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Biology

Estudio de la actividad de los neuropéptidos y otros reguladores del sistema excretor en el mosquito adulto

Published: August 24, 2021 doi: 10.3791/61849
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biology, York University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe las metodologías detrás del ensayo de Ramsay, los microelectrodos selectivos de iones, la técnica de electrodo selectivo de iones de barrido (SIET) y los ensayos de contracción in vitro, aplicados para estudiar el sistema excretor de mosquitos adultos, compuesto por los túbulos de Malpighian y el intestino posterior, para medir colectivamente las tasas de secreción de iones y líquidos, la actividad contráctil y el transporte de iones transepiteliales.

Abstract

Los estudios de fisiología de insectos, particularmente en aquellas especies que son vectores de patógenos que causan enfermedades en humanos y otros vertebrados, proporcionan la base para desarrollar estrategias novedosas para el control de plagas. Aquí, se describen una serie de métodos que se utilizan rutinariamente para determinar el papel funcional de los neuropéptidos y otros factores neuronales (es decir, aminas biogénicas) en el sistema excretor del mosquito, Aedes aegypti. Los túbulos de Malpighian (TM), responsables de la formación primaria de orina, pueden continuar funcionando durante horas cuando se eliminan del mosquito, lo que permite mediciones de secreción de líquido después de los tratamientos hormonales. Como tal, el ensayo de Ramsay es una técnica útil para medir las tasas de secreción de MT aislados. Los microelectrodos selectivos de iones (ISME) se pueden usar secuencialmente para medir las concentraciones de iones (es decir, Na + y K +) en el fluido secretado. Este ensayo permite la medición de varios TM en un momento dado, determinando los efectos de varias hormonas y medicamentos. La técnica de electrodo selectivo de iones de barrido utiliza ISME para medir el voltaje representativo de la actividad iónica en la capa no agitada adyacente a la superficie de los órganos transportadores de iones para determinar el transporte transepitelial de iones en tiempo casi real. Este método se puede utilizar para comprender el papel de las hormonas y otros reguladores en la absorción o secreción de iones a través de los epitelios. Los ensayos de contracción del intestino posterior también son una herramienta útil para caracterizar neuropéptidos mioactivos, que pueden mejorar o reducir la capacidad de este órgano para eliminar el exceso de líquido y desechos. En conjunto, estos métodos proporcionan información sobre cómo se regula el sistema excretor en los mosquitos adultos. Esto es importante porque la coordinación funcional de los órganos excretores es crucial para superar desafíos como el estrés por desecación después de la eclosión y antes de encontrar un huésped vertebrado adecuado para obtener una harina de sangre.

Introduction

El mantenimiento de los niveles de sal y agua en los insectos les permite tener éxito en muchos nichos ecológicos y ambientales, utilizando una variedad de estrategias de alimentación1. La mayoría de los insectos han desarrollado mecanismos para regular la composición de su hemolinfa dentro de límites estrechos con el fin de soportar los diferentes desafíos asociados con su entorno particular2. Los insectos terrestres a menudo se enfrentan al desafío de conservar el agua y el sistema excretor se somete a antidiuresis para evitar la pérdida de agua y algunas sales esenciales, por lo tanto, evitando la desecación. Por el contrario, la diuresis ocurre cuando el insecto se alimenta y es desafiado con el exceso de agua y potencialmente sales3,4. A través de su sistema excretor especializado y altamente activo, los insectos han desarrollado mecanismos reguladores que actúan para contrarrestar sus desafíos osmorreguladores. En los mosquitos adultos Aedes aegypti, el sistema excretor está compuesto por los túbulos de Malpighian (MT) y el intestino posterior, este último formado por el íleon anterior y el recto posterior5. Los MT son responsables de generar orina primaria, generalmente rica en NaCl y/o KCl. La orina primaria se modifica a través de procesos secretores y reabsortivos a medida que viaja aguas abajo del túbulo y entra en el intestino posterior5. Los excrementos finales pueden ser hiper o hipoosmóticos a la hemolinfa, dependiendo de las condiciones de alimentación/ambientales, y están enriquecidos en desechos tóxicos y nitrogenados2.

Las MT son ideales para estudiar muchas características del transporte de líquido epitelial y soluto, ya que realizan una gran variedad de funciones de transporte y excretoras2,6. A través de la regulación hormonal2, las MT funcionan secretando iones y otros solutos de la sangre hacia el túbulo lumen7, proporcionando un gradiente osmótico que permite que el agua sea transportada por acuaporinas8,9, que colectivamente crea la orina primaria, antes de viajar hacia el intestino posterior reabsortivo2. Por lo tanto, al recolectar el fluido secretado de MT aislados, se puede monitorear continuamente el transporte transepitelial de fluido e iones. La medición de la tasa de secreción y la composición de la orina proporciona información sobre los mecanismos responsables del transporte de iones y líquidos transepiteliales. Un método popular para estudiar las tasas de secreción de fluidos es el ensayo de Ramsay, que fue introducido por primera vez por Ramsay en 195310. En este método, el extremo distal (cerrado) del túbulo se trata con una hormona (u otro compuesto / fármaco de prueba), mientras que el extremo proximal (abierto) se envuelve alrededor de un alfiler en aceite de parafina saturado de agua, que secreta la orina primaria, acumulándose como una gota en la punta del alfiler. Los MT aislados son capaces de sobrevivir y funcionar durante largos períodos (hasta 24 h) en condiciones in vitro optimizadas, lo que los convierte en modelos adecuados y eficientes para la medición de la secreción de fluidos. Los insectos tienen sistemas circulatorios abiertos, por lo que los MT se diseccionan y eliminan fácilmente, ya que generalmente flotan libremente en la hemolinfa6. Además, con la excepción de los pulgones, que carecen de MT11, el número de MT en una especie de insecto dada puede variar considerablemente de cuatro a cientos (cinco en mosquitos Aedes), lo que permite múltiples mediciones de un insecto.

Los MT en los mosquitos Aedes, al igual que otros insectos endopterigotas, están compuestos por dos tipos de células que forman un epitelio simple2,12; células principales grandes, que facilitan el transporte activo de cationes (es decir, Na+ y K+) hacia la luz, y células estrelladas delgadas, que ayudan en la secreción transepitelial de Cl-13. Los MT no están inervados2, sino que están regulados por varias hormonas, incluidos factores diuréticos y antidiuréticos, lo que permite el control del transporte de iones (principalmente Na+, K+ y Cl-) y el agua osmóticamente obligada2. Numerosos estudios han examinado la regulación hormonal de los MT de Aedes para comprender el papel de los factores endocrinos en el transporte transepitelial14,15,16,17,18. Como se muestra en los resultados representativos, los protocolos aquí presentes demuestran los efectos de diferentes factores hormonales en TM aislados de mosquitos A. aegypti hembras adultas, incluido el control diurético y antidiurético (Figura 1). El ensayo de Ramsay se utiliza para demostrar cómo una hormona antidiurética, AedaeCAPA-1, inhibe la secreción de líquido de LAS ESTIMULADAS por la hormona diurética 31 (DH31) (Figura 1).

El tamaño más pequeño de los insectos ha requerido el desarrollo de micro métodos para medir la actividad iónica y las concentraciones en muestras de fluidos, o cerca de la superficie de tejidos aislados como los MT y el intestino. Se han implementado diversos métodos, incluyendo el uso de radioisótopos de iones19, que requiere la recolección de las gotas de fluido secretadas para la medición de las concentraciones de iones20. Los túbulos de Aedes estimulados in vitro generalmente secretan ~ 0.5 nL / min21, por lo que el manejo de volúmenes tan pequeños puede representar un desafío y potencialmente introducir errores en la transferencia. Como resultado, los microelectrodos selectivos de iones (IME) se han utilizado ampliamente para medir las concentraciones de iones en gotas secretadas de MT in vitro. En este método, un electrodo de referencia y un ISME, llenos de la solución de relleno y el ionóforo apropiados, se colocan en la gota de orina secretada para determinar las concentraciones de iones22. Adaptado de Donini y sus colegas23, este protocolo actual utiliza un ionóforo selectivo de Na+ para medir la actividad iónica en gotitas secretadas de MT estimuladas en mosquitos Aedes adultos. Dado que los microelectrodos selectivos de iones miden la actividad iónica, estos datos pueden expresarse como concentraciones de iones siguiendo el supuesto de que las soluciones de calibración y las muestras experimentales comparten el mismo coeficiente de actividad iónica21 (Figura 1B,C).

