Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61855
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Pediatrics, University of Minnesota, 2Center for Genomic Engineering, University of Minnesota, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

Summary

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להנדסת גנום מבוסס CRISPR / Cas9 של תאי B אנושיים ראשוניים לנוקאאוט גנים (KO) ו knock-in (KI) כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים בתאי B ופיתוח של טיפולי B-cell.

Abstract

תאי B הם לימפוציטים שמקורם בתאי גזע ההמטוטופיאטיים והם מרכיב מרכזי בזרוע ההומוריסטית של מערכת החיסון האדפטיבית. הם עושים מועמדים אטרקטיביים לטיפולים מבוססי תאים בגלל קלות הבידוד שלהם מדם היקפי, היכולת שלהם להתרחב במבחנה, ואת תוחלת החיים שלהם vivo. בנוסף, ניתן להשתמש בתפקוד הביולוגי התקין שלהם – כדי לייצר כמויות גדולות של נוגדנים – כדי לבטא כמויות גדולות מאוד של חלבון טיפולי, כגון נוגדן רקומביננטי למלחמה בזיהום, או אנזים לטיפול באנזימופתיות. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות לבידוד תאי B אנושיים ראשוניים מתאי מונונוקלור דם היקפיים (PBMCs) והפעלה/הרחבה של תאי B מבודדים במבחנה. לאחר מכן אנו מדגימים את השלבים הכרוכים בשימוש במערכת CRISPR/Cas9 עבור KO ספציפי לאתר של גנים אנדוגניים בתאי B. שיטה זו מאפשרת KO יעיל של גנים שונים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את הפונקציות הביולוגיות של גנים מעניינים. לאחר מכן אנו מדגימים את השלבים לשימוש במערכת CRISPR/Cas9 יחד עם וקטור רקומביננטי, הקשור לאדנו, ויראלי (rAAV) לשילוב יעיל ספציפי לאתר של קלטת ביטוי טרנסג'ין בתאי B. יחד, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה הנדסית צעד אחר צעד שניתן להשתמש בה בתאי B אנושיים ראשוניים כדי לחקור פונקציות ביולוגיות של גנים, כמו גם לפיתוח טיפולי B-cell.

Introduction

תאי B הם תת-קבוצה של שושלת הלימפוציטים המופקת מתאי גזע hematopoietic. הם מבצעים תפקיד קריטי במערכת החיסון ההומוריסטית האדפטיבית על ידי ייצור כמויות גדולות של נוגדנים בתגובה לאתגרים החיסוניים1. תאי B הם גם סימנים מקדימים של תאי זיכרון B ותאי פלזמה מובחנים, ארוכי טווח, ובכך מספקים חסינות הומוריסטית מתמשכת2. תאי פלזמה, בפרט, הם ייחודיים בקרב תאי החיסון ביכולתם לייצר כמויות גדולות של נוגדן מסוים תוך כדי הישרדות במשך שנים או עשרות שנים3. בנוסף, קלות הבידוד מדם היקפי הופכת את שושלת התאים B למועמד מצוין לטיפולים חדשניים מבוססי תאים4.

בעבר, שיטות אינטגרציה אקראיות, כגון אלה באמצעות וקטורים lentiviral או טרנספוזון היפהפייה הנרדמת, שימשו להנדסת תאי B עבור משלוח transgene וביטוי5,6,7,8. עם זאת, האופי הלא ספציפי של גישות אלה מקשה על חקר הפונקציות הביולוגיות של גן מסוים בתאי B ונושא סיכון אינהרנטי של מוטגנזה הכנסתית וביטוי טרנסג'ין משתנה ו / או השתקה בסביבה הטיפולית.

מערכת CRISPR/Cas9 היא כלי הנדסת גנום רב עוצמה המאפשר לחוקרים לערוך במדויק את הגנום של תאים שונים במינים רבים. לאחרונה, שתי קבוצות, כולל שלנו, פיתחו בהצלחה שיטות להרחבת ex vivo והנדסת גנום ממוקדת של תאי B אנושיים ראשוניים9,10. נתאר את התהליך של טיהור תאי B אנושיים ראשוניים מדגם לוקאפורזיס. לאחר מכן, נתאר את הפרוטוקול המעודכן שלנו להרחבת תאי B ולהפעלה של תאי B מבודדים. לאחר מכן נתאר תהליך להדחת אשכול של בידול 19 (CD19), קולטן B-cell ספציפי וסימן ההיכר של תאי B, על ידי electroporation להציג CRISPR / Cas9 mRNA יחד עם CD19 sgRNA לתוך תאי B פעילים.

