Summary
Denne protokol skitserer metoder bag Ramsay-assayet, ionselektive mikroelektroder, scanningsionselektiv elektrodeteknik (SIET) og in vitro-kontraktionsassays, der anvendes til at studere det voksne myggeudskillelsessystem, der består af malpighiske tubuli og bagtarm, til kollektivt at måle ion- og væskesekretionshastigheder, kontraktil aktivitet og transepiteliontransport.
Abstract
Undersøgelser af insektfysiologi, især hos de arter, der er vektorer af patogener, der forårsager sygdom hos mennesker og andre hvirveldyr, danner grundlag for at udvikle nye strategier for bekæmpelse af skadegørere. Her beskrives en række metoder, der rutinemæssigt anvendes til at bestemme neuropeptidernes og andre neuronale faktorers funktionelle roller (dvs. biogene aminer) på myggens udskillelsessystem, Aedes aegypti. De malpighiske tubuli (MT'er), der er ansvarlige for primær urindannelse, kan fortsætte med at fungere i timevis, når de fjernes fra myggen, hvilket muliggør væskesekretionsmålinger efter hormonbehandlinger. Som sådan er Ramsay-analysen en nyttig teknik til måling af sekretionshastigheder fra isolerede MT'er. Ionselektive mikroelektroder (ISME) kan sekventielt anvendes til at måle ionkoncentrationer (dvs. Na + og K +) i den udskillede væske. Dette assay gør det muligt at måle flere MT'er på et givet tidspunkt og bestemme virkningerne af forskellige hormoner og lægemidler. Scanningsionselektiv elektrodeteknik bruger ISME til at måle spænding, der er repræsentativ for ionisk aktivitet i det ustirrede lag ved siden af overfladen af iontransporterende organer for at bestemme transepiteltransport af ioner i næsten realtid. Denne metode kan bruges til at forstå hormoners og andre regulatorers rolle på ionabsorption eller sekretion på tværs af epitel. Hindgut sammentrækningsassays er også et nyttigt redskab til at karakterisere myoaktive neuropeptider, der kan forbedre eller reducere dette organs evne til at fjerne overskydende væske og affald. Samlet set giver disse metoder indsigt i, hvordan udskillelsessystemet reguleres hos voksne myg. Dette er vigtigt, fordi funktionel koordinering af udskillelsesorganerne er afgørende for at overvinde udfordringer som udtørringsstress efter eklosion og før man finder en passende hvirveldyrvært for at opnå et blodmel.
Introduction
Vedligeholdelse af salt- og vandstanden i insekter giver dem mulighed for at få succes i mange økologiske og miljømæssige nicher ved hjælp af en række fodringsstrategier1. De fleste insekter har udviklet mekanismer til at regulere sammensætningen af deres hæmolymfe inden for snævre grænser for at modstå de forskellige udfordringer, der er forbundet med deres særlige miljø2. Terrestriske insekter står ofte over for udfordringen med at bevare vand, og udskillelsessystemet gennemgår antidiurese for at forhindre tab af vand og nogle vigtige salte og derfor undgå udtørring. I modsætning hertil opstår diurese, når insektet fodrer og udfordres med overskydende vand og potentielt salte3,4. Gennem deres specialiserede og meget aktive udskillelsessystem har insekter udviklet reguleringsmekanismer, der virker for at imødegå deres osmoregulerende udfordringer. Hos voksne Aedes aegypti myg består udskillelsessystemet af malpighiske tubuli (MT'er) og bagtarm, hvoraf sidstnævnte består af den forreste ileum og bageste endetarm5. MT'er er ansvarlige for at generere primær urin, normalt rig på NaCl og / eller KCl. Den primære urin modificeres derefter gennem sekretoriske og reabsorptive processer, når den bevæger sig nedstrøms for tubuli og kommer ind i bagtarme5. Den endelige udskillelse kan være hyper- eller hypoosmotisk i forhold til hæmolymfen afhængigt af fodrings-/miljøforholdene og er beriget med giftigt og nitrogenholdigt affald2.
MT'er er ideelle til at studere mange funktioner i epitelvæske og opløst transport, da de udfører et stort udvalg af transport- og udskillelsesfunktioner2,6. Gennem hormonel regulering2 fungerer MT'er ved at udskille ioner og andre opløste stoffer fra blodet i tubulilumen7, hvilket giver en osmotisk gradient, der gør det muligt at transportere vand af aquaporiner8,9, som samlet skaber den primære urin, inden de rejser mod den reabsorptive bagtarm2. Ved at opsamle den udskillede væske fra isolerede MT'er kan man således kontinuerligt overvåge transepiteltransport af væske og ioner. Måling af sekretionshastighed og urinsammensætning giver indsigt i mekanismer, der er ansvarlige for transepitelion og væsketransport. En populær metode til at studere væskesekretionshastigheder er Ramsay-analysen, som først blev introduceret af Ramsay i 195310. I denne metode behandles den distale (lukkede) ende af tubuli med et hormon (eller anden testforbindelse / lægemiddel), mens den proksimale (åbne) ende vikles rundt om en stift i vandmættet paraffinolie, som udskiller den primære urin og akkumuleres som en dråbe på spidsen af stiften. Isolerede MT'er er i stand til at overleve og fungere i lange perioder (op til 24 timer) under optimerede in vitro-forhold, hvilket gør dem til egnede og effektive modeller til måling af væskesekretion. Insekter har åbne kredsløbssystemer, så MT'erne dissekeres let og fjernes, da de normalt er frit flydende i hæmolymfen6. Derudover, med undtagelse af bladlus - som mangler MT'er11 - kan antallet af MT'er i en given insektart variere betydeligt fra fire til hundreder (fem i Aedes-myg), hvilket giver mulighed for flere målinger fra et insekt.
MT'erne i Aedes-myg, i lighed med andre endopterygoteinsekter, består af to celletyper, der danner et simpelt epitel2,12; store hovedceller, som letter aktiv transport af kationer (dvs. Na+ og K+) ind i lumen, og tynde stellatceller, som hjælper med transepitelial Cl-sekretion13. MT'erne er ikke innerverede2 og reguleres i stedet af flere hormoner, herunder både diuretiske og antidiuretiske faktorer, hvilket muliggør kontrol af iontransport (hovedsageligt Na+, K+ og Cl-) og osmotisk forpligtet vand2. Talrige undersøgelser har undersøgt den hormonelle regulering af Aedes MT'er for at forstå rollen som endokrine faktorer på transepiteltransport14,15,16,17,18. Som det fremgår af de repræsentative resultater, viser protokollerne heri virkningerne af forskellige hormonelle faktorer på isolerede MT'er fra voksne kvindelige A. aegypti myg, herunder både diuretisk og antidiuretisk kontrol (figur 1). Ramsay-analysen bruges til at demonstrere, hvordan et antidiuretisk hormon, AedaeCAPA-1, hæmmer væskesekretionen af MT'er stimuleret af diuretisk hormon 31 (DH31) (figur 1).
Den mindre størrelse af insekter har krævet udvikling af mikrometoder til måling af ionisk aktivitet og koncentrationer i væskeprøver eller nær overfladen af isolerede væv som MT'er og tarm. Der er anvendt forskellige metoder, herunder anvendelse af radioisotoper af ioner19, som kræver indsamling af de udskillede væskedråber til måling af ionkoncentrationer20. Stimulerede Aedes-tubuli in vitro udskiller typisk ~0,5 nL/min21, og håndtering af så små mængder kan derfor udgøre en udfordring og potentielt medføre fejl ved overførsel. Som følge heraf er ionselektive mikroelektroder (IME'er) blevet anvendt i vid udstrækning til at måle ionkoncentrationer i udskillede dråber af MT'er in vitro. I denne metode placeres en referenceelektrode og ISME, fyldt med den passende genopfyldningsopløsning og ionofor, i den udskillede urindråbe for at bestemme ionkoncentrationer22. Tilpasset fra Donini og kolleger23 bruger denne nuværende protokol en Na+-selektiv ionofor til at måle ionaktivitet i udskillede dråber fra stimulerede MT'er hos voksne Aedes-myg. Da ionselektive mikroelektroder måler ionaktivitet, kan disse data udtrykkes som ionkoncentrationer efter antagelsen om, at kalibreringsopløsningerne og forsøgsprøverne har samme ionaktivitetskoefficient21 (figur 1B,C).
Scanning Ion-selektiv elektrodeteknik (SIET) gør også brug af IME'er til at måle ionkoncentrationsgradienter i det ustirrede lag ved siden af organer, væv eller celler, der transporterer ioner. IME'erne måler spændingsgradienter, som derefter kan bruges til at beregne ionkoncentrationsgradienterne og retningen og størrelsen af ionfluxen over organet, vævet eller cellen20. I denne teknik er ISME monteret på en manipulator med tre akser, der styres af computerstyrede mikrosteppermotorer, så dens 3D-position styres til mikrometerniveauet20. Spændinger måles på to punkter i det urørte lag ved hjælp af en prøveudtagningsprotokol programmeret ind i og styret af computersoftware. De to punkter er typisk adskilt af en afstand på 20-100 μm med et punkt inden for 5-10 μm fra overfladen af organet, vævet eller cellen og det andet punkt yderligere 20-100 μm væk. Forskellen i spændingsstørrelse mellem de to punkter beregnes for at opnå en spændingsgradient24,25,26, som derefter bruges til at beregne koncentrationsgradienten og efterfølgende nettofluxen ved hjælp af Ficks lov24,27. Denne metode er nyttig til vurdering af transport af specifikke ioner på tværs af forskellige områder af insekttarmen og MT'erne eller på bestemte tidspunkter efter en blodmel- eller behandlingseksponering. SIET kan f.eks. bruges til at forstå, hvordan absorberende og sekretoriske processer i myggeudskillelsessystemet reguleres af hormoner28 samt forskellig fodringsadfærd og opdrætsforhold25. Tidligere arbejde med at udnytte SIET afslørede steder, der var involveret i iontransport langs analpapiller og endetarm af larve og voksne myg24,28. Den nuværende protokol, der tidligere er beskrevet af Paluzzi og kolleger26, måler Na+ flux på tværs af rektalpudeepitel i den voksne kvindelige endetarm (figur 2).