La técnica de electrodo selectivo de iones de barrido (SIET) también hace uso de ISMEs para medir gradientes de concentración de iones en la capa no erosionada adyacente a órganos, tejidos o células que transportan iones. Los ISMEs miden gradientes de voltaje que luego se pueden usar para calcular los gradientes de concentración de iones y la dirección y magnitud del flujo de iones a través del órgano, tejido o célula20. En esta técnica, el ISME se monta en un manipulador de tres ejes controlado por motores micropastores computarizados para que su posición 3D se controle al nivel micrométrico20. Los voltajes se miden en dos puntos dentro de la capa no agitada utilizando un protocolo de muestreo programado y controlado por un software informático. Los dos puntos están típicamente separados por una distancia de 20–100 μm con un punto dentro de 5–10 μm de la superficie del órgano, tejido o célula y el segundo punto a 20–100 μm de distancia. La diferencia de magnitud de tensiones entre los dos puntos se calcula para obtener un gradiente de tensión24,25,26, que luego se utiliza para calcular el gradiente de concentración y posteriormente el flujo neto utilizando la Ley de Fick24,27. Este método es útil para evaluar el transporte de iones específicos a través de diferentes regiones del intestino del insecto y las MT, o en puntos de tiempo específicos después de una exposición a la harina de sangre o al tratamiento. Por ejemplo, el SIET se puede utilizar para comprender cómo los procesos de absorción y secreción en el sistema excretor de mosquitos están regulados por hormonas28, así como por diferentes comportamientos de alimentación y condiciones de cría25. Trabajos previos utilizando el SIET revelaron sitios involucrados en el transporte de iones a lo largo de las papilas anales y el recto de mosquitos larvales y adultos24,28. El protocolo actual, descrito anteriormente por Paluzzi y sus colegas26, mide el flujo de Na+ a través de los epitelios de la almohadilla rectal del recto femenino adulto (Figura 2).

El segmento final del sistema excretor de mosquitos requiere un movimiento muscular coordinado para ayudar a mezclar los alimentos y secretar desechos26. Los productos no absorbibles de la digestión del intestino medio, junto con la orina primaria secretada por los MT, se pasan a través de la válvula pilórica y se entregan al intestino posterior2. Las contracciones espontáneas del intestino posterior comienzan en la válvula pilórica y ocurren en ondas peristálticas, que se transmiten sobre el íleon a través de la contracción coordinada de los músculos circulares y longitudinales que rodean la superficie basal de las células epiteliales26. Finalmente, los músculos dentro del recto ayudan a impulsar y eliminar los desechos a través del canal anal. Aunque la motilidad del intestino posterior de los insectos es miogénica, requiriendo Ca2+ extracelular para producir contracciones espontáneas, estos procesos también pueden ser regulados neuronalmente26,29,30. Esta regulación exógena por parte del sistema nervioso es importante después de la alimentación, ya que el animal debe expulsar los desechos del intestino y restaurar el equilibrio hemolinfático31. Como resultado, la realización de bioensayos in vitro para identificar neuropéptidos mioestimuladores o mioinhibitorios es útil para evaluar cómo los neuroquímicos influyen en la motilidad del intestino posterior. El protocolo actual, realizado por Lajevardi y Paluzzi28, utiliza grabaciones de video para examinar la motilidad ileal en respuesta a neuropéptidos (Figura 3). Del mismo modo, también se puede utilizar un transductor de fuerza o un convertidor de impedancia para observar rastros de contracciones a través de un software de adquisición de datos32,33. Sin embargo, el uso de la tecnología de video nos permite evaluar visualmente el órgano y analizar más a fondo utilizando un subconjunto de parámetros para identificar el papel de las hormonas en la motilidad del intestino posterior.

El uso de estas técnicas puede ayudar a caracterizar los factores que regulan y coordinan el transporte de líquidos e iones a lo largo del sistema excretor junto con la motilidad del intestino posterior. Es importante destacar que se apoya un vínculo funcional entre la respuesta diurética de los MT y la motilidad del intestino posterior, ya que también se ha encontrado que las hormonas diuréticas, como DH31 y 5HT, caracterizadas por su capacidad para estimular la secreción de líquidos por las MT, exhiben acciones miotrópicas a lo largo del intestino posterior del mosquito21,34,35 . Estos hallazgos resaltan la importancia de una coordinación estricta entre los MT y el intestino posterior durante eventos como la diuresis postprandial en insectos que requieren una rápida eliminación de desechos.

Aquí, se describe el enfoque detallado detrás de la técnica de ensayo de Ramsay para medir la tasa de secreción de líquido en el mosquito, A. aegypti, y el uso de microelectrodos selectivos de iones para determinar las concentraciones de Na + dentro del fluido secretado de los MT, que cuando se combinan permite determinar las tasas de transporte de iones transepiteliales. Además, se describen la Técnica de Electrodo Selectivo de Iones de Barrido y los ensayos de contracción del intestino posterior para medir el flujo iónico y la motilidad, respectivamente, lo que ayuda a dilucidar la regulación hormonal del intestino posterior (Figura 4).

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Protocol

1. Hacer platos forrados de silicona

NOTA: Este paso debe realizarse antes de los experimentos. Estos platos se harán para preparar el plato de ensayo para disecciones y para experimentos de ensayo de contracción.

  1. Prepare la silicona con un kit de elastómero de silicona siguiendo las recomendaciones del fabricante. Mezcle los componentes líquidos de dos partes en una proporción de 10 a 1. Mezcle suavemente y a fondo invirtiendo, pero asegúrese de minimizar la formación de burbujas.
  2. Vierta el elastómero de silicona en platos de cultivo de poliestireno desechables estándar de 60 mm a una profundidad de normalmente entre 7 y 9 mm. Prepare tantos platos como sea necesario. Retire las burbujas de aire con un alfiler fino bajo un microscopio poco después de verter silicona en los platos. Coloque los platos en una cámara o gabinete libre de polvo a temperatura ambiente (RT) durante al menos 48 h o en el horno a 50 °C durante aproximadamente 4 h para curar (endurecer) (Figura 5A).

2. Hacer el plato de ensayo de Ramsay

NOTA: El plato se puede reutilizar de un experimento a otro, por lo tanto, repita este paso solo si el plato está dañado o se rompe. Se utiliza un plato separado para las disecciones.

  1. Usando un bisturí (con precauciones estándar de objetos punzantes), cree pocillos en una de las placas de Petri recubiertas de silicona para preparar la placa de ensayo, retirando suficiente silicona, aproximadamente ~ 5 mm, de la parte superior de la placa (esto debe caber ~ 20 μL gota de baño). Antes de esto, use un marcador permanente para marcar las posiciones debajo del plato para anotar dónde hacer los pozos. Los pozos deben estar separados por ~ 1 cm, con un diámetro de aproximadamente ~ 4 mm para permitir que el extremo distal del túbulo encaje. Cada pozo contendrá un túbulo secretor de líquido, por lo que un plato que contiene 20 pocillos permitirá analizar hasta 20 MT por experimento.
  2. Para preparar los pasadores Minutien, coloque los pasadores de acero inoxidable de 0,1 mm en fila sobre un trozo de cinta de etiquetado, perpendicular al eje de la cinta. Usando tijeras, corte a lo largo de la longitud de la cinta, creando mitades iguales de los pines. Use medio alfiler para cada pozo.
  3. Usando un par de fórceps contundentes, inserte cada medio pasador en el plato de ensayo recubierto de silicona, al lado de cada pozo. Dependiendo de la longitud del túbulo del insecto, inserte el medio pasador a una distancia que permita que el extremo distal del túbulo se sumerja en la solución salina de baño y el extremo proximal se envuelva alrededor del pasador. Este paso se puede hacer bajo un microscopio para visualizar pozos fácilmente. Los pines se pueden reutilizar, sin embargo, reemplace el medio pasador si está dañado o perdido. (Figura 5B)

3. Hacer el plato SIET recubierto de poli-L-lisina

NOTA: Este paso es importante para que el órgano se adhiera a la parte inferior del plato durante las mediciones de SIET, lo que garantiza que el sitio de medición permanezca igual para cada muestra. La preparación de estos platos debe hacerse al menos 2 días antes de los experimentos. Cada plato solo debe usarse una vez al aplicar un tratamiento específico. Deseche después de cada muestra o si la capa de poli-L-lisina está rayada o dañada.

  1. Para cada muestra, coloque una placa de Petri de 35 mm sobre una superficie nivelada. Retire las tapas y pipetee 70 μL de poli-L-lisina (0,1 mg/ml) en el centro de cada plato. Vuelva a colocar las tapas y deje que la poli-L-lisina se seque (~ 48 h) sin ser molestada.
  2. Una vez seco, marque el fondo del plato con un círculo que describa la capa seca de poli-L-lisina para visualizar mejor dónde se debe colocar el órgano extirpado después de las disecciones. Si es necesario para minimizar los volúmenes de solución salina y de tratamiento en los experimentos, use una pistola de pegamento caliente para rodear el recubrimiento de poli-L-lisina, dejando suficiente espacio para que el electrodo se mueva y tome medidas de fondo (~ 20–25 mm de diámetro del círculo pegado es suficiente). Estos platos recubiertos se pueden almacenar indefinidamente en RT (Figura 5C).

