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Biology

Étude de l’activité des neuropeptides et d’autres régulateurs du système excréteur chez le moustique adulte

Published: August 24, 2021 doi: 10.3791/61849
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biology, York University
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit les méthodologies derrière le test de Ramsay, les microélectrodes sélectives d’ions, la technique d’électrode sélective d’ions à balayage (SIET) et les tests de contraction in vitro, appliqués pour étudier le système excréteur de moustique adulte, composé des tubules de Malpighian et de l’intestin postérieur, pour mesurer collectivement les taux de sécrétion d’ions et de liquides, l’activité contractile et le transport transépithélial des ions.

Abstract

Les études sur la physiologie des insectes, en particulier chez les espèces qui sont vecteurs d’agents pathogènes causant des maladies chez les humains et d’autres vertébrés, fournissent la base pour développer de nouvelles stratégies de lutte antiparasitaire. Ici, une série de méthodes sont décrites qui sont couramment utilisées pour déterminer les rôles fonctionnels des neuropeptides et d’autres facteurs neuronaux (c’est-à-dire les amines biogènes) sur le système excréteur du moustique, Aedes aegypti. Les tubules de Malpighian (MT), responsables de la formation primaire d’urine, peuvent continuer à fonctionner pendant des heures lorsqu’ils sont retirés du moustique, ce qui permet de mesurer la sécrétion de liquide après des traitements hormonaux. En tant que tel, le test de Ramsay est une technique utile pour mesurer les taux de sécrétion des MT isolés. Les microélectrodes sélectives d’ions (ISME) peuvent être utilisées séquentiellement pour mesurer les concentrations d’ions (c.-à-d. Na+ et K+) dans le fluide sécrété. Ce test permet de mesurer plusieurs MT à la fois, en déterminant les effets de diverses hormones et médicaments. La technique de l’électrode sélective d’ions à balayage utilise l’ISME pour mesurer la tension représentative de l’activité ionique dans la couche non instigorée adjacente à la surface des organes de transport d’ions afin de déterminer le transport transépithélial des ions en temps quasi réel. Cette méthode peut être utilisée pour comprendre le rôle des hormones et d’autres régulateurs sur l’absorption ou la sécrétion d’ions à travers l’épithélium. Les tests de contraction de l’intestin postérieur sont également un outil utile pour caractériser les neuropeptides myoactifs, qui peuvent améliorer ou réduire la capacité de cet organe à éliminer l’excès de liquide et de déchets. Collectivement, ces méthodes donnent un aperçu de la façon dont le système excréteur est régulé chez les moustiques adultes. Ceci est important car la coordination fonctionnelle des organes excréteurs est cruciale pour surmonter des défis tels que le stress de dessiccation après l’éclosion et avant de trouver un hôte vertébré approprié pour obtenir une farine de sang.

Introduction

Le maintien des niveaux de sel et d’eau chez les insectes leur permet de réussir dans de nombreuses niches écologiques et environnementales, en utilisant une variété de stratégies d’alimentation1. La plupart des insectes ont développé des mécanismes pour réguler la composition de leur hémolymphe dans des limites étroites afin de résister aux différents défis associés à leur environnement particulier2. Les insectes terrestres sont souvent confrontés au défi de conserver l’eau et le système excréteur subit une antidiaurèse pour prévenir la perte d’eau et de certains sels essentiels, évitant ainsi la dessiccation. En revanche, la diurèse se produit lorsque l’insecte se nourrit et est confronté à un excès d’eau et potentiellement de sels3,4. Grâce à leur système excréteur spécialisé et très actif, les insectes ont développé des mécanismes de régulation agissant pour contrer leurs défis de scorrégulation. Chez les moustiques adultes Aedes aegypti, le système excréteur est composé des tubules de Malpighian (MT) et de l’intestin postérieur, ce dernier étant constitué de l’iléon antérieur et du rectum postérieur5. Les MT sont responsables de la génération d’urine primaire, généralement riche en NaCl et / ou KCl. L’urine primaire est ensuite modifiée par des processus sécrétoires et réabsorptifs lorsqu’elle se déplace en aval du tubule et pénètre dans l’intestin postérieur5. Les excréments finaux peuvent être hyper- ou hypoosmotiques à l’hémolymphe, selon les conditions alimentaires/environnementales, et sont enrichis en déchets toxiques et azotés2.

Les MT sont idéales pour étudier de nombreuses caractéristiques du liquide épithélial et du transport du soluté, car elles remplissent une grande variété de fonctions de transport et d’excrétion2,6. Grâce à la régulation hormonale2, les MT fonctionnent en sécrétant des ions et d’autres solutés du sang dans la lumière du tubule7, fournissant un gradient osmotique permettant à l’eau d’être transportée par des aquaporines8,9, qui créent collectivement l’urine primaire, avant de se déplacer vers l’intestin postérieur réabsorptif2. Ainsi, en collectant le fluide sécrété à partir de MT isolés, on peut surveiller en permanence le transport transépithélial du liquide et des ions. La mesure du taux de sécrétion et de la composition de l’urine donne un aperçu des mécanismes responsables du transport transépithélial des ions et des fluides. Une méthode populaire pour étudier les taux de sécrétion de liquide est le test de Ramsay, qui a été introduit pour la première fois par Ramsay en 195310. Dans cette méthode, l’extrémité distale (fermée) du tubule est traitée avec une hormone (ou un autre composé / médicament de test), tandis que l’extrémité proximale (ouverte) est enroulée autour d’une épingle dans de l’huile de paraffine saturée d’eau, qui sécrète l’urine primaire, s’accumulant sous forme de gouttelette sur le bout de l’épingle. Les MT isolés sont capables de survivre et de fonctionner pendant de longues périodes (jusqu’à 24 h) dans des conditions in vitro optimisées, ce qui en fait des modèles appropriés et efficaces pour la mesure de la sécrétion de fluide. Les insectes ont des systèmes circulatoires ouverts, de sorte que les MT sont facilement disséqués et enlevés car ils flottent généralement librement dans l’hémolymphe6. De plus, à l’exception des pucerons, qui n’ont pas de MT11, le nombre de MT dans une espèce d’insecte donnée peut varier considérablement de quatre à cent (cinq chez les moustiques Aedes), ce qui permet plusieurs mesures d’un insecte.

Les MT chez les moustiques Aedes, en commun avec d’autres insectes endoptérygotes, sont composés de deux types de cellules formant un épithélium simple2,12; les grandes cellules principales, qui facilitent le transport actif des cations (c.-à-d. Na+ et K+) dans la lumière, et les cellules stellaires minces, qui aident à la sécrétion transépithéliale de Cl13. Les MT ne sont pas innervés2, mais sont régulés par plusieurs hormones, y compris des facteurs diurétiques et anti-diurétiques, permettant le contrôle du transport ionique (principalement Na+, K+ et Cl-) et de l’eau imposée par osmotique2. De nombreuses études ont examiné la régulation hormonale des MT d’Aedes pour comprendre le rôle des facteurs endocriniens sur le transport transépithélial14,15,16,17,18. Comme le montrent les résultats représentatifs, les protocoles présentés ici démontrent les effets de différents facteurs hormonaux sur les MT isolées des moustiques A. aegypti femelles adultes, y compris le contrôle diurétique et antidiatétique (figure 1). Le test de Ramsay est utilisé pour démontrer comment une hormone anti-diurétique, AedaeCAPA-1, inhibe la sécrétion liquidienne des MT stimulée par l’hormone diurétique 31 (DH31) (Figure 1).

La plus petite taille des insectes a nécessité le développement de microméthodes pour mesurer l’activité ionique et les concentrations dans les échantillons de liquide, ou près de la surface de tissus isolés tels que les MT et l’intestin. Diverses méthodes ont été mises en œuvre, y compris l’utilisation de radio-isotopes d’ions19, ce qui nécessite la collecte des gouttes de fluide sécrétées pour la mesure des concentrations d’ions20. Les tubules d’Aedes stimulés in vitro sécrètent généralement environ 0,5 nL / min21, de sorte que la manipulation de si petits volumes peut poser un défi et potentiellement introduire une erreur lors du transfert. En conséquence, les microélectrodes sélectives d’ions (SMSI) ont été largement utilisées pour mesurer les concentrations d’ions dans les gouttelettes sécrétées de MT in vitro. Dans cette méthode, une électrode de référence et un ISME, remplis de la solution de remblayage et de l’ionophore appropriés, sont positionnés dans la gouttelette d’urine sécrétée pour déterminer les concentrations d’ions22. Adapté de Donini et de ses collègues23, ce protocole actuel utilise un ionophore sélectif Na+ pour mesurer l’activité ionique dans les gouttelettes sécrétées par les MT stimulées chez les moustiques Aedes adultes. Étant donné que les microélectrodes sélectives d’ions mesurent l’activité ionique, ces données peuvent être exprimées sous forme de concentrations d’ions en supposant que les solutions d’étalonnage et les échantillons expérimentaux partagent le même coefficient d’activité ionique21 (figure 1B, C).