Det sidste segment af myggeudskillelsessystemet kræver koordineret muskelbevægelse for at hjælpe med at blande mad og udskille affald26. Ikke-absorberbare fordøjelsesprodukter fra midgut sammen med primær urin udskilt af MT'erne føres gennem pylorventilen og leveres til bagtargut2. Spontane baggutkontraktioner begynder ved pylorventilen og forekommer i peristaltiske bølger, som videresendes over ileum gennem den koordinerede sammentrækning af cirkulære og langsgående muskler, der omgiver epitelcellernes basale overflade26. Endelig hjælper musklerne i endetarmen med at drive og eliminere affald gennem analkanalen. Selvom insekt bagtarm motilitet er myogen, hvilket kræver ekstracellulær Ca2+ for at producere spontane sammentrækninger, kan disse processer også reguleres neuronalt26,29,30. Denne eksogene regulering af nervesystemet er vigtig efter fodring, da dyret skal udvise affald fra tarmen og genoprette hæmolymfebalancen31. Som følge heraf er det nyttigt at udføre in vitro-bioassays for at identificere myostimulerende eller myoinhibitoriske neuropeptider til at vurdere, hvordan neurokemikalier påvirker bagtarmtiliteten. Den nuværende protokol, udført af Lajevardi og Paluzzi28, bruger videooptagelser til at undersøge ileal motilitet som reaktion på neuropeptider (figur 3). Tilsvarende kan en krafttransducer eller impedanskonverter også anvendes til at observere spor af sammentrækninger gennem en dataindsamlingssoftware32,33. Brug af videoteknologi giver os imidlertid mulighed for visuelt at vurdere organet og yderligere analysere ved hjælp af en delmængde af parametre for at identificere hormonernes rolle på bagtarmsmotiliteten.
Brug af disse teknikker kan hjælpe med at karakterisere faktorer, der regulerer og koordinerer væske- og iontransport langs udskillelsessystemet sammen med bagtarmsmotilitet. Det er vigtigt, at en funktionel forbindelse mellem MT'ernes diuretiske respons og baggutmotilitet understøttes, da diuretiske hormoner, såsom DH31 og 5HT, der er kendetegnet ved deres evne til at stimulere væskesekretion af MT'erne, også har vist sig at udvise myotrope virkninger langs myggenes baggut21,34,35 . Disse resultater understreger betydningen af streng koordinering mellem MT'erne og bagtargut under begivenheder som post-prandial diurese hos insekter, der kræver hurtig eliminering af affald.
Heri beskrives den detaljerede tilgang bag Ramsay-analyseteknikken til måling af væskesekretionshastighed i myggen, A. aegypti, og brugen af ionselektive mikroelektroder til bestemmelse af Na+ -koncentrationer inden for MT'ernes udskillede væske, som ved kombination gør det muligt at bestemme transepiteliontransporthastigheder. Derudover beskrives scanningsionselektiv elektrodeteknik og bagtarmskontraktionsassays for at måle henholdsvis ionflux og bevægelighed, hvilket hjælper med at belyse hormonel regulering af bagtarden (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af silikoneforede retter
BEMÆRK: Dette trin skal udføres inden forsøgene. Disse retter vil blive lavet til at forberede assayskålen til dissektioner og til sammentrækningsanalyseeksperimenter.
- Forbered silikonen ved hjælp af et silikoneelastomersæt efter producentens anbefalinger. Bland de todelte flydende komponenter i et forhold på 10 til 1. Bland forsigtigt og grundigt ved at vende om, men sørg for at minimere bobledannelsen.
- Hæld silikoneelastomeren i standard 60 mm engangs polystyrenkulturskåle til en dybde på normalt mellem 7-9 mm. Forbered så mange retter som nødvendigt. Fjern eventuelle luftbobler ved hjælp af en fin stift under et mikroskop kort efter hældning af silikone i tallerkener. Anbring opvasken i et støvfrit kammer eller skab ved stuetemperatur (RT) i mindst 48 timer eller i ovnen ved 50 °C i ca. 4 timer for at hærde (hærde) (figur 5A).
2. Fremstilling af Ramsay-assayskålen
BEMÆRK: Skålen kan genbruges fra eksperiment til eksperiment, og gentag derfor kun dette trin, hvis skålen er beskadiget eller går i stykker. En separat skål bruges til dissektioner.
- Brug en skalpel (med standard skarpe forholdsregler) til at oprette brønde i en af de silikonebelagte petriskåle for at forberede assayskålen ved at fjerne nok af silikonen, ca. ~ 5 mm, fra toppen af fadet (dette skal passe ~ 20 μL badedråbe). Før dette skal du bruge en permanent markør til at markere positionerne under fadet for at bemærke, hvor brøndene skal laves. Brøndene skal være ~ 1 cm fra hinanden med en diameter på ca. ~ 4 mm for at give mulighed for, at den distale ende af tubuli passer. Hver brønd vil indeholde et væskeudskillende rør, således at en skål indeholdende 20 brønde gør det muligt at analysere op til 20 MT'er pr. Eksperiment.
- For at forberede Minutien-stifterne skal du placere 0,1 mm stifterne i rustfrit stål i træk på et stykke mærkningstape, vinkelret på båndets akse. Brug en saks til at skære langs båndets længde og skabe lige halvdele af stifterne. Brug en halv stift til hver brønd.
- Brug et stumpt par tang til at indsætte hver halvstift i den silikonebelagte assayskål ved siden af hver brønd. Afhængigt af længden af insekttubulien skal du indsætte halvstiften i en afstand, der gør det muligt for den distale ende af tubuli at nedsænke i badesaltvandet og den proksimale ende for at vikle rundt om stiften. Dette trin kan udføres under et mikroskop for nemt at visualisere brønde. Stifterne kan genbruges, men udskift halvstiften, hvis den er beskadiget eller mistet. (Figur 5B)
3. Fremstilling af den poly-L-lysinbelagte SIET-skål
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for organet at klæbe til bunden af fadet under SIET-målinger, hvilket sikrer, at målestedet forbliver det samme for hver prøve. Forberedelse af disse retter skal ske mindst 2 dage før forsøgene. Hver skål bør kun bruges én gang, når der anvendes en bestemt behandling. Bortskaf efter hver prøve, eller hvis poly-L-lysinbelægningen er ridset af eller beskadiget.
- For hver prøve anbringes en 35 mm petriskål på en plan overflade. Fjern lågene og pipetten 70 μL poly-L-lysin (0,1 mg/ml) i midten af hver skål. Sæt lågene på igen, og lad poly-L-lysinen tørre (~ 48 timer) uforstyrret.
- Når det er tørt, skal du markere skålbunden med en cirkel, der skitserer det tørrede poly-L-lysinlag for bedre at visualisere, hvor det udskårne organ skal placeres efter dissektioner. Hvis det er nødvendigt for at minimere mængder saltvand og behandlingsopløsninger i eksperimenter, skal du bruge en varm limpistol til at omslutte poly-L-lysinbelægningen, hvilket giver plads nok til, at elektroden kan bevæge sig og tage baggrundsmålinger (~ 20-25 mm diameter af den limede cirkel er nok). Disse overtrukne retter kan opbevares på ubestemt tid ved RT (figur 5C).
4. Forberedelse af Ramsay- og sammentrækningsanalyseretterne til eksperimenter
BEMÆRK: Skålen kan genbruges (forudsat passende vask for at fjerne tidligere brugt saltvand / behandlinger), og gentag således kun dette trin, hvis pladen er beskadiget eller går i stykker. En separat skål bruges til dissektioner. Dette trin udføres på dagen for eksperimentet.
- Til sammentrækningsanalyseskålen skal du bruge en skalpel (med standard skarpe forholdsregler), opret brønde i en af de silikonebelagte petriskåle til at forberede assayskålen. Vinkl skalpellen på en måde, så brøndene bliver trekantede for at lette fastgørelsen af det dissekerede væv på kanterne. Brønde skal være store nok til at holde op til 250 μL og passe til hele fordøjelseskanalen (i stedet for at grave for dybt, gør brønden bredere til ca. 0,5-1 cm) (figur 5D).
- Til Ramsay-plade skal du bruge en pipette og fylde brønde op til 20 μL opløsning (18 μL 1X Aedes saltvand:Schneiders medium fremstillet i trin 5.2 og 2 μL hormon /lægemiddel). For ustimulerede kontroller fyldes brønde med 20 μL 1X Aedes saltvand:Schneiders medium. Når alle brøndene er fyldt op, hældes hydreret mineralolie i assayskålen, indtil brøndene og Minutien-stifterne er nedsænket. Brug en 20 μL pipettespids til at poppe eller fjerne luftbobler, der kan forstyrre de udskillede dråber.
5. Forberedelse af løsninger
- Forbered 2X Aedes aegypti saltvand og 10x glucose, som beskrevet i tabel 1, tilpasset fra Petzel og kolleger36. Stamopløsninger skal opbevares ved 4 °C. Lav arbejdslagre af 1X Aedes aegypti saltvand (tabel 1), og opbevar ved 4 °C. På forsøgsdagen skal du lade de arbejdende lagre komme til RT inden brug. Forbered frisk, hvis der er tegn på svampe- eller bakterievækst.