4. Preparación de los platos de ensayo de Ramsay y contracción para experimentos

NOTA: El plato se puede reutilizar (siempre que se proporcione el lavado adecuado para eliminar la solución salina / tratamientos utilizados anteriormente), por lo tanto, solo repita este paso si el plato está dañado o se rompe. Se utiliza un plato separado para las disecciones. Este paso se realiza el día del experimento.

  1. Para el plato de ensayo de contracción, use un bisturí (con precauciones estándar de objetos punzantes), cree pocillos en una de las placas de Petri recubiertas de silicona para preparar la placa de ensayo. Incline el bisturí de manera que los pocillos tengan forma de triángulo para facilitar la fijación del tejido diseccionado en los bordes. Los pozos deben ser lo suficientemente grandes como para contener hasta 250 μL y adaptarse a todo el canal alimentario (en lugar de cavar demasiado profundo, haga que el pozo sea más ancho a aproximadamente 0.5–1 cm) (Figura 5D).
  2. Para la placa Ramsay, use una pipeta y llene los pocillos hasta 20 μL de solución (18 μL de solución salina 1X Aedes : medio de Schneider preparado en el paso 5.2 y 2 μL de hormona / medicamento). Para controles no estimulados, llene los pozos con 20 μL de solución salina 1X Aedes : medio de Schneider. Una vez que todos los pozos estén llenos, vierta aceite mineral hidratado en el plato de ensayo hasta que los pozos y los alfileres minutien estén sumergidos. Use una punta de pipeta de 20 μL para reventar o eliminar las burbujas de aire que podrían interferir con las gotas secretadas.

5. Preparación de soluciones

  1. Preparar 2X Aedes aegypti solución salina y 10x glucosa, como se describe en la Tabla 1, adaptada de Petzel y colegas36. Las soluciones madre deben almacenarse a 4 °C. Elaborar existencias de trabajo de solución salina 1X Aedes aegypti (Tabla 1) y conservar a 4 °C. El día del experimento, permita que las existencias de trabajo lleguen a RT antes de su uso. Prepare fresco si hay alguna evidencia de crecimiento fúngico o bacteriano.
  2. Para preparar la gota de baño, mezcle la solución salina de Aedes (a partir del paso 5.1) con el medio de Schneider, en una proporción de 1: 1. Prepárese en pequeñas alícuotas, dependiendo de cuánto se necesite. Mantenga el medio de Schneider en el refrigerador, deseche si hay alguna evidencia de crecimiento de hongos o bacterias. (Este paso debe realizarse el día del experimento).
  3. Para las mediciones de flujo de Na+ utilizando el SIET, prepare una solución salina de Aedes libre de Ca2+ modificada (Tabla 2), como se describió anteriormente26.

6. Mosquito MTs y disecciones de intestinos traseros

  1. Para las disecciones de mosquitos adultos, recolecte la pupa en un vaso de precipitados pequeño y colóquela en un frasco que contenga una solución de sacarosa para alimentarse. Para determinar la edad del mosquito, aísle los mosquitos eclosionados y colóquelos en un frasco diferente anotando la edad y el sexo de los mosquitos para futuras disecciones.
  2. Coloque brevemente los mosquitos para ser diseccionados en una almohadilla de CO2 y espere hasta que no respondan. Usando fórceps finos, recoja el mosquito de su pata o ala y colóquelo en un plato de disección recubierto de elastómero de silicona preparado en el paso 1. Coloque el mosquito en un lado (lateral hacia arriba), y con un alfiler Minutien, empale en el tórax para asegurar el mosquito en su lugar. Opcionalmente, retire las alas y las patas de los mosquitos para facilitar la disección.
  3. Usando una pipeta Pasteur, agregue una gota de solución salina RT Aedes para sumergir completamente el mosquito en solución salina. Asegúrese de que la disección esté toda bajo solución salina (consulte la Tabla 1 para hacer solución salina de Aedes ).
  4. Coloque la placa de disección bajo un microscopio estereoscópico. Pellizque el último segmento abdominal con fórceps finos y aléjese lentamente del mosquito. Este paso se facilita mirando simultáneamente bajo el microscopio. El intestino medio, unido a los MT y al intestino posterior, debe estar expuesto (Figura 6).
  5. Para el ensayo de Ramsay, retire cuidadosamente cada túbulo de la unión intestino medio-intestino posterior, asegurándose de no dañar los órganos. Use fórceps finos y afilados para eliminar los túbulos individualmente; no use túbulos dañados para el ensayo. (Consulte el paso 7 para la configuración).
  6. Para el SIET, diseccionar el intestino posterior en solución salina de Aedes libre de Ca2+ (paso 5.3). Asegúrese de que el plato de poli-L-lisina también tenga un volumen fijo de solución salina de Aedes libre de Ca2+. Retire con cuidado la cutícula del recto y coloque el intestino posterior (puede eliminar cualquier otro órgano adjunto, dependiendo de lo que se esté midiendo) en el plato de poli-L-lisina. Si mide el transporte de iones a lo largo de los epitelios de la almohadilla rectal, coloque el lado orientado hacia la hemolinfa de al menos una almohadilla rectal para que sea accesible al microelectrodo (Figura 7).
    1. Usando fórceps para agarrar el extremo más posterior, lleve el intestino posterior hasta el fondo del plato (sin dañar ninguna estructura que se medirá). Tan pronto como el órgano toque la capa de poli-L-lisina, se adherirá. Esta muestra disecada está lista para las mediciones. (Consulte los pasos 14–16 para la configuración y las mediciones de SIET).
  7. Para el ensayo de contracción del íleon, asegúrese de que el intestino posterior permanezca unido al intestino medio durante la disección (Figura 4D). Retire cuidadosamente los MT para tener una vista sin obstáculos del intestino posterior. Este órgano se transferirá a un nuevo plato preparado como se describe en el paso 4.1. (Consulte el paso 17 para obtener videos de ensayo).

7. Configuración del ensayo de Ramsay

  1. Usando la punta de los fórceps, levante cuidadosamente el extremo proximal (abierto) del túbulo cubriéndolo sobre los fórceps (no pellizque el túbulo) y transfiéralo a un pozo del plato de ensayo. Este paso también se puede hacer utilizando sondas de vidrio fino.
  2. Una vez que el túbulo esté sumergido en el pozo, recoja el extremo proximal del túbulo con las pinzas, retírelo de la gota de baño y envuelva el extremo alrededor del pasador. Envuelva el túbulo alrededor del pasador dos veces, y mantenga la longitud del túbulo restante en la gota de baño consistente con los otros túbulos. En este punto, el extremo distal del túbulo debe estar en la gota de baño, mientras que el extremo proximal envuelto alrededor del pasador lejos de la gota de baño permitiendo que el líquido secretado se acumule en la punta del pasador desde el extremo proximal abierto.
  3. Inmediatamente después de que el túbulo se envuelva alrededor del alfiler, anote los pocillos (por ejemplo, A, B, C), la hora (que será la hora de inicio de cuándo comenzará a secretarse el líquido del túbulo) y cualquier otra información de identificación (por ejemplo, hormona, genotipo, etc.).
  4. Cada mosquito tiene cinco túbulos, por lo que repite los pasos 7.1-7.3 con el resto de los túbulos. Para tratamientos de control y experimentales, divida los cinco túbulos dentro de los diferentes tratamientos. Continúe con la siguiente disección, hasta que se llene todo el plato de ensayo. Con la práctica, esta técnica debe tomar típicamente 2-3 minutos para diseccionar los túbulos, transferirlos a la solución salina de baño y envolver alrededor del alfiler, creando así una diferencia de 2-3 minutos en la hora de inicio entre cada túbulo.
    NOTA: Antes de comenzar el experimento, calibre el micrómetro ocular del microscopio con un micrómetro de etapa debajo del objetivo seleccionado. Las gotas secretadas se miden rutinariamente bajo un aumento total de 40x-50x.
  5. Después del tiempo de incubación asignado, se puede medir la gota secretada. Usando el micrómetro ocular del microscopio, mida y registre el diámetro de la gota secretada. Calcule el diámetro (d) de la gota secretada multiplicando el diámetro unitario ocular medido por la conversión de calibración (Tabla 3). Calcule el volumen de la gota secretada usando la ecuación, V = πd3/6.
  6. Para calcular la tasa de secreción (nL min-1), use la ecuación, tasa de secreción de fluido = V / tiempo de secreción, donde V es el volumen de la gota secretada calculado en el paso 7.5, y el tiempo de secreción se refiere al período de incubación del túbulo.