Cas9 mRNA מתורגם ונקשר ל- CD19 sgRNA כדי ליצור קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין (RNP) CRISPR/Cas9-sgRNA. לאחר מכן, sgRNA במתחם מוביל Cas9 ליצור שבר גדיל כפול (DSB) ברצף היעד על exon 2 של הגן. התאים יתקנו את ה- DSB על ידי "הצטרפות קצה לא הומולוגית" על ידי החדרה או מחיקה של נוקלאוטידים, מה שיוביל למוטציה של frameshift ויגרום לגן להיות בנוקאאוט. לאחר מכן נמדוד את אובדן CD19 על ידי ציטומטריית זרימה וננתח היווצרות אינדל על ידי מעקב אחר אינדלים על ידי ניתוח פירוק (TIDE).

לאחר מכן נתאר את תהליך השימוש ב- CRISPR/Cas9 יחד עם וקטור AAV6 רקומביננטי (rAAV6, תבנית תורמת לתיקון מונחה הומולוגיה (HDR)) כדי לתווך בהכנסה ספציפית לאתר של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר(EGFP) בגן שילוב וירוסים הקשורים לאדנו 1 (AAVS1). גן AAVS1 הוא מוקד פעיל ללא פונקציות ביולוגיות ידועות ואתר אינטגרציה נגיפי AAV על הגנום האנושי; לכן, הוא נחשב "נמל בטוח" להנדסת גנום. כאן אנו מדווחים כי התרחבות והפעלה של תאי B אפשרו התרחבות של עד פי 44 ב-7 ימי תרבות (איור 1). אלקטרופורציה של תאי B הראתה ירידה קלה בבריאות הכללית של התאים (איור 2A) ב-24 שעות לאחר ההעברה. ניתוח התוויית פיזור של סמן CD19 (איור 2B) הראה ירידה של עד 83% בתאים הערוכים (איור 2C).

ניתוח TIDE של הכרומטוגרפים (איור 3A) גילה כי % indels היה דומה לאחוז אובדן החלבון על ידי ציטומטריית זרימה(איור 3B). ניתוח ציטומטריה זרימה של ניסוי KI הראה כי התאים שקיבלו וקטור AAV (איור 4), יחד עם RNP, הביעו עד 64% תאים חיוביים ל- EGFP (איור 5A) ומאוחר יותר הציגו אינטגרציה מוצלחת על ידי תגובת שרשרת פולימראז צומת (PCR) (איור 5B). ספירת תאים הראתה כי כל הדגימות התאוששו במהירות בתוך 3 ימים לאחר ההנדסה (איור 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דגימות לויקפירזיס מתורמים בריאים התקבלו מבנק דם מקומי. כל הניסויים המתוארים כאן נקבעו להיות פטורים למחקר על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית (IRB) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית Biosafety (IBC) באוניברסיטת מינסוטה.

הערה: כל הניסויים בוצעו בהתאם לאמצעי הזהירות האוניברסלי לפתוגנים המועברים בדם, עם טכניקות סטריליות/אספטיות וציוד biosafety רמה 2 מתאים.

1. הכנת תוספי תזונה למדיום הרחבת תאי B

  1. לשקם אוליגונוקלאוטידים CpG לריכוז של 1 מ"ג / מ"ל.
  2. לשקם את CD40 ליגנד (CD40L) לריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל.
  3. לשקם את האדם רקומביננטי IL-10 (rhIL-10) לריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
  4. לשקם אדם רקומביננטי IL-15 (rhIL-15) לריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
    הערה: שמור כל תוספת aliquots קטן ב -20 °C (70 °F) כדי -80 °C (6 °F) עד 6 חודשים.