- For at forberede badedråben blandes Aedes saltvand (fra trin 5.1) med Schneiders medium i forholdet 1:1. Forbered dig i små aliquots, afhængigt af hvor meget der er behov for. Opbevar Schneiders medium i køleskabet, kassér det, hvis der er tegn på svampe- eller bakterievækst. (Dette trin skal udføres på dagen for eksperimentet).
- For Na+ -fluxmålinger ved hjælp af SIET fremstilles en modificeret Ca2+-fri Aedes-saltvand (tabel 2) som tidligere beskrevet26.
6. Myg MT'er og bagtarmdissektioner
- Til voksne myggedissektioner samles puppe i et lille bægerglas og anbringes i en krukke indeholdende en saccharoseopløsning til fodring. For at bestemme myggens alder skal du isolere klækkede myg og placere i en anden krukke, der bemærker myggenes alder og køn til fremtidige dissektioner.
- Placer kort myg, der skal dissekeres på en CO2-pude , og vent, indtil de ikke reagerer. Brug fine tang til at samle myggen op fra benet eller vingen og læg den på en silikone elastomerbelagt dissekeringsskål tilberedt i trin 1. Placer myggen på den ene side (sidesiden op), og spidder med en Minutien-nål i brystkassen for at sikre myggen på plads. Fjern eventuelt vinger og ben fra myg for lettere dissektion.
- Brug en Pasteur-pipette til at tilføje en dråbe RT Aedes saltvand for fuldt ud at nedsænke myggen i saltvand. Sørg for, at dissektionen er under saltvand (se tabel 1 for fremstilling af Aedes saltvand).
- Placer dissekeringsskålen under et stereoskopisk mikroskop. Klem det sidste abdominale segment med fine tang og træk langsomt væk fra myggen. Dette trin lettes ved samtidig at se under mikroskopet. Midgut, der er fastgjort med MT'erne og bagtargut, skal udsættes (figur 6).
- Til Ramsay-analysen skal du forsigtigt fjerne hvert rør fra midgut-hindgut-krydset, og sørg for ikke at beskadige organerne. Brug skarpe fine tang til at fjerne rørene individuelt - brug ikke beskadigede rør til analysen. (Se trin 7 for opsætning).
- For SIET skal du dissekere bagtarden i Ca2+-fri Aedes saltvand (trin 5.3). Sørg for, at poly-L-lysinskålen også har et fast volumen Ca2+-fri Aedes saltvand. Fjern forsigtigt neglebåndet fra endetarmen og læg bagtargen (kan fjerne andre vedhæftede organer, afhængigt af hvad der måles) i poly-L-lysinskålen. Hvis der måles iontransport langs rektalpuden epitel, placeres den hæmolymfevendte side af mindst én rektalpude, så mikroelektroden er tilgængelig (figur 7).
- Brug tang til at få fat i den bageste ende, bring bagtargen ned til bunden af fadet (uden at beskadige nogen strukturer, der måles). Så snart orgelet berører poly-L-lysinbeklædningen, klæber det fast. Denne dissekerede prøve er klar til målinger. (Se trin 14-16 for SIET-opsætning og -målinger).
- For ileumkontraktionsassayet skal det sikres, at bagtarmet forbliver fastgjort til midgut under dissektionen (figur 4D). Fjern forsigtigt MT'erne for at få et uhindret udsyn til bagtargutten. Dette organ overføres til en ny ret tilberedt som beskrevet i trin 4.1. (Se trin 17 for at få analysevideoer.)
7. Opsætning af Ramsay-analysen
- Brug spidsen af tangen til forsigtigt at løfte den proksimale (åbne) ende af tubuli ved at drapere den over tangen (klem ikke tubuli) og overfør den til en brønd i assayskålen. Dette trin kan også udføres ved hjælp af fine glasprober.
- Når tubuli er nedsænket i brønden, skal du hente den proksimale ende af tubuli med tangen, fjerne den fra badedråben og vikle enden rundt om stiften. Pak tubuli rundt om stiften to gange - og hold længden af tubuli tilbage i badedråbe i overensstemmelse med de andre rør. På dette tidspunkt skal den distale ende af tubuli være i badedråben, mens den proksimale ende vikles rundt om stiften væk fra badedråben, så den udskillede væske kan akkumulere på spidsen af stiften fra den åbne proksimale ende.
- Umiddelbart efter at tubuli er viklet rundt om stiften, skal du notere brøndene (f.eks. A, B, C), tidspunktet (som vil være starttidspunktet for, hvornår væsken begynder at blive udskilt fra tubuli) og andre identificerende oplysninger (f.eks. Hormon, genotype osv.).
- Hver myg har fem tubuli, og gentag således trin 7,1-7,3 med resten af rørene. Til kontrol og eksperimentelle behandlinger opdeles de fem tubuli inden for de forskellige behandlinger. Fortsæt med den næste dissektion, indtil hele assayskålen er fyldt. Med øvelse bør denne teknik typisk tage 2-3 min at dissekere rørene, overføre dem til badesaltvandet og vikle rundt om stiften, hvilket skaber en forskel på 2-3 minutter i starttidspunktet mellem hvert rør.
BEMÆRK: Inden eksperimentet påbegyndes, kalibreres mikroskopets okulære mikrometer med et trinmikrometer under det valgte mål. Udskillede dråber måles rutinemæssigt under en 40x-50x total forstørrelse. - Efter den tildelte inkubationstid kan den udskillede dråbe måles. Ved hjælp af mikroskopets okulære mikrometer måles og registreres diameteren af den udskillede dråbe. Diameteren (d) af den udskillede dråbe beregnes ved at gange den okulære enhedsdiameter målt ved kalibreringsomregningen (tabel 3). Beregn volumenet af den udskillede dråbe ved hjælp af ligningen, V = πd3/6.
- For at beregne sekretionshastigheden (nL min-1) skal du bruge ligningen, væskesekretionshastighed = V / sekretionstid, hvor V er volumenet af den udskillede dråbe beregnet i trin 7.5, og sekretionstiden refererer til inkubationsperioden for tubuli.
8. Opsætning af ISME
- Placer mikromanipulatorer på hver side af stereomikroskopet for at opsætte ISME-stationen. Klortering af sølvtrådene kan opnås ved at nedsænke i en opløsning af jernchlorid og tråde hver sølvtråd i hver af mikroelektrodeholderne (eller lodde ledningerne på koaksialkablerne, hvis det er nødvendigt). Gentag dette trin, når sølvtrådene bliver ukordrede.
- Tilslut sølvledningerne til en forstærker, som læses til et dataindsamlingssystem. Konfigurer og kalibrer systemet i henhold til producentens anvisninger. I tilfælde af øget elektrisk interferens skal du bruge et korrekt jordet Faraday-bur.
9. Klargøring af mikroelektroderne til ISME og SIET
- Brug en P-97 Flaming Brown pipettetrækker til at trække ~5-6 ufilamenterede borosilikatglaskapillærer (ydre diameter 1,5 mm, indvendig diameter 1,12 mm, længde 100 mm) med en spids på 1-5 μm. Disse vil blive anvendt som ionselektive mikroelektroder. For SIET-mikroelektroder skal den resulterende elektrode have en spidsåbning på ~ 5 μm, kendetegnet ved et kort skaft.
- Anbring mikroelektroderne på en kogeplade i en hætte (sæt forsigtigt ned for ikke at bryde elektrodernes spidser). Tilsæt dichlordimethylsilen inde i en 15 cm glas petriskål og inverter over elektroderne på kogepladen. Brug dichlordimethylsilan til at silanisere de ionselektive elektroder ved at tilsætte et hydrofobt lag til alle overflader af elektroden, så det kan bevare den hydrofobe ionophore37. Ubrugte silaniserede elektroder kan efterlades i et par uger; derfor udføres dette trin hvert par uger eller for nyligt trukne elektroder.
BEMÆRK: Vær forsigtig ved håndtering af dichlordimethylsilen – brandfarlig, ætsende og giftig, se MSDS for sikker håndtering.- Drej kogepladen til 350 °C, og lad den stå på plads i 75 minutter. Brug et 1:2 forhold mellem antallet af mikroelektroder og volumen (μL) dichlordimethylsilen til at tilføje på glaspetriskålen. For 10 mikroelektroder tilsættes således 20 μL dichlordimethylsilen.
- Efter 75 minutter skal du slukke for kogepladen. Når elektroderne og kogepladen er kølet af, skal du fjerne glassets petriskålen og overføre elektroderne (med tang) til en opbevaringsboks med støbeler. Sørg for, at spidsen af elektroden peger op for at forhindre skader.
- For at fremstille referenceelektroderne til ISME skal du trække ~4-5 filamenterede borosilikatglaskapillærrør (ydre diameter 1 mm, indvendig diameter 0,58 mm, længde 100 mm). Disse elektroder behøver ikke at blive silaniseret. Mærk og opbevar i en lignende kasse, og undgå skader på spidsen.
- SIET-referenceelektroder er lavet af standardglaskapillærer (udvendig diameter 2 mm, indvendig diameter 1,12 mm, længde 102 mm). Kapillærerne fyldes med smeltet 1 M KCl + 3% agar og skal opbevares i et 50 ml centrifugerør indeholdende 1 M KCl (fuldt nedsænket) indtil brug. De kan bruges gentagne gange, indtil bobler begynder at danne sig, eller hvis agaren går i stykker. Hvis der er noget luftrum, skal du bortskaffe glasset og bruge et nyt for at sikre, at kredsløbet er komplet.
10. Klargøring af genopfyldningssprøjterne
BEMÆRK: Dette trin udføres for at oprette sprøjter med fine spidser til genopfyldning af elektroder til ISME.