8. Configuración de ISME

  1. Coloque micromanipuladores a ambos lados del estereomicroscopio para configurar la estación ISME. La cloración de los alambres de plata se puede lograr sumergiendo en una solución de cloruro férrico y roscando cada alambre de plata en cada uno de los soportes de microelectrodos (o soldando los cables en los cables coaxiales, si es necesario). Repita este paso cada vez que los cables de plata se vuelvan sin cloruro.
  2. Conecte los cables plateados a un amplificador, que leerá a un sistema de adquisición de datos. Configure y calibre el sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En caso de aumento de la interferencia eléctrica, use una jaula de Faraday correctamente conectada a tierra.

9. Preparación de los microelectrodos para ISME y SIET

  1. Usando un extractor de pipetaS P-97 Flaming Brown, tire de ~ 5–6 capilares de vidrio de borosilicato sin relleno (diámetro exterior 1.5 mm, diámetro interno 1.12 mm, longitud 100 mm) con una punta de 1–5 μm. Estos se utilizarán como microelectrodos selectivos de iones. Para los microelectrodos SIET, el electrodo resultante debe tener una abertura de punta de ~ 5 μm, caracterizada por un vástago corto.
  2. En una campana, coloque los microelectrodos en una placa caliente (colocándolos con cuidado para no romper las puntas de los electrodos). Agregue diclorodimetilsilano dentro de una placa de Petri de vidrio de 15 cm e invierta sobre los electrodos de la placa caliente. Utilice diclorodimetilsilano para silanizar los electrodos selectivos de iones mediante la adición de una capa hidrofóbica a todas las superficies del electrodo, lo que le permite retener el ionóforo hidrófobo37. Los electrodos silanizados no utilizados se pueden dejar durante unas semanas; por lo tanto, este paso se realiza cada pocas semanas, o para electrodos recién tirados.
    NOTA: Tenga cuidado al manipular diclorodimetilsilano: inflamable, corrosivo y tóxico, consulte MSDS para un manejo seguro.
    1. Gire la placa a 350 °C y déjela en su lugar durante 75 min. Utilice una proporción de 1:2 del número de microelectrodos al volumen (μL) de diclorodimetilsilano para agregar a la placa de Petri de vidrio. Por lo tanto, para 10 microelectrodos, agregue 20 μL de diclorodimetilsilano.
  3. Después de 75 minutos, apague la placa caliente. Después de que los electrodos y la placa caliente se hayan enfriado, retire la placa de Petri de vidrio y transfiera los electrodos (con fórceps) a una caja de almacenamiento con arcilla de moldeo. Asegúrese de que la punta del electrodo esté apuntando hacia arriba para evitar cualquier daño.
  4. Para hacer los electrodos de referencia para ISME, tire de ~ 4–5 tubos capilares de vidrio de borosilicato filamentado (diámetro exterior 1 mm, diámetro interior 0,58 mm, longitud 100 mm). Estos electrodos no tienen que ser silanizados. Etiquete y guarde en una caja similar, evitando cualquier daño en la punta.
  5. Los electrodos de referencia SIET están hechos de capilares de vidrio estándar (diámetro exterior 2 mm, diámetro interior 1,12 mm, longitud 102 mm). Los capilares se llenan con agar fundido de 1 M KCl + 3% y deben almacenarse en un tubo centrífugo de 50 ml que contenga 1 M KCl (completamente sumergido) hasta su uso. Se pueden usar repetidamente hasta que comiencen a formarse burbujas o si el agar se rompe. Si hay espacio de aire, deseche el vidrio y use uno nuevo para asegurarse de que el circuito esté completo.

10. Preparación de las jeringas de relleno

NOTA: Este paso se realiza para crear jeringas de punta fina para rellenar electrodos para ISME.

  1. Use una jeringa de punta deslizante de 1 ml con una aguja desechable. Deseche la aguja y tire hacia atrás de la jeringa hasta la marca de 1 ml. Debajo del humo, encienda el quemador Bunsen y caliente la punta de plástico de la jeringa hasta que comience a derretirse. Usando un par de fórceps viejos, pellizque cuidadosamente la punta de la jeringa derretida y tire hacia abajo para estirar la punta.
  2. Usando tijeras, corte la punta fundida a la longitud deseada, dejando el diámetro lo suficientemente pequeño como para caber dentro de los electrodos (Ver diagrama). Después de que la jeringa se haya enfriado, pruebe la presión de la jeringa con agua para asegurarse de que no haya obstrucción. Cree uno para cada solución de relleno requerida y etiquete en consecuencia (Figura 8).

11. Llenado del microelectrodo selectivo de iones y de referencia para ISME y SIET

NOTA: El microelectrodo puede ser reutilizado siempre y cuando siga funcionando (calibrar antes de cada experimento). Para ISME, este paso se puede hacer mientras los MT se incuban en el ensayo de Ramsay.

  1. Para hacer un microelectrodo selectivo de Na+, use la jeringa de 1 ml creada en el paso 10 para rellenar el electrodo con NaCl de 100 mM. Asegúrese de que la solución de relleno se llene hasta la punta del electrodo. Si aparecen burbujas de aire, mueva suavemente el microelectrodo o retire la solución y vuelva a llenarla. Esto debe hacerse bajo un microscopio estereoscópico para visualizar mejor.
  2. Bajo un microscopio estereoscópico, sumerja una punta de pipeta de 10 μL en la solución de ionóforo selectivo de Na+. Alineando el electrodo perpendicular a la pipeta, coloque un dedo enguantado sobre la parte inferior de la punta para crear presión y expulsar una pequeña gota de ionóforo. Viendo bajo el objetivo alto de un microscopio, toque cuidadosamente la gota de ionóforo a la punta del microelectrodo, evitando romper la punta. Normalmente, los microelectrodos se rellenan hacia adelante con una longitud de columna de cóctel ionóforo de entre 150 y 300 μm, hasta que el borde de la solución de ionóforo/relleno es plano.
    PRECAUCIÓN: Este ionóforo es tóxico, consulte MSDS para un manejo seguro.
  3. En un vaso de precipitados pequeño, llene hasta la mitad con NaCl de 100 mM y coloque un poco de arcilla de modelado en el interior en la parte superior del vaso de precipitados. Después de que se haya tomado el ionóforo de Na+ , coloque la punta del electrodo hacia abajo en la pared del vaso de precipitados, dejando que la punta se asiente dentro del NaCl de 100 mM, y mantenga ISME en el vaso de precipitados hasta que esté listo para usar.
  4. Para hacer el electrodo de referencia ISME, rellene un electrodo con KCl de 500 mM asegurando que la solución se llene hasta la punta (siga el mismo protocolo que el anterior). Almacene el KCl en un vaso de precipitados.

12. Calibración de electrodos para ISME

NOTA: Este paso se realiza justo antes de tomar medidas del líquido secretado (~ 10-15 minutos antes). Las calibraciones deben realizarse cada ~ 5-6 mediciones para garantizar que la pendiente sea consistente.

  1. Cubra las puntas de los electrodos con una solución de ~3.5% (p/v) de cloruro de polivinilo disuelto en tetrahidrofurano, para evitar el desplazamiento del ionóforo cuando se sumerge en aceite de parafina.
    PRECAUCIÓN: Esto es inflamable, consulte MSDS para un manejo seguro.
  2. Para calibrar el electrodo de Na+ , coloque gotas de 10 μL de las siguientes concentraciones estándar de NaCl en el borde de la placa Ramsay con los MT incubados: 200 mM NaCl y 20 mM + 180 mM LiCl. Coloque las gotas estándar ~ 2 cm de distancia, con la mayor concentración en la parte superior.
  3. Inserte tanto el electrodo de referencia como el electrodo selectivo de iones sobre los cables de plata cloruro y sujéntelos de forma segura utilizando soportes de electrodos que estén conectados a micromanipuladores. Navegue por ambos electrodos hacia la gota de NaCl de 200 mM utilizando los micromanipuladores, asegurándose de que las puntas de los electrodos no toquen el fondo del plato. Encienda el electrómetro para comenzar a grabar y permita que la lectura se estabilice.
  4. Grabe la lectura y continúe con el siguiente estándar (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Calcule la pendiente, y si la lectura del electrodo es estable y la pendiente está dentro del rango, proceda a usar el electrodo para las mediciones de gotas secretadas. Si la lectura es inestable, no da un registro o pendiente adecuados, o tarda un tiempo en equilibrarse, prepare un nuevo electrodo selectivo de iones o rompa la punta del electrodo de referencia pasando un tejido a través de la punta. La pendiente para Na+ debe ser de ~58–60 mV38, aunque un rango aceptable es de 50–60 mV.