La technique d’électrode sélective d’ions à balayage (SIET) utilise également des SMSI pour mesurer les gradients de concentration d’ions dans la couche non excitée adjacente aux organes, tissus ou cellules qui transportent des ions. Les ISME mesurent des gradients de tension qui peuvent ensuite être utilisés pour calculer les gradients de concentration d’ions et la direction et l’ampleur du flux d’ions à travers l’organe, le tissu ou la cellule20. Dans cette technique, l’ISME est monté sur un manipulateur à trois axes contrôlé par des moteurs micro-pas à pas informatisés afin que sa position 3D soit contrôlée au niveau micrométrique20. Les tensions sont mesurées en deux points de la couche non stimulée à l’aide d’un protocole d’échantillonnage programmé et contrôlé par un logiciel informatique. Les deux points sont généralement séparés par une distance de 20 à 100 μm avec un point à moins de 5 à 10 μm de la surface de l’organe, du tissu ou de la cellule et le deuxième point à 20 à 100 μm de distance. La différence de magnitude des tensions entre les deux points est calculée pour obtenir un gradient de tension24,25,26, qui est ensuite utilisé pour calculer le gradient de concentration et par la suite le flux net en utilisant la loi de Fick24,27. Cette méthode est utile pour évaluer le transport d’ions spécifiques à travers différentes régions de l’intestin de l’insecte et des MT, ou à des moments spécifiques après une exposition à la farine de sang ou à un traitement. Par exemple, le SIET peut être utilisé pour comprendre comment les processus absorbants et sécrétoires dans le système excréteur des moustiques sont régulés par les hormones28 ainsi que par différents comportements alimentaires et conditions d’élevage25. Des travaux antérieurs utilisant le SIET ont révélé des sites impliqués dans le transport d’ions le long des papilles anales et du rectum des larves et des moustiques adultes24,28. Le protocole actuel, décrit précédemment par Paluzzi et ses collègues26, mesure le flux de Na+ à travers l’épithélium rectal du rectum féminin adulte (Figure 2).

Le dernier segment du système excréteur de moustiques nécessite un mouvement musculaire coordonné pour aider à mélanger les aliments et à sécréter des déchets26. Les produits non absorbables de la digestion de l’intestin moyen, ainsi que l’urine primaire sécrétée par les MT, sont passés à travers la valve pylorique et livrés à l’intestin postérieur2. Les contractions spontanées de l’intestin postérieur commencent au niveau de la valve pylorique et se produisent dans les ondes péristaltiques, qui sont relayées sur l’iléon par la contraction coordonnée des muscles circulaires et longitudinaux entourant la surface basale des cellules épithéliales26. Enfin, les muscles du rectum aident à propulser et à éliminer les déchets à travers le canal anal. Bien que la motilité de l’intestin postérieur des insectes soit myogénique, nécessitant du Ca2+ extracellulaire pour produire des contractions spontanées, ces processus peuvent également être régulés par voie neuronale26,29,30. Cette régulation exogène par le système nerveux est importante après l’alimentation, car l’animal doit expulser les déchets de l’intestin et rétablir l’équilibre de l’hémolymphe31. Par conséquent, la réalisation de tests biologiques in vitro pour identifier les neuropeptides myostimulants ou myoinhibitory est utile pour évaluer comment les neurochimiques influencent la motilité de l’intestin postérieur. Le protocole actuel, réalisé par Lajevardi et Paluzzi28, utilise des enregistrements vidéo pour examiner la motilité iléale en réponse aux neuropeptides (Figure 3). De même, un capteur de force ou un convertisseur d’impédance peut également être utilisé pour observer des traces de contractions via un logiciel d’acquisition de données32,33. Cependant, l’utilisation de la technologie vidéo nous permet d’évaluer visuellement l’organe et d’analyser davantage en utilisant un sous-ensemble de paramètres pour identifier le rôle des hormones sur la motilité de l’intestin postérieur.

L’utilisation de ces techniques peut aider à caractériser les facteurs qui régulent et coordonnent le transport des fluides et des ions le long du système excréteur ainsi que la motilité de l’intestin postérieur. Il est important de noter qu’un lien fonctionnel entre la réponse diurétique des MT et la motilité de l’intestin postérieur est soutenu, car les hormones diurétiques, telles que DH31 et 5HT, caractérisées par leur capacité à stimuler la sécrétion de liquide par les MT, présentent également des actions myotropes le long de l’intestin postérieur du moustique21,34,35 . Ces résultats soulignent l’importance d’une coordination rigoureuse entre les MT et l’intestin postérieur lors d’événements tels que la diurèse post-prandiale chez les insectes nécessitant une élimination rapide des déchets.

Ici, l’approche détaillée derrière la technique de dosage de Ramsay pour mesurer le taux de sécrétion de liquide chez le moustique, A. aegypti, et l’utilisation de microélectrodes sélectives d’ions pour déterminer les concentrations de Na + dans le fluide sécrété des MT sont décrites, ce qui, lorsqu’il est combiné, permet de déterminer les taux de transport transépithélial des ions. De plus, la technique d’électrode sélective d’ions à balayage et les tests de contraction de l’intestin postérieur sont décrits pour mesurer respectivement le flux ionique et la motilité, ce qui aide à élucider la régulation hormonale de l’intestin postérieur (Figure 4).

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Protocol

1. Faire des plats doublés de silicone

REMARQUE: Cette étape doit être effectuée avant les expériences. Ces plats seront préparés pour préparer le plat d’essai pour les dissections et pour les expériences de dosage de contraction.

  1. Préparez le silicone à l’aide d’un kit d’élastomère de silicone en suivant les recommandations du fabricant. Mélanger les composants liquides en deux parties dans un rapport de 10 à 1. Mélanger doucement et soigneusement en inversant mais assurez-vous de minimiser la formation de bulles.
  2. Versez l’élastomère de silicone dans des boîtes de culture de polystyrène jetables standard de 60 mm à une profondeur normale comprise entre 7 et 9 mm. Préparez autant de plats que nécessaire. Retirez toutes les bulles d’air à l’aide d’une fine broche sous un microscope peu de temps après avoir versé du silicone dans la vaisselle. Placer les plats dans une chambre ou une armoire sans poussière à température ambiante (RT) pendant au moins 48 h ou au four à 50 °C pendant environ 4 h pour durcir (durcir) (Figure 5A).

2. Faire le plat du test Ramsay

REMARQUE: Le plat peut être réutilisé d’expérience en expérience, donc, répétez cette étape uniquement si le plat est endommagé ou se casse. Un plat séparé est utilisé pour les dissections.

  1. À l’aide d’un scalpel (avec des précautions tranchantes standard), créez des puits dans l’une des boîtes de Petri recouvertes de silicone pour préparer le plat d’essai, en retirant suffisamment de silicone, environ ~ 5 mm, du haut du plat (cela devrait tenir ~ 20 μL de gouttelette de bain). Avant cela, utilisez un marqueur permanent pour marquer les positions sous le plat afin de noter où faire les puits. Les puits doivent être espacés d’environ 1 cm, avec un diamètre d’environ ~4 mm pour permettre à l’extrémité distale du tubule de s’adapter. Chaque puits contiendra un tubule sécrétant du fluide, donc un plat contenant 20 puits permettra d’analyser jusqu’à 20 MT par expérience.
  2. Pour préparer les broches Minutien, placez les broches en acier inoxydable de 0,1 mm en rangée sur un morceau de ruban d’étiquetage, perpendiculairement à l’axe de la bande. À l’aide de ciseaux, coupez le long de la bande, en créant des moitiés égales des broches. Utilisez une demi-épingle pour chaque puits.
  3. À l’aide d’une pince émoussée, insérez chaque demi-épingle dans le plat de dosage recouvert de silicone, à côté de chaque puits. Selon la longueur du tubule d’insecte, insérez la demi-épingle à une distance qui permettra à l’extrémité distale du tubule de s’immerger dans la solution saline de bain et à l’extrémité proximale pour s’enrouler autour de l’épingle. Cette étape peut être effectuée au microscope pour visualiser facilement les puits. Les broches peuvent être réutilisées, cependant, remplacez la demi-broche si elle est endommagée ou perdue. (Figure 5B)

3. Fabrication du plat SIET enduit de poly-L-lysine

REMARQUE: Cette étape est importante pour que l’organe adhère au fond de la boîte pendant les mesures SIET en veillant à ce que le site de mesure reste le même pour chaque échantillon. La préparation de ces plats doit être faite au moins 2 jours avant les expériences. Chaque plat ne doit être utilisé qu’une seule fois lors de l’application d’un traitement spécifique. Éliminer après chaque échantillon ou si la couche de poly-L-lysine est rayée ou endommagée.