- Brug en 1 ml sprøjte med slip-tip med en engangsnål. Kassér nålen og træk sprøjten tilbage indtil 1 ml mærket. Tænd Bunsen-brænderen under røghætten, og opvarm sprøjtens plastikspids, indtil den begynder at smelte. Brug et gammelt par tang til forsigtigt at klemme den smeltede sprøjtespids og trække ned for at strække spidsen.
- Brug en saks til at skære den smeltede spids til den ønskede længde, så diameteren er lille nok til at passe ind i elektroderne (Se diagram). Når sprøjten er afkølet, skal du teste sprøjtens tryk med vand for at sikre, at der ikke er nogen blokering. Opret en for hver behov for udfyldningsløsning, og mærk den i overensstemmelse hermed (figur 8).
11. Påfyldning af ionselektiv og referencemikroelektrode for ISME og SIET
BEMÆRK: Mikroelektroden kan genbruges, så længe den stadig fungerer (kalibrer før hvert forsøg). For ISME kan dette trin udføres, mens MT'erne inkuberes i Ramsay-analysen.
- For at fremstille en Na +-selektiv mikroelektrode skal du bruge 1 ml sprøjten oprettet i trin 10 til at genopfylde elektrode med 100 mM NaCl. Sørg for, at genopfyldningsopløsningen fyldes, indtil spidsen af elektroden. Hvis der vises luftbobler, skal du forsigtigt svirpe mikroelektroden eller fjerne opløsningen og genopfylde. Dette skal gøres under et stereoskopisk mikroskop for at visualisere bedre.
- Under et stereoskopisk mikroskop dyppes en 10 μL pipettespids i den Na+-selektive ionophoreopløsning. Foring af elektroden vinkelret på pipetten, læg en behandsket finger over bunden af spidsen for at skabe tryk og udvise en lille dråbe ionofor. Visning under et mikroskops høje mål skal du forsigtigt røre dråben af ionofor til mikroelektrodespidsen og undgå at bryde spidsen. Normalt fyldes mikroelektroder fremad med en ionoforcocktailsøjlelængde på mellem 150-300 μm, indtil grænsen mellem ionofor/udfyldningsopløsning er flad.
FORSIGTIG: Denne iofor er giftig, se MSDS for sikker håndtering. - I et lille bægerglas fyldes der halvvejs op med 100 mM NaCl, og anbring noget modellervoks på indersiden øverst på bægerglasset. Når Na+ ionoforen er taget op, anbringes elektrodens tip-down på bægerglassets væg, så spidsen sidder inden for 100 mM NaCl, og opbevar ISME i bægerglasset, indtil den er klar til brug.
- For at fremstille ISME-referenceelektroden skal du genopfylde en elektrode med 500 mM KCl, hvilket sikrer, at opløsningen fyldes til spidsen (følg den samme protokol som ovenfor). Opbevar KCl i et bægerglas.
12. Kalibrering af elektroder til ISME
BEMÆRK: Dette trin udføres lige før målinger af den udskillede væske (~ 10-15 minutter før). Kalibreringer skal udføres hver ~ 5-6 måling for at sikre, at hældningen er konsistent.
- Belæg elektrodespidserne ved hjælp af en opløsning af ~ 3,5% (w / v) polyvinylchlorid opløst i tetrahydrofuran for at undgå forskydning af ioforen, når den nedsænkes i paraffinolie.
FORSIGTIG: Dette er brandfarligt, se MSDS for sikker håndtering. - For at kalibrere Na+- elektroden anbringes 10 μL-dråber af følgende NaCl-standardkoncentrationer på kanten af Ramsay-fadet med de inkuberede MT'er: 200 mM NaCl og 20 mM + 180 mM LiCl. Placer standarddråberne ~ 2 cm fra hinanden, med den højere koncentration ovenpå.
- Indsæt både referenceelektrode og ionselektiv elektrode over de klorderede sølvtråde, og fastgør dem sikkert ved hjælp af elektrodeholdere, der er fastgjort til mikromanipulatorer. Naviger begge elektroderne mod 200 mM NaCl-dråben ved hjælp af mikromanipulatorerne, og det sikres, at elektrodespidserne ikke rører bunden af fadet. Tænd for elektrometeret for at starte optagelsen, og lad aflæsningen stabilisere sig.
- Optag aflæsningen, og fortsæt til næste standard (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Beregn hældningen, og hvis elektrodeaflæsningen er stabil, og hældningen er inden for rækkevidde, skal du fortsætte med at bruge elektroden til de udskillede dråbemålinger. Hvis aflæsningen er ustabil, ikke giver en ordentlig optagelse eller hældning eller tager et stykke tid at udligne, skal du forberede enten en ny ionselektiv elektrode eller bryde selve spidsen af referenceelektroden ved at køre et væv over spidsen. Hældningen for Na+ skal være ~58-60 mV38, selvom en acceptabel rækkevidde er 50-60 mV.
13. ISME-registreringer og -beregninger
- Efter målinger af væskesekretionshastigheden (se trin 7.7) skal du forsigtigt flytte både reference- og ionselektiv elektroden ind i den udskillede dråbe ved hjælp af mikromanipulatorerne. Tænd for optagelsen, og lad læsningen stabilisere og optage værdi. Gentag dette trin for de andre dråber (gentag kalibreringsmålingerne hver ~5-6 måling).
- Kationkoncentrationer beregnes ved hjælp af den tidligere beskrevne ligning22,38, [ion] = [C] x 10ΔV/m, hvor [C] er koncentrationen i mmol L-1 af kalibreringsopløsningen, der anvendes til at kalibrere ISME, ΔV er spændingsændringen mellem den spænding, der registreres fra den udskillede væskedråbe, og spændingen i den samme kalibreringsopløsning og m er spændingsforskellen mellem de to standardkalibreringer, som også er hældningen.
14. SIET opsætning
BEMÆRK: SIET-systemet er tidligere beskrevet27,39. For at reducere baggrundsstøj installeres et Faraday-bur omkring lysmikroskopet og hovedscenen. Eksperimenter, der præsenteres i dette papir, bruger følgende indstillinger på ASET-softwaren (Automated Scanning Electrode Technique) 2.0: en ventetid på 4 sekunder for at gøre det muligt for iongradienter at genoprette fuldt ud efter mikroelektrodebevægelser, hvor spændingen registreres i 0,5 s efter ventetiden, en udflugtsafstand på 100 μm og tre gentagelser for hver optagelse. Visse indstillinger kan ændres af brugeren i ASET efter behov.
- Tænd for IPA-2 Ion/Polarographic Amplifier, lysmikroskopet (med et vedhæftet videokamera) og den eller de computere, der er tilsluttet hver af disse kørende ASET og cellSens.
- Forbered mikroelektroder og referenceelektroder beskrevet i trin 9.1-9.3, 9.5, 10 og 11.1-11.3. Den ionselektive mikroelektrode vil indeholde Na+ ionophore med 100 mM NaCl-udfyldning, og referenceelektroden (med agarbroerne) vil altid blive fyldt med 3 M KCl.
- Anbring Na+-selektiv mikroelektrode på holderen, der består af en sølvchloridtråd (AgCl), og fastgør den til det kvindelige stikstik. Brug en sprøjte til at fylde referenceelektrodeholderen med frisk 3 M KCl (kan fremstilles før forsøgsdagen og opbevares på RT).
BEMÆRK: Efter forsøg skal referenceelektrodeholderen vaskes ud med ddH2O. - Fjern en referenceelektrode fra bægerglasset, der indeholder alle referenceelektroder nedsænket i 3 M KCl, anbring en finger i den ene ende og vip glaskapillæren mod denne finger for at forhindre, at agaren falder ud. Placer forsigtigt den ene ende i holderen, og sørg for, at der ikke dannes bobler. Hvis der er en boble, skal du fjerne referenceelektroden, genopfylde holderen med mere 3 M KCl og gentage. Anbring elektrodeholderen i det kvindelige stikstik.
15. Kalibrering af elektroder til SIET
- Til Na+-målinger skal du bruge en 150 mM NaCl og 15 mM NaCl + 135 mM LiCl-opløsning24. Der bør være en 10 gange forskel i Na+-koncentrationerne mellem de to opløsninger, der omfatter na+-niveauerne (20 mM) i saltvandet (tabel 2).
- Opbevar kalibreringsopløsninger ved RT i et 50 ml centrifugerør og alikvot i en petriskål, når eksperimentet udføres. Denne alikvote bortskaffes i slutningen af dagen. Hvis der er tegn på forurening i stamopløsningerne, bortskaffes og fremstilles friske opløsninger.
- For at kalibrere skal du alicitere de to kalibreringsopløsninger (trin 15.1) i individuelle 35 mm petriskåle og placere disse på mikroskoptrinnet. Brug de manuelle justeringsknapper, der styrer stepmotorerne med "deaktiver" valgt på computerens bevægelsesstyreenhed, skal du sikre, at mikroelektrodespidsen er placeret inde i kalibreringsopløsningen. Nedsænk ikke spidsen for langt, da den kan gå i stykker. Hvis spidsen går i stykker, skal du forberede en ny ionselektiv mikroelektrode og kalibrere igen.
- Åbn ASET-softwaren på den computer, der er tilsluttet forstærkeren. Åbn Kalibreringsindstillinger. Vælg Nernst Slope for kalibreringstypen, indstil prøven i 3 sekunder, og indtast koncentrationerne af kalibreringsløsningerne. For eksempel skal du til Na+ -målinger indtaste 150 mM i opløsning 1, placere den Na+-selektive mikroelektrodespids og referenceelektrode inde i denne kalibreringsopløsning. Spændingsaflæsningen på forstærkeren skal være stabil. Klik på Løsning 1, vent på, at spænding (i mV) registreres. Placer derefter mikroelektroden og referenceelektroden inde i 15 mM NaCl + 135 mM LiCl-opløsningen, indtast 15 mM i opløsning 2 og klik på Løsning 2 for at opnå spændingsaflæsningen. Hældningen vil være forskellen mellem disse to spændinger, beregnet i disse indstillinger. Klik på OK efter kalibrering.