13. Registros y cálculos ismolares

  1. Después de las mediciones de la velocidad de secreción de fluido (consulte el paso 7.7), mueva cuidadosamente tanto el electrodo de referencia como el selectivo de iones en la gota secretada utilizando los micromanipuladores. Encienda la grabación y permita que la lectura se estabilice y registre el valor. Repita este paso para las otras gotas (repita las mediciones de calibración cada ~ 5–6 mediciones).
  2. Las concentraciones de cationes se calculan utilizando la ecuación descrita anteriormente22,38, [ion] = [C] x 10ΔV/m, donde [C] es la concentración en mmol L-1 de la solución de calibración utilizada para calibrar el ISME, ΔV es el cambio de tensión entre la tensión registrada de la gota de fluido secretada y la tensión de la misma solución de calibración, y m es la diferencia de voltaje entre las dos calibraciones estándar, que también es la pendiente.

14. Configuración de SIET

NOTA: El sistema SIET ha sido descrito anteriormente27,39. Para reducir el ruido de fondo, se instala una jaula de Faraday alrededor del microscopio de luz y el escenario. Los experimentos presentados en este documento utilizan los siguientes ajustes en el software Automated Scanning Electrode Technique (ASET) 2.0: un período de espera de 4 segundos para permitir que los gradientes de iones restablezcan completamente los siguientes movimientos de microelectrodos, con un voltaje registrado durante 0,5 s después del período de espera, una distancia de excursión de 100 μm y tres repeticiones para cada grabación. Ciertas configuraciones se pueden modificar por el usuario en ASET, según sea necesario.

  1. Encienda el amplificador de iones/polarográfico IPA-2, el microscopio de luz (con una cámara de video conectada) y las computadoras conectadas a cada uno de estos ASET y cellSens en ejecución.
  2. Prepare microelectrodos y electrodos de referencia descritos en los pasos 9.1–9.3, 9.5, 10 y 11.1–11.3. El microelectrodo selectivo de iones contendrá ionóforo Na+ con relleno de NaCl de 100 mM y el electrodo de referencia (con los puentes de agar) siempre se llenará con 3 M KCl.
  3. Coloque el microelectrodo selectivo de Na + en el soporte que consiste en un cable de cloruro de plata (AgCl) y conéctelo al conector hembra. Con una jeringa, llene el soporte del electrodo de referencia con 3 M KCl fresco (se puede hacer antes del día del experimento y almacenarse en RT).
    NOTA: Después de los experimentos, lave el soporte del electrodo de referencia con ddH2O.
  4. Retire un electrodo de referencia del vaso de precipitados que contenga todos los electrodos de referencia sumergidos en 3 M KCl, colocando un dedo en un extremo e inclinando el capilar de vidrio hacia este dedo para evitar que el agar se caiga. Coloque con cuidado un extremo en el soporte, asegurándose de que no se formen burbujas. Si hay una burbuja, retire el electrodo de referencia, vuelva a llenar el soporte con más 3 M KCl y repita. Coloque el soporte del electrodo en el conector hembra.

15. Calibración de electrodos para SIET

  1. Para las mediciones de Na+ , utilice soluciones de NaCl de 150 mM y NaCl de 15 mM + LiCl de 135 mM24. Debe haber una diferencia de 10 veces en las concentraciones de Na+ entre las dos soluciones, abarcando el rango de niveles de Na+ (20 mM) en la solución salina (Tabla 2).
  2. Almacene las soluciones de calibración en RT en un tubo de centrífuga de 50 ml y alícuota en una placa de Petri cuando realice el experimento. Esta alícuota se elimina al final del día. Si hay alguna evidencia de contaminación en las soluciones de stock, deseche y haga soluciones frescas.
  3. Para calibrar, alícute las dos soluciones de calibración (paso 15.1) en placas de Petri individuales de 35 mm y colóquelas en el escenario del microscopio. Utilizando las perillas de ajuste manual que controlan los motores paso a paso con "desactivación" seleccionada en la unidad de control de movimiento de la computadora, asegúrese de que la punta del microelectrodo se coloque dentro de la solución de calibración. No sumerja la punta demasiado lejos, ya que puede romperse. Si la punta se rompe, prepare un nuevo microelectrodo selectivo de iones y vuelva a calibrar.
    1. En el ordenador conectado al amplificador, abra el software ASET. Abra Configuración de calibración. Seleccione Nernst Slope para el tipo de calibración, ajuste la muestra durante 3 segundos e introduzca las concentraciones de las soluciones de calibración. Por ejemplo, para las mediciones de Na+ , introduzca 150 mM en la solución 1, coloque la punta de microelectrodo selectivo de Na+ y el electrodo de referencia dentro de esta solución de calibración. La lectura de voltaje en el amplificador debe ser estable. Haga clic en la Solución 1, espere a que se registre el voltaje (en mV). A continuación, coloque el microelectrodo y el electrodo de referencia dentro de la solución 15 mM NaCl + 135 mM LiCl, ingrese 15 mM en la solución 2 y haga clic en Solución 2 para obtener la lectura de voltaje. La pendiente será la diferencia entre estos dos voltajes, calculada en estos ajustes. Después de la calibración, haga clic en Aceptar.
    2. Las pendientes para microelectrodos selectivos de Na + para un cambio de diez veces en la concentración de iones deben ser de alrededor de 59.0 ± 1.624. Si la pendiente de Nernst se desvía en gran medida de este rango, prepare un nuevo microelectrodo o alícuota nuevos estándares (ya que pueden estar contaminados). Se requiere calibración antes de cada 2-3 muestras, dependiendo de la estabilidad del voltaje. Si el voltaje se vuelve inestable y comienza a fluctuar, prepare un nuevo microelectrodo selectivo de iones.

16. Mediciones SIET

NOTA: El interruptor del motor de la unidad de control de movimiento de la computadora siempre debe cambiarse a Desactivar, excepto cuando se manipula el electrodo con las teclas de la computadora a través de ASET, o durante las grabaciones de medición (momento en el cual la tecla debe cambiarse a Habilitar).

  1. Después de la calibración, diseccionar el órgano (ver paso 6.6). Coloque la placa de poli-L-lisina con la muestra diseccionada en la etapa del microscopio e inserte la punta del electrodo de referencia dentro de la solución salina. Sumergir la punta del microelectrodo selectivo de iones en la solución salina teniendo cuidado de no romper la punta.
  2. Utilice las perillas de ajuste manual para ajustar la posición del microelectrodo mientras mira bajo el microscopio óptico. Ajuste la posición vertical del microelectrodo de modo que su punta esté en el mismo plano que el órgano o tejido. Una vez en la posición deseada, gire el interruptor del motor a Habilitar. En este punto, los motores paso a paso solo se pueden operar utilizando el software de la computadora.
  3. Con las teclas de flecha de la computadora, mueva el microelectrodo horizontalmente a una posición a 3 mm de distancia del tejido para medir las grabaciones de fondo. Inserte notas presionando F2. Cuando esté listo, comience a grabar (presionando F5). Obtener cinco mediciones de la actividad de fondo. La actividad promedio de voltaje de fondo para cada muestra se restará de los gradientes de voltaje medidos a lo largo del tejido para la misma muestra.
  4. Mueva la punta del microelectrodo hacia atrás cerca del tejido, teniendo cuidado de no perforar el órgano. Reduzca la sensibilidad del keyhit para colocar la punta del microelectrodo 2 μm directamente a la derecha, perpendicular al tejido. Obtenga tres grabaciones en cada sitio a lo largo de la almohadilla rectal para identificar el sitio de mayor actividad iónica. Obtener mediciones salinas de referencia en el sitio que muestra la mayor actividad (el sitio "hotspot").
  5. Cambie el motor a Disable y agregue el tratamiento adecuado en el plato para obtener la dosis final deseada. Después de la aplicación, cree una nueva nota (es decir, nombre y dosis del tratamiento), vuelva a cambiar el motor a Habilitar y tome grabaciones de voltaje con F5. Si el objetivo es observar los cambios a lo largo del tiempo, continúe tomando medidas a intervalos de tiempo específicos. Se pueden crear múltiples protocolos para aplicaciones específicas utilizando el SIET, dependiendo del objetivo del investigador.
  6. Observe cómo el software ASET registra el voltaje en el sitio a lo largo del tejido y reste esto del voltaje a una distancia de excursión (Figura 7) de 100 μm de distancia del tejido. Dado que el primer registro se toma en el tejido, una diferencia de voltaje positiva indica que el voltaje es mayor en el epitelio (tejido) (Figura 7A) que lejos del epitelio (Figura 7B), y por lo tanto el catión está siendo absorbido. Un gradiente de voltaje negativo es indicativo de secreción catiónica.
  7. Obtenga nuevamente registros de fondo después del tratamiento (a 3 mm de distancia) y utilícelos al calcular el flujo de iones después del tratamiento. Haga un conjunto de grabaciones de fondo en "línea de base" y un conjunto después del tratamiento. Cambie el motor a Desactivado cada vez que el microelectrodo no se esté ajustando con las teclas de la computadora o cuando no se registre el voltaje. Exporte los datos a un archivo de texto y ábralos con Excel para realizar todos los cálculos.
  8. Calcular el flujo iónico utilizando las ecuaciones descritas anteriormente24,26. El flujo de iones neto para cada tratamiento se puede expresar como un cambio absoluto de las mediciones de flujo de iones basales. Para verificar la importancia de los resultados, se puede utilizar un control del vehículo (es decir, agregar solución salina sola en el plato en lugar de un tratamiento). Los cambios en el transporte de iones después del tratamiento hormonal deben evaluarse en relación con cualquier cambio en la respuesta a este control.

