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Biology

Studiare l'attività dei neuropeptidi e di altri regolatori del sistema escretore nella zanzara adulta

Published: August 24, 2021 doi: 10.3791/61849
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biology, York University
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo delinea le metodologie alla base del test Ramsay, dei microelettrodi iono-selettivi, della tecnica dell'elettrodo iono-selettivo a scansione (SIET) e dei saggi di contrazione in vitro, applicati per studiare il sistema escretore di zanzare adulte, composto dai tubuli malpighiani e dall'intestino posteriore, per misurare collettivamente i tassi di secrezione di ioni e fluidi, l'attività contrattile e il trasporto di ioni transepiteliali.

Abstract

Gli studi sulla fisiologia degli insetti, in particolare in quelle specie che sono vettori di agenti patogeni che causano malattie negli esseri umani e in altri vertebrati, forniscono le basi per sviluppare nuove strategie per il controllo dei parassiti. Qui, vengono descritti una serie di metodi che vengono abitualmente utilizzati per determinare i ruoli funzionali dei neuropeptidi e di altri fattori neuronali (cioè ammine biogeniche) sul sistema escretore della zanzara, Aedes aegypti. I tubuli malpighiani (MT), responsabili della formazione di urina primaria, possono continuare a funzionare per ore quando vengono rimossi dalla zanzara, consentendo misurazioni della secrezione di liquidi dopo trattamenti ormonali. Come tale, il test di Ramsay è una tecnica utile per misurare i tassi di secrezione da MT isolati. I microelettrodi iono-selettivi (ISME) possono essere utilizzati in sequenza per misurare le concentrazioni di ioni (cioè Na + e K +) nel fluido secreto. Questo test consente la misurazione di diversi MT in un dato momento, determinando gli effetti di vari ormoni e farmaci. La tecnica dell'elettrodo iono-selettivo a scansione utilizza ISME per misurare la tensione rappresentativa dell'attività ionica nello strato non istigato adiacente alla superficie degli organi che trasportano ioni per determinare il trasporto transepiteliale di ioni quasi in tempo reale. Questo metodo può essere utilizzato per comprendere il ruolo degli ormoni e di altri regolatori sull'assorbimento o la secrezione di ioni attraverso gli epiteli. I saggi di contrazione dell'intestino posteriore sono anche uno strumento utile per caratterizzare i neuropeptidi mioattivi, che possono migliorare o ridurre la capacità di questo organo di rimuovere i liquidi in eccesso e i rifiuti. Collettivamente, questi metodi forniscono informazioni su come il sistema escretore è regolato nelle zanzare adulte. Questo è importante perché la coordinazione funzionale degli organi escretori è fondamentale per superare sfide come lo stress da essiccazione dopo l'eclosione e prima di trovare un ospite vertebrato adatto per ottenere una farina di sangue.

Introduction

Il mantenimento dei livelli di sale e acqua negli insetti consente loro di avere successo in molte nicchie ecologiche e ambientali, utilizzando una varietà di strategie di alimentazione1. La maggior parte degli insetti ha sviluppato meccanismi per regolare la composizione della loro emolinfa entro limiti ristretti al fine di resistere alle diverse sfide associate al loro particolare ambiente2. Gli insetti terrestri si trovano spesso di fronte alla sfida di conservare l'acqua e il sistema escretore subisce anti-diuresi per prevenire la perdita di acqua e di alcuni sali essenziali, evitando quindi l'essiccazione. Al contrario, la diuresi si verifica quando l'insetto si nutre e viene sfidato con l'acqua in eccesso e potenzialmente i sali3,4. Attraverso il loro sistema escretore specializzato e altamente attivo, gli insetti hanno sviluppato meccanismi di regolazione che agiscono per contrastare le loro sfide osmoregolatrici. Nelle zanzare adulte Aedes aegypti, il sistema escretore è costituito dai tubuli malpighiani (MT) e dall'intestino posteriore, quest'ultimo costituito dall'ileo anteriore e dal retto posteriore5. Le MT sono responsabili della generazione di urina primaria, solitamente ricca di NaCl e/o KCl. L'urina primaria viene quindi modificata attraverso processi secretori e di riassorbimento mentre viaggia a valle del tubulo ed entra nell'intestino posteriore5. Gli escrementi finali possono essere iper- o ipoosmotici all'emolinfa, a seconda delle condizioni di alimentazione/ambientali, e sono arricchiti in rifiuti tossici e azotati2.

Le MT sono ideali per studiare molte caratteristiche del fluido epiteliale e del trasporto del soluto in quanto svolgono una grande varietà di funzioni di trasporto ed escretorie2,6. Attraverso la regolazione ormonale2, le MT funzionano secernendo ioni e altri soluti dal sangue nel lume del tubulo7, fornendo un gradiente osmotico che consente all'acqua di essere trasportata dalle acquaporine8,9, che collettivamente crea l'urina primaria, prima di viaggiare verso l'intestino posteriore riassorbito2. Pertanto, raccogliendo il fluido secreto da MT isolate, è possibile monitorare continuamente il trasporto transepiteliale di fluido e ioni. La misurazione della velocità di secrezione e della composizione delle urine fornisce informazioni sui meccanismi responsabili del trasporto di ioni e fluidi transepiteliali. Un metodo popolare per studiare i tassi di secrezione fluida è il test Ramsay, che è stato introdotto per la prima volta da Ramsay nel 195310. In questo metodo, l'estremità distale (chiusa) del tubulo viene trattata con un ormone (o altro composto / farmaco di prova), mentre l'estremità prossimale (aperta) è avvolta attorno a un perno in olio di paraffina saturo d'acqua, che secerne l'urina primaria, accumulandosi come una goccia sulla punta del perno. Le MT isolate sono in grado di sopravvivere e funzionare per lunghi periodi (fino a 24 ore) in condizioni in vitro ottimizzate, che le rendono modelli adatti ed efficienti per la misurazione della secrezione di fluidi. Gli insetti hanno sistemi circolatori aperti, quindi le MT sono facilmente sezionate e rimosse poiché di solito fluttuano liberamente nell'emolinfa6. Inoltre, ad eccezione degli afidi, che mancano di MT11, il numero di MT in una determinata specie di insetti può variare considerevolmente da quattro a centinaia (cinque nelle zanzare Aedes) consentendo misurazioni multiple da un insetto.

Le MT nelle zanzare Aedes, in comune con altri insetti endottergoti, sono composte da due tipi cellulari che formano un epitelio semplice2,12; grandi cellule principali, che facilitano il trasporto attivo dei cationi (cioè Na+ e K+) nel lume, e sottili cellule stellate, che aiutano nella secrezione transepiteliale di Cl13. Le MT non sono innervate2 e sono invece regolate da diversi ormoni, tra cui fattori diuretici e antidiuretici, consentendo il controllo del trasporto ionico (principalmente Na +, K + e Cl-) e dell'acqua osmoticamente obbligata2. Numerosi studi hanno esaminato la regolazione ormonale delle Aedes MTs per comprendere il ruolo dei fattori endocrini sul trasporto transepiteliale14,15,16,17,18. Come mostrato nei risultati rappresentativi, i protocolli qui riportati dimostrano gli effetti di diversi fattori ormonali su MT isolate da zanzare A. aegypti femmine adulte, incluso il controllo diuretico e antidiuretico (Figura 1). Il test Ramsay viene utilizzato per dimostrare come un ormone antidiuretico, AedaeCAPA-1, inibisce la secrezione fluida di MT stimolati dall'ormone diuretico 31 (DH31) (Figura 1).

La dimensione più piccola degli insetti ha richiesto lo sviluppo di micro metodi per misurare l'attività ionica e le concentrazioni in campioni di fluido o vicino alla superficie di tessuti isolati come le MT e l'intestino. Sono stati implementati diversi metodi, tra cui l'uso di radioisotopi di ioni19, che richiede la raccolta delle gocce di fluido secrete per la misurazione delle concentrazioni di ioni20. I tubuli di Aedes stimolati in vitro secernono tipicamente ~ 0,5 nL / min21, quindi la gestione di volumi così piccoli può rappresentare una sfida e potenzialmente introdurre errori al momento del trasferimento. Di conseguenza, i microelettrodi iono-selettivi (ISMI) sono stati ampiamente utilizzati per misurare le concentrazioni di ioni in goccioline secrete di MT in vitro. In questo metodo, un elettrodo di riferimento e ISME, riempiti con la soluzione di riempimento appropriata e ionoforo, vengono posizionati nella goccia di urina secreta per determinare le concentrazioni di ioni22. Adattato da Donini e colleghi23, questo protocollo attuale utilizza uno ionoforo Na+-selettivo per misurare l'attività ionica in goccioline secrete da MT stimolate in zanzare Aedes adulte. Poiché i microelettrodi iono-selettivi misurano l'attività ionica, questi dati possono essere espressi in concentrazioni ioniche in seguito all'ipotesi che le soluzioni di taratura e i campioni sperimentali condividano lo stesso coefficiente di attività ionica21 (Figura 1B,C).

La Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) utilizza anche gli ISMI per misurare i gradienti di concentrazione ionica nello strato non istigato adiacente a organi, tessuti o cellule che trasportano ioni. Gli ISMI misurano i gradienti di tensione che possono quindi essere utilizzati per calcolare i gradienti di concentrazione ionica e la direzione e l'entità del flusso ionico attraverso l'organo, il tessuto o la cellula20. In questa tecnica, l'ISME è montato su un manipolatore a tre assi controllato da motori micro-passo-passo computerizzati in modo che la sua posizione 3D sia controllata al livello micrometrico20. Le tensioni vengono misurate in due punti all'interno dello strato non agitato utilizzando un protocollo di campionamento programmato e controllato da un software per computer. I due punti sono tipicamente separati da una distanza di 20-100 μm con un punto entro 5-10 μm dalla superficie dell'organo, del tessuto o della cellula e il secondo punto a ulteriori 20-100 μm di distanza. La differenza di grandezza delle tensioni tra i due punti viene calcolata per ottenere un gradiente di tensione24,25,26, che viene poi utilizzato per calcolare il gradiente di concentrazione e successivamente il flusso netto utilizzando la legge di Fick24,27. Questo metodo è utile per valutare il trasporto di ioni specifici attraverso diverse regioni dell'intestino degli insetti e delle MT, o in punti temporali specifici a seguito di un'esposizione a farina di sangue o trattamento. Ad esempio, il SIET può essere utilizzato per capire come i processi di assorbimento e secretorio nel sistema escretore delle zanzare sono regolati dagli ormoni28, nonché da diversi comportamenti alimentari e condizioni di allevamento25. Precedenti lavori che utilizzavano il SIET hanno rivelato siti coinvolti nel trasporto di ioni lungo le papille anali e il retto di zanzare larvali e adulte24,28. L'attuale protocollo, descritto in precedenza da Paluzzi e colleghi26, misura il flusso di Na+ attraverso l'epitelio rettale del retto femminile adulto (Figura 2).

Il segmento finale del sistema escretore delle zanzare richiede un movimento muscolare coordinato per aiutare a mescolare il cibo e secernere i rifiuti26. I prodotti non assorbibili della digestione dal midgut, insieme all'urina primaria secreta dalle MT, vengono fatti passare attraverso la valvola pilorica e consegnati all'intestino posteriore2. Le contrazioni spontanee dell'intestino posteriore iniziano dalla valvola pilorica e si verificano in onde peristaltiche, che vengono trasmesse sull'ileo attraverso la contrazione coordinata dei muscoli circolari e longitudinali che circondano la superficie basale delle cellule epiteliali26. Infine, i muscoli all'interno del retto aiutano a spingere ed eliminare i rifiuti attraverso il canale anale. Sebbene la motilità dell'intestino posteriore degli insetti sia miogenica e richieda Ca2+ extracellulare per produrre contrazioni spontanee, questi processi possono anche essere regolati neuronalmente26,29,30. Questa regolazione esogena da parte del sistema nervoso è importante dopo l'alimentazione, poiché l'animale deve espellere i rifiuti dall'intestino e ripristinare l'equilibrio dell'emolinfa31. Di conseguenza, l'esecuzione di biosaggi in vitro per identificare neuropeptidi miostimolatori o mioinibitori è utile per valutare come le sostanze neurochimiche influenzano la motilità dell'intestino posteriore. L'attuale protocollo, eseguito da Lajevardi e Paluzzi28, utilizza registrazioni video per esaminare la motilità ileale in risposta ai neuropeptidi (Figura 3). Allo stesso modo, un trasduttore di forza o un convertitore di impedenza può anche essere utilizzato per osservare tracce di contrazioni attraverso un software di acquisizione dati32,33. Tuttavia, l'utilizzo della tecnologia video ci consente di valutare visivamente l'organo e analizzare ulteriormente utilizzando un sottoinsieme di parametri per identificare il ruolo degli ormoni sulla motilità dell'intestino posteriore.

L'uso di queste tecniche può aiutare a caratterizzare i fattori che regolano e coordinano il trasporto di fluidi e ioni lungo il sistema escretore insieme alla motilità dell'intestino posteriore. È importante sottolineare che è supportato un legame funzionale tra la risposta diuretica da parte delle MT e la motilità dell'intestino posteriore, poiché gli ormoni diuretici, come DH31 e 5HT, caratterizzati dalla loro capacità di stimolare la secrezione di liquidi da parte delle MT, sono stati trovati anche per esibire azioni miotropiche lungo l'intestino posteriore della zanzara21,34,35 . Questi risultati evidenziano l'importanza di un rigoroso coordinamento tra le MT e l'intestino posteriore durante eventi come la diuresi post-prandiale negli insetti che richiedono una rapida eliminazione dei rifiuti.

Qui, vengono descritti l'approccio dettagliato alla base della tecnica di analisi Ramsay per misurare il tasso di secrezione di fluido nella zanzara, A. aegypti, e l'uso di microelettrodi iono-selettivi per determinare le concentrazioni di Na + all'interno del fluido secreto delle MT, che quando combinato consente di determinare i tassi di trasporto degli ioni transepiteliali. Inoltre, la tecnica dell'elettrodo iono-selettivo a scansione e i saggi di contrazione dell'intestino posteriore sono descritti per misurare rispettivamente il flusso ionico e la motilità, che aiuta a chiarire la regolazione ormonale dell'intestino posteriore (Figura 4).

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Protocol

1. Preparare piatti rivestiti in silicone

NOTA: questo passaggio deve essere eseguito prima degli esperimenti. Questi piatti saranno fatti per preparare il piatto di analisi per le dissezioni e per gli esperimenti di saggio di contrazione.

  1. Preparare il silicone utilizzando un kit di elastomero siliconico seguendo le raccomandazioni del produttore. Mescolare i componenti liquidi in due parti con un rapporto di 10 a 1. Mescolare delicatamente e accuratamente invertendo ma assicurarsi di ridurre al minimo la formazione di bolle.
  2. Versare l'elastomero siliconico in piatti standard di coltura monouso in polistirene da 60 mm a una profondità normalmente compresa tra 7 e 9 mm. Prepara tutti i piatti necessari. Rimuovere eventuali bolle d'aria usando un perno sottile al microscopio poco dopo aver versato il silicone nei piatti. Mettere le piastre in una camera o in un armadio privo di polvere a temperatura ambiente (RT) per almeno 48 ore o in forno a 50 °C per circa 4 ore per polimerizzare (indurire) (Figura 5A).

2. Preparare il piatto di dosaggio Ramsay

NOTA: Il piatto può essere riutilizzato da esperimento a esperimento, quindi, ripetere questo passaggio solo se il piatto è danneggiato o si rompe. Un piatto separato viene utilizzato per le dissezioni.

  1. Usando un bisturi (con precauzioni standard per i taglienti), creare pozzetti in una delle piastre di Petri rivestite in silicone per preparare la piastra di saggio, rimuovendo abbastanza del silicone, circa ~ 5 mm, dalla parte superiore del piatto (questo dovrebbe adattarsi a ~ 20 μL di goccia da bagno). Prima di questo, utilizzare un pennarello permanente per contrassegnare le posizioni sotto il piatto per notare dove fare i pozzetti. I pozzetti dovrebbero essere distanti ~ 1 cm, con un diametro di circa ~ 4 mm per consentire l'adattamento dell'estremità distale del tubulo. Ogni pozzo conterrà un tubulo secernente fluido, quindi un piatto contenente 20 pozzetti consentirà di analizzare fino a 20 MT per esperimento.
  2. Per preparare i perni Minutien, posizionare i perni in acciaio inossidabile da 0,1 mm in fila su un pezzo di nastro adesivo, perpendicolare all'asse del nastro. Usando le forbici, tagliare lungo la lunghezza del nastro, creando metà uguali dei perni. Usa mezzo perno per ogni pozzetto.
  3. Usando un paio di pinze smussate, inserire ogni mezzo perno nel piatto di analisi rivestito in silicone, accanto a ciascun pozzetto. A seconda della lunghezza del tubulo dell'insetto, inserire il mezzo perno a una distanza che consentirà all'estremità distale del tubulo di immergersi nella soluzione salina da bagno e all'estremità prossimale per avvolgere il perno. Questo passaggio può essere fatto al microscopio per visualizzare facilmente i pozzi. I pin possono essere riutilizzati, tuttavia, sostituire il mezzo perno se danneggiato o perso. (Figura 5B)

3. Preparare il piatto SIET rivestito in poli-L-lisina

NOTA: questo passaggio è importante affinché l'organo aderisca al fondo del piatto durante le misurazioni SIET assicurando che il sito di misurazione rimanga lo stesso per ciascun campione. La preparazione di questi piatti dovrebbe essere fatta almeno 2 giorni prima degli esperimenti. Ogni piatto deve essere usato solo una volta quando si applica un trattamento specifico. Smaltire seguendo ogni campione o se il rivestimento in poli-L-lisina è graffiato o danneggiato.

  1. Per ogni campione, posizionare una capsula di Petri da 35 mm su una superficie piana. Rimuovere i coperchi e la pipetta 70 μL di poli-L-lisina (0,1 mg/mL) al centro di ogni piatto. Rimettere i coperchi e lasciare asciugare indisturbata la poli-L-lisina (~48 h).
  2. Una volta asciutto, segnare il fondo del piatto con un cerchio che delinea il rivestimento di poli-L-lisina essiccato per visualizzare meglio dove deve essere posizionato l'organo asportato dopo le dissezioni. Se necessario per ridurre al minimo i volumi di soluzioni saline e di trattamento negli esperimenti, utilizzare una pistola per colla a caldo per circondare il rivestimento in poli-L-lisina, lasciando spazio sufficiente per l'elettrodo per muoversi e prendere misure di fondo (~ 20-25 mm di diametro del cerchio incollato è sufficiente). Questi piatti rivestiti possono essere conservati indefinitamente a RT (Figura 5C).