2. הכנת מדיום בסיסי

  1. שלב מדיום בסיסי של תאי B עם תוסף מדיה של 5% (v/v) להרחבת תאי החיסון במבחנה (למשל, CTS Immune Cell SR) ו- 1% (v/v) פניצילין וסטרפטומיצין.
  2. מסנן-לעקר את המדיום הבסיסי באמצעות מתאם מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק מעוקר.
  3. שמור על מדיום הבסיס ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.

3. הכן מדיום הרחבה של תאי B

  1. להעביר את הכמות הנדרשת של מדיום הבסיס לתוך מיכל סטרילי לתרבות תאי B ב 5 × 105 תאים / מ"ל.
  2. להשלים את המדיום הבסיסי עם 1 מיקרוגרם / מ"ל CpG, 100 ננוגרם / מ"ל CD40L, 50 ng/ mL rhIL-10, ו 10 ng/mL rhIL-15.
  3. סנן את אמצעי ההרחבה של תא B באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
  4. יש להשוות את מדיום ההתפשטות של תאי B באינקובטור תרבית הרקמות ב-37°C, 5% CO2 עם לחות לפחות 30 דקות לפני השימוש.
    הערה: הכן מדיום הרחבה חדש של תאי B לשימוש ליום אחד. אל תכין את אמצעי ההרחבה של תא B לשימוש במשך מספר ימים. מתכון מדיה זה מעודד התפשטות של תאי זיכרון B ותאי B אנושיים ראשוניים מופעלים.

4. טיהור והתרחבות תאי B אנושיים

הערה: מוסיפים 99–100% אלכוהול איזופרופיל למיכל הקפאה מבוקר טמפרטורה, בהתאם להוראת היצרן, ומצננים את מיכל ההקפאה ב-4 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים את שלב 4.1.