17. Ensayos de contracción del intestino posterior

  1. Llene uno de los pocillos del plato descrito en el paso 4.1 con un volumen conocido de solución salina de Aedes (paso 5.1). Después de la disección (paso 6.7), transfiera cuidadosamente el intestino posterior diseccionado unido al intestino medio al pozo en el otro plato, asegurándose de no pellizcar el órgano que se está examinando (íleon). Sumerja el intestino en la solución salina dentro del pozo y coloque los alfileres minutien en el intestino medio y el recto. Al hacerlo, el íleon no debe estar bajo tensión, y se deben observar contracciones espontáneas, que se originan en la válvula pilórica en el íleon anterior.
  2. Conecte una cámara de vídeo a un microscopio estereoscópico y grabe vídeos utilizando un software de captura de vídeo (por ejemplo, INFINITY CAPTURE de Luminera). Coloque el plato que contiene el órgano diseccionado bajo el microscopio y grabe durante 2 min. Esta será la condición de "Línea de base".
  3. Agregue un volumen conocido de solución salina 1X Aedes (paso 5.1) al pozo para tener en cuenta cualquier cambio en la motilidad ileal al aumentar el volumen dentro del pozo. Espere 1 minuto después de la aplicación, luego vuelva a grabar durante 2 minutos. Esta es la condición "salina".
  4. Agregue un volumen conocido de tratamiento (a partir de una concentración de stock de 10x para obtener la dosis deseada en el pozo). Espere 1 minuto después de la aplicación, luego vuelva a grabar durante 2 minutos. Esta será la condición de "tratamiento".
  5. Guarde todos los videos y conviértalos a MP4. Para analizar, cuente el número de contracciones en los intervalos de 2 minutos (definida como una onda peristáltica que se inicia en la válvula pilórica y se extiende por todo el íleon). Divida este número por 2 min para obtener la tasa de contracción. También se pueden evaluar otros parámetros, como la contracción o la duración de la relajación. Después de la recopilación de datos sin procesar, exprese cada parámetro relativo a los datos para las condiciones de "línea de base" para cada muestra. Trazar el cambio de pliegue para la "solución salina" y el "tratamiento", todo en relación con la "línea de base".

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Representative Results

La aplicación de DH31 contra las MT no estimuladas da como resultado un aumento significativo en la tasa de secreción de líquidos, lo que confirma su papel como hormona diurética en los mosquitos Aedes (Figura 1A). Cuando los túbulos se tratan con AedaeCAPA-1, se observa una reducción en la tasa de secreción en las MT estimuladas por DH31. La Figura 1B demuestra el uso de electrodos selectivos de iones para medir las concentraciones de Na+ en las gotas secretadas. El tratamiento de DH31 en los TM no tuvo ningún efecto sobre la concentración de Na+ en la gota secretada; sin embargo, con la aplicación de AedaeCAPA-1, la concentración de Na+ en el líquido secretado aumentó significativamente. Además, en comparación con los controles no estimulados, DH31 condujo a una tasa de transporte de Na+ significativamente mayor, mientras que AedaeCAPA-1 abolió este aumento en los túbulos estimulados por DH31 (Figura 1C). Juntos, estos resultados de la muestra demuestran cómo se pueden medir las tasas de secreción de líquido después de la aplicación de hormonas diuréticas y antidiuréticas, así como la concentración de iones dentro de las gotas secretadas. Se diseccionaron hembras de tres a seis días de edad y se analizaron entre 23 y 35 TM para el experimento. Las diferencias se denotaron como estadísticamente significativas si p < 0,05 utilizando un ANOVA unidireccional y pruebas t no apareadas.

El SIET se utilizó para evaluar los cambios en el transporte de Na + a lo largo de los epitelios de la almohadilla rectal de los mosquitos hembra adultos. La mayoría de las rectas no estimuladas examinadas exhibieron transporte (absorción) de Na+ dirigido por hemolinfa, por lo que solo se examinaron estas preparaciones. Debido a la variabilidad en la actividad basal, se calculó la diferencia en el flujo iónico, después de la aplicación salina o peptídica, en relación con la actividad de transporte inicial en solución salina. Estos valores producen un cambio negativo en el flujo iónico (flujo iónico después del tratamiento – flujo iónico en las condiciones basales), aunque todos los órganos permanecieron absortivos después de los tratamientos. Se utilizó un análogo de leucoquinina (Drosokinin) para examinar los cambios en la absorción de Na+ , lo que resultó en una disminución de cuatro veces en la absorción de Na+ en comparación con el control salino (Figura 2).

