגון Rhodnius prolixus38, מיני יתושים זחלים ומבוגרים, Drosophila41, ומיני זבובים (Hexagenia rigida)43. באופן דומה, ניתן לבחון יונים שונים, כגון Cl-, K +, H+ ו- NH4 +.
במהלך מדידות SIET, תיתכן שונות בין כל דגימה במהלך תנאים בסיסיים. הבדלים עדיין יכולים להתעורר בעת שליטה על הגיל, המין ומצב ההאכלה של היתוש, במיוחד כאשר בוחנים אזורים שונים במעיים (כלומר מרחקים מסוימים קדמיים או אחוריים מצומת איליום-פי הטבעת). הבדלים אלה ניתן להסביר על ידי הבעת שטף יונים בעקבות הטיפול כשינוי ביחס לתנאים הבסיסיים. עם הזמן, פעילות היונים עשויה גם להשתנות ולכן חשוב להעריך שינויים בהשוואה לבקרת רכב (מלוחים), כפי שמוצג בתוצאות המוצגות כאן. אם קריאות המתח מתחילות להשתנות באופן דרסטי, הכינו מיקרו-אלקטרוניקה סלקטיבית-יונים חדשה וכיילו מחדש. שימוש בפתרון כיול שלישי (מדולל פי 10 מריכוז פתרון הכיול הנמוך ביותר) יכול לסייע עוד יותר בהקמת שיפוע נרנסט מדויק יותר. מכיוון שפעילות Na+ בדרך כלל רגישה מאוד לרעשי רקע, נעשה שימוש במלוח Aedes שונה המורכב מפחות Na+ (טבלה 2). חשוב גם לשמור על מרחק מכלוב פאראדיי במהלך המדידות כדי למנוע הפרעה ולהפחית כל רקע. בנוסף, אם האיבר עדיין מייצר התכווצויות ספונטניות כאשר הוא דבק בפולי-L-ליזין בתחתית המנה, הוספת כלטור סידן למלח תסייע עוד יותר למנוע זאת. אם בוחנים הובלת יונים לאורך אפיתלית כרית רקטלית, כפי שמוצג בתוצאות המוצגות כאן, חשוב לזהות את אתר "נקודה חמה" המציג את פעילות היונים הגדולה ביותר על ידי הזזת קצה המיקרואלקטרודים במרווחים קטנים לאורך הצד הפונה להמולימפה של כרית הפי הטבעת. אם לא ניתן לזהות שינויים גדולים בפעילות היונים, ייתכן שהאיבר ניזוק או שקצה המיקרואלקטרודה אינו נמצא באותו מישור תלת מימדי כמו פתח כרית פי הטבעת, ולכן יש לנתח יתוש אחר.
ה- SIET יכול לשמש לניסויים שונים, כגון בחינת פעילות היונים אצל יתושים הגדלים בתנאים שונים25 או האכילו דיאטות שונות (כלומר, האכלת סוכרוז לעומת ניזון מדם לעומת unfed), אשר יכול להיות שימושי כדי לזהות מנגנוני הובלת יונים קריטיים בעקבות קמח דם. לכן חשוב לוודא כי מדידות מתקבלות מאותו אתר בין דגימות. לדוגמה, ניתן לקחת מדידות מצומת פי הטבעת של איליאום או במרחקים ספציפיים הממוקמים באופן קדמי מאתר זה (לאורך האיליום) או מאחור (לאורך האפיתל הפי הטבעתי). מדידות אלה ניתן להשיג גם לאורך אפיתל כרית רקטלי הדורש מיקום שונה של האיבר בצלחת. בנוסף, חשוב לציין כי ה- SIET אינו מוגבל למדידת פעילות היונים אך ורק לאורך ההינדוגט; ניתן לבדוק גם איברים אחרים, כולל מידגוט ו- MTs. באופן דומה, ניתן למדוד את K+, H+, NH4+ ו- Cl-flux באמצעות SIET25,44,45 וניתן למדוד מדידות במרווחי זמן קבועים לאחר טיפול44. טכניקה זו שימשה הן יתושים זחליים ומבוגרים26,44, כמו גם חרקים שונים אחרים, כולל Chironomus riparius46, Trichoplusia ni45,47 ו Hexagenia rigida43. ניסויים אלה יכולים לשמש יחד עם ה-Ramsay assay ו-ISME כדי להבין טוב יותר את תפקידם של טיפולים שונים וגורמים סביבתיים על הפרשת נוזלים, ריכוז יונים והובלת יונים.