  1. Pour chaque échantillon, placez une boîte de Petri de 35 mm sur une surface plane. Retirer les couvercles et pipeter 70 μL de poly-L-lysine (0,1 mg/mL) au centre de chaque plat. Remettez les couvercles et laissez la poly-L-lysine sécher (~48 h) sans être dérangée.
  2. Une fois sec, marquez le fond du plat avec un cercle décrivant la couche de poly-L-lysine séchée pour mieux visualiser où l’organe excisé doit être placé après les dissections. Si nécessaire pour minimiser les volumes de solution saline et de solutions de traitement dans les expériences, utilisez un pistolet à colle chaude pour encercler le revêtement en poly-L-lysine, en laissant suffisamment d’espace pour que l’électrode se déplace et prenne des mesures de fond (~ 20-25 mm de diamètre du cercle collé suffit). Ces plats enrobés peuvent être conservés indéfiniment à TA (Figure 5C).

4. Préparation des plats de Ramsay et de dosage de contraction pour les expériences

REMARQUE: Le plat peut être réutilisé (à condition d’un lavage approprié pour éliminer les solutions salines / traitements précédemment utilisés), donc ne répétez cette étape que si la plaque est endommagée ou se casse. Un plat séparé est utilisé pour les dissections. Cette étape est effectuée le jour de l’expérience.

  1. Pour le plat de dosage de contraction, utilisez un scalpel (avec des précautions tranchantes standard), créez des puits dans l’une des boîtes de Petri recouvertes de silicone pour préparer le plat d’essai. Inclinez le scalpel de manière à ce que les puits deviennent en forme de triangle pour faciliter l’épinglage du tissu disséqué sur les bords. Les puits doivent être assez grands pour contenir jusqu’à 250 μL et s’adapter à l’ensemble du canal alimentaire (plutôt que de creuser trop profondément, élargissez le puits à environ 0,5 à 1 cm) (figure 5D).
  2. Pour la plaque Ramsay, utilisez une pipette et remplissez les puits jusqu’à 20 μL de solution (18 μL de solution saline 1X Aedes : milieu de Schneider préparé à l’étape 5.2, et 2 μL d’hormone/médicament). Pour les témoins non stimulés, remplissez les puits avec 20 μL de solution saline 1X Aedes : milieu de Schneider. Une fois tous les puits remplis, versez de l’huile minérale hydratée dans le plat d’essai jusqu’à ce que les puits et les épingles Minutien soient submergés. Utilisez une pointe de pipette de 20 μL pour faire éclater ou éliminer les bulles d’air qui pourraient interférer avec les gouttelettes sécrétées.

5. Préparer des solutions

  1. Préparez 2X Aedes aegypti solution saline et 10x de glucose, comme décrit dans le tableau 1, adapté de Petzel et ses collègues36. Les solutions mères doivent être conservées à 4 °C. Préparer des stocks de travail de 1X Aedes aegypti saline (Tableau 1) et conserver à 4 °C. Le jour de l’expérience, laissez les stocks de travail arriver à RT avant utilisation. Préparez-vous frais s’il y a des signes de croissance fongique ou bactérienne.
  2. Pour préparer la gouttelette de bain, mélanger la solution saline Aedes (à partir de l’étape 5.1) avec le milieu de Schneider, dans un rapport de 1:1. Préparez-vous en petites aliquotes, en fonction de la quantité nécessaire. Conservez le milieu de Schneider au réfrigérateur, jetez-le s’il y a des signes de croissance fongique ou bactérienne. (Cette étape doit être effectuée le jour de l’expérience).
  3. Pour les mesures de flux de Na+ à l’aide du SIET, préparez une solution saline Aedes modifiée sans Ca2+ (tableau 2), comme décrit précédemment26.

6. Mt/mT et dissections de l’intestin postérieur

  1. Pour les dissections de moustiques adultes, recueillir la nymphe dans un petit bécher et placer dans un bocal contenant une solution de saccharose pour l’alimentation. Pour déterminer l’âge du moustique, isolez les moustiques éclos et placez-les dans un bocal différent en notant l’âge et le sexe des moustiques pour de futures dissections.
  2. Placez brièvement les moustiques à disséquer sur un tampon de CO2 et attendez que vous ne répondiez plus. À l’aide de pinces fines, ramassez le moustique de sa jambe ou de son aile et placez-le sur un plat disséquant recouvert d’élastomère de silicone préparé à l’étape 1. Placez le moustique d’un côté (côté latéral vers le haut) et, à l’aide d’une épingle Minutien, empalez-le dans le thorax pour le maintenir en place. En option, retirez les ailes et les pattes des moustiques pour faciliter la dissection.
  3. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez une goutte de solution saline RT Aedes pour immerger complètement le moustique dans une solution saline. Assurez-vous que la dissection est entièrement sous solution saline (voir le tableau 1 pour la fabrication de la solution saline Aedes ).
  4. Placez la parabole disséquante sous un microscope stéréoscopique. Pincez le dernier segment abdominal avec une pince fine et éloignez-vous lentement du moustique. Cette étape est facilitée par l’observation simultanée au microscope. L’intestin moyen, attaché avec les MT et l’intestin postérieur, doit être exposé (figure 6).
  5. Pour le test de Ramsay, retirez soigneusement chaque tubule de la jonction intestin-intestin moyen, en veillant à ne pas endommager les organes. Utilisez des pinces fines pointues pour retirer les tubules individuellement – n’utilisez pas de tubules endommagés pour le test. (Voir l’étape 7 pour la configuration.)
  6. Pour le SIET, disséquez l’intestin postérieur dans une solution saline Aedes sans Ca2+ (étape 5.3). Assurez-vous que la boîte à poly-L-lysine a également un volume fixe de solution saline Aedes sans Ca2+. Retirez soigneusement la cuticule du rectum et placez l’intestin postérieur (peut enlever tout autre organe attaché, selon ce qui est mesuré) dans le plat de poly-L-lysine. Si vous mesurez le transport ionique le long de l’épithélium rectal, positionnez le côté orienté vers l’hémolymphe d’au moins un coussinet rectal pour qu’il soit accessible à la microélectrode (figure 7).
    1. À l’aide de pinces pour saisir l’extrémité la plus postérieure, ramenez l’intestin postérieur au fond du plat (sans endommager les structures qui seront mesurées). Dès que l’organe touche la couche de poly-L-lysine, il adhère. Cet échantillon disséqué est prêt pour les mesures. (Voir les étapes 14 à 16 pour la configuration et les mesures SIET.)
  7. Pour le test de contraction de l’iléon, assurez-vous que l’intestin postérieur reste attaché à l’intestin moyen pendant la dissection (Figure 4D). Retirez soigneusement les MT pour avoir une vue sans entrave de l’intestin postérieur. Cet organe sera transféré dans un nouveau plat préparé comme décrit à l’étape 4.1. (Voir l’étape 17 pour obtenir des vidéos de dosage.)

7. Mise en place du test Ramsay

  1. À l’aide de la pointe de la pince, soulevez soigneusement l’extrémité proximale (ouverte) du tubule en la drapant sur la pince (ne pincez pas le tubule) et transférez-la dans un puits du plat d’essai. Cette étape peut également être effectuée à l’aide de sondes en verre fin.
  2. Une fois le tubule immergé dans le puits, ramassez l’extrémité proximale du tubule avec la pince, retirez-la de la gouttelette de bain et enroulez l’extrémité autour de l’épingle. Enroulez le tubule autour de l’épingle deux fois – et gardez la longueur du tubule restant dans la gouttelette de bain cohérente avec les autres tubules. À ce stade, l’extrémité distale du tubule doit être dans la gouttelette de bain, tandis que l’extrémité proximale enroulée autour de l’épingle loin de la gouttelette de bain permettant au liquide sécrété de s’accumuler sur l’extrémité de l’épingle à partir de l’extrémité proximale ouverte.
  3. Immédiatement après que le tubule est enroulé autour de l’épingle, notez les puits (p. ex., A, B, C), l’heure (qui sera l’heure de début du moment où le liquide commencera à être sécrété par le tubule) et toute autre information d’identification (p. ex., hormone, génotype, etc.).
  4. Chaque moustique a cinq tubules, répétez donc les étapes 7.1-7.3 avec le reste des tubules. Pour les traitements de contrôle et expérimentaux, divisez les cinq tubules dans les différents traitements. Continuez avec la dissection suivante, jusqu’à ce que tout le plat d’essai soit rempli. Avec de la pratique, cette technique devrait prendre généralement 2 à 3 minutes pour disséquer les tubules, les transférer dans la solution saline de bain et envelopper autour de l’épingle, créant ainsi une différence de 2 à 3 minutes dans le temps de début entre chaque tubule.
    REMARQUE: Avant de commencer l’expérience, calibrez le micromètre oculaire du microscope avec un micromètre d’étage sous l’objectif sélectionné. Les gouttelettes sécrétées sont systématiquement mesurées sous un grossissement total de 40 à 50x.
  5. Après le temps d’incubation alloué, la gouttelette sécrétée peut être mesurée. À l’aide du micromètre oculaire du microscope, mesurez et enregistrez le diamètre de la gouttelette sécrétée. Calculer le diamètre (d) de la gouttelette sécrétée en multipliant le diamètre de l’unité oculaire mesuré par la conversion d’étalonnage (tableau 3). Calculer le volume de la gouttelette sécrétée à l’aide de l’équation V = πd3/6.
  6. Pour calculer le taux de sécrétion (nL min-1), utilisez l’équation, taux de sécrétion de fluide = V/temps de sécrétion, où V est le volume de la gouttelette sécrétée calculé à l’étape 7.5, et le temps de sécrétion fait référence à la période d’incubation du tubule.