  1. בידוד מחשבים אישיים מדגם לוקאפורזיס
    1. מעבירים דגימת לוקאפורזיס (כ-8-10 מ"ל) לצינור חרוט סטרילי של 50 מ"ל.
    2. העלה את עוצמת הקול ל- 35 מ"ל עם מלוחים סטריליים עם אגירת פוספט (PBS) של 1x פוספט.
    3. שכבה בזהירות מדגם 35 מ"ל leukaphoresis על 15 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית.
    4. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 25 דקות ללא בלם, להסיר את שכבת הפלזמה מבלי להפריע מעיל באפי (שכבת PBMC), לאסוף את המחשבים מהממשק, ולהעביר צינור סטרילי חדש 50 מ"ל חרוט.
    5. העלה את מחשבי ה- PCMCs ל- 50 מ"ל עם PBS אחד.
    6. צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ללא בלם. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה PBMC, אשר עשוי להיראות אדום.
    7. מוסיפים 7 מ"ל של מאגר תמוגה אמוניום-כלוריד-אשלגן, פיפטה 3 פעמים כדי לערבב היטב, ואת הדגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות.
    8. העלה את עוצמת הקול ל- 50 מ"ל עם PBS 1x.
    9. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות עם בלם התנגדות נמוכה. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה. גלולה צריך להיראות ורדרד או לבן.
      הערה: כדי להמשיך לתרבת את תאי B המבודדים זה עתה, הכינו את מדיום ההתפשטות של תאי B לפני שתתחילו בבידוד תאי B (שלב 4.2).
  2. בידוד תאי B ממחשבי PC באמצעות ערכת בידוד שלילית ראשונית של תאי B אנושיים
    1. התחדשו במחשבי PCBM במאגר הבידוד לריכוז של 5 × 107 תאים/מ"ל.
      הערה: אם המספר הכולל של מחשבים אישיים קטן מ- 5 × 107 תאים, הקטן את נפח מאגר הבידוד כדי לשמור על 5 × 107 תאים/מ"ל. נפחים מינימליים ומקסימליים של השעיית תאים הם 0.25 מ"ל ו- 8 מ"ל, בהתאמה.
    2. מעבירים עד 8 מ"ל (5 ×10 7 תאים/מ"ל) לצינור סטרילי, פוליפרופילן, עם כובע.
    3. הוסף 50 μL / mL של משפר קוקטייל למחשבים.
    4. הוסיפו 50 μL/mL של קוקטייל בידוד למחשבי PCMCs, כיפה הצינור, והפך 2-3 פעמים לערבב.
    5. דגירה ב RT במשך 5 דקות; בדקהה-4 של הדגירה, חיידקים מגנטיים מערבולת לפחות 30 שניות.
    6. העבר 50 μL של microbeads מגנטי לכל 1 מ"ל של PBMCs, כובע הצינור, והפך 2-3 פעמים לערבב.
    7. יש לשלך עד 10 מ"ל עם מאגר בידוד ופיפט בעדינות למעלה ולמטה 2-3 פעמים.
    8. מניחים את הצינור בתחנה מגנטית ודגרים ב- RT במשך 3 דקות.
    9. החזק את המגנט ואת הצינור יחד, ובתנועה אחת, להפוך את המגנט ואת הצינור יחד לשפוך את המתלה התא לתוך הצינור החדש. השלך את הצינור הישן.
    10. חזור על שלב 4.2.8 (להפחית את זמן הדגירה ל 2 דקות) ויוצקים את ההשעיה B-cell לתוך צינור חרוט נקי.
    11. תאי B המועשרים מוכנים לשימוש. אם ייעשה שימוש מיידי בתאים, המשך לסעיף 4.3 (הרחבת תאי B אנושיים). בדוק את הטוהר של תאי B המבודדים לפי ציטומטריית זרימה (אופציונלי). אם יש להקפיא תאים לפני השימוש, המשך לשלב 4.2.12.
    12. כדי להקפיא את תאי B, צנטריפוגה ב 400 × g במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה.
    13. resuspend התאים במדיום הקפאה ב 107 תאים / מ"ל, ו aliquot 1 מ"ל / cryovial.
    14. מניחים את ההקפאה במיכל ההקפאה המצונן, ומאחסנים ב -80 מעלות צלזיוס לילה; לאחר מכן, להעביר את cryovial קפוא למיכל חנקן נוזלי; לשמור על תאים קפואים עד שנה אחת.
      הערה: התשואה הצפויה של תאי B מבודדים היא 2%-8% מסך המחשבים האישיים, עם כדאיות של 95%-99%.
  3. הרחבת תאי B אנושיים
    הערה: אם אתה משתמש בתאי B מבודדים זה עתה, דלג על שלבים 4.3.1-4.3.5. לספור את התאים ולהעביר את מספר התאים הנדרש לתוך צינור חרוט סטרילי ולהמשיך עם שלב 4.3.6.
    1. סרום שור עוברי חם מראש (FBS) באמבט מים לפני הפשרת תאי B. הכינו 20 מ"ל של מדיום הרחבת תאי B, העבירו לבקבוק T25, ושווים מראש את המדיום באינקובטור תרבית רקמות (ב-37 °C (37 °C, 5% CO2, עם לחות) לפחות 15 דקות לפני השימוש.
    2. להפשיר תאי B באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בזמן ההמתנה, להעביר 2 מ"ל של FBS שחומם מראש לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל חרוט.
    3. לאחר תאי B מופשרים לחלוטין, מיד להוסיף 1 מ"ל של FBS מחומם מראש, טיפה חכם, לתוך המדגם. דגירה ב- RT למשך דקה.
    4. בעדינות פיפטה כדי resuspend את המדגם ולהעביר את כל נפח, dropwise, לתוך צינור חרוט המכיל 2 מ"ל של FBS מחומם מראש.
    5. העלה את עוצמת הקול ל- 15 מ"ל עם PBS סטרילי של 1x, כיפה והפך את הצינור בעדינות 2-3 פעמים.
    6. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות.
    7. להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה התא, resuspend גלולה התא עם 1 מ"ל של מדיום הרחבה B-cell שווה מראש, ולספור את התאים. מספר התא הכולל צריך להיות כ- 107 תאים.
    8. העבר את התאים לבקבוק המכיל 20 מ"ל של מדיום הרחבת תאי B המשווונים מראש. הריכוז הסופי של התאים צריך להיות כ 5 x 105 תאים / מ"ל.
    9. דגירה אנכית של הבקבוק באינקובטור של תרבית רקמות.
    10. רענן את מדיום ההרחבה לחלוטין כל יומיים על ידי העברת כל נפח תאי B לצינור חרוט סטרילי וחזר על שלבים 4.3.6–4.3.9.
      הערה: בקבוקון T25 יכול להכיל 10-20 מ"ל של בינוני; בקבוקון T75 יכול להכיל עד 20-60 מ"ל של בינוני.