4. Preparare i piatti ramsay e contrazione per gli esperimenti

NOTA: Il piatto può essere riutilizzato (a condizione di un lavaggio appropriato per rimuovere la soluzione salina / trattamenti precedentemente utilizzati), quindi ripetere questo passaggio solo se la piastra è danneggiata o si rompe. Un piatto separato viene utilizzato per le dissezioni. Questo passaggio viene eseguito il giorno dell'esperimento.

  1. Per il piatto di saggio di contrazione, utilizzare un bisturi (con precauzioni standard di taglienti), creare pozzetti in una delle piastre di Petri rivestite in silicone per preparare la piastra di analisi. Angolare il bisturi in modo che i pozzetti diventino a forma di triangolo per facilitare l'appuntamento del tessuto sezionato sui bordi. I pozzetti dovrebbero essere abbastanza grandi da contenere fino a 250 μL e adattarsi all'intero canale alimentare (piuttosto che scavare troppo in profondità, rendere il pozzo più largo a circa 0,5-1 cm) (Figura 5D).
  2. Per la piastra Ramsay, utilizzare una pipetta e riempire pozzetti fino a 20 μL di soluzione (18 μL di 1X soluzione salina Aedes :il mezzo di Schneider preparato nella fase 5.2 e 2 μL di ormone/farmaco). Per i controlli non stimolati, riempire i pozzetti con 20 μL di 1X Aedes soluzione salina: il mezzo di Schneider. Una volta riempiti tutti i pozzetti, versare l'olio minerale idratato nel piatto di analisi fino a quando i pozzetti e i perni Minutien sono immersi. Utilizzare una punta della pipetta da 20 μL per far scoppiare o rimuovere le bolle d'aria che potrebbero interferire con le goccioline secrete.

5. Preparare le soluzioni

  1. Preparare 2X Aedes aegypti soluzione salina e 10x glucosio, come descritto nella Tabella 1, adattato da Petzel e colleghi36. Le soluzioni stock devono essere conservate a 4 °C. Preparare scorte di lavoro di 1X Aedes aegypti soluzione salina (Tabella 1) e conservare a 4 °C. Il giorno dell'esperimento, lasciare che le scorte di lavoro arrivino a RT prima dell'uso. Preparare fresco se ci sono prove di crescita fungina o batterica.
  2. Per preparare la goccia da bagno, mescolare la soluzione salina Aedes (dal punto 5.1) con il mezzo di Schneider, con un rapporto 1:1. Preparare in piccole aliquote, a seconda di quanto è necessario. Tenere il mezzo di Schneider in frigorifero, scartare se ci sono prove di crescita fungina o batterica. (Questo passaggio dovrebbe essere fatto il giorno dell'esperimento).
  3. Per le misurazioni del flusso Na+ utilizzando il SIET, preparare una soluzione salina Aedes priva di Ca2+ modificata (Tabella 2), come descritto in precedenza26.

6. Zanzare MT e dissezioni dell'intestino posteriore

  1. Per le dissezioni di zanzare adulte, raccogliere la pupa in un piccolo becher e metterla in un barattolo contenente una soluzione di saccarosio per l'alimentazione. Per determinare l'età della zanzara, isolare le zanzare tratteggiate e metterle in un barattolo diverso annotando l'età e il sesso delle zanzare per future dissezioni.
  2. Posiziona brevemente le zanzare da sezionare su un cuscinetto di CO2 e attendi fino a quando non rispondono. Usando una pinza fine, raccogli la zanzara dalla sua gamba o ala e posizionala su un piatto di dissezione rivestito di elastomero siliconico preparato nel passaggio 1. Posiziona la zanzara su un lato (lato laterale verso l'alto) e, con un perno Minutien, impala nel torace per fissare la zanzara in posizione. Opzionalmente, rimuovere le ali e le zampe dalle zanzare per una dissezione più semplice.
  3. Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere una goccia di soluzione salina RT Aedes per immergere completamente la zanzara in soluzione salina. Assicurarsi che la dissezione sia tutta sotto soluzione salina (vedere Tabella 1 per fare Aedes soluzione salina).
  4. Posizionare la parabola di dissezione sotto un microscopio stereoscopico. Pizzicare l'ultimo segmento addominale con una pinza fine e allontanarsi lentamente dalla zanzara. Questo passaggio è facilitato guardando contemporaneamente al microscopio. Il midgut, attaccato con le MT e l'intestino posteriore, deve essere esposto (Figura 6).
  5. Per il test ramsay, rimuovere con attenzione ogni tubulo dalla giunzione midgut-hindgut, assicurandosi di non danneggiare gli organi. Utilizzare pinze sottili affilate per rimuovere i tubuli singolarmente - non utilizzare tubuli danneggiati per il test. Vedere il passaggio 7 per l'installazione.
  6. Per il SIET, sezionare l'intestino posteriore in soluzione salina Aedes priva di Ca2+ (fase 5.3). Assicurarsi che il piatto di poli-L-lisina abbia anche un volume fisso di soluzione salina Aedes senza Ca2 +. Rimuovere con cura la cuticola dal retto e posizionare l'intestino posteriore (può rimuovere qualsiasi altro organo attaccato, a seconda di ciò che viene misurato) nel piatto di poli-L-lisina. Se si misura il trasporto ionico lungo gli epiteli del cuscinetto rettale, posizionare il lato rivolto verso l'emolinfa di almeno un cuscinetto rettale in modo che sia accessibile al microelettrodo (Figura 7).
    1. Usando una pinza per afferrare l'estremità più posteriore, porta l'intestino posteriore sul fondo del piatto (senza danneggiare alcuna struttura che verrà misurata). Non appena l'organo tocca il rivestimento in poli-L-lisina, aderirà. Questo campione sezionato è pronto per le misurazioni. Vedere i passaggi da 14 a 16 per la configurazione e le misurazioni SIET.
  7. Per il saggio di contrazione dell'ileo, assicurarsi che l'intestino posteriore rimanga attaccato all'intestino medio durante la dissezione (Figura 4D). Rimuovere con attenzione le MT per avere una vista senza ostacoli dell'intestino posteriore. Questo organo sarà trasferito in un nuovo piatto preparato come descritto al punto 4.1. (Vedere il passaggio 17 per ottenere i video del test.)

7. Impostazione del test Ramsay

  1. Usando la punta della pinza, sollevare con attenzione l'estremità prossimale (aperta) del tubulo drappeggiandolo sopra la pinza (non pizzicare il tubulo) e trasferirlo in un pozzetto del piatto di saggio. Questo passaggio può essere eseguito anche utilizzando sonde di vetro fine.
  2. Una volta che il tubulo è immerso nel pozzo, raccogliere l'estremità prossimale del tubulo con la pinza, rimuoverlo dalla goccia da bagno e avvolgere l'estremità attorno al perno. Avvolgere il tubulo attorno al perno due volte e mantenere la lunghezza del tubulo rimanente nella goccia da bagno coerente con gli altri tubuli. A questo punto, l'estremità distale del tubulo dovrebbe essere nella goccia da bagno, mentre l'estremità prossimale avvolta attorno al perno lontano dalla goccia da bagno permettendo al fluido secreto di accumularsi sulla punta del perno dall'estremità prossimale aperta.
  3. Subito dopo che il tubulo è avvolto attorno al perno, annotare i pozzetti (ad esempio, A, B, C), il tempo (che sarà l'ora di inizio di quando il fluido inizierà a essere secreto dal tubulo) e qualsiasi altra informazione identificativa (ad esempio, ormone, genotipo, ecc.).
  4. Ogni zanzara ha cinque tubuli, quindi ripeti i passaggi 7.1-7.3 con il resto dei tubuli. Per i trattamenti di controllo e sperimentali, dividere i cinque tubuli all'interno dei diversi trattamenti. Continuare con la dissezione successiva, fino a riempire l'intero piatto del saggio. Con la pratica, questa tecnica dovrebbe richiedere in genere 2-3 minuti per sezionare i tubuli, trasferirli nella soluzione salina da bagno e avvolgere il perno, creando così una differenza di 2-3 minuti nel tempo di inizio tra ciascun tubulo.
    NOTA: Prima di iniziare l'esperimento, calibrare il micrometro oculare del microscopio con un micrometro di stadio sotto l'obiettivo selezionato. Le goccioline secrete vengono regolarmente misurate con un ingrandimento totale di 40x-50x.
  5. Dopo il tempo di incubazione assegnato, è possibile misurare la goccia secreta. Utilizzando il micrometro oculare del microscopio, misurare e registrare il diametro della goccia secreta. Calcolare il diametro (d) della goccia secreta moltiplicando il diametro dell'unità oculare misurato dalla conversione di taratura (Tabella 3). Calcola il volume della goccia secreta usando l'equazione V = πd3/6.
  6. Per calcolare il tasso di secrezione (nL min-1), utilizzare l'equazione, tasso di secrezione fluida = V / tempo di secrezione, dove V è il volume della goccia secreta calcolato nel passaggio 7.5 e il tempo di secrezione si riferisce al periodo di incubazione del tubulo.