8. Configuration de l’ISME

  1. Placez des micromanipulateurs de chaque côté du stéréomicroscope pour configurer la station ISME. Le chlorage des fils d’argent peut être réalisé en immergeant dans une solution de chlorure ferrique et enfilant chaque fil d’argent dans chacun des supports de microélectrode (ou en soudant les fils sur les câbles coaxiaux, si nécessaire). Répétez cette étape chaque fois que les fils d’argent ne sont pas chlorés.
  2. Connectez les fils d’argent à un amplificateur, qui lira à un système d’acquisition de données. Configurez et calibrez le système conformément aux instructions du fabricant. En cas d’interférence électrique accrue, utilisez une cage de Faraday correctement mise à la terre.

9. Préparation des microélectrodes pour l’ISME et le SIET

  1. À l’aide d’un extracteur de pipette P-97 Flaming Brown, tirez ~5–6 capillaires en verre borosilicate non stratifié (diamètre extérieur 1,5 mm, diamètre intérieur 1,12 mm, longueur 100 mm) avec une pointe de 1–5 μm. Ceux-ci seront utilisés comme microélectrodes sélectives d’ions. Pour les microélectrodes SIET, l’électrode résultante doit avoir une ouverture de pointe d’environ 5 μm, caractérisée par une tige courte.
  2. Dans une hotte, placez les microélectrodes sur une plaque chauffante (en déposant soigneusement pour ne pas casser les extrémités des électrodes). Ajouter le dichlorodiméthylsilane à l’intérieur d’une boîte de Petri en verre de 15 cm et inverser les électrodes sur la plaque chauffante. Utilisez le dichlorodiméthylsilane pour silaniser les électrodes sélectives d’ions en ajoutant une couche hydrophobe à toutes les surfaces de l’électrode, ce qui lui permet de retenir l’ionophore hydrophobe37. Les électrodes silanisées inutilisées peuvent être laissées pendant quelques semaines; par conséquent, cette étape est effectuée toutes les quelques semaines, ou pour les électrodes nouvellement tirées.
    REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous manipulez du dichlorodiméthylsilane – inflammable, corrosif et toxique, voir FS pour une manipulation sûre.
    1. Tournez la plaque chauffante à 350 °C et laissez-la en place pendant 75 min. Utilisez un rapport de 1:2 du nombre de microélectrodes au volume (μL) de dichlorodiméthylsilane à ajouter sur la boîte de Petri en verre. Ainsi, pour 10 microélectrodes, ajoutez 20 μL de dichlorodiméthylsilane.
  3. Après 75 min, éteignez la plaque chauffante. Une fois les électrodes et la plaque chauffante refroidies, retirez la boîte de Petri en verre et transférez les électrodes (avec pince) dans une boîte de stockage avec de l’argile de moulage. Assurez-vous que l’extrémité de l’électrode pointe vers le haut pour éviter tout dommage.
  4. Pour fabriquer les électrodes de référence pour l’ISME, tirez ~4–5 tubes capillaires en verre borosilicate filamenté (diamètre extérieur 1 mm, diamètre intérieur 0,58 mm, longueur 100 mm). Ces électrodes n’ont pas besoin d’être silanisées. Étiquetez et conservez dans une boîte similaire, en évitant tout dommage à la pointe.
  5. Les électrodes de référence SIET sont fabriquées à partir de capillaires en verre standard (diamètre extérieur 2 mm, diamètre intérieur 1,12 mm, longueur 102 mm). Les capillaires sont remplis de gélose fondue de 1 M KCl + 3% et doivent être stockés dans un tube de centrifugation de 50 mL contenant 1 M KCl (complètement immergé) jusqu’à utilisation. Ils peuvent être utilisés à plusieurs reprises jusqu’à ce que des bulles commencent à se former ou si la gélose se brise. S’il y a de l’espace d’air, jetez le verre et utilisez-en un nouveau pour vous assurer que le circuit est complet.

10. Préparation des seringues de remblayage

REMARQUE: Cette étape est effectuée pour créer des seringues à pointe fine pour remplir les électrodes pour ISME.

  1. Utilisez une seringue à pointe glissante de 1 mL avec une aiguille jetable. Jetez l’aiguille et retirez la seringue jusqu’à la marque de 1 mL. Sous la fumière, allumez le brûleur Bunsen et chauffez la pointe en plastique de la seringue jusqu’à ce qu’elle commence à fondre. À l’aide d’une vieille pince, pincez soigneusement l’embout de la seringue fondue et tirez vers le bas pour étirer l’embout.
  2. À l’aide de ciseaux, coupez la pointe fondue à la longueur souhaitée, en laissant le diamètre suffisamment petit pour tenir à l’intérieur des électrodes (voir schéma). Une fois la seringue refroidie, testez la pression de la seringue avec de l’eau pour vous assurer qu’il n’y a pas de blocage. Créez-en un pour chaque solution de remblai requise et étiquetez-en conséquence (Figure 8).

11. Remplissage de la microélectrode sélective d’ions et de référence pour ISME et SIET

REMARQUE: La microélectrode peut être réutilisée tant qu’elle fonctionne encore (calibrer avant chaque expérience). Pour l’ISME, cette étape peut être effectuée pendant que les MT sont incubés dans le test de Ramsay.

  1. Pour fabriquer une microélectrode sélective Na+, utilisez la seringue de 1 mL créée à l’étape 10 pour remplir l’électrode avec 100 mM de NaCl. Assurez-vous que la solution de remblai se remplit jusqu’à l’extrémité de l’électrode. Si des bulles d’air apparaissent, faites glisser doucement la microélectrode ou retirez la solution et remplissez-la à nouveau. Cela devrait être fait sous un microscope stéréoscopique pour mieux visualiser.
  2. Sous un microscope stéréoscopique, trempez une pointe de pipette de 10 μL dans la solution d’ionophore sélective Na+. Alignant l’électrode perpendiculairement à la pipette, placez un doigt ganté sur le bas de la pointe pour créer une pression et expulser une petite goutte d’ionophore. En regardant sous un objectif élevé d’un microscope, touchez soigneusement la goutte d’ionophore à la pointe de la microélectrode, en évitant de casser la pointe. Normalement, les microélectrodes sont remplies vers l’avant avec une longueur de colonne de cocktail d’ionophore comprise entre 150 et 300 μm, jusqu’à ce que la bordure de la solution d’ionophore / remblai soit plate.
    ATTENTION : Cet ionophore est toxique, voir FS pour une manipulation sécuritaire.
  3. Dans un petit bécher, remplir à mi-chemin avec 100 mM de NaCl et placer de la pâte à modeler à l’intérieur en haut du bécher. Une fois l’ionophore Na+ pris, placez l’électrode sur la paroi du bécher, en laissant la pointe reposer dans le NaCl de 100 mM, et gardez ISME dans le bécher jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
  4. Pour fabriquer l’électrode de référence ISME, remplissez une électrode de 500 mM KCl en veillant à ce que la solution soit remplie jusqu’à la pointe (suivez le même protocole que ci-dessus). Conservez le KCl dans un bécher.

12. Électrodes d’étalonnage pour ISME

REMARQUE: Cette étape est effectuée juste avant de prendre des mesures du fluide sécrété (~ 10-15 min avant). Des étalonnages doivent être effectués toutes les ~5-6 mesures pour s’assurer que la pente est cohérente.

  1. Enduire les extrémités de l’électrode à l’aide d’une solution d’environ 3,5% (p / v) de chlorure de polyvinyle dissous dans le tétrahydrofurane, pour éviter le déplacement de l’ionophore lorsqu’il est immergé dans de l’huile de paraffine.
    ATTENTION : Ceci est inflammable, voir FS pour une manipulation sécuritaire.
  2. Pour calibrer l’électrode Na+ , placez des gouttelettes de 10 μL des concentrations étalons de NaCl suivantes sur le bord de la parabole Ramsay avec les MT incubés : 200 mM de NaCl et 20 mM + 180 mM de LiCl. Placez les gouttelettes standard à environ 2 cm l’une de l’autre, avec la concentration la plus élevée sur le dessus.
  3. Insérez à la fois l’électrode de référence et l’électrode sélective d’ions sur les fils d’argent chlorés et fixez-les solidement à l’aide de porte-électrodes fixés à des micromanipulateurs. Faites naviguer les deux électrodes vers la gouttelette de NaCl de 200 mM à l’aide des micromanipulateurs, en veillant à ce que les extrémités des électrodes ne touchent pas le fond de la parabole. Allumez l’électromètre pour commencer l’enregistrement et permettre à la lecture de se stabiliser.
  4. Enregistrez la lecture et passez à la norme suivante (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Calculez la pente, et si la lecture de l’électrode est stable et que la pente est à portée, utilisez l’électrode pour les mesures de gouttelettes sécrétées. Si la lecture est instable, ne donne pas un enregistrement ou une pente appropriée, ou prend un certain temps pour s’équilibrer, préparez une nouvelle électrode sélective d’ions ou cassez l’extrémité même de l’électrode de référence en faisant passer un tissu à travers la pointe. La pente pour Na+ devrait être d’environ 58–60 mV38, bien qu’une plage acceptable soit de 50–60 mV.