5. הנדסת תאי B אנושית ראשונית

  1. מהנדס B תאים ב 48 ± 2 שעות לאחר הרחבה / הפעלה לקבלת תוצאות אופטימליות. הכינו את מדיום הרחבת תאי ה-B, aliquot 1 מ"ל של המדיום לצלחת תרבית רקמות של 48 באר, וקדם-שיווי משקל באינקובטור של תרבית רקמות לפחות 15 דקות לפני השימוש.
    הערה: בעת עיצוב CRISPR/Cas9 sgRNA עבור גן מעניין, בצע את השלבים המפורטים להלן.
    - עיצוב sgRNAs באמצעות כלי מקוון11.
    - עיצוב sgRNAs על אקסון המשותף לכל isoforms של החלבון.
    - להזמין sgRNA שונה כימית מחברות מכובדות.
    - sgRNA בדרך כלל מגיע בצורה lyophilized; לשקם sgRNA ב DNase / RNase סטרילי ללא טריס-EDTA (TE) מאגר לריכוז של 1 מיקרוגרם / μL.
  2. הכן CRISPR / Cas9 מצע transfecting על ידי ערבוב 1 μL (1 מיקרוגרם / μL) של sgRNA שונה כימית עם 1.5 μL (1 מיקרוגרם / μL) של נוקם סטרפטוקוקוס שונה כימית Cas 9 (S.p. Cas9) גרעין לכל תגובת transfection. לפקד, השתמש ב- μL אחד של מאגר TE במקום ב- sgRNA.
    הערה: כאשר CD19 sgRNA משמש לניסוי KO בגן, ראה איור 2 לקבלת תוצאות. כש-AAVS1 sgRNA משמש לניסוי KI בגנים, ראו איור 5 לתוצאות.
    • שמור את כל הרכיבים על קרח.
  3. מערבבים בעדינות ומעבירים 2.5 μL של CRISPR / Cas9 מצע חוצה לכל תגובה לתוך צינור של 0.2 מ"ל 8 צינור רצועה; מניחים בצד ב-RT.
  4. הפעל גרעין (אלקטרופורטור), והכן ריאגנטים transfection כפי שמוצג בטבלה 1.
    הערה: זהו צעד טוב להפסקה, במידת הצורך, על ידי הצבת כל ריאגנטים על קרח. הסר את כל ריאגנטים מקרח כאשר מוכן לחדש את הניסוי. בעת שימוש בחלבון S.p. Cas9, החוקר חייב מראש מורכב CRISPR / Cas9-sgRNA ריבונוקלאופרוטאין על ידי ערבוב 1 מיקרוגרם sgRNA עם 5 מיקרוגרם של חלבון S.p. Cas9, הימנעות כל בועות, דגירה התערובת ב RT לפחות 20 דקות לפני השימוש לקבלת תוצאות אופטימליות.
  5. לספור ולהעביר 106 תאי B לכל תגובת transfection לתוך צינור חרוט סטרילי.
  6. העלה את עוצמת הקול ל-15 מ"ל עם PBS סטרילי של 1x, וצנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 5 דקות. בזמן ההמתנה, הכינו את ריאגנט transfection התא הראשי (טבלה 2) והניחו בצד ב- RT.
  7. להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה התא.
  8. Resuspend גלולת התא עם 10 מ"ל של סטרילי 1x PBS וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות.
  9. להשליך את supernatant לחלוטין מבלי להפריע גלולה התא.
  10. העבר 0.5 מיקרוגרם של MRNA GFP שונה כימית (ככתב transfection) לכל 106 תאים B לכדור התא (אופציונלי).
  11. Resuspend גלולת התא עם 20 μL תא ראשי transfection מגיב לכל 106 תאי B; מערבבים בעדינות על ידי pipetting 5-6 פעמים. העבר 20.5 μL לכל תגובת transfection לתוך הצינור 0.2 מ"ל של רצועת 8 צינור המכיל 2.5 μL של מצע TRANSFection CRISPR / Cas9.