8. Configurazione ISME

  1. Posizionare i micromanipolatori su entrambi i lati dello stereomicroscopio per configurare la stazione ISME. La cloridizzazione dei fili d'argento può essere ottenuta immergendo in una soluzione di cloruro ferrico e infilando ciascun filo d'argento in ciascuno dei supporti microelettrodi (o saldando i fili sui cavi coassiali, se necessario). Ripeti questo passaggio ogni volta che i fili d'argento diventano non clorurati.
  2. Collegare i fili d'argento a un amplificatore, che leggerà a un sistema di acquisizione dati. Impostare e calibrare il sistema secondo le istruzioni del produttore. In caso di aumento delle interferenze elettriche, utilizzare una gabbia di Faraday correttamente messa a terra.

9. Preparazione dei microelettrodi per ISME e SIET

  1. Utilizzando un estrattore di pipetta P-97 Flaming Brown, tirare ~ 5-6 capillari di vetro borosilicato non filato (diametro esterno 1,5 mm, diametro interno 1,12 mm, lunghezza 100 mm) con una punta di 1-5 μm. Questi saranno usati come microelettrodi iono-selettivi. Per i microelettrodi SIET, l'elettrodo risultante dovrebbe avere un'apertura della punta di ~ 5 μm, caratterizzata da un gambo corto.
  2. In una cappa, posizionare i microelettrodi su una piastra riscaldante (posizionando con attenzione per non rompere le punte degli elettrodi). Aggiungere il diclorodimetilsilano all'interno di una capsula di Petri di vetro da 15 cm e invertire sopra gli elettrodi sulla piastra elettrica. Utilizzare il diclorodimetilsilano per silanizzare gli elettrodi iono-selettivi aggiungendo uno strato idrofobo a tutte le superfici dell'elettrodo, permettendogli di trattenere lo ionoforo idrofobo37. Gli elettrodi silanizzati inutilizzati possono essere lasciati per alcune settimane; pertanto, questo passaggio viene eseguito ogni poche settimane o per gli elettrodi appena tirati.
    NOTA: Prestare attenzione quando si maneggia il diclorodimetilsillano – infiammabile, corrosivo e tossico, vedere MSDS per una manipolazione sicura.
    1. Ruotare la piastra elettrica a 350 °C e lasciare in posizione per 75 minuti. Utilizzare un rapporto 1:2 tra numero di microelettrodi e volume (μL) di diclorodimetilsilano da aggiungere alla capsula di Vetro di Petri. Pertanto, per 10 microelettrodi, aggiungere 20 μL di diclorodimetilsilano.
  3. Dopo 75 minuti, spegnere la piastra calda. Dopo che gli elettrodi e la piastra calda si sono raffreddati, rimuovere la capsula di Petri di vetro e trasferire gli elettrodi (con pinza) in una scatola di stoccaggio con argilla per lo stampaggio. Assicurarsi che la punta dell'elettrodo sia rivolta verso l'alto per evitare danni.
  4. Per realizzare gli elettrodi di riferimento per ISME, tirare ~ 4-5 tubi capillari di vetro borosilicato filamentoso (diametro esterno 1 mm, diametro interno 0,58 mm, lunghezza 100 mm). Questi elettrodi non devono essere silanizzati. Etichettare e conservare in una scatola simile, evitando qualsiasi danno alla punta.
  5. Gli elettrodi di riferimento SIET sono costituiti da capillari di vetro standard (diametro esterno 2 mm, diametro interno 1,12 mm, lunghezza 102 mm). I capillari sono riempiti con agar fuso 1 M KCl + 3% e devono essere conservati in un tubo centrifugo da 50 ml contenente 1 M KCl (completamente sommerso) fino all'uso. Possono essere usati ripetutamente fino a quando le bolle iniziano a formarsi o se l'agar si rompe. Se c'è spazio d'aria, smaltire il vetro e usarne uno nuovo per assicurarti che il circuito sia completo.

10. Preparazione delle siringhe di riempimento

NOTA: questo passaggio viene eseguito per creare siringhe a punta fine per riempire gli elettrodi per ISME.

  1. Utilizzare una siringa a punta antiscivolo da 1 mL con un ago monouso. Gettare l'ago e tirare indietro la siringa fino al segno di 1 mL. Sotto il fumiccio, accendere il bruciatore Bunsen e riscaldare la punta di plastica della siringa fino a quando non inizia a sciogliersi. Usando un vecchio paio di pinze, pizzicare con cura la punta della siringa fusa e tirare verso il basso per allungare la punta.
  2. Usando le forbici, tagliare la punta fusa alla lunghezza desiderata, lasciando il diametro abbastanza piccolo da adattarsi all'interno degli elettrodi (vedi diagramma). Dopo che la siringa si è raffreddata, testare la pressione della siringa con acqua per assicurarsi che non vi siano blocchi. Crearne uno per ogni soluzione di riempimento richiesta ed etichettare di conseguenza (Figura 8).

11. Riempimento del microelettrodo iono-selettivo e di riferimento per ISME e SIET

NOTA: il microelettrodo può essere riutilizzato finché funziona ancora (calibrare prima di ogni esperimento). Per ISME, questo passaggio può essere eseguito mentre i MT vengono incubati nel test Ramsay.

  1. Per creare un microelettrodo Na+-selettivo, utilizzare la siringa da 1 mL creata nel passaggio 10 per riempire l'elettrodo con NaCl da 100 mM. Assicurarsi che la soluzione di riempimento si riempia fino alla punta dell'elettrodo. Se compaiono bolle d'aria, scorrere delicatamente il microelettrodo o rimuovere la soluzione e riempire nuovamente. Questo dovrebbe essere fatto al microscopio stereoscopico per visualizzare meglio.
  2. Al microscopio stereoscopico, immergere una punta di pipetta da 10 μL nella soluzione di ionoforo Na+-selettivo. Allineando l'elettrodo perpendicolare alla pipetta, posizionare un dito guantato sul fondo della punta per creare pressione ed espellere una piccola goccia di ionoforo. Guardando sotto l'obiettivo alto di un microscopio, toccare attentamente la goccia di ionoforo sulla punta del microelettrodo, evitando di rompere la punta. Normalmente, i microelettrodi sono riempiti in avanti con una lunghezza della colonna di cocktail ionofora compresa tra 150-300 μm, fino a quando il bordo della soluzione di ionoforo / riempimento è piatto.
    ATTENZIONE: Questo ionoforo è tossico, vedere MSDS per una manipolazione sicura.
  3. In un piccolo becher, riempi a metà strada con 100 mM NaCl e posiziona un po 'di argilla modellante all'interno nella parte superiore del becher. Dopo che lo ionoforo Na+ è stato sollevato, posizionare l'elettrodo verso il basso sulla parete del becher, lasciando che la punta si trovi all'interno del NaCl da 100 mM, e tenere ISME nel becher fino a quando non è pronto per l'uso.
  4. Per realizzare l'elettrodo di riferimento ISME, riempire un elettrodo con 500 mM KCl assicurandosi che la soluzione sia riempita fino alla punta (seguire lo stesso protocollo di cui sopra). Conservare il KCl in un becher.

12. Taratura elettrodi per ISME

NOTA: questo passaggio viene eseguito subito prima di effettuare misurazioni del fluido secreto (~ 10-15 minuti prima). Le calibrazioni devono essere eseguite ogni ~ 5-6 misurazioni per garantire che la pendenza sia coerente.

  1. Rivestire le punte degli elettrodi usando una soluzione di ~ 3,5% (p / v) di cloruro di polivinile disciolto in tetraidrofurano, per evitare lo spostamento dello ionoforo quando immerso in olio di paraffina.
    ATTENZIONE: questo è infiammabile, vedere MSDS per una manipolazione sicura.
  2. Per calibrare l'elettrodo Na+ , posizionare goccioline da 10 μL delle seguenti concentrazioni standard di NaCl sul bordo della parabola Ramsay con le MT incubate: 200 mM NaCl e 20 mM + 180 mM LiCl. Posizionare le goccioline standard a ~ 2 cm di distanza, con la maggiore concentrazione sulla parte superiore.
  3. Inserire sia l'elettrodo di riferimento che l'elettrodo iono-selettivo sopra i fili d'argento clorurato e fissarli saldamente utilizzando portaelettrodi collegati ai micromanipolatori. Navigare entrambi gli elettrodi verso la goccia NaCl da 200 mM utilizzando i micromanipolatori, assicurandosi che le punte degli elettrodi non tocchino il fondo del piatto. Accendere l'elettrometro per avviare la registrazione e consentire alla lettura di stabilizzarsi.
  4. Registrare la lettura e passare allo standard successivo (20 mM NaCl + 180 mM LiCl). Calcolare la pendenza e, se la lettura dell'elettrodo è stabile e la pendenza è nel raggio d'azione, procedere all'utilizzo dell'elettrodo per le misurazioni delle goccioline secrete. Se la lettura è instabile, non fornisce una registrazione o una pendenza adeguata, o impiega un po 'di tempo per equilibrare, preparare un nuovo elettrodo iono-selettivo o rompere la punta stessa dell'elettrodo di riferimento facendo scorrere un tessuto attraverso la punta. La pendenza per Na+ dovrebbe essere ~ 58-60 mV38, anche se un intervallo accettabile è 50-60 mV.