- Hældninger for Na+-selektive mikroelektroder for en tidobling af ionkoncentrationen bør være omkring 59,0 ± 1,624. Hvis Nernst-hældningen afviger meget fra dette interval, skal du forberede en ny mikroelektrode eller aliquot nye standarder (da de kan være forurenet). Kalibrering er påkrævet før hver 2-3 prøver, afhængigt af spændingsstabiliteten. Hvis spændingen bliver ustabil og begynder at svinge, skal du forberede en ny ionselektiv mikroelektrode.
16. SIET-målinger
BEMÆRK: Motorkontakten på Computerens bevægelsesstyreenhed skal altid skiftes til Deaktiver, undtagen når elektroden manipuleres ved hjælp af computertaster via ASET eller under måleoptagelser (på hvilket tidspunkt nøglen skal skiftes til Aktiver).
- Efter kalibrering dissekeres organet (se trin 6.6). Anbring poly-L-lysindskålen med den dissekerede prøve på mikroskoptrinnet, og indsæt spidsen af referenceelektroden inde i saltvandet. Nedsænk spidsen af den ionselektive mikroelektrode i saltvandet, og pas på ikke at bryde spidsen.
- Brug de manuelle justeringsknapper til at justere mikroelektrodepositionen, mens du kigger under lysmikroskopet. Juster mikroelektrodens lodrette position, således at dens spids er på samme plan som organet eller vævet. Når du er i den ønskede position, skal du dreje motorkontakten til Aktiver. På dette tidspunkt kan stepmotorerne kun betjenes ved hjælp af computersoftwaren.
- Brug computerens piletaster til at flytte mikroelektroden vandret til en position 3 mm væk fra vævet for at måle baggrundsoptagelser. Indsæt noter ved at trykke på F2. Når du er klar, skal du begynde at optage (ved at trykke på F5). Få fem målinger af baggrundsaktivitet. Den gennemsnitlige baggrundsspændingsaktivitet for hver prøve trækkes fra spændingsgradienterne målt langs vævet for den samme prøve.
- Flyt mikroelektrodespidsen tilbage tæt på vævet, og pas på ikke at gennembore organet. Reducer keyhit-følsomheden for at placere mikroelektrodespidsen 2 μm direkte til højre, vinkelret på vævet. Få tre optagelser på hvert sted langs rektalpuden for at identificere stedet for den største ionaktivitet. Få baseline saltholdige målinger på det sted, der viser størst aktivitet ("hotspot" -stedet).
- Skift motoren til Deaktiver, og tilføj den passende behandling i skålen for at opnå den endelige ønskede dosis. Efter anvendelse skal du oprette en ny note (dvs. behandlingsnavn og dosis), skifte motor tilbage til Aktiver og tage spændingsoptagelser ved hjælp af F5. Hvis målet er at observere ændringer over tid, skal du fortsætte med at foretage målinger med bestemte tidsintervaller. Flere protokoller kan oprettes til specifikke applikationer ved hjælp af SIET, afhængigt af forskerens mål.
- Se ASET-softwaren registrere spændingen på stedet langs vævet og trække denne fra spændingen i en udflugtsafstand (figur 7) på 100 μm væk fra vævet. Da den første optagelse tages ved vævet, indikerer en positiv spændingsforskel, at spændingen er højere ved epitelet (væv) (figur 7A) end væk fra epitelet (figur 7B), og dermed absorberes kationen. En negativ spændingsgradient er tegn på kationsekretion.
- Få baggrundsoptagelser igen efter behandlingen (3 mm væk), og brug disse ved beregning af ionflux efter behandlingen. Lav et sæt baggrundsoptagelser i "baseline" og et sæt efter behandlingen. Skift motoren til Deaktiver, når mikroelektroden ikke justeres med computertasterne, eller når spændingen ikke registreres. Eksporter dataene til en tekstfil, og åbn ved hjælp af Excel for at udføre alle beregninger.
- Beregn ionflux ved hjælp af ligninger beskrevet tidligere24,26. Nettoionfluxen for hver behandling kan udtrykkes som en absolut ændring i basislinje-ionfluxmålingerne. For at verificere resultaternes betydning kan der anvendes en køretøjskontrol (dvs. tilsætning af saltvand alene i skålen i stedet for en behandling). Ændringer i iontransport efter hormonbehandlingen bør vurderes i forhold til eventuelle ændringer som reaktion på denne kontrol.
17. Hindgut sammentrækningsassays
- Fyld en af brøndene i fadet beskrevet i trin 4.1 med et kendt volumen Aedes saltvand (trin 5.1). Efter dissektion (trin 6.7) skal du forsigtigt overføre den dissekerede bagtarm, der er fastgjort til midguten, til brønden i den anden skål, og sørg for ikke at klemme det organ, der undersøges (ileum). Nedsænk tarmen i saltvandet inde i brønden, og læg Minutien stifter i midgut og endetarm. Ved at gøre dette bør ileum ikke være under spænding, og spontane sammentrækninger, der stammer fra pylorisk ventil ved det forreste ileum, bør observeres.
- Tilslut et videokamera til et stereoskopisk mikroskop, og optag videoer ved hjælp af en videooptagelsessoftware (f.eks. Lumineras INFINITY CAPTURE). Læg fadet med det dissekerede organ under mikroskopet og optag i 2 min. Dette vil være "Baseline" -betingelsen.
- Tilsæt et kendt volumen på 1X Aedes saltvand (trin 5.1) til brønden for at tage højde for eventuelle ændringer i ileal motilitet ved stigende volumen i brønden. Vent i 1 minut efter påføring, og optag derefter igen i 2 minutter. Dette er tilstanden "saltvand".
- Tilsæt et kendt behandlingsvolumen (fra en 10x lagerkoncentration for at opnå den ønskede dosis i brønden). Vent i 1 minut efter påføring, og optag derefter igen i 2 minutter. Dette vil være "behandling" -tilstanden.
- Gem alle videoer, og konverter dem til MP4. For at analysere skal du tælle antallet af sammentrækninger i 2 minutters intervaller (defineret som en peristaltisk bølge, der initierer ved pylorventilen og strækker sig gennem ileum). Del dette tal med 2 minutter for at opnå sammentrækningshastigheden. Andre parametre kan også vurderes, såsom sammentrækning eller afslapningsvarighed. Efter indsamling af rådata udtrykkes hver parameter i forhold til dataene for "baseline"-betingelser for hver prøve. Plot fold-ændringen for "saltvand" og "behandling" alle i forhold til "baseline".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af DH31 mod ustimulerede MT'er resulterer i en signifikant stigning i væskesekretionshastigheden, hvilket bekræfter dets rolle som et diuretisk hormon i Aedes-myg (figur 1A). Når tubuli behandles med AedaeCAPA-1, observeres en reduktion i sekretionshastigheden i DH31-stimulerede MT'er. Figur 1B viser brugen af ionselektive elektroder til måling af Na+ -koncentrationer i de udskillede dråber. Behandling af DH31 på MT'erne havde ingen effekt på Na+- koncentrationen i den udskillede dråbe; Men med anvendelsen af AedaeCAPA-1 blev Na+- koncentrationen i den udskillede væske signifikant forøget. Sammenlignet med ustimulerede kontroller førte DH31 desuden til en signifikant større Na+ transportrate, mens AedaeCAPA-1 afskaffede denne stigning i DH31-stimulerede tubuli (figur 1C). Sammen viser disse prøveresultater, hvordan væskesekretionshastigheder efter påføring af diuretiske og antidiuretiske hormoner kan måles såvel som ionkoncentrationen i de udskillede dråber. Tre til seks dage gamle hunner blev dissekeret, og mellem 23-35 MT'er blev analyseret til eksperimentet. Forskelle blev betegnet som statistisk signifikante, hvis p < 0,05 ved hjælp af en envejs ANOVA og uparrede t-tests.
SIET blev brugt til at vurdere ændringer i Na + transport langs rektal pad epithelia af voksne kvindelige myg. De fleste ustimulerede recta undersøgte udviste hæmolymfestyret Na+ transport (absorption), og derfor blev kun disse præparater undersøgt. På grund af variation i baselineaktivitet blev forskellen i ionflux efter enten saltvands- eller peptidpåføring i forhold til den indledende transportaktivitet i saltvand beregnet. Disse værdier giver en negativ ændring i ionflux (ionflux efter behandling - ionflux i baseline-tilstande), selvom alle organer forblev absorberende efter behandlinger. En leucokininanalog (Drosokinin) blev anvendt til at undersøge ændringer i Na+ -absorptionen, hvilket resulterede i et firedobbelt fald i Na+ -absorptionen sammenlignet med saltvandskontrol (figur 2).
For at vurdere rollen som et neuropeptid, pyrokinin-2 (PK2), på ilealmotilitet blev der anvendt en Rhodnius prolixus-analog , som tidligere viste sig at aktivere A. aegypti PK2-receptoren, beriget i myg ileum28. I forhold til baseline-niveauer hæmmer PK2 signifikant ileale sammentrækninger (figur 3).