Para evaluar el papel de un neuropéptido, la piroquinina-2 (PK2), en la motilidad ileal, se utilizó un análogo de Rhodnius prolixus , que previamente se demostró que activaba el receptor PK2 de A. aegypti , enriquecido en el íleon mosquito28. En relación con los niveles basales, PK2 inhibe significativamente las contracciones ileales (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Efecto de los neuropéptidos diuréticos y antidiuréticos sobre la tasa de secreción de líquido in vitro, la concentración de Na+ y la tasa de transporte por MTs A. aegypti de hembra adulta. Aedae CAPA-1 (0,1 fM) se aplicó a los MT estimulados con DromeDH31 (25 nM). (A) Los TM se incubaron durante 60 min con neuropéptidos y 120 min para controles no estimulados. (B) Las concentraciones de Na+ en la gota secretada se midieron utilizando ISME y los valores se utilizaron para calcular la tasa de transporte (C). Las columnas que son significativamente diferentes de los controles se denotan con la misma letra, según lo determinado por una prueba posterior de ANOVA y Bonferroni unidireccional (n = 23–35). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cambios en el transporte de Na+ a través de los epitelios de la almohadilla rectal femenina medidos con el SIET. La absorción de Na+ se registró en condiciones salinas basales no estimuladas, seguida de tratamiento con solución salina adicional (control del vehículo) o 1 μM de drosoquinina (n = 10–12). Se midieron los cambios en el flujo de Na+ dirigido por hemolinfa para cada tratamiento. Hubo una disminución de cuatro veces en la absorción de Na + en respuesta a la drosoquinina, según lo determinado por una prueba t de dos colas no apareadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Cambio en la motilidad ileal de los mosquitos hembra después de la solución salina (control del vehículo) y la aplicación de RhoprPK2. El cambio en la frecuencia de contracción después de ambos tratamientos se registró para cada muestra en relación con las condiciones basales (n = 32). Rhopr PK2 disminuyó la motilidad ileal, según lo determinado por una prueba t de dos colas emparejadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Esquema del ensayo de Ramsay, uso de microelectrodos selectivos de iones (ISME), la técnica de electrodo selectivo de iones de barrido (SIET) y ensayos de contracción del intestino posterior. Ilustraciones de los cuatro métodos utilizados para determinar las funciones funcionales de los factores endocrinos en el sistema excretor del mosquito Aedes aegypti. (A) El ensayo de Ramsay se utiliza para medir las tasas de secreción de líquidos en túbulos malpighianos aislados. El extremo proximal (abierto) del túbulo se envuelve alrededor de un alfiler, rodeado de aceite mineral, mientras que el extremo distal (cerrado) se baña en la solución salina de tratamiento. Después de un período de tiempo establecido, el extremo proximal secretará la orina primaria, acumulándose como gotas en el alfiler. (B) Un electrodo de referencia y un ISME se colocan en la gota secretada, conectada a un sistema de adquisición de datos, para medir la concentración de iones. (C) El SIET mide el transporte de iones utilizando un microelectrodo selectivo de iones colocado perpendicularmente a ~ 2 μm de distancia del órgano adherido al fondo de un plato de poli-L-lisina. La dirección de las flechas rojas en este esquema indica que El Na+ está siendo absorbido por la solución salina, indicado por un mayor registro de voltaje a lo largo del epitelio en relación con la región alejada de la superficie del órgano. (D) Los ensayos de contracción del intestino posterior se realizan utilizando grabaciones de video para evaluar los cambios en la frecuencia de contracción, la duración y la duración de la relajación. En este esquema, los órganos se colocan dentro de un pozo, y se inserta un pasador de metal directamente en el intestino medio y el recto para permitir que el íleon flote y se contraiga libremente. Los tratamientos se agregan al pozo para evaluar los cambios en la motilidad tanto cualitativa como cuantitativamente. Creado usando BioRender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Platos utilizados para (A) disección de mosquitos, (B) ensayo de Ramsay, (C) mediciones de siet y (D) de ensayo de contracción. A, B y D están completamente recubiertos con silicona, mientras que C está recubierto con poli-L-lisina en el centro. Para preparar el plato utilizado para el ensayo de Ramsay (B), se utiliza una pequeña placa de Petri recubierta de silicona, y se tallan pequeños pozos de ~ 4-5 mm a 1 cm de distancia (se pueden tallar / plato alrededor de ~ 20 pozos). Los pasadores metálicos Minutien se colocan al lado de cada pozo para sujetar el túbulo aislado para medir la tasa de secreción de líquido. El plato de poli-L-lisina (C) permite que el órgano se adhiera a la parte inferior durante las mediciones de SIET. Los pocillos en el plato de ensayo de contracción (D) están llenos de solución salina y cualquier tratamiento posterior. El órgano de contracción colocado dentro del pozo se observa utilizando una cámara de video. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: El sistema excretor del mosquito Aedes aegypti. Después de una harina de sangre, los solutos, el agua y los nutrientes se pasan a lo largo del canal alimentario, que incluye (pero no se limita a) el intestino medio, la válvula pilórica, las MT y el intestino posterior. El intestino medio es el sitio principal para la digestión de los alimentos y la absorción de nutrientes. Los cinco MT transportan agua, solutos y desechos de la hemolinfa circundante y secretan esta orina primaria en el intestino posterior, formado por un íleon anterior y un recto posterior, el último de los cuales incluye cuatro almohadillas rectales (masculinas) o seis (femeninas). El intestino posterior actúa como el sitio de reabsorción final antes de que se excreten los desechos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Imágenes fijas de un intestino trasero de mosquito diseccionado durante las mediciones de SIET. Para medir la actividad iónica a lo largo de los epitelios de una de las seis almohadillas rectales, el microelectrodo selectivo de Na+ se coloca a 2 μm de distancia del tejido (A). El voltaje se registra en este sitio antes de que la punta del microelectrodo se mueva a una distancia de excursión (Δx) de 100 μm de distancia de este punto (B). El gradiente de voltaje entre estos dos puntos se utiliza para calcular el gradiente de concentración y el flujo iónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Las jeringas de relleno para ISME y SIET. Una imagen de las jeringas utilizadas para rellenar las soluciones de NaCl y KCl en los microelectrodos. Esto muestra cuatro jeringas de punta deslizante de 1 ml con agujas desechables, con una punta estirada modificada para permitir la inserción en un electrodo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2X Aedes aegypti solución salina
Para 500 ml:
En un vaso de precipitados, agregue 400 ml de ddH2O, luego agregue los siguientes solutos:
Componente Peso (g) Concentración final (mM)
NaCl 8.766 150
HEPES 5.957 25
Kcl 0.253 3.4
NaOH 0.3 7.5
NaHCO3 0.151 1.8
MgSO4 0.12 1
CaCl2-2H20 0.249 1.7
Revuelva y ajuste el pH a 7.1
Agregue ddH2O al volumen final de 500 ml para hacer 2x solución salina de Aedes
10X glucosa
Para 500 ml:
En un vaso de precipitados, agregue 450 ml de ddH2O, luego agregue:
Componente Peso (g) Concentración final (mM)
Glucosa 4.5 5
Revuelva y agregue ddH2O al volumen final de 500 ml
Para hacer 1X Aedes aegypti solución salina:
Para 100 ml:
En un vaso de precipitados, agregue 40 ml de ddH2O y, a continuación, agregue:
Componente Volumen (ml)
2x Solución salina Aedes 10
Revuelva, ajuste el pH a 7.1
Esterilizar el filtro

Tabla 1: Elaboración de solución salina Aedes aegypti . Para hacer solución salina de Aedes , prepare por separado 2X solución salina de Aedes y 10 veces glucosa, guárdela en una nevera de 4 °C. Utilice estas dos soluciones para preparar existencias de trabajo (1x solución salina de Aedes ), utilizadas para diseccionar tejidos, ensayos de Ramsay y ensayos de contracción.

Aedes aegypti salino libre de calcio + NMDG
Para 500 ml:
En un vaso de precipitados, agregue 400 ml de ddH2O, luego agregue los siguientes solutos:
Componente Peso (g) Concentración final (mM)
NaCl 1.17 20
NMDG 25.38 130
HEPES 5.957 25
Kcl 0.253 3.4
NaHCO3 0.151 1.8
MgSO4 0.12 1
Glucosa 0.9 5
Revuelva y ajuste el pH a 7.1
Añadir ddH2O al volumen final de 500 mL

Tabla 2: Solución salina Aedes aegypti modificada utilizada para las mediciones de SIET. Esta solución salina libre de Ca2+ se utiliza para prevenir las contracciones espontáneas del intestino posterior durante las mediciones de SIET. Esta solución salina es específica para medir el transporte de Na+ , ya que consiste en Na+ reducido (20 mM) compuesto por sustitución equimolar con N-metil-D-glucamina (NMDG) para reducir el ruido de fondo.

MT estimuladas por DH31 Diámetro de la gota (unidades) Diámetro de la gota (um) Volumen de gotas (um3) Tasa de secreción (nl/min)
n Tratamiento #1 (60 min) Tratamiento #1 (60 min) Tratamiento #1 (60 min) Tratamiento #1 (60 min)
1 16 313.73 16167692.56 0.27
2 14 274.51 10831090.91 0.18
3 17 333.33 19392547.25 0.32
4 13 254.90 8671977.67 0.14
5 14 274.51 10831090.91 0.18
6 22 431.37 42029685.15 0.70
7 15 294.12 13321768.16 0.22
8 16 313.73 16167692.56 0.27
9 20 392.16 31577524.53 0.53
Significar 16.33333333 320.26 18776785.52 0.31
STD ERR 0.06

Tabla 3: Ejemplo de datos del ensayo de Ramsay. Tabla que muestra datos de muestra recopilados de MT estimulados por DH31 de mosquitos hembra adultos. Al medir el diámetro de la gota secretada, primero mida con el micrómetro ocular estereomicroscopio y anote el valor. A continuación, multiplique el diámetro de la unidad ocular con la conversión de calibración realizada antes del experimento para obtener el diámetro de la gota en μm. Calcule el volumen de la ecuación a continuación, utilizando la ecuación observada en el paso 7.7, seguida de la tasa de secreción, utilizando la ecuación observada en el paso 7.8.

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Discussion

Al ingerir una comida de sangre, los insectos hematófagos se enfrentan al desafío del exceso de solutos y agua en su hemolinfa2. Para hacer frente a esto, tienen un sistema excretor especializado, que está estrechamente controlado por factores hormonales, lo que permite a los insectos iniciar rápidamente la diuresis postprandial. El ensayo de Ramsay y el uso de microelectrodos selectivos de iones permiten medir las tasas de secreción de líquido junto con las concentraciones de iones y las tasas de transporte en MT de insectos aislados. Los pasos críticos dentro de estos enfoques incluyen garantizar la disección adecuada de los MT de insectos. La eliminación individual de cada túbulo del insecto debe hacerse con cuidado, ya que cualquier daño al túbulo hará que el líquido se secrete del desgarro o conduzca a una preparación no funcional. Aedes Las MT no se secretan fácilmente en controles no estimulados, por lo que se pueden aplicar hormonas y medicamentos para estimular la secreción. Sin embargo, incluso con la aplicación de diuréticos o disecciones cuidadosas, algunos MT pueden no secretar si se dañan (incluso si no son en absoluto obvios con la inspección visual), por lo que es posible que se deban realizar múltiples rondas del ensayo. Para el uso adecuado de electrodos selectivos de iones durante las mediciones ISME y SIET, asegúrese de que la pendiente de los estándares esté dentro del rango normal informado para el ionóforo, lo que dará las lecturas más precisas. Sin embargo, si las lecturas son inestables, examine el electrodo bajo el microscopio para confirmar que el ionóforo ha sido absorbido y no tiene fugas. Se debe preparar un nuevo electrodo si hay burbujas de aire presentes, la punta está rota o el ionóforo no se ha absorbido correctamente. Si el borde ionóforo/relleno es convexo, los electrodos están poco silanizados y se debe usar más diclorodimetilsilano. Si el borde es cóncavo, los electrodos están sobressilizados y se debe usar menos diclorodimetilsilano. Además, algunos electrodos pueden ser menos estables que otros, como el electrodo selectivo de Na+, por lo que la pendiente se deteriora más rápido en comparación con K+ o H+.