  12. פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת כדי לערבב ולהעביר את כל נפח (23 μL) לתוך cuvette transfection. מכסים ומקשים בעדינות על הקובטה שעל הספסל כדי להבטיח שהנוזל מכסה את תחתית הקובט.
  13. השתמש בפרוטוקול B-cell ראשי אנושי על הגרעין עבור transfection.
    הערה: ניתן למקם את הגרעין (אלקטרופורטור) ולהשתמש בו מחוץ למכסה המנוע של תרבות הרקמות. כיפה cuvette כדי להבטיח סטריליות.
  14. מניחים את התאים האלקטרופוטים בקובט ב- RT למשך 15 דקות.
  15. העבר 80 μL של מדיום הרחבת תאי B המשווונים מראש מלוח תרבית הרקמה לתגובת transfection ב cuvette. מניחים את הקובטה באינקובטור תרבית הרקמות במשך 30 דקות.
  16. בעדינות פיפטה כמה פעמים כדי לערבב ולהעביר את כל נפח המדגם מן cuvette לבאר המתאימה של צלחת 48-באר רקמה תרבות המכיל 1 מ"ל של מדיום הרחבת B-cell. הריכוז הסופי של התאים צריך להיות 106 תאים / מ"ל.
  17. אם מבצעים ניסוי KI גן, להעביר rAAV6 וקטור ב 500,000 ריבוי של זיהום לתוך הבאר המתאימה המכילה תאים electroporated (כ 45 דקות לאחר electroporation). ראו מבנה וקטורי rAAV6 לדוגמה באיור 4A.
    הערה: לדוגמה: דגימת בקרה תיקרא אלקטרופוטית ללא CRISPR/Cas9 או הווקטור rAAV6. דגימה וקטורית בלבד תטופל ללא CRISPR/Cas9 ולאחר מכן תשתנה עם הווקטור rAAV6. דגימת KI תהיה electroporated עם CRISPR /Cas9 ולאחר מכן להיות transduced עם וקטור rAAV6. rAAV6 חייב להכיל זרועות הומולוגיות במעלה ובמורד הזרם של אתר DSB היעד עבור HDR.
  18. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 עם לחות.
  19. ספור את התאים ואת יכולת הקיום של הרשומה ביום הראשון שלאחר ההנדסה.
  20. רענן את מדיום ההרחבה של תאי B כל יומיים על-ידי ספירת התאים ולאחר מכן העברת כל נפח התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 × g במשך 5 דקות, ולזרוק את supernatant מבלי להפריע גלולה. לשים מחדש את התאים עם 100 μL של מדיום הרחבת תאי B טריים, ולהעביר לבאר של צלחת תרבית רקמות 24-גם. העלה את הנפח הבינוני כדי להשיג ריכוז תאים סופי ב 5 × 105 תאים / מ"ל.
    הערה: צלחת 48 באר יכול להחזיק עד 1 מ"ל בינוני / טוב; צלחת 24 באר יכול להחזיק עד 2 מ"ל בינוני / טוב; צלחת 12-באר יכול להחזיק עד 4 מ"ל בינוני / טוב, צלחת 6-באר יכול להחזיק עד 8 מ"ל בינוני / טוב.
  21. אפשר לתאים המהונדסים להתרחב לפחות 5 ימים לפני ביצוע ניתוחים במורד הזרם, כגון ניתוח ציטומטריית זרימה, ניתוח TIDE ו- PCR של צומת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול ההרחבה וההפעלה המעודכן איפשר התרחבות מהירה של תאי B עד פי 44 ב-7 ימים (איור 1; n =3 תורמים). בניסוי KO, ספירת תאי B באמצעות כתמים כחולים Trypan הראה יותר מ 80% תאים קיימא עם ירידה קלה בשחזור התא הן את הפקד ואת דגימות CD19 KO ב 24 שעות לאחר electroporation (איור 2A;p ≥ 0.05, n = 3 