13. Registrazioni e calcoli ISME

  1. Dopo le misurazioni della velocità di secrezione del fluido (vedere punto 7.7), spostare con attenzione sia l'elettrodo di riferimento che l'elettrodo iono-selettivo nella goccia secreta utilizzando i micromanipolatori. Attiva la registrazione e consenti alla lettura di stabilizzare e registrare il valore. Ripetere questo passaggio per le altre goccioline (ripetere le misurazioni di calibrazione ogni ~ 5-6 misurazioni).
  2. Le concentrazioni di cationi sono calcolate utilizzando l'equazione descritta in precedenza22,38, [ion] = [C] x 10ΔV/m, dove [C] è la concentrazione in mmol L-1 della soluzione di taratura utilizzata per calibrare l'ISME, ΔV è la variazione di tensione tra la tensione registrata dalla goccia di fluido secreta e la tensione della stessa soluzione di taratura, e m è la differenza di tensione tra le due calibrazioni standard, che è anche la pendenza.

14. Configurazione SIET

NOTA: Il sistema SIET è stato descritto in precedenza27,39. Per ridurre il rumore di fondo, una gabbia di Faraday è installata attorno al microscopio ottico e all'headstage. Gli esperimenti presentati in questo articolo utilizzano le seguenti impostazioni sul software Automated Scanning Electrode Technique (ASET) 2.0: un periodo di attesa di 4 secondi per consentire ai gradienti ionici di ristabilirsi completamente dopo i movimenti del microelettrodo, con tensione registrata per 0,5 s dopo il periodo di attesa, una distanza di escursione di 100 μm e tre ripetizioni per ogni registrazione. Alcune impostazioni possono essere modificate dall'utente in ASET, in base alle esigenze.

  1. Accendere l'amplificatore ionico/polarografico IPA-2, il microscopio ottico (con una videocamera collegata) e i computer collegati a ciascuno di questi ASET e cellSens.
  2. Preparare microelettrodi ed elettrodi di riferimento descritti nei passaggi 9.1–9.3, 9.5, 10 e 11.1–11.3. Il microelettrodo iono-selettivo conterrà ionoforo Na+ con riempimento NaCl da 100 mM e l'elettrodo di riferimento (con i ponti di agar) sarà sempre riempito con 3 M KCl.
  3. Posizionare il microelettrodo Na+-selettivo sul supporto costituito da un filo di cloruro d'argento (AgCl) e collegarlo al jack del connettore femmina. Utilizzando una siringa, riempire il supporto dell'elettrodo di riferimento con 3 M KCl freschi (può essere fatto prima del giorno dell'esperimento e conservato a RT).
    NOTA: A seguito di esperimenti, lavare il supporto dell'elettrodo di riferimento con ddH2O.
  4. Rimuovere un elettrodo di riferimento dal becher contenente tutti gli elettrodi di riferimento immersi in 3 M KCl, posizionando un dito a un'estremità e inclinando il capillare di vetro verso questo dito per evitare che l'agar cada. Posizionare con attenzione un'estremità nel supporto, assicurandosi che non si formino bolle. Se c'è una bolla, rimuovere l'elettrodo di riferimento, riempire nuovamente il supporto con più 3 M KCl e ripetere. Posizionare il supporto dell'elettrodo nel jack del connettore femmina.

15. Elettrodi di calibrazione per SIET

  1. Per le misurazioni Na+ , utilizzare soluzioni NaCl da 150 mM e NaCl da 15 mM + 135 mM LiCl24. Ci dovrebbe essere una differenza di 10 volte nelle concentrazioni di Na+ tra le due soluzioni, che comprende l'intervallo di livelli di Na+ (20 mM) nella soluzione salina (Tabella 2).
  2. Conservare le soluzioni di calibrazione a RT in un tubo di centrifuga da 50 ml e aliquota in una capsula di Petri durante la conduzione dell'esperimento. Questa aliquota viene eliminata alla fine della giornata. Se ci sono prove di contaminazione nelle soluzioni stock, smaltire e produrre soluzioni fresche.
  3. Per calibrare, aliquotare le due soluzioni di taratura (fase 15.1) in singole piastre di Petri da 35 mm e posizionarle sullo stadio del microscopio. Utilizzando le manopole di regolazione manuale che controllano i motori passo-passo con "disabilita" selezionato sull'unità di controllo del movimento del computer, assicurarsi che la punta del microelettrodo sia posizionata all'interno della soluzione di calibrazione. Non immergere troppo la punta, poiché potrebbe rompersi. Se la punta si rompe, preparare un nuovo microelettrodo iono-selettivo e ricalibrare.
    1. Sul computer collegato all'amplificatore, aprire il software ASET. Aprire Impostazioni calibrazione. Selezionare Nernst Slope per il tipo di calibrazione, impostare il campione per 3 secondi e immettere le concentrazioni delle soluzioni di calibrazione. Ad esempio, per le misurazioni Na+ , immettere 150 mM nella soluzione 1, posizionare la punta microelettrodo Na+-selettiva e l'elettrodo di riferimento all'interno di questa soluzione di calibrazione. La lettura della tensione sull'amplificatore dovrebbe essere stabile. Fare clic sulla soluzione 1, attendere che venga registrata la tensione (in mV). Quindi, posizionare il microelettrodo e l'elettrodo di riferimento all'interno della soluzione LiCl da 15 mM NaCl + 135 mM, immettere 15 mM nella soluzione 2 e fare clic sulla soluzione 2 per ottenere la lettura della tensione. La pendenza sarà la differenza tra queste due tensioni, calcolata in queste impostazioni. Dopo la calibrazione, fare clic su OK.
    2. Le pendenze per i microelettrodi Na+-selettivi per un cambiamento di dieci volte nella concentrazione di ioni dovrebbero essere intorno a 59,0 ± 1,624. Se la pendenza di Nernst si discosta notevolmente da questo intervallo, preparare un nuovo microelettrodo o aliquote nuovi standard (in quanto potrebbero essere contaminati). La calibrazione è necessaria prima di ogni 2-3 campioni, a seconda della stabilità della tensione. Se la tensione diventa instabile e inizia a fluttuare, preparare un nuovo microelettrodo iono-selettivo.

16. Misurazioni SIET

NOTA: l'interruttore del motore dell'unità Computer Motion Control deve essere sempre impostato su Disabilita, tranne quando si manipola l'elettrodo utilizzando i tasti del computer tramite ASET o durante le registrazioni di misurazione (a quel punto il tasto deve essere commutato su Abilita).

  1. Dopo la calibrazione, sezionare l'organo (vedere punto 6.6). Posizionare il piatto di poli-L-lisina con il campione sezionato sul palco del microscopio e inserire la punta dell'elettrodo di riferimento all'interno della soluzione salina. Immergere la punta del microelettrodo iono selettivo nella soluzione salina facendo attenzione a non rompere la punta.
  2. Utilizzare le manopole di regolazione manuale per regolare la posizione del microelettrodo mentre si guarda al microscopio ottico. Regolare la posizione verticale del microelettrodo in modo tale che la sua punta si trovi sullo stesso piano dell'organo o del tessuto. Una volta nella posizione desiderata, ruotare l'interruttore del motore su Abilita. A questo punto, i motori passo-passo possono essere azionati solo utilizzando il software del computer.
  3. Utilizzando i tasti freccia del computer, spostare il microelettrodo orizzontalmente in una posizione a 3 mm di distanza dal tessuto per misurare le registrazioni in background. Inserire note premendo F2. Quando sei pronto, inizia a registrare (premendo F5). Ottenere cinque misurazioni dell'attività in background. L'attività media della tensione di fondo per ogni campione verrà sottratta dai gradienti di tensione misurati lungo il tessuto per lo stesso campione.
  4. Spostare la punta del microelettrodo vicino al tessuto, facendo attenzione a non perforare l'organo. Ridurre la sensibilità dei tasti per posizionare la punta del microelettrodo 2 μm direttamente a destra, perpendicolare al tessuto. Ottenere tre registrazioni in ogni sito lungo il pad rettale per identificare il sito di maggiore attività ionica. Ottenere misurazioni saline di base nel sito che mostra la maggiore attività (il sito "hotspot").
  5. Passare il motore a Disable e aggiungere il trattamento appropriato nel piatto per ottenere la dose finale desiderata. Dopo l'applicazione, creare una nuova nota (ad esempio, nome e dose del trattamento), riportare il motore su Abilita e prendere le registrazioni di tensione utilizzando F5. Se l'obiettivo è osservare i cambiamenti nel tempo, continuare a prendere misure a intervalli di tempo specifici. È possibile creare più protocolli per applicazioni specifiche utilizzando il SIET, a seconda dell'obiettivo del ricercatore.
  6. Guardare il software ASET registrare la tensione nel sito lungo il tessuto e sottrarla dalla tensione a una distanza di escursione (Figura 7) di 100 μm dal tessuto. Poiché la prima registrazione viene effettuata sul tessuto, una differenza di tensione positiva indica che la tensione è più alta all'epitelio (tessuto) (Figura 7A) che lontano dall'epitelio (Figura 7B), e quindi il catione viene assorbito. Un gradiente di tensione negativo è indicativo della secrezione cationica.
  7. Ottenere nuovamente le registrazioni di sottofondo dopo il trattamento (3 mm di distanza) e utilizzarle nel calcolo del flusso ionico dopo il trattamento. Effettuare una serie di registrazioni di sottofondo in "baseline" e una set dopo il trattamento. Impostare il motore su Disabilita ogni volta che il microelettrodo non viene regolato con i tasti del computer o quando la tensione non viene registrata. Esporta i dati in un file di testo e apri utilizzando Excel per eseguire tutti i calcoli.
  8. Calcola il flusso ionico usando le equazioni descritte in precedenza24,26. Il flusso ionico netto per ciascun trattamento può essere espresso come una variazione assoluta rispetto alle misurazioni del flusso ionico al basale. Per verificare la significatività dei risultati, è possibile utilizzare un controllo del veicolo (ad esempio, l'aggiunta di soluzione salina da sola nel piatto anziché un trattamento). I cambiamenti nel trasporto ionico dopo il trattamento ormonale devono essere valutati in relazione a qualsiasi cambiamento in risposta a questo controllo.