Estos enfoques ofrecen oportunidades ilimitadas para estudiar los mecanismos detrás de la secreción de fluidos por parte de los MT. Debido a los recientes avances en la edición genómica, las estrategias genéticas inversas como la edición de genes CRISPR-Cas9 y la interferencia de ARN pueden utilizarse para investigar el papel regulador y / o funcional de genes específicos expresados en órganos excretores. Los estudios han utilizado estas herramientas para comprender la regulación hormonal en las MT de Aedes40 y Drosophila41. Además, la gota de baño puede modificarse para observar las funciones específicas de las hormonas14,15,18,21,42, los sistemas de segundo mensajero y los fármacos sobre la tasa de secreción y las concentraciones de iones. Estas metodologías se han aplicado en varios otros insectos como Rhodnius prolixus38, especies de mosquitos larvales y adultos, Drosophila41 y especies de moscas de mayo (Hexagenia rigida)43. Del mismo modo, se pueden examinar diferentes iones, como Cl-, K +, H + y NH4 +.

Durante las mediciones de SIET, puede haber variabilidad entre cada muestra durante las condiciones basales. Las diferencias aún podrían surgir al controlar la edad, el sexo y el estado de alimentación del mosquito, particularmente cuando se examinan diferentes regiones del intestino (es decir, ciertas distancias anteriores o posteriores de la unión íleon-recto). Estas diferencias se pueden explicar expresando el flujo iónico después del tratamiento como un cambio en relación con las condiciones basales. Con el tiempo, la actividad iónica también puede fluctuar y, por lo tanto, es importante evaluar los cambios en comparación con un control del vehículo (solución salina), como se muestra en los resultados presentados aquí. Si las lecturas de voltaje comienzan a fluctuar drásticamente, prepare un nuevo microelectrodo selectivo de iones y vuelva a calibrar. El uso de una tercera solución de calibración (diluida 10 veces de la concentración más baja de la solución de calibración) puede ayudar aún más a establecer una pendiente de Nernst más precisa. Dado que la actividad de Na+ suele ser altamente susceptible al ruido de fondo, se utiliza una solución salina de Aedes modificada que consiste en menos Na+ (Tabla 2). También es importante mantener una distancia de la jaula de Faraday durante las mediciones para evitar interferencias y reducir cualquier fondo. Además, si el órgano todavía produce contracciones espontáneas cuando se adhiere a la poli-L-lisina en la parte inferior del plato, agregar un quelante de calcio a la solución salina ayudará aún más a prevenir esto. Si se examina el transporte de iones a lo largo de los epitelios de la almohadilla rectal, como se muestra en los resultados presentados aquí, es importante identificar el sitio "hotspot" que exhibe la mayor actividad iónica moviendo la punta del microelectrodo en pequeños incrementos a lo largo del lado orientado hacia la hemolinfa de la almohadilla rectal. Si no puede detectar grandes cambios en la actividad iónica, el órgano puede haber sido dañado o la punta del microelectrodo no está en el mismo plano tridimensional que la abertura de la almohadilla rectal, y por lo tanto otro mosquito debe ser diseccionado.

El SIET se puede utilizar para diversos experimentos, como el examen de la actividad iónica en mosquitos criados en diferentes condiciones25 o alimentados con diferentes dietas (es decir, alimentados con sacarosa frente a alimentados con sangre frente a no alimentados), lo que puede ser útil para identificar mecanismos de transporte de iones críticos después de una harina de sangre. Por lo tanto, es importante asegurarse de que las mediciones se obtienen del mismo sitio entre muestras. Por ejemplo, las mediciones se pueden tomar de la unión íleon-recto o a distancias específicas ubicadas anteriormente de este sitio (a lo largo del íleon) o posteriormente (a lo largo del epitelio rectal). Estas mediciones también se pueden obtener a lo largo del epitelio de la almohadilla rectal que requiere un posicionamiento diferente del órgano en el plato. Además, es importante tener en cuenta que el SIET no se limita a medir la actividad iónica únicamente a lo largo del intestino posterior; también se pueden examinar otros órganos, incluidos el intestino medio y las MT. Del mismo modo, el flujo de K+, H+, NH4+ y Cl- se puede medir utilizando el SIET25,44,45 y las mediciones se pueden tomar a intervalos de tiempo establecidos después de un tratamiento44. Esta técnica se ha utilizado tanto en mosquitos larvales como adultos26,44, así como en varios otros insectos, entre ellos Chironomus riparius46, Trichoplusia ni45,47 y Hexagenia rigida43. Estos experimentos se pueden utilizar junto con el ensayo de Ramsay y el ISME para obtener una mejor comprensión del papel de los diferentes tratamientos y factores ambientales en la secreción de fluidos, la concentración de iones y el transporte de iones.

Por último, los ensayos de contracción son útiles para identificar los factores neuroendocrinos que influyen en la motilidad intestinal. Es crucial que el órgano en estudio no se dañe ya que este ensayo se basa en los movimientos generados por la musculatura. Por lo tanto, los fórceps solo deben usarse para agarrar las estructuras circundantes al transferir los órganos al plato de ensayo. Agarrar estos órganos adyacentes con un alfiler dentro del pozo también evita que se muevan e influye en el movimiento del órgano aislado que se está examinando. Si no se observan contracciones espontáneas, el tejido puede haber sido dañado y se requiere una nueva disección. Otros métodos comúnmente utilizados para examinar la actividad contráctil intestinal de los insectos incluyen el uso de un transductor de fuerza32 o monitor de impedancia33. Estos métodos también se pueden usar para medir la tasa de contracción en el intestino posterior del mosquito; sin embargo, si el objetivo es examinar visualmente estos cambios a través de grabaciones de video, los métodos descritos en este protocolo serán beneficiosos y pueden ser utilizados para análisis posteriores48.

Las cuatro técnicas descritas en este protocolo han ayudado a deducir el papel de una serie de neuropéptidos en el sistema excretor de varios insectos. El uso de estos métodos junto con técnicas adicionales utilizadas por los fisiólogos de insectos, como la PCR cuantitativa y la inmunohistoquímica, puede proporcionar una comprensión más completa de las vías subyacentes y los sistemas de señalización, que pueden servir como nuevos objetivos potenciales para el control de vectores.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada por Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants a AD y J-PP. AL y FS recibieron premios NSERC CGS-M en apoyo de su investigación de posgrado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringes Fisher Scientific 14955456
35 mm Petri dishes Corning Falcon (Fisher Scientific) C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes
(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)		 World Precision Instruments 1B100F-4 used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes
(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)		 World Precision Instruments 1B200F-4 used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes
(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)		 World Precision Instruments TW150-4 used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad Diamed GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution Sigma-Aldrich 41716
Faraday cage Custom Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride Sigma-Aldrich 157740
Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 91150-20
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-748A
Hydrated mineral oil Fisher Scientific 8042-47-5 Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera Luminera INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed) World Precision Instruments MMJL and MMJR Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light Fisher Scientific 0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel) Fine Science Tools 26002-10
Non-hardening modeling clay Sargent Art Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET) Olympus customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette Fisher Scientific 13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) Sigma-Aldrich A-005-M 84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81395
Scalpel Blade Fine Science Tools 10050-00
Scalpel Handle Fine Science Tools 10053-09
Schneider's Drosophila medium Sigma-Aldrich S0146
SIET system Applicable Electronics customized system Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire World Precision Instruments AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A Fluka 99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes Fisherbrand FB012921 Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer Nikon SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller Sutter Instruments FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Chemical Company NC9285739
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 401757
VWR advanced hotplate stirrer - aluminum VWR 9578 Specific brand is not important

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References

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Biología Número 174 neuropéptidos túbulos malpighianos intestino posterior sistema excretor mosquito Aedes aegypti ensayo de Ramsay ensayo de secreción SIET ISME transporte de iones contracciones
Estudio de la actividad de los neuropéptidos y otros reguladores del sistema excretor en el mosquito adulto
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Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. P. V. Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito. J. Vis. Exp. (174), e61849, doi:10.3791/61849 (2021).

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