Figur 1: Effekt af diuretiske og antidiuretiske neuropeptider på in vitro-væskesekretionshastighed, Na + -koncentration og transporthastighed hos voksne kvindelige A. aegypti MT'er. Aedae CAPA-1 (0,1 fM) blev anvendt på MT'er stimuleret med DromeDH31 (25 nM). (A) MT'er blev inkuberet i 60 minutter med neuropeptider og 120 minutter for ustimulerede kontroller. (B) Na+-koncentrationer i den udskillede dråbe blev målt ved hjælp af ISME, og der blev anvendt værdier til beregning af transporthastigheden (C). Kolonner, der er væsentligt forskellige fra kontroller, betegnes med det samme bogstav som bestemt af en envejs ANOVA og Bonferroni efter test (n = 23-35). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ændringer i Na + transport over kvindelig rektal pad epithelia målt ved hjælp af SIET. Na+- absorption blev registreret ved ustimulerede baseline-saltvandsbetingelser efterfulgt af behandling med enten yderligere saltvand (køretøjskontrol) eller 1 μM Drosokinin (n = 10-12). Ændringer i hæmolymfestyret Na+ -flux blev målt for hver behandling. Der var et firedobbelt fald i Na + -absorptionen som reaktion på Drosokinin, som bestemt ved en uparret to-halet t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ændring i ileal motilitet hos kvindelige myg efter saltvand (køretøjskontrol) og RhoprPK2-anvendelse. Ændringen i sammentrækningsfrekvensen efter begge behandlinger blev registreret for hver prøve i forhold til baseline-betingelserne (n = 32). Rhopr PK2 reducerede ileal motilitet, som bestemt af en parret to-halet t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Skematisk over Ramsay-analysen, anvendelse af ionselektive mikroelektroder (ISME), scanningsionselektiv elektrodeteknik (SIET) og bagtarmskontraktionsassays. Illustrationer af de fire metoder, der anvendes til at bestemme de funktionelle roller af endokrine faktorer på myggens udskillelsessystem, Aedes aegypti. (A) Ramsay-assayet bruges til at måle væskesekretionshastigheder i isolerede malpighiske tubuli. Den proksimale (åbne) ende af tubuli er viklet rundt om en stift, omgivet af mineralolie, mens den distale (lukkede) ende bades i behandlingssaltvandet. Efter en bestemt tidsperiode vil den proksimale ende udskille den primære urin og akkumulere som dråber på stiften. (B) En referenceelektrode og ISME anbringes i den udskillede dråbe, der er forbundet til et dataindsamlingssystem, for at måle ionkoncentrationen. (C) SIET måler iontransport ved hjælp af en ionselektiv mikroelektrode vinkelret placeret ~ 2 μm væk fra organet, der klæbes til bunden af en poly-L-lysinskål. Retningen af de røde pile i dette skema indikerer, at Na + absorberes i saltvandet, indikeret ved en større spændingsoptagelse langs epitelet i forhold til området væk fra organoverfladen. (D) Hindgut sammentrækningsassays udføres ved hjælp af videooptagelser til at vurdere ændringer i sammentrækningsfrekvens, længde og afslapningsvarighed. I denne skematisk placeres organerne inde i en brønd, og en metalstift indsættes direkte i midgut og endetarm for at give ileum mulighed for frit at flyde og trække sig sammen. Behandlinger tilsættes i brønden for at vurdere ændringer i bevægelighed både kvalitativt og kvantitativt. Oprettet ved hjælp af BioRender. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Retter, der anvendes til (A) dissekering af myg, (B) Ramsay-assay, (C) SIET og (D) sammentrækningsanalysemålinger. A, B og D er fuldstændigt belagt med silikone, mens C er belagt med poly-L-lysin i midten. For at forberede skålen, der bruges til Ramsay-analysen (B), anvendes en lille silikonebelagt petriskål, og små ~ 4-5 mm brønde udskæres 1 cm fra hinanden (ca. ~ 20 brønde kan udskæres / fad). Minutien metalstifter placeres ved siden af hver brønd for at holde fast i det isolerede rør for at måle væskesekretionshastigheden. Poly-L-lysinskålen (C) gør det muligt for organet at klæbe til bunden under SIET-målinger. Brøndene i sammentrækningsanalyseskålen (D) er fyldt med saltvand og eventuelle følgende behandlinger. Det kontraherende organ, der er placeret inde i brønden, observeres ved hjælp af et videokamera. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Udskillelsessystemet af myg, Aedes aegypti. Efter et blodmel ledes opløste stoffer, vand og næringsstoffer langs fordøjelseskanalen, som omfatter (men ikke er begrænset til) midgut, pylorisk ventil, MT'er og bagtarm. Midgut er det vigtigste sted for fordøjelse af fødevarer og næringsstofabsorption. De fem MT'er transporterer vand, opløste stoffer og affald fra den omgivende hæmolymfe og udskiller denne primære urin i bagtarmen, der består af en forreste ileum og bageste endetarm, hvoraf sidstnævnte omfatter fire (mandlige) eller seks (kvindelige) rektale puder. Bagtargen fungerer som det endelige reabsorptionssted, før affald udskilles. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Stillbilleder af en dissekeret myggekviste under SIET-målinger. For at måle ionaktivitet langs epitelen af en af de seks rektale puder placeres den Na+-selektive mikroelektrode 2 μm væk fra vævet (A). Spændingen registreres på dette sted, før mikroelektrodespidsen flyttes i en udflugtsafstand (Δx) på 100 μm væk fra dette punkt (B). Spændingsgradienten mellem disse to punkter bruges til at beregne koncentrationsgradienten og ionfluxen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Genopfyldningssprøjterne til ISME og SIET. Et billede af de sprøjter, der bruges til at fylde NaCl- og KCl-opløsninger op i mikroelektroderne. Dette viser fire 1 ml slip-tip sprøjter med engangsnåle, med en modificeret strakt spids for at muliggøre indsættelse i en elektrode. Klik her for at se en større version af denne figur.
| 2X Aedes aegypti saltvand | ||
| Til 500 ml: | ||
| Tilsæt 400 ml ddH2O i et bægerglas, og tilsæt derefter følgende opløste stoffer: | ||
| Komponent | Vægt (g) | Endelig koncentration (mM) |
| NaCl | 8.766 | 150 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| KCl | 0.253 | 3.4 |
| NaOH | 0.3 | 7.5 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| CaCl2-2H20 | 0.249 | 1.7 |
| Rør rundt, og juster pH til 7,1 | ||
| Tilsæt ddH2O til det endelige volumen på 500 ml for at gøre 2x Aedes saltvand | ||
| 10X glukose | ||
| Til 500 ml: | ||
| Tilsæt 450 ml ddH2O i et bægerglas, og tilføj derefter: | ||
| Komponent | Vægt (g) | Endelig koncentration (mM) |
| Glukose | 4.5 | 5 |
| Rør rundt og tilsæt ddH2O til det endelige volumen på 500 ml | ||
| Sådan laver du 1X Aedes aegypti saltvand: | ||
| Til 100 ml: | ||
| Tilsæt 40 ml ddH2O i et bægerglas, og tilføj derefter: | ||
| Komponent | Volumen (ml) | |
| 2x Aedes saltvand | 10 | |
| Rør, juster pH til 7,1 | ||
| Filter sterilisere | ||
Tabel 1: Fremstilling af Aedes aegypti saltvand. For at fremstille Aedes saltvand skal du separat forberede 2X Aedes saltvand og 10x glucose, opbevares i 4 ° C køleskab. Brug disse to løsninger til at forberede arbejdslagre (1x Aedes saltvand), der anvendes til dissekering af væv, Ramsay-assays og sammentrækningsassays.
| Calciumfri Aedes aegypti Saline + NMDG | ||
| Til 500 ml: | ||
| Tilsæt 400 ml ddH2O i et bægerglas, og tilsæt derefter følgende opløste stoffer: | ||
| Komponent | Vægt (g) | Endelig koncentration (mM) |
| NaCl | 1.17 | 20 |
| NMDG | 25.38 | 130 |
| HEPES | 5.957 | 25 |
| KCl | 0.253 | 3.4 |
| NaHCO3 | 0.151 | 1.8 |
| MgSO4 | 0.12 | 1 |
| Glukose | 0.9 | 5 |
| Rør rundt, og juster pH til 7,1 | ||
| Tilsæt ddH2O til det endelige volumen på 500 ml | ||
Tabel 2: Modificeret Aedes aegypti saltvand anvendt til SIET-målinger. Denne Ca2+-fri saltvand bruges til at forhindre spontane bagtarmskontraktioner under SIET-målinger. Dette saltvand er specifikt til måling af Na+ -transport, da det består af reduceret Na+ (20 mM), der består af equimolær substitution med N-methyl-D-glucamine (NMDG) for at reducere baggrundsstøj.