17. Saggi di contrazione dell'intestino posteriore

  1. Riempire uno dei pozzetti del piatto descritto al punto 4.1 con un volume noto di soluzione salina Aedes (passaggio 5.1). Dopo la dissezione (fase 6.7), trasferire con cura l'intestino posteriore sezionato attaccato all'intestino medio al pozzo nell'altro piatto, assicurandosi di non pizzicare l'organo da esaminare (ileo). Immergere l'intestino nella soluzione salina all'interno del pozzo e posizionare i perni di Minutien nel midgut e nel retto. In questo modo, l'ileo non dovrebbe essere sotto tensione e dovrebbero essere osservate contrazioni spontanee, originate dalla valvola pilorica nell'ileo anteriore.
  2. Collegare una videocamera a un microscopio stereoscopico e registrare video utilizzando un software di acquisizione video (ad esempio, INFINITY CAPTURE di Luminera). Posizionare il piatto contenente l'organo sezionato sotto il microscopio e registrare per 2 minuti. Questa sarà la condizione "Baseline".
  3. Aggiungere un volume noto di 1X soluzione salina di Aedes (passaggio 5.1) al pozzo per tenere conto di eventuali cambiamenti nella motilità ileale all'aumentare del volume all'interno del pozzo. Attendere 1 minuto dopo l'applicazione, quindi registrare di nuovo per 2 minuti. Questa è la condizione "salina".
  4. Aggiungere un volume noto di trattamento (da una concentrazione di stock 10x per ottenere la dose desiderata nel pozzo). Attendere 1 minuto dopo l'applicazione, quindi registrare di nuovo per 2 minuti. Questa sarà la condizione di "trattamento".
  5. Salva tutti i video e convertili in MP4. Per analizzare, contare il numero di contrazioni negli intervalli di 2 minuti (definito come un'onda peristaltica che inizia alla valvola pilorica e si estende per tutto l'ileo). Dividere questo numero per 2 minuti per ottenere il tasso di contrazione. Possono essere valutati anche altri parametri, come la contrazione o la durata del rilassamento. Dopo la raccolta dei dati grezzi, esprimere ogni parametro relativo ai dati per le condizioni di "baseline" per ogni campione. Traccia il cambio di piega per la "soluzione salina" e il "trattamento" tutti relativi alla "linea di base".

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Representative Results

L'applicazione di DH31 contro LE MT non stimolate si traduce in un significativo aumento del tasso di secrezione di liquidi, confermando il suo ruolo come ormone diuretico nelle zanzare Aedes (Figura 1A). Quando i tubuli vengono trattati con AedaeCAPA-1, si osserva una riduzione della velocità di secrezione nelle MT stimolate da DH31. La Figura 1B dimostra l'uso di elettrodi iono-selettivi per misurare le concentrazioni di Na+ nelle goccioline secrete. Il trattamento di DH31 sulle MT non ha avuto alcun effetto sulla concentrazione di Na+ nella goccia secreta; tuttavia, con l'applicazione di AedaeCAPA-1, la concentrazione di Na+ nel fluido secreto è stata significativamente aumentata. Inoltre, rispetto ai controlli non stimolati, DH31 ha portato a un tasso di trasporto Na+ significativamente maggiore, mentre AedaeCAPA-1 ha abolito questo aumento dei tubuli stimolati da DH31 (Figura 1C). Insieme, questi risultati del campione dimostrano come i tassi di secrezione di liquidi dopo l'applicazione di ormoni diuretici e antidiuretici possono essere misurati, nonché la concentrazione di ioni all'interno delle goccioline secrete. Le femmine di età compresa tra tre e sei giorni sono state sezionate e tra 23-35 MT sono state analizzate per l'esperimento. Le differenze sono state indicate come statisticamente significative se p < 0,05 utilizzando un ANOVA unidirezionale e t-test spaiati.

Il SIET è stato utilizzato per valutare i cambiamenti nel trasporto di Na+ lungo gli epiteli rettali delle zanzare femmine adulte. La maggior parte dei recta non stimolati esaminati ha mostrato un trasporto na+ diretto dall'emolinfa (assorbimento), e quindi sono stati esaminati solo questi preparati. A causa della variabilità nell'attività basale, è stata calcolata la differenza nel flusso ionico, dopo applicazione di soluzione salina o peptidica, rispetto all'attività di trasporto iniziale in soluzione salina. Questi valori producono una variazione negativa del flusso ionico (flusso ionico dopo il trattamento – flusso ionico in condizioni basali), sebbene tutti gli organi siano rimasti assorbenti dopo i trattamenti. Un analogo della leucochinina (Drosochinina) è stato utilizzato per esaminare i cambiamenti nell'assorbimento di Na+ , che ha comportato una diminuzione di quattro volte dell'assorbimento di Na+ rispetto al controllo salino (Figura 2).