לבסוף, בדיקות התכווצות שימושיות כדי לזהות גורמים נוירואנדוקריניים המשפיעים על תנועתיות המעיים. זה חיוני כי האיבר תחת המחקר אינו פגום מאז בדיקה זו מסתמכת על תנועות שנוצרו על ידי שרירים. לכן, מלקחיים יש להשתמש רק כדי לתפוס את המבנים שמסביב בעת העברת האיברים לצלחת הבדיקה. אחיזת איברים סמוכים אלה עם סיכה בתוך הבאר גם מונעת מהם לנוע ולהשפיע על התנועה של האיבר המבודד הנבדק. אם לא נצפו התכווצויות ספונטניות, ייתכן שהרקמה ניזוקה, ונדרש ניתוח חדש. שיטות אחרות המשמשות בדרך כלל לבחינת פעילות התכווצות המעיים של החרקים כוללות שימוש במתמר כוח32 או במוניטור עכבה33. שיטות אלה יכולות לשמש גם כדי למדוד את שיעור ההתכווצות בהינדגוט יתושים; עם זאת, אם המטרה היא לבחון חזותית שינויים אלה באמצעות הקלטות וידאו, השיטות המתוארות בפרוטוקול זה יהיו מועילות וניתן להשתמש בהן לניתוח נוסף48.
ארבע הטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה סייעו להסיק את תפקידם של מספר נוירופפטידים במערכת ההפרשה של חרקים שונים. שימוש בשיטות אלה בשילוב עם טכניקות נוספות המשמשות פיזיולוגים של חרקים, כגון PCR כמותי ואימונוהיסטוכימיה, יכול לספק הבנה מקיפה יותר של מסלולים בסיסיים ומערכות איתות, אשר יכול לשמש מטרות פוטנציאליות חדשניות לשליטה וקטורית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענקי גילוי של המועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ל- AD ו- J-PP. אל ו-FS קיבלו פרסי NSERC CGS-M לתמיכה במחקרם לתואר שני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955456 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning Falcon (Fisher Scientific) | C351008 | |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | used for ISME reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm) |
World Precision Instruments | 1B200F-4 | used for SIET reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | TW150-4 | used for ISME and SIET electrodes |
| CO2 pad | Diamed | GEN59-114 | |
| Dimethyltrimethylsilylamine solution | Sigma-Aldrich | 41716 | |
| Faraday cage | Custom | Can be fabricated by local machine shop | |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-748A | |
| Hydrated mineral oil | Fisher Scientific | 8042-47-5 | Specific brand is not important |
| INFINITY1-2CB video camera | Luminera | INFINITY1-2CB | |
| Micromanipulators (left and right handed) | World Precision Instruments | MMJL and MMJR | Specific brand is not important so long as high quality manipulator |
| Mineral Oil, Light | Fisher Scientific | 0121-4 | |
| Minutien pins (0.1 mm stainless steel) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Non-hardening modeling clay | Sargent Art | Specific brand is not important | |
| Olympus light microscope (FOR SIET) | Olympus | customized system | |
| Plastic Pasteur (transfer) pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) | Sigma-Aldrich | A-005-M | 84 kDa |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81395 | |
| Scalpel Blade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10053-09 | |
| Schneider's Drosophila medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| SIET system | Applicable Electronics | customized system | Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview |
| Silver wire | World Precision Instruments | AGW1010 | |
| Sodium ionophore II cocktail A | Fluka | 99357 | |
| Standard polystyrene Petri (culture) dishes | Fisherbrand | FB012921 | Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | |
| Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller | Sutter Instruments | FGPN7 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Chemical Company | NC9285739 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| VWR advanced hotplate stirrer - aluminum | VWR | 9578 | Specific brand is not important |
References
- Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic factors in insects: the role of CAPA peptides. General and Comparative Endocrinology. 176, 300-308 (2012).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. Journal of Experimental Biology. 206, 3845-3856 (2003).
- Bradley, T. J.