| DH31-stimulerede MT'er | Dråbediameter (enheder) | Dråbediameter (um) | Dråbevolumen (um3) | Sekretionshastighed (nl/min) |
| n | Behandling nr. 1 (60 min) | Behandling nr. 1 (60 min) | Behandling nr. 1 (60 min) | Behandling nr. 1 (60 min) |
| 1 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 2 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 3 | 17 | 333.33 | 19392547.25 | 0.32 |
| 4 | 13 | 254.90 | 8671977.67 | 0.14 |
| 5 | 14 | 274.51 | 10831090.91 | 0.18 |
| 6 | 22 | 431.37 | 42029685.15 | 0.70 |
| 7 | 15 | 294.12 | 13321768.16 | 0.22 |
| 8 | 16 | 313.73 | 16167692.56 | 0.27 |
| 9 | 20 | 392.16 | 31577524.53 | 0.53 |
| Betyde | 16.33333333 | 320.26 | 18776785.52 | 0.31 |
| STD FEJL | 0.06 |
Tabel 3: Eksempel på Ramsay-analysedata. Tabel, der viser prøvedata indsamlet fra DH31-stimulerede MT'er fra voksne kvindelige myg. Når du måler diameteren af den udskillede dråbe, skal du først måle med stereomikroskopet okulært mikrometer og notere værdien. Multiplicer derefter den okulære enhedsdiameter med kalibreringskonverteringen udført før eksperimentet for at få dråbens diameter i μm. Beregn volumenet af ligningen næste ved hjælp af ligningen noteret i trin 7.7 efterfulgt af sekretionshastigheden ved hjælp af ligningen noteret i trin 7.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når de indtager et blodmåltid, står hæmatofaginsekter over for udfordringen med overskydende opløste stoffer og vand i deres hæmolymfe2. For at klare dette har de et specialiseret udskillelsessystem, som er tæt kontrolleret af hormonelle faktorer, så insekterne hurtigt kan starte post-prandial diurese. Ramsay-analysen og anvendelsen af ionselektive mikroelektroder gør det muligt at måle væskesekretionshastigheder sammen med ionkoncentrationer og transporthastigheder i isolerede insekt-MT'er. Kritiske trin inden for disse tilgange omfatter sikring af korrekt dissektion af insektet MT'erne. Individuel fjernelse af hvert rør fra insektet skal udføres omhyggeligt, da enhver skade på tubuli vil medføre, at væsken udskilles fra riven eller føre til et ikke-funktionelt præparat. Aedes MT'er udskilles ikke let i ustimulerede kontroller, således at hormoner og lægemidler kan anvendes til at stimulere sekretion. Men selv med vanddrivende påføring eller omhyggelig dissektion kan nogle MT'er muligvis ikke udskilles, hvis de beskadiges (selvom det slet ikke er indlysende med visuel inspektion), og det kan derfor være muligt at udføre flere runder af assayet. For korrekt brug af ionselektive elektroder under både ISME- og SIET-målinger skal du sikre, at standardernes hældning ligger inden for det normale område, der er rapporteret for ionoforen, hvilket vil give de mest nøjagtige aflæsninger. Men hvis aflæsningerne er ustabile, skal du undersøge elektroden under mikroskopet for at bekræfte, at inoforen er blevet optaget og ikke lækker. En ny elektrode skal forberedes, hvis der er luftbobler til stede, spidsen er brudt, eller ioforen ikke er taget ordentligt op. Hvis ionophor/genopfyldningsgrænsen er konveks, er elektroderne undersilaniserede, og der bør anvendes mere dichlordimethylsilan. Hvis grænsen er konkav, oversilaniseres elektroderne, og der skal anvendes mindre dichlordimethylsilan. Derudover kan nogle elektroder være mindre stabile end andre, såsom den Na+-selektive elektrode, hvorved hældningen forringes hurtigere sammenlignet med K+ eller H+.
Disse tilgange giver ubegrænsede muligheder for at studere mekanismerne bag væskesekretion af MT'erne. På grund af de seneste fremskridt inden for genomisk redigering kan omvendte genetiske strategier som CRISPR-Cas9-genredigering og RNA-interferens bruges til at undersøge den regulatoriske og / eller funktionelle rolle af specifikke gener udtrykt i udskillelsesorganer. Undersøgelser har brugt sådanne værktøjer til at forstå den hormonelle regulering i Aedes40 og Drosophila41 MTs. Derudover kan badedråben ændres for at se på de specifikke roller af hormoner14,15,18,21,42, second-messenger systemer og lægemidler på sekretionshastighed og ionkoncentrationer. Disse metoder er blevet anvendt i forskellige andre insekter såsom Rhodnius prolixus38, larve og voksne myggearter, Drosophila41 og majfluearter (Hexagenia rigida)43. Tilsvarende kan forskellige ioner undersøges, såsom Cl-, K+, H+ og NH4+.
Under SIET-målinger kan der være variation mellem hver prøve under baseline-betingelser. Forskelle kan stadig opstå, når man kontrollerer myggens alder, køn og fodringstilstand, især når man undersøger forskellige områder af tarmen (dvs. visse afstande forreste eller bageste fra ileum-endetarmskrydset). Disse forskelle kan forklares ved at udtrykke ionflux efter behandling som en ændring i forhold til baseline-betingelserne. Over tid kan ionaktiviteten også svinge, og derfor er det vigtigt at vurdere ændringer i forhold til en køretøjskontrol (saltvand), som vist i resultaterne præsenteret her. Hvis spændingsaflæsningerne begynder at svinge drastisk, skal du forberede en ny ionselektiv mikroelektrode og kalibrere igen. Brug af en tredje kalibreringsopløsning (fortyndet 10 gange fra den laveste kalibreringsopløsningskoncentration) kan yderligere hjælpe med at etablere en mere nøjagtig Nernst-hældning. Da Na+- aktivitet typisk er meget modtagelig for baggrundsstøj, anvendes en modificeret Aedes-saltvand bestående af mindre Na+ (tabel 2). Det er også vigtigt at holde afstand til Faraday-buret under målinger for at undgå interferens og reducere enhver baggrund. Derudover, hvis organet stadig producerer spontane sammentrækninger, når det klæbes til poly-L-lysin i bunden af skålen, vil tilsætning af en calciumchelator til saltvand yderligere bidrage til at forhindre dette. Hvis man undersøger iontransport langs rektalpuden epitel, som vist i de resultater, der præsenteres her, er det vigtigt at identificere det "hotspot" -sted, der udviser størst ionaktivitet, ved at flytte mikroelektrodespidsen i små trin langs den hæmolymfevendte side af rektalpuden. Hvis det ikke er muligt at opdage store ændringer i ionaktiviteten, kan organet være blevet beskadiget, eller mikroelektrodespidsen er ikke i samme tredimensionelle plan som rektalpudeåbningen, og derfor skal en anden myg dissekeres.
SIET kan bruges til forskellige eksperimenter, såsom at undersøge ionaktivitet hos myg opdrættet under forskellige forhold25 eller fodres med forskellige kostvaner (dvs. saccharosefodret vs. blodfodret vs. ædt), hvilket kan være nyttigt til at identificere iontransportmekanismer, der er kritiske efter et blodmåltid. Det er derfor vigtigt at sikre, at der foretages målinger fra samme sted mellem prøverne. For eksempel kan målinger tages fra ileum-endetarmskrydset eller i bestemte afstande placeret forrest fra dette sted (langs ileum) eller posteriorly (langs det rektale epitel). Disse målinger kan også opnås langs det rektale pudeepitel, der kræver forskellig placering af organet i fadet. Derudover er det vigtigt at bemærke, at SIET ikke er begrænset til måling af ionaktivitet udelukkende langs bagtargutten; andre organer, herunder midgut og MT'er kan også undersøges. Tilsvarende kan K+, H+, NH4+ og Cl-flux måles ved hjælp af SIET25,44,45, og målinger kan foretages med faste tidsintervaller efter en behandling44. Denne teknik er blevet anvendt på både larve og voksne myg26,44 samt forskellige andre insekter, herunder Chironomus riparius46, Trichoplusia ni45,47 og Hexagenia rigida43. Disse eksperimenter kan bruges sammen med Ramsay-analysen og ISME for at få en bedre forståelse af forskellige behandlingers og miljøfaktorers rolle på væskesekretion, ionkoncentration og iontransport.
Endelig er sammentrækningsassays nyttige til at identificere neuroendokrine faktorer, der påvirker tarmmotiliteten. Det er afgørende, at det undersøgte organ ikke er beskadiget, da dette assay er afhængig af bevægelser genereret af muskulatur. Derfor bør tang kun bruges til at gribe omgivende strukturer, når organerne overføres til assayskålen. At gribe fat i disse tilstødende organer med en stift inde i brønden forhindrer dem også i at bevæge sig og påvirke bevægelsen af det isolerede organ, der undersøges. Hvis der ikke observeres spontane sammentrækninger, kan vævet være blevet beskadiget, og en ny dissektion er påkrævet. Andre metoder, der almindeligvis anvendes til at undersøge insekttarmkontraktil aktivitet, omfatter brugen af en krafttransducer32 eller impedansmonitor33. Disse metoder kan også bruges til at måle sammentrækningshastigheden i myggets bagtarm; Men hvis målet er visuelt at undersøge disse ændringer gennem videooptagelser, vil de metoder, der er beskrevet i denne protokol, være gavnlige og kan bruges til yderligere analyse48.
De fire teknikker, der er skitseret i denne protokol, har hjulpet med at udlede rollen som en række neuropeptider i udskillelsessystemet af forskellige insekter. Brug af disse metoder i forbindelse med yderligere teknikker, der anvendes af insektfysiologer, såsom kvantitativ PCR og immunhistokemi, kan give en mere omfattende forståelse af underliggende veje og signalsystemer, som kan tjene som nye potentielle mål for vektorkontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants til AD og J-PP. AL og FS modtog NSERC CGS-M-priser til støtte for deres kandidatforskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955456 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning Falcon (Fisher Scientific) | C351008 | |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | used for ISME reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary filamented tubes (OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm) |
World Precision Instruments | 1B200F-4 | used for SIET reference electrodes |
| Borosillicate glass capillary unfilamented tubes (OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm) |
World Precision Instruments | TW150-4 | used for ISME and SIET electrodes |
| CO2 pad | Diamed | GEN59-114 | |
| Dimethyltrimethylsilylamine solution | Sigma-Aldrich | 41716 | |
| Faraday cage | Custom | Can be fabricated by local machine shop | |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-748A | |
| Hydrated mineral oil | Fisher Scientific | 8042-47-5 | Specific brand is not important |
| INFINITY1-2CB video camera | Luminera | INFINITY1-2CB | |
| Micromanipulators (left and right handed) | World Precision Instruments | MMJL and MMJR | Specific brand is not important so long as high quality manipulator |
| Mineral Oil, Light | Fisher Scientific | 0121-4 | |
| Minutien pins (0.1 mm stainless steel) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Non-hardening modeling clay | Sargent Art | Specific brand is not important | |
| Olympus light microscope (FOR SIET) | Olympus | customized system | |
| Plastic Pasteur (transfer) pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) | Sigma-Aldrich | A-005-M | 84 kDa |
| Polyvinyl chloride (PVC) | Sigma-Aldrich | 81395 | |
| Scalpel Blade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10053-09 | |
| Schneider's Drosophila medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| SIET system | Applicable Electronics | customized system | Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview |
| Silver wire | World Precision Instruments | AGW1010 | |
| Sodium ionophore II cocktail A | Fluka | 99357 | |
| Standard polystyrene Petri (culture) dishes | Fisherbrand | FB012921 | Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay |
| Stereomicroscope with ocular micrometer | Nikon | SMZ800 | |
| Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller | Sutter Instruments | FGPN7 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Chemical Company | NC9285739 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| VWR advanced hotplate stirrer - aluminum | VWR | 9578 | Specific brand is not important |
References
- Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic factors in insects: the role of CAPA peptides. General and Comparative Endocrinology. 176, 300-308 (2012).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. Journal of Experimental Biology. 206, 3845-3856 (2003).