13. Enregistrements et calculs ISME

  1. Après avoir mesuré le taux de sécrétion de fluide (voir étape 7.7), déplacez soigneusement l’électrode de référence et l’électrode sélective d’ions dans la gouttelette sécrétée à l’aide des micromanipulateurs. Activez l’enregistrement et laissez la lecture se stabiliser et enregistrer la valeur. Répétez cette étape pour les autres gouttelettes (répétez les mesures d’étalonnage toutes les ~5–6 mesures).
  2. Les concentrations de cations sont calculées à l’aide de l’équation décrite précédemment22,38, [ion] = [C] x 10ΔV/m, où [C] est la concentration en mmol L-1 de la solution d’étalonnage utilisée pour étalonner l’ISME, ΔV est le changement de tension entre la tension enregistrée à partir de la gouttelette de fluide sécrétée et la tension de la même solution d’étalonnage, et m est la différence de tension entre les deux étalonnages standard, qui est aussi la pente.

14. Configuration SIET

REMARQUE: Le système SIET a été décrit précédemment27,39. Pour réduire le bruit de fond, une cage de Faraday est installée autour du microscope optique et de la scène de tête. Les expériences présentées dans cet article utilisent les paramètres suivants du logiciel Automated Scanning Electrode Technique (ASET) 2.0 : une période d’attente de 4 secondes pour permettre aux gradients d’ions de se rétablir complètement après les mouvements de microélectrodes, avec une tension enregistrée pendant 0,5 s après la période d’attente, une distance d’excursion de 100 μm et trois répétitions pour chaque enregistrement. Certains paramètres peuvent être modifiés par l’utilisateur dans ASET, selon les besoins.

  1. Allumez l’amplificateur ionique/polarographique IPA-2, le microscope optique (avec une caméra vidéo connectée) et le ou les ordinateurs connectés à chacun de ces ASET et cellSens en cours d’exécution.
  2. Préparer les microélectrodes et les électrodes de référence décrites aux étapes 9.1–9.3, 9.5, 10 et 11.1–11.3. La microélectrode sélective d’ions contiendra de l’ionophore Na+ avec un remblai de 100 mM de NaCl et l’électrode de référence (avec les ponts de gélose) sera toujours remplie de 3 M KCl.
  3. Placez la microélectrode sélective Na+ sur un support constitué d’un fil de chlorure d’argent (AgCl) et fixez-la dans une prise de connecteur femelle. À l’aide d’une seringue, remplissez le porte-électrode de référence avec 3 M KCl frais (peut être fabriqué avant le jour de l’expérience et stocké à RT).
    REMARQUE: Après les expériences, lavez le porte-électrode de référence avec du ddH2O.
  4. Retirez une électrode de référence du bécher contenant toutes les électrodes de référence immergées dans 3 M KCl, en plaçant un doigt à une extrémité et en inclinant le capillaire en verre vers ce doigt pour empêcher la gélose de tomber. Placez soigneusement une extrémité dans le support, en vous assurant qu’aucune bulle ne se forme. S’il y a une bulle, retirez l’électrode de référence, remplissez à nouveau le support avec plus de 3 M KCl et répétez. Placez le porte-électrode dans la prise de connexion femelle.

15. Électrodes d’étalonnage pour SIET

  1. Pour les mesures Na+ , utilisez des solutions NaCl 150 mM et 15 mM NaCl + 135 mM LiCl24. Il devrait y avoir une différence de 10 fois dans les concentrations de Na+ entre les deux solutions, englobant la plage des niveaux de Na+ (20 mM) dans la solution saline (tableau 2).
  2. Stockez les solutions d’étalonnage à RT dans un tube de centrifugeuse de 50 mL et aliquote dans une boîte de Pétri lors de la réalisation de l’expérience. Cette aliquote est éliminée à la fin de la journée. S’il y a des signes de contamination dans les solutions mères, éliminez et fabriquez des solutions fraîches.
  3. Pour calibrer, aliquotez les deux solutions d’étalonnage (étape 15.1) dans des boîtes de Petri individuelles de 35 mm et placez-les sur la scène du microscope. À l’aide des boutons de réglage manuel qui contrôlent les moteurs pas à pas avec « désactiver » sélectionné sur l’unité de commande de mouvement de l’ordinateur, assurez-vous que la pointe de la microélectrode est placée à l’intérieur de la solution d’étalonnage. Ne submergez pas la pointe trop loin, car elle pourrait se briser. Si la pointe se casse, préparez une nouvelle microélectrode sélective d’ions et recalibrez-la.
    1. Sur l’ordinateur connecté à l’amplificateur, ouvrez le logiciel ASET. Ouvrez Paramètres d’étalonnage. Sélectionnez Nernst Slope pour le type d’étalonnage, réglez l’échantillon pendant 3 secondes et entrez les concentrations des solutions d’étalonnage. Par exemple, pour les mesures Na+ , entrez 150 mM dans la solution 1, placez la pointe de microélectrode sélective Na+ et l’électrode de référence à l’intérieur de cette solution d’étalonnage. La lecture de tension sur l’amplificateur doit être stable. Cliquez sur Solution 1, attendez que la tension (en mV) soit enregistrée. Ensuite, placez la microélectrode et l’électrode de référence à l’intérieur de la solution 15 mM NaCl + 135 mM LiCl, entrez 15 mM dans la solution 2 et cliquez sur Solution 2 pour obtenir la lecture de tension. La pente sera la différence entre ces deux tensions, calculée dans ces paramètres. Après l’étalonnage, cliquez sur OK.
    2. Les pentes des microélectrodes sélectives Na+ pour un changement décuplé de la concentration en ions devraient être d’environ 59,0 ± 1,624. Si la pente de Nernst s’écarte fortement de cette plage, préparez une nouvelle microélectrode ou aliquote de nouvelles normes (car elles peuvent être contaminées). L’étalonnage est nécessaire avant tous les 2 à 3 échantillons, en fonction de la stabilité de la tension. Si la tension devient instable et commence à fluctuer, préparez une nouvelle microélectrode sélective d’ions.

16. Mesures SIET

REMARQUE: L’interrupteur du moteur de l’unité de commande de mouvement de l’ordinateur doit toujours être commuté sur Désactiver, sauf lors de la manipulation de l’électrode à l’aide de touches d’ordinateur via ASET, ou pendant les enregistrements de mesure (à ce moment-là, la clé doit être commutée sur Activer).

  1. Après l’étalonnage, disséquer l’organe (voir étape 6.6). Placez la boîte de poly-L-lysine avec l’échantillon disséqué sur l’étage du microscope et insérez la pointe de l’électrode de référence à l’intérieur de la solution saline. Immergez la pointe de la microélectrode sélective d’ions dans la solution saline en prenant soin de ne pas casser la pointe.
  2. Utilisez les boutons de réglage manuel pour régler la position de la microélectrode tout en regardant sous le microscope optique. Ajustez la position verticale de la microélectrode de manière à ce que son extrémité soit sur le même plan que l’organe ou le tissu. Une fois à la position souhaitée, tournez le commutateur du moteur sur Activer. À ce stade, les moteurs pas à pas ne peuvent être utilisés qu’à l’aide du logiciel informatique.
  3. À l’aide des touches fléchées de l’ordinateur, déplacez la microélectrode horizontalement dans une position située à 3 mm du tissu pour mesurer les enregistrements d’arrière-plan. Insérez des notes en appuyant sur F2. Lorsque vous êtes prêt, commencez à enregistrer (en appuyant sur F5). Obtenez cinq mesures de l’activité de fond. L’activité moyenne de la tension de fond pour chaque échantillon sera soustraite des gradients de tension mesurés le long du tissu pour le même échantillon.
  4. Déplacez la pointe de la microélectrode près du tissu, en prenant soin de ne pas percer l’organe. Réduisez la sensibilité de la touche pour placer la pointe de la microélectrode de 2 μm directement vers la droite, perpendiculairement au tissu. Obtenez trois enregistrements à chaque site le long du coussinet rectal pour identifier le site de la plus grande activité ionique. Obtenir des mesures de base de la solution saline sur le site affichant la plus grande activité (le site « hotspot »).
  5. Réglez le moteur sur Désactiver et ajoutez le traitement approprié dans la boîte pour obtenir la dose finale souhaitée. Après l’application, créez une nouvelle note (c.-à-d. le nom du traitement et la dose), retournez le moteur sur Activer et prenez des enregistrements de tension à l’aide de F5. Si l’objectif est d’observer les changements au fil du temps, continuez à prendre des mesures à des intervalles de temps spécifiques. Plusieurs protocoles peuvent être créés pour des applications spécifiques à l’aide du SIET, en fonction de l’objectif du chercheur.
  6. Regardez le logiciel ASET enregistrer la tension sur le site le long du tissu et la soustraire de la tension à une distance d’excursion (Figure 7) de 100 μm du tissu. Étant donné que le premier enregistrement est effectué au niveau du tissu, une différence de tension positive indique que la tension est plus élevée au niveau de l’épithélium (tissu) (figure 7A) que loin de l’épithélium (figure 7B), et donc le cation est absorbé. Un gradient de tension négatif est révélateur de la sécrétion de cations.
  7. Obtenez à nouveau des enregistrements de fond après le traitement (à 3 mm de distance) et utilisez-les lors du calcul du flux ionique après le traitement. Faites un ensemble d’enregistrements en arrière-plan en « baseline » et un ensemble après le traitement. Réglez le moteur sur Désactiver chaque fois que la microélectrode n’est pas réglée avec les touches de l’ordinateur ou lorsque la tension n’est pas enregistrée. Exportez les données dans un fichier texte et ouvrez-les à l’aide d’Excel pour effectuer tous les calculs.
  8. Calculer le flux ionique à l’aide des équations décrites précédemment24,26. Le flux ionique net pour chaque traitement peut être exprimé sous la forme d’un changement absolu par rapport aux mesures de base du flux ionique. Pour vérifier l’importance des résultats, un contrôle du véhicule (c.-à-d. l’ajout d’une solution saline seule dans la boîte au lieu d’un traitement) peut être utilisé. Les changements dans le transport des ions après le traitement hormonal doivent être évalués par rapport à tout changement dans la réponse à ce contrôle.