- Patrick, M. L., Aimanova, K., Sanders, H. R., Gill, S. S. P-type Na+/K+-ATPase and V-type H+-ATPase expression patterns in the osmoregulatory organs of larval and adult mosquito Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 209, 4638-4651 (2006).
- Coast, G. The endocrine control of salt balance in insects. General and Comparative Endocrinology. 152, 332-338 (2007).
- Maddrell, S. H. P., Overton, J. A. Methods for the study of fluid and solute transport and their control in insect Malpighian tubules. Methods in Enzymology. , 617-632 (1990).
- Beyenbach, K. W., Oviedo, A., Aneshansley, D. J. Malpighian tubules of Aedes aegypti: Five tubules, one function. Journal of Insect Physiology. 39, 639-648 (1993).
- Misyura, L., Yerushalmi, G. Y., Donini, A. A mosquito entomoglyceroporin, Aedes aegypti AQP5, participates in water transport across the Malpighian tubules of larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 3536-3544 (2017).
- Drake, L. L., Rodriguez, S. D., Hansen, I. A. Functional characterization of aquaporins and aquaglyceroporins of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 5, 7795 (2015).
- Ramsay, J. A. Active transport of water by the Malpighian tubules of the stick insect, Dixippus morosus (Orthoptera, Phasmidae). Journal of Experimental Biology. 31, 104-113 (1954).
- Jing, X., White, T. A., Yang, X., Douglas, A. E. The molecular correlates of organ loss: the case of insect Malpighian tubules. Biology Letters. 11, 20150154 (2015).
- Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. T. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
- O'Connor, K. R., Beyenbach, K. W. Chloride channels in apical membrane patches of stellate cells of Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 204, 367-378 (2001).
- Ionescu, A., Donini, A. AedesCAPA-PVK-1 displays diuretic and dose dependent antidiuretic potential in the larval mosquito Aedes aegypti (Liverpool). Journal of Insect Physiology. 58, 1299-1306 (2012).
- Coast, G. M., Garside, C., Webster, S. G., Schegg, K. M., Schooley, D. A. Mosquito natriuretic peptide identified as a calcitonin-like diuretic hormone in Anopheles gambiae (Giles). Journal of Experimental Biology. 208, 3281-3291 (2005).
- Clark, T. M., Bradley, T. J. Additive effects of 5-HT and diuretic peptide on Aedes Malpighian tubule fluid secretion. Comparative Biochemistry and Physiology. 119, 599-605 (1998).
- Veenstra, J. A. Effects of 5-hydroxytryptamine on the Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 34, 299-304 (1988).
- Pollock, V. P., et al. Conservation of capa peptide-induced nitric oxide signalling in Diptera. Journal of Experimental Biology. 207, 4135-4145 (2004).
- Maddrell, S. H. P., Gardiner, B. O. C. The passive permeability of insect Malpighian tubules to organic solutes. Journal of Experimental Biology. 60, 641-652 (1974).
- O'Donnell, M. J. Too much of a good thing: How insects cope with excess ions or toxins in the diet. Journal of Experimental Biology. 212, 363-372 (2009).
- Sajadi, F., Curcuruto, C., Al Dhaheri, A., Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic action of a CAPA neuropeptide against a subset of diuretic hormones in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Donini, A., O'Donnell, M. J., Orchard, I. Differential actions of diuretic factors on the Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 42-48 (2008).
- Donini, A., et al. Secretion of water and ions by Malpighian tubules of larval mosquitoes: Effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiological and Biochemical Zoology. 79, 645-655 (2006).
- Donini, A., O'Donnell, M. J. Analysis of Na+, Cl-, K+, H+ and NH4+ concentration gradients adjacent to the surface of anal papillae of the mosquito Aedes aegypti: Application of self-referencing ion-selective microelectrodes. Journal of Experimental Biology. 208, 603-610 (2005).
- Durant, A. C., Donini, A. Development of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito larvae in high ammonia sewage in septic tanks causes alterations in ammonia excretion, ammonia transporter expression, and osmoregulation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Paluzzi, J. P. V., Vanderveken, M., O'Donnell, M. J. The heterodimeric glycoprotein hormone, GPA2/GPB5, regulates ion transport across the hindgut of the adult mosquito, Aedes aegypti. PLoS One. 9, 86386 (2014).