Per valutare il ruolo di un neuropeptide, la pirochinina-2 (PK2), sulla motilità ileale, è stato utilizzato un analogo di Rhodnius prolixus , che in precedenza aveva dimostrato di attivare il recettore A. aegypti PK2, arricchito nell'ileo della zanzara28. Rispetto ai livelli basali, PK2 inibisce significativamente le contrazioni ileali (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Effetto dei neuropeptidi diuretici e antidiuretici sul tasso di secrezione di liquidi in vitro, sulla concentrazione di Na+ e sul tasso di trasporto da parte di A. aegypti MT di sesso femminile adulta. Aedae · CAPA-1 (0,1 fM) è stato applicato a MT stimolati con DromeDH31 (25 nM). (A) Le MT sono state incubate per 60 minuti con neuropeptidi e 120 minuti per controlli non stimolati. (B) Le concentrazioni di Na+ nella goccia secreta sono state misurate utilizzando l'ISME e i valori sono stati utilizzati per calcolare la velocità di trasporto (C). Le colonne che sono significativamente diverse dai controlli sono indicate con la stessa lettera, come determinato da un post-test ANOVA e Bonferroni unidirezionale (n = 23-35). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Cambiamenti nel trasporto di Na+ attraverso gli epiteli del cuscinetto rettale femminile misurati utilizzando il SIET. L'assorbimento di Na+ è stato registrato in condizioni saline basali non stimolate, seguito da trattamento con soluzione salina aggiuntiva (controllo del veicolo) o 1 μM di drosochinina (n = 10-12). Per ogni trattamento sono state misurate variazioni del flusso di Na+ diretto all'emolinfa. C'è stata una diminuzione di quattro volte dell'assorbimento di Na+ in risposta alla Drosochinina, come determinato da un t-test a due code spaiato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Variazione della motilità ileale delle zanzare femmine a seguito di soluzione salina (controllo del veicolo) e applicazione di RhoprPK2. La variazione della frequenza di contrazione dopo entrambi i trattamenti è stata registrata per ogni campione rispetto alle condizioni basali (n = 32). Rhopr · PK2 ha ridotto la motilità ileale, come determinato da un t-test accoppiato a due code. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Schema del saggio ramsay, uso di microelettrodi iono-selettivi (ISME), tecnica dell'elettrodo iono-selettivo a scansione (SIET) e saggi di contrazione dell'intestino posteriore. Illustrazioni dei quattro metodi utilizzati per determinare i ruoli funzionali dei fattori endocrini sul sistema escretore della zanzara, Aedes aegypti. (A) Il test Ramsay viene utilizzato per misurare i tassi di secrezione di liquidi in tubuli malpighiani isolati. L'estremità prossimale (aperta) del tubulo è avvolta attorno a uno spillo, circondata da olio minerale, mentre l'estremità distale (chiusa) è bagnata nella soluzione salina di trattamento. Dopo un determinato periodo di tempo, l'estremità prossimale secernerà l'urina primaria, accumulandosi come goccioline sul perno. (B) Un elettrodo di riferimento e l'ISME sono collocati nella goccia secreta, collegata a un sistema di acquisizione dati, per misurare la concentrazione di ioni. (C) Il SIET misura il trasporto ionico utilizzando un microelettrodo iono-selettivo posto perpendicolarmente a circa 2 μm di distanza dall'organo aderente al fondo di un piatto di poli-L-lisina. La direzione delle frecce rosse in questo schema indica che Na+ viene assorbito nella soluzione salina, indicata da una maggiore registrazione di tensione lungo l'epitelio rispetto alla regione lontana dalla superficie dell'organo. (D) I saggi di contrazione dell'intestino posteriore sono condotti utilizzando registrazioni video per valutare i cambiamenti nella frequenza di contrazione, nella lunghezza e nella durata del rilassamento. In questo schema, gli organi sono collocati all'interno di un pozzo e un perno metallico viene inserito direttamente nel midgut e nel retto per consentire all'ileo di fluttuare e contrarsi liberamente. I trattamenti vengono aggiunti al pozzo per valutare i cambiamenti nella motilità sia qualitativamente che quantitativamente. Creato utilizzando BioRender. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Piatti utilizzati per (A) sezionare le zanzare, (B) saggio Ramsay, (C) SIET e (D) misurazioni del saggio di contrazione. A, B e D sono completamente rivestiti con silicone, mentre C è rivestito con poli-L-lisina al centro. Per preparare il piatto utilizzato per il saggio Ramsay (B), viene utilizzata una piccola capsula di Petri rivestita in silicone e piccoli pozzetti di ~ 4-5 mm sono scolpiti a 1 cm di distanza (circa ~ 20 pozzetti possono essere scolpiti / piatto). I perni metallici minutien sono posizionati accanto a ciascun pozzetto per trattenere il tubulo isolato per misurare la velocità di secrezione del fluido. Il piatto di poli-L-lisina (C) consente all'organo di aderire al fondo durante le misurazioni SIET. I pozzetti nel piatto di saggio di contrazione (D) sono riempiti con soluzione salina ed eventuali trattamenti successivi. L'organo contraente posto all'interno del pozzo viene osservato utilizzando una videocamera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Il sistema escretore della zanzara, Aedes aegypti. Dopo una farina di sangue, soluti, acqua e sostanze nutritive vengono passati lungo il canale alimentare, che include (ma non è limitato a) il midgut, la valvola pilorica, le MT e l'intestino posteriore. Il midgut è il sito principale per la digestione degli alimenti e l'assorbimento dei nutrienti. I cinque MT trasportano acqua, soluti e rifiuti dall'emolinfa circostante e secernono questa urina primaria nell'intestino posteriore, costituito da un ileo anteriore e un retto posteriore, l'ultimo dei quali comprende quattro cuscinetti rettali (maschi) o sei (femmine). L'intestino posteriore funge da sito di riassorbimento finale prima che i rifiuti vengano escreti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Immagini fisse di un intestino posteriore di zanzara sezionato durante le misurazioni SIET. Per misurare l'attività ionica lungo gli epiteli di uno dei sei cuscinetti rettali, il microelettrodo Na+-selettivo viene posizionato a 2 μm di distanza dal tessuto (A). La tensione viene registrata in questo sito prima che la punta del microelettrodo venga spostata a una distanza di escursione (Δx) di 100 μm da questo punto (B). Il gradiente di tensione tra questi due punti viene utilizzato per calcolare il gradiente di concentrazione e il flusso ionico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Le siringhe di riempimento per ISME e SIET. Un'immagine delle siringhe utilizzate per riempire le soluzioni naCl e KCl nei microelettrodi. Questo mostra quattro siringhe a punta antiscivolo da 1 mL con aghi monouso, con una punta allungata modificata per consentire l'inserimento in un elettrodo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2X Aedes aegypti soluzione salina
Per 500 ml:
In un becher, aggiungere 400 ml di ddH2O, quindi aggiungere i seguenti soluti:
Componente Peso (g) Concentrazione finale (mM)
NaCl 8.766 150
HEPES · 5.957 25
Kcl 0.253 3.4
NaOH · 0.3 7.5
NaHCO3 · 0.151 1.8
MgSO4 · 0.12 1
CaCl2-2H20 0.249 1.7
Mescolare e regolare il pH a 7,1
Aggiungi ddH2O al volume finale di 500 mL per ottenere 2x Aedes salino
10X glucosio
Per 500 ml:
In un becher, aggiungere 450 ml di ddH2O, quindi aggiungere:
Componente Peso (g) Concentrazione finale (mM)
Glucosio 4.5 5
Mescolare e aggiungere ddH2O al volume finale di 500 mL
Per fare 1X Aedes aegypti soluzione salina:
Per 100 ml:
In un becher, aggiungere 40 ml di ddH2O, quindi aggiungere:
Componente Volume (mL)
2x Aedes soluzione salina 10
Mescolare, regolare il pH a 7,1
Filtro sterilizzato

Tabella 1: Fare Aedes aegypti soluzione salina. Per preparare Aedes soluzione salina, preparare separatamente 2X Aedes soluzione salina e 10x glucosio, conservare in frigorifero a 4 °C. Utilizzare queste due soluzioni per preparare scorte di lavoro (1x soluzione salina Aedes ), utilizzate per sezionare tessuti, saggi Ramsay e saggi di contrazione.

Aedes aegypti saline senza calcio + NMDG
Per 500 ml:
In un becher, aggiungere 400 ml di ddH2O, quindi aggiungere i seguenti soluti:
Componente Peso (g) Concentrazione finale (mM)
NaCl 1.17 20
NMDG · 25.38 130
HEPES · 5.957 25
Kcl 0.253 3.4
NaHCO3 · 0.151 1.8
MgSO4 · 0.12 1
Glucosio 0.9 5
Mescolare e regolare il pH a 7,1
Aggiungere ddH2O al volume finale di 500 mL

Tabella 2: Aedes aegypti saline modificata utilizzata per le misurazioni SIET. Questa soluzione salina priva di Ca2+ viene utilizzata per prevenire le contrazioni spontanee dell'intestino posteriore durante le misurazioni SIET. Questa soluzione salina è specifica per la misurazione del trasporto di Na+ , in quanto consiste in Na+ ridotto (20 mM) costituito dalla sostituzione equimolare con N-metil-D-glucamina (NMDG) per ridurre il rumore di fondo.

MT stimolate da DH31 Diametro goccioline (unità) Diametro goccioline (um) Volume delle gocce (um3) Tasso di secrezione (nl/min)
n Trattamento #1 (60 min) Trattamento #1 (60 min) Trattamento #1 (60 min) Trattamento #1 (60 min)
1 16 313.73 16167692.56 0.27
2 14 274.51 10831090.91 0.18
3 17 333.33 19392547.25 0.32
4 13 254.90 8671977.67 0.14
5 14 274.51 10831090.91 0.18
6 22 431.37 42029685.15 0.70
7 15 294.12 13321768.16 0.22
8 16 313.73 16167692.56 0.27
9 20 392.16 31577524.53 0.53
Significare 16.33333333 320.26 18776785.52 0.31
STD ERR 0.06

Tabella 3: Dati del saggio Ramsay campione. Tabella che mostra i dati campione raccolti da MT stimolati da DH31 da zanzare femmine adulte. Quando si misura il diametro della goccia secreta, misurare prima con il micrometro oculare stereomicroscopio e annotare il valore. Quindi, moltiplicare il diametro dell'unità oculare con la conversione di calibrazione condotta prima dell'esperimento per ottenere il diametro della goccia in μm. Calcola il volume dell'equazione successiva, usando l'equazione annotata nel passaggio 7.7, seguita dal tasso di secrezione, usando l'equazione nota nel passaggio 7.8.

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Discussion

Quando ingeriscono un pasto di sangue, gli insetti ematofagi affrontano la sfida dell'eccesso di soluti e acqua nella loro emolinfa2. Per far fronte a questo, hanno un sistema escretore specializzato, che è strettamente controllato da fattori ormonali, consentendo agli insetti di avviare rapidamente la diuresi post-prandiale. Il saggio Ramsay e l'uso di microelettrodi iono-selettivi consentono di misurare i tassi di secrezione del fluido insieme alle concentrazioni di ioni e ai tassi di trasporto nelle MT di insetti isolati. I passaggi critici all'interno di questi approcci includono la garanzia di una corretta dissezione delle MT degli insetti. La rimozione individuale di ciascun tubulo dall'insetto deve essere eseguita con attenzione, poiché qualsiasi danno al tubulo causerà la secrezione del fluido dalla lacrima o porterà a una preparazione non funzionale. Aedes Le MT non secernono prontamente nei controlli non stimolati, quindi ormoni e farmaci possono essere applicati per stimolare la secrezione. Tuttavia, anche con l'applicazione diuretica o con un'attenta dissezione, alcuni MT potrebbero non riuscire a secernere se danneggiati (anche se non del tutto evidenti con l'ispezione visiva), quindi potrebbe essere necessario condurre più cicli del test. Per un uso corretto degli elettrodi iono-selettivi durante le misurazioni ISME e SIET, assicurarsi che la pendenza degli standard rientri nell'intervallo normale riportato per lo ionoforo, che fornirà le letture più accurate. Tuttavia, se le letture sono instabili, esaminare l'elettrodo al microscopio per confermare che lo ionoforo è stato assorbito e non perde. Un nuovo elettrodo deve essere preparato se sono presenti bolle d'aria, la punta è rotta o lo ionoforo non è stato assorbito correttamente. Se il bordo ionoforo/riempimento è convesso, gli elettrodi sono sotto-silanizzati e deve essere usato più diclorodimetilsilano. Se il bordo è concavo, gli elettrodi sono sovra-silanizzati e deve essere usato meno diclorodimetilsilano. Inoltre, alcuni elettrodi possono essere meno stabili di altri, come l'elettrodo Na+-selettivo, per cui la pendenza si deteriora più velocemente rispetto a K+ o H+.