17. Tests de contraction de l’intestin postérieur

  1. Remplir l’un des puits de la boîte décrite à l’étape 4.1 avec un volume connu de solution saline Aedes (étape 5.1). Après la dissection (étape 6.7), transférer soigneusement l’intestin postérieur disséqué attaché à l’intestin moyen au puits de l’autre plat, en veillant à ne pas pincer l’organe examiné (iléon). Immergez l’intestin dans la solution saline à l’intérieur du puits et placez les épingles De Minutien dans l’intestin moyen et le rectum. Ce faisant, l’iléon ne doit pas être sous tension et des contractions spontanées, provenant de la valve pylorique de l’iléon antérieur, doivent être observées.
  2. Connectez une caméra vidéo à un microscope stéréoscopique et enregistrez des vidéos à l’aide d’un logiciel de capture vidéo (par exemple, INFINITY CAPTURE de Luminera). Placez le plat contenant l’organe disséqué sous le microscope et enregistrez pendant 2 min. Ce sera la condition « Baseline ».
  3. Ajoutez un volume connu de solution saline 1X Aedes (étape 5.1) au puits pour tenir compte de tout changement dans la motilité iléale lors de l’augmentation du volume dans le puits. Attendez 1 min après l’application, puis enregistrez à nouveau pendant 2 min. C’est la condition « saline ».
  4. Ajouter un volume connu de traitement (à partir d’une concentration de stock 10x pour obtenir la dose souhaitée dans le puits). Attendez 1 min après l’application, puis enregistrez à nouveau pendant 2 min. Ce sera la condition de « traitement ».
  5. Enregistrez toutes les vidéos et convertissez-les en MP4. Pour analyser, comptez le nombre de contractions dans les intervalles de 2 minutes (définis comme une onde péristaltique s’initiant au niveau de la valve pylorique et s’étendant sur tout l’iléon). Divisez ce nombre par 2 min pour obtenir le taux de contraction. D’autres paramètres peuvent également être évalués, tels que la contraction ou la durée de relaxation. Après la collecte des données brutes, exprimez chaque paramètre par rapport aux données pour les conditions de « référence » pour chaque échantillon. Tracez le changement de pli pour la « solution saline » et le « traitement » par rapport à la « ligne de base ».

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Representative Results

L’application de DH31 contre les MT non stimulées entraîne une augmentation significative du taux de sécrétion de liquide, confirmant son rôle en tant qu’hormone diurétique chez les moustiques Aedes (Figure 1A). Lorsque les tubules sont traités avec AedaeCAPA-1, une réduction du taux de sécrétion est observée dans les MT stimulés par DH31. La figure 1B montre l’utilisation d’électrodes sélectives d’ions pour mesurer les concentrations de Na+ dans les gouttelettes sécrétées. Le traitement du DH31 sur les MT n’a eu aucun effet sur la concentration de Na+ dans la gouttelette sécrétée; cependant, avec l’application d’AedaeCAPA-1, la concentration de Na+ dans le fluide sécrété a été significativement augmentée. De plus, par rapport aux témoins non stimulés, le DH31 a entraîné un taux de transport de Na+ significativement plus élevé, tandis que aedaeCAPA-1 a aboli cette augmentation des tubules stimulés par le DH31 (Figure 1C). Ensemble, ces résultats d’échantillons démontrent comment les taux de sécrétion de liquide après l’application d’hormones diurétiques et anti-diurétiques peuvent être mesurés ainsi que la concentration d’ions dans les gouttelettes sécrétées. Des femelles âgées de trois à six jours ont été disséquées et entre 23 et 35 MT ont été analysées pour l’expérience. Les différences ont été désignées comme statistiquement significatives si p < 0,05 en utilisant une ANOVA unidirectionnelle et des tests t non appariés.

Le SIET a été utilisé pour évaluer les changements dans le transport du Na+ le long de l’épithélium rectal des moustiques femelles adultes. La plupart des recta non stimulés examinés présentaient un transport de Na+ dirigé par l’hémolymphe (absorption), et seules ces préparations ont donc été examinées. En raison de la variabilité de l’activité de base, la différence de flux ionique, après l’application d’une solution saline ou de peptides, par rapport à l’activité de transport initiale dans la solution saline a été calculée. Ces valeurs donnent un changement négatif dans le flux ionique (flux ionique après traitement – flux ionique dans les conditions de base), bien que tous les organes soient restés absorbants après les traitements. Un analogue de la leucokinine (drosocinine) a été utilisé pour examiner les changements dans l’absorption de Na+ , ce qui a entraîné une diminution de quatre fois de l’absorption de Na+ par rapport au contrôle salin (Figure 2).

Pour évaluer le rôle d’un neuropeptide, la pyrokinine-2 (PK2), sur la motilité iléale, un analogue de Rhodnius prolixus a été utilisé, qui a déjà été montré pour activer le récepteur A. aegypti PK2, enrichi dans le moustique iléon28. Par rapport aux niveaux de base, la PK2 inhibe de manière significative les contractions iléales (Figure 3).