- Bradley, T. J.
- Patrick, M. L., Aimanova, K., Sanders, H. R., Gill, S. S. P-type Na+/K+-ATPase and V-type H+-ATPase expression patterns in the osmoregulatory organs of larval and adult mosquito Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 209, 4638-4651 (2006).
- Coast, G. The endocrine control of salt balance in insects. General and Comparative Endocrinology. 152, 332-338 (2007).
- Maddrell, S. H. P., Overton, J. A. Methods for the study of fluid and solute transport and their control in insect Malpighian tubules. Methods in Enzymology. , 617-632 (1990).
- Beyenbach, K. W., Oviedo, A., Aneshansley, D. J. Malpighian tubules of Aedes aegypti: Five tubules, one function. Journal of Insect Physiology. 39, 639-648 (1993).
- Misyura, L., Yerushalmi, G. Y., Donini, A. A mosquito entomoglyceroporin, Aedes aegypti AQP5, participates in water transport across the Malpighian tubules of larvae. Journal of Experimental Biology. 220, 3536-3544 (2017).
- Drake, L. L., Rodriguez, S. D., Hansen, I. A. Functional characterization of aquaporins and aquaglyceroporins of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 5, 7795 (2015).
- Ramsay, J. A. Active transport of water by the Malpighian tubules of the stick insect, Dixippus morosus (Orthoptera, Phasmidae). Journal of Experimental Biology. 31, 104-113 (1954).
- Jing, X., White, T. A., Yang, X., Douglas, A. E. The molecular correlates of organ loss: the case of insect Malpighian tubules. Biology Letters. 11, 20150154 (2015).
- Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. T. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
- O'Connor, K. R., Beyenbach, K. W. Chloride channels in apical membrane patches of stellate cells of Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 204, 367-378 (2001).
- Ionescu, A., Donini, A. AedesCAPA-PVK-1 displays diuretic and dose dependent antidiuretic potential in the larval mosquito Aedes aegypti (Liverpool). Journal of Insect Physiology. 58, 1299-1306 (2012).
- Coast, G. M., Garside, C., Webster, S. G., Schegg, K. M., Schooley, D. A. Mosquito natriuretic peptide identified as a calcitonin-like diuretic hormone in Anopheles gambiae (Giles). Journal of Experimental Biology. 208, 3281-3291 (2005).
- Clark, T. M., Bradley, T. J. Additive effects of 5-HT and diuretic peptide on Aedes Malpighian tubule fluid secretion. Comparative Biochemistry and Physiology. 119, 599-605 (1998).
- Veenstra, J. A. Effects of 5-hydroxytryptamine on the Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 34, 299-304 (1988).
- Pollock, V. P., et al. Conservation of capa peptide-induced nitric oxide signalling in Diptera. Journal of Experimental Biology. 207, 4135-4145 (2004).
- Maddrell, S. H. P., Gardiner, B. O. C. The passive permeability of insect Malpighian tubules to organic solutes. Journal of Experimental Biology. 60, 641-652 (1974).
- O'Donnell, M. J. Too much of a good thing: How insects cope with excess ions or toxins in the diet. Journal of Experimental Biology. 212, 363-372 (2009).
- Sajadi, F., Curcuruto, C., Al Dhaheri, A., Paluzzi, J. P. V. Anti-diuretic action of a CAPA neuropeptide against a subset of diuretic hormones in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Donini, A., O'Donnell, M. J., Orchard, I. Differential actions of diuretic factors on the Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 42-48 (2008).
- Donini, A., et al. Secretion of water and ions by Malpighian tubules of larval mosquitoes: Effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiological and Biochemical Zoology. 79, 645-655 (2006).
- Donini, A., O'Donnell, M. J. Analysis of Na+, Cl-, K+, H+ and NH4+ concentration gradients adjacent to the surface of anal papillae of the mosquito Aedes aegypti: Application of self-referencing ion-selective microelectrodes. Journal of Experimental Biology. 208, 603-610 (2005).
- Durant, A. C., Donini, A. Development of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito larvae in high ammonia sewage in septic tanks causes alterations in ammonia excretion, ammonia transporter expression, and osmoregulation. Scientific Reports. 9, (2019).
- Paluzzi, J. P. V., Vanderveken, M., O'Donnell, M. J. The heterodimeric glycoprotein hormone, GPA2/GPB5, regulates ion transport across the hindgut of the adult mosquito, Aedes aegypti. PLoS One. 9, 86386 (2014).
- Nguyen, H., Donini, A. Larvae of the midge Chironomus riparius possess two distinct mechanisms for ionoregulation in response to ion-poor conditions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 299, 762-773 (2010).
- Lajevardi, A., Paluzzi, J. -P. V. Receptor characterization and functional activity of pyrokinins on the hindgut in the adult mosquito, Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 11, 490 (2020).
- Cook, B. J., Holman, G. M. The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology and Pharmacology. 80, 65-73 (1985).
- Robertson, L., Rodriguez, E. P., Lange, A. B. The neural and peptidergic control of gut contraction in Locusta migratoria: The effect of an FGLa/AST. Journal of Experimental Biology. 215, 3394-3402 (2012).
- Te Brugge, V. A., Schooley, D. A., Orchard, I. Amino acid sequence and biological activity of a calcitonin-like diuretic hormone (DH31) from Rhodnius prolixus. Journal of Experimental Biology. 211, 382-390 (2008).
- Lange, A. B., et al. The distribution and physiological effects of the myoinhibiting peptides in the kissing bug, Rhodnius prolixus. Frontiers in Neuroscience. 6, 98 (2012).
- Robertson, L., Chasiotis, H., Galperin, V., Donini, A. Allatostatin A-like immunoreactivity in the nervous system and gut of the larval midge Chironomus riparius: Modulation of hindgut motility, rectal K+ transport and implications for exposure to salinity. Journal of Experimental Biology. 217, 3815-3822 (2014).
- Kwon, H., Pietrantonio, P. V. Calcitonin receptor 1 (AedaeGPCRCAL1) hindgut expression and direct role in myotropic action in females of the mosquito Aedes aegypti (L.). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43, 588-593 (2013).
- Messer, A. C., Brown, M. R. Non-linear dynamics of neurochemical modulation of mosquito oviduct and hindgut contractions. Journal of Experimental Biology. 198, 2325-2336 (1995).
- Petzel, D. H., Berg, M. M., Beyenbach, K. W. Hormone-controlled cAMP-mediated fluid secretion in yellow-fever mosquito. The American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 253, 701-711 (1987).
- Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay assay to measure fluid secretion and ion flux rates in the Drosophila melanogaster Malpighian tubule. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53144 (2015).
- Paluzzi, J. -P. V., Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Natriuresis and diuretic hormone synergism in R. prolixus upper Malpighian tubules is inhibited by the anti-diuretic hormone, RhoprCAPA-α2. Journal of Insect Physiology. 58, 534-542 (2012).
- Rheault, M. R., O'Donnell, M. J., Morris, C. E. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. Journal of Experimental Biology. 207, 2173-2184 (2004).
- Sajadi, F., et al. CAPA neuropeptides and their receptor form an anti-diuretic hormone signaling system in the human disease vector, Aedes aegypti. Scientific Reports. 10, 1755 (2020).
- Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. American Journal of Physiology. 303, 883-894 (2012).
- Yu, M. J., Beyenbach, K. W. Effects of leucokinin-VIII on Aedes Malpighian tubule segments lacking stellate cells. Journal of Experimental Biology. 207, 519-526 (2004).
- Nowghani, F., et al. Impact of salt-contaminated freshwater on osmoregulation and tracheal gill function in nymphs of the mayfly Hexagenia rigida. Aquatic Toxicology. 211, 92-104 (2019).
- D'Silva, N. M., O'Donnell, M. J. Mechanisms of transport of H+, Na+ and K+, across the distal gastric caecum of larval Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 121, 103997 (2020).
- Kolosov, D., O'Donnell, M. J. Malpighian tubules of caterpillars: blending RNAseq and physiology to reveal regional functional diversity and novel epithelial ion transport control mechanisms. Journal of Experimental Biology. 222, (2019).
- Jonusaite, S., Kelly, S. P., Donini, A. Tissue-specific ionomotive enzyme activity and K+ reabsorption reveal the rectum as an important ionoregulatory organ in larval Chironomus riparius exposed to varying salinity. Journal of Experimental Biology. 216, 3637-3648 (2013).
- O'Donnell, M. J., Ruiz-Sanchez, E. The rectal complex and Malpighian tubules of the cabbage looper (Trichoplusia ni): regional variations in Na+ and K+ transport and cation reabsorption by secondary cells. Journal of Experimental Biology. 218, 3206-3214 (2015).
- Simo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44, 819-826 (2014).