Questi approcci offrono opportunità illimitate per studiare i meccanismi alla base della secrezione di liquidi da parte delle MT. A causa dei recenti progressi nell'editing genomico, strategie genetiche inverse come l'editing genetico CRISPR-Cas9 e l'interferenza dell'RNA possono essere utilizzate per studiare il ruolo regolatore e / o funzionale di geni specifici espressi negli organi escretori. Gli studi hanno utilizzato tali strumenti per comprendere la regolazione ormonale in Aedes40 e Drosophila41 MT. Inoltre, la goccia da bagno può essere modificata per esaminare i ruoli specifici degli ormoni14,15,18,21,42, dei sistemi di secondo messaggero e dei farmaci sul tasso di secrezione e sulle concentrazioni di ioni. Queste metodologie sono state applicate in vari altri insetti come Rhodnius prolixus38, specie di zanzare larvali e adulte, Drosophila41 e specie di moscerini (Hexagenia rigida)43. Allo stesso modo, possono essere esaminati diversi ioni, come Cl-, K +, H + e NH4 +.

Durante le misurazioni SIET, ci può essere variabilità tra ogni campione durante le condizioni basali. Le differenze potrebbero ancora sorgere quando si controlla l'età, il sesso e lo stato di alimentazione della zanzara, in particolare quando si esaminano diverse regioni dell'intestino (cioè determinate distanze anteriori o posteriori dalla giunzione ileo-retto). Queste differenze possono essere spiegate esprimendo il flusso ionico dopo il trattamento come un cambiamento rispetto alle condizioni basali. Nel corso del tempo, l'attività ionica può anche fluttuare e quindi è importante valutare i cambiamenti rispetto a un controllo del veicolo (soluzione salina), come mostrato nei risultati qui presentati. Se le letture di tensione iniziano a fluttuare drasticamente, preparare un nuovo microelettrodo iono-selettivo e ricalibrare. L'utilizzo di una terza soluzione di calibrazione (diluita 10 volte dalla più bassa concentrazione di soluzione di calibrazione) può ulteriormente aiutare a stabilire una pendenza nernst più accurata. Poiché l'attività di Na+ è tipicamente altamente suscettibile al rumore di fondo, viene utilizzata una soluzione salina Aedes modificata costituita da meno Na+ (Tabella 2). È anche importante mantenere una distanza dalla gabbia di Faraday durante le misurazioni per evitare interferenze e ridurre qualsiasi sfondo. Inoltre, se l'organo produce ancora contrazioni spontanee quando aderisce alla poli-L-lisina nella parte inferiore del piatto, l'aggiunta di un chelante di calcio alla soluzione salina aiuterà ulteriormente a prevenirlo. Se si esamina il trasporto ionico lungo gli epiteli del cuscinetto rettale, come mostrato nei risultati qui presentati, è importante identificare il sito "hotspot" che mostra la maggiore attività ionica spostando la punta del microelettrodo con piccoli incrementi lungo il lato rivolto verso l'emolinfa della rettale. Se non è in grado di rilevare grandi cambiamenti nell'attività ionica, l'organo potrebbe essere stato danneggiato o la punta del microelettrodo non si trova nello stesso piano tridimensionale dell'apertura del cuscinetto rettale, e quindi un'altra zanzara dovrebbe essere sezionata.

Il SIET può essere utilizzato per vari esperimenti, come l'esame dell'attività ionica nelle zanzare allevate in condizioni diverse25 o alimentate con diete diverse (ad esempio, alimentate con saccarosio vs alimentate con sangue vs non nutrite), che possono essere utili per identificare i meccanismi di trasporto ionico critici a seguito di una farina di sangue. È quindi importante garantire che le misurazioni siano ottenute dallo stesso sito tra i campioni. Ad esempio, le misurazioni possono essere prese dalla giunzione ileo-retto o a distanze specifiche situate anteriormente da questo sito (lungo l'ileo) o posteriormente (lungo l'epitelio rettale). Queste misurazioni possono anche essere ottenute lungo l'epitelio del pad rettale che richiede un diverso posizionamento dell'organo nel piatto. Inoltre, è importante notare che il SIET non si limita a misurare l'attività degli ioni esclusivamente lungo l'intestino posteriore; possono essere esaminati anche altri organi, tra cui il midgut e le MT. Allo stesso modo, il flusso K+, H+, NH4+ e Cl- può essere misurato utilizzando il SIET25,44,45 e le misurazioni possono essere effettuate a intervalli di tempo prestabiliti dopo un trattamento44. Questa tecnica è stata utilizzata sia su zanzare larvali che adulte26,44, così come su vari altri insetti, tra cui Chironomus riparius46, Trichoplusia ni45,47 e Hexagenia rigida43. Questi esperimenti possono essere utilizzati insieme al test Ramsay e ISME per ottenere una migliore comprensione del ruolo dei diversi trattamenti e fattori ambientali sulla secrezione di fluidi, sulla concentrazione di ioni e sul trasporto di ioni.

Infine, i saggi di contrazione sono utili per identificare i fattori neuroendocrini che influenzano la motilità intestinale. È fondamentale che l'organo in studio non sia danneggiato poiché questo test si basa sui movimenti generati dalla muscolatura. Pertanto, la pinza deve essere utilizzata solo per afferrare le strutture circostanti durante il trasferimento degli organi al piatto di analisi. Afferrare questi organi adiacenti con un perno all'interno del pozzo impedisce loro anche di muoversi e influenzare il movimento dell'organo isolato in esame. Se non si osservano contrazioni spontanee, il tessuto potrebbe essere stato danneggiato ed è necessaria una nuova dissezione. Altri metodi comunemente usati per esaminare l'attività contrattile intestinale degli insetti includono l'uso di un trasduttore di forza32 o di un monitor di impedenza33. Questi metodi possono anche essere utilizzati per misurare il tasso di contrazione nell'intestino posteriore della zanzara; tuttavia, se l'obiettivo è quello di esaminare visivamente questi cambiamenti attraverso registrazioni video, i metodi descritti in questo protocollo saranno utili e potranno essere utilizzati per ulteriori analisi48.

Le quattro tecniche delineate in questo protocollo hanno contribuito a dedurre il ruolo di un certo numero di neuropeptidi nel sistema escretore di vari insetti. L'utilizzo di questi metodi in combinazione con tecniche aggiuntive utilizzate dai fisiologi degli insetti, come la PCR quantitativa e l'immunoistochimica, può fornire una comprensione più completa dei percorsi sottostanti e dei sistemi di segnalazione, che possono servire come nuovi potenziali bersagli per il controllo dei vettori.

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Disclosures

Nessuno.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata finanziata dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants to AD e J-PP. AL e FS hanno ricevuto i premi NSERC CGS-M a sostegno della loro ricerca universitaria.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringes Fisher Scientific 14955456
35 mm Petri dishes Corning Falcon (Fisher Scientific) C351008
Borosillicate glass capillary filamented tubes
(OD 1 mm, ID 0.58 mm, length 100 mm)		 World Precision Instruments 1B100F-4 used for ISME reference electrodes
Borosillicate glass capillary filamented tubes
(OD 2 mm, ID 1.12 mm, length 102 mm)		 World Precision Instruments 1B200F-4 used for SIET reference electrodes
Borosillicate glass capillary unfilamented tubes
(OD 1.5 mm, ID 1.12 mm, length 100 mm)		 World Precision Instruments TW150-4 used for ISME and SIET electrodes
CO2 pad Diamed GEN59-114
Dimethyltrimethylsilylamine solution Sigma-Aldrich 41716
Faraday cage Custom Can be fabricated by local machine shop
Ferric chloride Sigma-Aldrich 157740
Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 91150-20
Glass Petri dish Fisher Scientific 08-748A
Hydrated mineral oil Fisher Scientific 8042-47-5 Specific brand is not important
INFINITY1-2CB video camera Luminera INFINITY1-2CB
Micromanipulators (left and right handed) World Precision Instruments MMJL and MMJR Specific brand is not important so long as high quality manipulator
Mineral Oil, Light Fisher Scientific 0121-4
Minutien pins (0.1 mm stainless steel) Fine Science Tools 26002-10
Non-hardening modeling clay Sargent Art Specific brand is not important
Olympus light microscope (FOR SIET) Olympus customized system
Plastic Pasteur (transfer) pipette Fisher Scientific 13-711-7M
Poly-L-lysine solution (0.1 mg/mL) Sigma-Aldrich A-005-M 84 kDa
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81395
Scalpel Blade Fine Science Tools 10050-00
Scalpel Handle Fine Science Tools 10053-09
Schneider's Drosophila medium Sigma-Aldrich S0146
SIET system Applicable Electronics customized system Details available at: http://www.applicableelectronics.com/overview
Silver wire World Precision Instruments AGW1010
Sodium ionophore II cocktail A Fluka 99357
Standard polystyrene Petri (culture) dishes Fisherbrand FB012921 Any size would work, but 60 mm dishes are good for both dissections and assay
Stereomicroscope with ocular micrometer Nikon SMZ800
Sutter P-97 Flaming Brown Pipette puller Sutter Instruments FGPN7
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Chemical Company NC9285739
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 401757
VWR advanced hotplate stirrer - aluminum VWR 9578 Specific brand is not important

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Biologia Numero 174 neuropeptidi tubuli malpighiani intestino posteriore sistema escretore zanzara Aedes aegypti saggio di Ramsay saggio di secrezione SIET ISME trasporto ionico contrazioni
Studiare l'attività dei neuropeptidi e di altri regolatori del sistema escretore nella zanzara adulta
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Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. P. V. Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito. J. Vis. Exp. (174), e61849, doi:10.3791/61849 (2021).

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