Figure 1
Figure 1 : Effet des neuropeptides diurétiques et antidiurétiques sur le taux de sécrétion de liquide in vitro, la concentration de Na+ et le taux de transport par les femmes adultes A. aegypti MTs. Aedae CAPA-1 (0,1 fM) a été appliqué aux MT stimulées par DromeDH31 (25 nM). (A) Les MT ont été incubées pendant 60 min avec des neuropeptides et 120 min pour les témoins non stimulés. (B) Les concentrations de Na+ dans la gouttelette sécrétée ont été mesurées à l’aide de l’ISME et des valeurs ont été utilisées pour calculer le taux de transport (C). Les colonnes qui sont significativement différentes des contrôles sont indiquées par la même lettre, déterminée par une ANOVA unidirectionnelle et un post-test de Bonferroni (n = 23–35). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Changements dans le transport du Na+ à travers l’épithélium du coussinet rectal féminin mesuré à l’aide du SIET. L’absorption de Na+ a été enregistrée dans des conditions salines de base non stimulées, suivies d’un traitement avec une solution saline supplémentaire (contrôle du véhicule) ou 1 μM de drosokinine (n = 10–12). Les changements dans le flux Na+ dirigé par l’hémolymphe ont été mesurés pour chaque traitement. Il y avait une diminution de quatre fois de l’absorption de Na + en réponse à la drosockinine, déterminée par un test t à deux queues non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Changement de la motilité iléale des moustiques femelles après l’application d’une solution saline (contrôle du véhicule) et de RhoprPK2. Le changement de fréquence de contraction après les deux traitements a été enregistré pour chaque échantillon par rapport aux conditions initiales (n = 32). Rhopr PK2 a diminué la motilité iléale, telle que déterminée par un test t apparié à deux queues. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Schéma du test de Ramsay, utilisation de microélectrodes sélectives d’ions (ISME), technique d’électrode sélective d’ions à balayage (SIET) et tests de contraction de l’intestin postérieur. Illustrations des quatre méthodes utilisées pour déterminer les rôles fonctionnels des facteurs endocriniens sur le système excréteur du moustique, Aedes aegypti. (A) Le test de Ramsay est utilisé pour mesurer les taux de sécrétion de liquide dans les tubules de Malpighian isolés. L’extrémité proximale (ouverte) du tubule est enroulée autour d’une épingle, entourée d’huile minérale, tandis que l’extrémité distale (fermée) est baignée dans la solution saline de traitement. Après une période de temps définie, l’extrémité proximale sécrètera l’urine primaire, s’accumulant sous forme de gouttelettes sur l’épingle. (B) Une électrode de référence et l’ISME sont placés dans la gouttelette sécrétée, reliée à un système d’acquisition de données, pour mesurer la concentration en ions. (C) Le SIET mesure le transport des ions à l’aide d’une microélectrode sélective d’ions placée perpendiculairement à environ 2 μm de l’organe collé au fond d’une boîte de poly-L-lysine. La direction des flèches rouges dans ce schéma indique que Na+ est absorbé dans la solution saline, indiquée par un enregistrement de tension plus important le long de l’épithélium par rapport à la région éloignée de la surface de l’organe. (D) Les tests de contraction de l’intestin postérieur sont effectués à l’aide d’enregistrements vidéo pour évaluer les changements dans la fréquence, la durée et la durée de la relaxation de la contraction. Dans ce schéma, les organes sont placés à l’intérieur d’un puits et une broche métallique est insérée directement dans l’intestin moyen et le rectum pour permettre à l’iléon de flotter et de se contracter librement. Des traitements sont ajoutés dans le puits pour évaluer les changements de motilité à la fois qualitativement et quantitativement. Créé à l’aide de BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Plats utilisés pour (A) disséquer les moustiques, (B) le test ramsay, (C) siET et (D) les mesures du test de contraction. A, B et D sont complètement recouverts de silicone, tandis que C est recouvert de poly-L-lysine au centre. Pour préparer le plat utilisé pour le test de Ramsay (B), une petite boîte de Petri recouverte de silicone est utilisée et de petits puits d’environ 4 à 5 mm sont sculptés à 1 cm l’un de l’autre (environ ~ 20 puits peuvent être sculptés / plat). Des broches métalliques minutieuses sont placées à côté de chaque puits pour s’accrocher au tubule isolé afin de mesurer le taux de sécrétion de liquide. La boîte en poly-L-lysine (C) permet à l’organe d’adhérer au fond lors des mesures SIET. Les puits dans le plat de dosage de contraction (D) sont remplis de solution saline et de tout traitement suivant. L’organe contractant placé à l’intérieur du puits est observé à l’aide d’une caméra vidéo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Le système excréteur du moustique, Aedes aegypti. Après une farine de sang, les solutés, l’eau et les nutriments sont transmis le long du canal alimentaire, qui comprend (mais sans s’y limiter) l’intestin moyen, la valve pylorique, les MT et l’intestin postérieur. L’intestin moyen est le site principal de la digestion des aliments et de l’absorption des nutriments. Les cinq MT transportent l’eau, les solutés et les déchets de l’hémolymphe environnante et sécrètent cette urine primaire dans l’intestin postérieur, composé d’un iléon antérieur et d’un rectum postérieur, ce dernier comprenant quatre coussinets (mâles) ou six (femelles). L’intestin postérieur agit comme site de réabsorption final avant que les déchets ne soient excrétés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Images fixes d’un intestin postérieur de moustique disséqué pendant les mesures SIET. Pour mesurer l’activité ionique le long de l’épithélium de l’un des six coussinets rectaux, la microélectrode sélective Na+ est placée à 2 μm du tissu (A). La tension est enregistrée sur ce site avant que la pointe de la microélectrode ne soit déplacée à une distance d’excursion (Δx) de 100 μm de ce point (B). Le gradient de tension entre ces deux points est utilisé pour calculer le gradient de concentration et le flux ionique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Les seringues de remblayage pour ISME et SIET. Une image des seringues utilisées pour remplir les solutions de NaCl et de KCl dans les microélectrodes. Cela montre quatre seringues à pointe glissante de 1 mL avec des aiguilles jetables, avec une pointe étirée modifiée pour permettre l’insertion dans une électrode. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2X Aedes aegypti solution saline
Pour 500 mL :
Dans un bécher, ajouter 400 mL de ddH2O, puis ajouter les solutés suivants :
Composant Poids (g) Concentration finale (mM)
NaCl 8.766 150
HEPES 5.957 25
Kcl 0.253 3.4
NaOH 0.3 7.5
NaHCO3 0.151 1.8
MgSO4 0.12 1
CaCl2-2H20 0.249 1.7
Remuer et ajuster le pH à 7,1
Ajouter le ddH2O au volume final de 500 mL pour obtenir 2x solution saline Aedes
10X de glucose
Pour 500 mL :
Dans un bécher, ajouter 450 mL de ddH2O, puis ajouter :
Composant Poids (g) Concentration finale (mM)
Glucose 4.5 5
Remuer et ajouter le ddH2O au volume final de 500 mL
Pour faire 1X Aedes aegypti solution saline:
Pour 100 mL :
Dans un bécher, ajouter 40 mL de ddH2O, puis ajouter :
Composant Volume (mL)
2x solution saline Aedes 10
Remuer, ajuster le pH à 7,1
Stériliser le filtre

Tableau 1 : Fabrication d’Aedes aegypti saline. Pour faire une solution saline Aedes , préparez séparément 2X solution saline Aedes et 10x glucose, conservez au réfrigérateur à 4 °C. Utilisez ces deux solutions pour préparer des stocks de travail (1x solution saline Aedes ), utilisées pour disséquer les tissus, les tests de Ramsay et les tests de contraction.

Aedes aegypti Saline sans calcium + NMDG
Pour 500 mL :
Dans un bécher, ajouter 400 mL de ddH2O, puis ajouter les solutés suivants :
Composant Poids (g) Concentration finale (mM)
NaCl 1.17 20
NmDG 25.38 130
HEPES 5.957 25
Kcl 0.253 3.4
NaHCO3 0.151 1.8
MgSO4 0.12 1
Glucose 0.9 5
Remuer et ajuster le pH à 7,1
Ajouter le ddH2O au volume final de 500 mL

Tableau 2 : Solution saline Aedes aegypti modifiée utilisée pour les mesures SIET. Cette solution saline sans Ca2+ est utilisée pour prévenir les contractions spontanées de l’intestin postérieur lors des mesures SIET. Cette solution saline est spécifique pour mesurer le transport de Na+ , car elle consiste en Na+ réduit (20 mM) constitué par substitution équimolaire avec de la N-méthyl-D-glucamine (NMDG) pour réduire le bruit de fond.

MT stimulées par DH31 Diamètre des gouttelettes (unités) Diamètre des gouttelettes (um) Volume de gouttelettes (um3) Taux de sécrétion (nl/min)
n Traitement #1 (60 min) Traitement #1 (60 min) Traitement #1 (60 min) Traitement #1 (60 min)
1 16 313.73 16167692.56 0.27
2 14 274.51 10831090.91 0.18
3 17 333.33 19392547.25 0.32
4 13 254.90 8671977.67 0.14
5 14 274.51 10831090.91 0.18
6 22 431.37 42029685.15 0.70
7 15 294.12 13321768.16 0.22
8 16 313.73 16167692.56 0.27
9 20 392.16 31577524.53 0.53
Méchant 16.33333333 320.26 18776785.52 0.31
STD ERR 0.06

Tableau 3 : Données d’analyse de Ramsay. Tableau montrant des données d’échantillon recueillies auprès de MT stimulées par le DH31 chez des moustiques femelles adultes. Lors de la mesure du diamètre de la gouttelette sécrétée, mesurez d’abord avec le micromètre oculaire stéréomicroscope et notez la valeur. Ensuite, multipliez le diamètre de l’unité oculaire avec la conversion d’étalonnage effectuée avant l’expérience pour obtenir le diamètre de la gouttelette en μm. Calculez ensuite le volume de l’équation, en utilisant l’équation notée à l’étape 7.7, suivie du taux de sécrétion, en utilisant l’équation notée à l’étape 7.8.

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Discussion

Lors de l’ingestion d’un repas de sang, les insectes hématophages sont confrontés au défi de l’excès de solutés et d’eau dans leur hémolymphe2. Pour faire face à cela, ils ont un système excréteur spécialisé, qui est étroitement contrôlé par des facteurs hormonaux, permettant aux insectes d’initier rapidement une diurèse post-prandiale. Le test de Ramsay et l’utilisation de microélectrodes sélectives d’ions permettent de mesurer les taux de sécrétion de liquide ainsi que les concentrations d’ions et les taux de transport dans les MT d’insectes isolés. Les étapes critiques de ces approches comprennent la bonne dissection des MT d’insectes. Le retrait individuel de chaque tubule de l’insecte doit être fait avec soin, car tout dommage au tubule entraînera la sécrétion du liquide de la déchirure ou conduira à une préparation non fonctionnelle. Aedes Les MT ne sécrètent pas facilement dans les témoins non stimulés, de sorte que des hormones et des médicaments peuvent être appliqués pour stimuler la sécrétion. Cependant, même avec une application de diurétique ou des dissections minutieuses, certains MT peuvent ne pas sécréter s’ils sont endommagés (même s’ils ne sont pas du tout évidents avec une inspection visuelle), de sorte que plusieurs cycles du test peuvent devoir être effectués. Pour une utilisation correcte des électrodes sélectives d’ions lors des mesures ISME et SIET, assurez-vous que la pente des étalons se situe dans la plage normale indiquée pour l’ionophore, ce qui donnera les lectures les plus précises. Cependant, si les lectures sont instables, examinez l’électrode au microscope pour confirmer que l’ionophore a été absorbé et ne fuit pas. Une nouvelle électrode doit être préparée s’il y a des bulles d’air présentes, si la pointe est cassée ou si l’ionophore n’a pas été absorbé correctement. Si la bordure ionophore/remblai est convexe, les électrodes sont sous-silanisées et il faut utiliser plus de dichlorodiméthylsilane. Si la bordure est concave, les électrodes sont trop silanisées et moins de dichlorodiméthylsilane doit être utilisé. De plus, certaines électrodes peuvent être moins stables que d’autres, comme l’électrode sélective Na+, où la pente se détériore plus rapidement par rapport à K+ ou H+.