- Nguyen, H., Donini, A. Larvae of the midge Chironomus riparius possess two distinct mechanisms for ionoregulation in response to ion-poor conditions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299, 762-773 (2010).
- Lajevardi, A., Paluzzi, J. -P. V. Receptor characterization and functional activity of pyrokinins on the hindgut in the adult mosquito, Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 11, 490 (2020).
- Cook, B. J., Holman, G. M. The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology and Pharmacology. 80, 65-73 (1985).
- Robertson, L., Rodriguez, E. P., Lange, A. B. The neural and peptidergic control of gut contraction in Locusta migratoria: The effect of an FGLa/AST. Journal of Experimental Biology. 215, 3394-3402 (2012).
- Te Brugge, V. A., Schooley, D. A., Orchard, I. Amino acid sequence and biological activity of a calcitonin-like diuretic hormone (DH31) from Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 382-390 (2008).
- Lange, A. B., et al. The distribution and physiological effects of the myoinhibiting peptides in the kissing bug, Rhodnius prolixus. Frontiers in Neuroscience. 6, 98 (2012).
- Robertson, L., Chasiotis, H., Galperin, V., Donini, A. Allatostatin A-like immunoreactivity in the nervous system and gut of the larval midge Chironomus riparius: Modulation of hindgut motility, rectal K+ transport and implications for exposure to salinity. Journal of Experimental Biology. 217, 3815-3822 (2014).
- Kwon, H., Pietrantonio, P. V. Calcitonin receptor 1 (AedaeGPCRCAL1) hindgut expression and direct role in myotropic action in females of the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43, 588-593 (2013).
- Messer, A. C., Brown, M. R. Non-linear dynamics of neurochemical modulation of mosquito oviduct and hindgut contractions. Journal of Experimental Biology. 198, 2325-2336 (1995).
- Petzel, D. H., Berg, M. M., Beyenbach, K. W. Hormone-controlled cAMP-mediated fluid secretion in yellow-fever mosquito. The American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 253, 701-711 (1987).
- Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the Drosophila melanogaster Malpighian tubule. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53144 (2015).
- Paluzzi, J. -P. V., Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Natriuresis and diuretic hormone synergism in R. prolixus upper Malpighian tubules is inhibited by the anti-diuretic hormone, RhoprCAPA-α2. Journal of Insect Physiology. 58, 534-542 (2012).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J., Morris, C. E. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. Journal of Experimental Biology. 207, 2173-2184 (2004).
- Sajadi, F., et al. CAPA neuropeptides and their receptor form an anti-diuretic hormone signaling system in the human disease vector, Aedes aegypti. Scientific Reports. 10, 1755 (2020).
- Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. American Journal of Physiology. 303, 883-894 (2012).
- Yu, M. J., Beyenbach, K. W. Effects of leucokinin-VIII on Aedes Malpighian tubule segments lacking stellate cells. Journal of Experimental Biology. 207, 519-526 (2004).
- Nowghani, F., et al. Impact of salt-contaminated freshwater on osmoregulation and tracheal gill function in nymphs of the mayfly Hexagenia rigida. Aquatic Toxicology. 211, 92-104 (2019).
- D'Silva, N. M., O'Donnell, M. J. Mechanisms of transport of H+, Na+ and K+, across the distal gastric caecum of larval Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 121, 103997 (2020).
- Kolosov, D., O'Donnell, M. J. Malpighian tubules of caterpillars: blending RNAseq and physiology to reveal regional functional diversity and novel epithelial ion transport control mechanisms. Journal of Experimental Biology. 222, (2019).
- Jonusaite, S., Kelly, S. P., Donini, A. Tissue-specific ionomotive enzyme activity and K+ reabsorption reveal the rectum as an important ionoregulatory organ in larval Chironomus riparius exposed to varying salinity. Journal of Experimental Biology. 216, 3637-3648 (2013).
- O'Donnell, M. J., Ruiz-Sanchez, E. The rectal complex and Malpighian tubules of the cabbage looper (Trichoplusia ni): regional variations in Na+ and K+ transport and cation reabsorption by secondary cells. Journal of Experimental Biology. 218, 3206-3214 (2015).
- Simo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44, 819-826 (2014).