Ces approches offrent des possibilités illimitées d’étudier les mécanismes à l’origine de la sécrétion de liquide par les MT. En raison des progrès récents de l’édition génomique, des stratégies génétiques inverses telles que l’édition de gènes CRISPR-Cas9 et l’interférence ARN peuvent être utilisées pour étudier le rôle régulateur et / ou fonctionnel de gènes spécifiques exprimés dans les organes excréteurs. Des études ont utilisé de tels outils pour comprendre la régulation hormonale chez les MT aedes40 et Drosophila41. De plus, la gouttelette de bain peut être modifiée pour examiner les rôles spécifiques des hormones14,15,18,21,42, des systèmes de second messager et des médicaments sur le taux de sécrétion et les concentrations d’ions. Ces méthodologies ont été appliquées à divers autres insectes tels que Rhodnius prolixus38, les espèces de moustiques larvaires et adultes, Drosophila41 et les espèces d’éphémères (Hexagenia rigida)43. De même, différents ions peuvent être examinés, tels que Cl-, K+, H+ et NH4+.

Au cours des mesures SIET, il peut y avoir une variabilité entre chaque échantillon dans les conditions de référence. Des différences peuvent encore survenir lors du contrôle de l’âge, du sexe et de l’état d’alimentation du moustique, en particulier lors de l’examen de différentes régions de l’intestin (c’est-à-dire certaines distances antérieures ou postérieures de la jonction iléon-rectum). Ces différences peuvent être expliquées en exprimant le flux ionique après le traitement comme un changement par rapport aux conditions de base. Au fil du temps, l’activité ionique peut également fluctuer et il est donc important d’évaluer les changements par rapport à un contrôle du véhicule (solution saline), comme le montrent les résultats présentés ici. Si les lectures de tension commencent à fluctuer considérablement, préparez une nouvelle microélectrode sélective d’ions et recalibrez-la. L’utilisation d’une troisième solution d’étalonnage (diluée 10 fois par rapport à la concentration la plus faible de la solution d’étalonnage) peut en outre aider à établir une pente de Nernst plus précise. Étant donné que l’activité de Na+ est généralement très sensible au bruit de fond, une solution saline Aedes modifiée composée de moins de Na+ est utilisée (tableau 2). Il est également important de garder une distance de la cage de Faraday pendant les mesures pour éviter les interférences et réduire tout arrière-plan. De plus, si l’organe produit encore des contractions spontanées lorsqu’il adhère à la poly-L-lysine au fond de la boîte, l’ajout d’un chélateur de calcium à la solution saline aidera davantage à prévenir cela. Si l’on examine le transport ionique le long de l’épithélium du coussinet rectal, comme le montrent les résultats présentés ici, il est important d’identifier le site « point chaud » présentant la plus grande activité ionique en déplaçant la pointe de la microélectrode par petits incréments le long du côté orienté hémolymphe du coussinet rectal. S’il est incapable de détecter de grands changements dans l’activité ionique, l’organe peut avoir été endommagé ou la pointe de la microélectrode n’est pas dans le même plan tridimensionnel que l’ouverture du coussinet rectal, et donc un autre moustique doit être disséqué.

Le SIET peut être utilisé pour diverses expériences, telles que l’examen de l’activité ionique chez les moustiques élevés dans différentes conditions25 ou nourris avec différents régimes alimentaires (c.-à-d. nourris au saccharose vs nourris au sang vs non nourris), ce qui peut être utile pour identifier les mécanismes de transport ionique essentiels après un repas dans le sang. Il est donc important de s’assurer que les mesures sont obtenues à partir du même site entre les échantillons. Par exemple, des mesures peuvent être prises à partir de la jonction iléon-rectum ou à des distances spécifiques situées antérieurement à ce site (le long de l’iléon) ou postérieurement (le long de l’épithélium rectal). Ces mesures peuvent également être obtenues le long de l’épithélium du coussinet rectal qui nécessite un positionnement différent de l’organe dans la boîte. De plus, il est important de noter que le SIET ne se limite pas à mesurer l’activité ionique uniquement le long de l’intestin postérieur; d’autres organes, y compris l’intestin moyen et les MT, peuvent également être examinés. De même, les flux K+, H+, NH4+ et Cl- peuvent être mesurés à l’aide du SIET25,44,45 et les mesures peuvent être prises à des intervalles de temps définis après un traitement44. Cette technique a été utilisée sur les moustiques larvaires et adultes26,44, ainsi que sur divers autres insectes, dont Chironomus riparius46, Trichoplusia ni45,47 et Hexagenia rigida43. Ces expériences peuvent être utilisées avec le test de Ramsay et l’ISME pour mieux comprendre le rôle des différents traitements et facteurs environnementaux sur la sécrétion de fluide, la concentration d’ions et le transport d’ions.

Enfin, les tests de contraction sont utiles pour identifier les facteurs neuroendocriniens qui influencent la motilité intestinale. Il est crucial que l’organe étudié ne soit pas endommagé puisque ce test repose sur des mouvements générés par la musculature. Par conséquent, les pinces ne doivent être utilisées que pour saisir les structures environnantes lors du transfert des organes dans la boîte d’essai. Saisir ces organes adjacents avec une épingle à l’intérieur du puits les empêche également de bouger et d’influencer le mouvement de l’organe isolé examiné. Si aucune contraction spontanée n’est observée, le tissu peut avoir été endommagé et une nouvelle dissection est nécessaire. D’autres méthodes couramment utilisées pour examiner l’activité contractile intestinale des insectes comprennent l’utilisation d’un transducteur de force32 ou d’un moniteur d’impédance33. Ces méthodes peuvent également être utilisées pour mesurer le taux de contraction dans l’intestin postérieur du moustique; toutefois, si l’objectif est d’examiner visuellement ces changements au moyen d’enregistrements vidéo, les méthodes décrites dans ce protocole seront bénéfiques et pourront être utilisées pour une analyse plus approfondie48.

Les quatre techniques décrites dans ce protocole ont permis de déduire le rôle d’un certain nombre de neuropeptides dans le système excréteur de divers insectes. L’utilisation de ces méthodes en conjonction avec d’autres techniques utilisées par les physiologistes des insectes, telles que la PCR quantitative et l’immunohistochimie, peut fournir une compréhension plus complète des voies sous-jacentes et des systèmes de signalisation, qui peuvent servir de nouvelles cibles potentielles pour la lutte antivectorielle.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par des subventions de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) à AD et J-PP. AL et FS ont reçu des prix CGS-M du CRSNG du CRSNG à l’appui de leurs recherches aux cycles supérieurs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringes Fisher Scientific 14955456
35 mm Petri dishes Corning Falcon (Fisher Scientific) C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes
(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)		 World Precision Instruments 1B100F-4 used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes
(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)		 World Precision Instruments 1B200F-4 used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes
(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)		 World Precision Instruments TW150-4 used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad Diamed GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution Sigma-Aldrich 41716
Faraday cage Custom Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride Sigma-Aldrich 157740
Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 91150-20
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-748A
Hydrated mineral oil Fisher Scientific 8042-47-5 Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera Luminera INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed) World Precision Instruments MMJL and MMJR Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light Fisher Scientific 0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel) Fine Science Tools 26002-10
Non-hardening modeling clay Sargent Art Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET) Olympus customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette Fisher Scientific 13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) Sigma-Aldrich A-005-M 84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81395
Scalpel Blade Fine Science Tools 10050-00
Scalpel Handle Fine Science Tools 10053-09
Schneider's Drosophila medium Sigma-Aldrich S0146
SIET system Applicable Electronics customized system Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire World Precision Instruments AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A Fluka 99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes Fisherbrand FB012921 Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer Nikon SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller Sutter Instruments FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Chemical Company NC9285739
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 401757
VWR advanced hotplate stirrer - aluminum VWR 9578 Specific brand is not important

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Biologie numéro 174 neuropeptides tubules malpighiens intestin postérieur système excréteur moustique Aedes aegypti test de Ramsay test de sécrétion SIET ISME transport d’ions contractions
Étude de l’activité des neuropeptides et d’autres régulateurs du système excréteur chez le moustique adulte
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Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. P. V. Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito. J. Vis. Exp. (174), e61849, doi:10.3791/61849 (2021).

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