תורמים). תוצאה זו מצביעה על כך שאלקטרופורציה השפיעה מעט על הבריאות הכללית של תאי B. תאי B נאספו ביום 5 שלאחר ההעברה לניתוחי ציטומטריית זרימה ו- TIDE. חלקות פיזור מייצגות של הפקד ודגימת KO הראו 14% ו-95% תאים CD19 שליליים, בהתאמה (איור 2B). כמות החלקות הזרימה הראתה ירידה משמעותית בביטוי CD19 בדגימות KO בהשוואה לבקרה (איור 2B;p ≤ 0.0001, n = 3 תורמים). כרומטוגרמות של רצף גנומי (ראה רצפי פריימר בטבלה 3)הראו פסגות כפולות בתאי CD19 KO B, המציינות הכנסות/מחיקות של נוקלאוטידים לאחר CRISPR/Cas9 בתיווך DSB, בעוד ששיאים בודדים נצפו בפקד, מה שמצביע על כך שלא התרחש DSB במדגם זה (איור 3A). ניתוח Indel של הכרומטוגרפים (באמצעות כלי ניתוח TIDE מקוון חינם) של דגימות KO הראה אחוז גבוה של היווצרות indel (>90%) ב- CD19 locus, אשר עולה בקנה אחד עם % אובדן חלבון CD19 זוהה על ידי cytometry זרימה (איור 3B;p ≥ 0.05, n = 3 תורמים). תוצאות אלה מצביעות על כך ש- CRISPR/Cas9 יצר ביעילות CD19 KO בתאי B. תאי B מניסוי KI נאספו ביום 12 שלאחר ההנדסה עבור ניתוחי PCR של זרימה וצומת PCR (טבלה 4). חלקות פיזור הראו 64% מהתאים החיוביים של EGFP במדגם שקיבל את הווקטור rAAV6 (איור 4) יחד עם RNP, בעוד שלא נצפה תא חיובי ל- EGFP בפקד; דגימה מינימלית של חיוביות EGFP נצפתה במדגם שקיבל וקטור AAV בלבד (איור 5A). הגברה של PCR בצומת (ראו רצפי פריימר בטבלה 3)הראתה 1.5 קג"מ בדגימה KI (איור 5B),בעוד שאף מוצר PCR לא נצפה בדגימה של הפקד או של הווקטור בלבד. ספירות תאים הראו כי התהליך ההנדסי משפיע על שחזור התאים במדגם KI יותר מהפקד או מהדגימות הווקטוריות בלבד (איור 5B). עם זאת, כל הדגימות התאוששו במהירות תוך 3 ימים לאחר ההנדסה (איור 5B). יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך ששילוב מוצלח של EGFP בלוקוס AAVS1 מוביל לביטוי יציב של EGFP לפחות 12 ימים לאחר ההנדסה.

Figure 1
איור 1: הרחבת תא B במבחנה. תאי B נזרעו ב 1 × 106 תאים ביום 0 (אפס) בצפיפות של 5 × 105 ל mL והרחיב 44-פי 7 ימים (n = 3 תורמים עצמאיים). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2A
איור 2A: לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2B
איור 2B: לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2C
איור 2C: הסתרת CD19 בתיווך CRISPR/Cas9 (KO) בתאי B. (A) גרף עמודות מציג >70% שחזור תאים (לוח שמאל) ו >80% הכדאיות (לוח ימני) של תאים לאחר transfection נצפו הן בדגימות הבקרה והן בדגימות CD19 KO ב 24 שעות לאחר electroporation. (B) התוויות זרימה מייצגות של CD19 gating של תאים חיים מראה 84.3% ו 3.43% CD19 חיובי תאים במדגם הפקד ואת מדגם CD19 KO, בהתאמה. (C) גרף עמודות מראה הפחתה משמעותית של CD19 בקבוצה CD19 KO בתיווך CRISPR/Cas9 (p ≤ 0.0001). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3A
איור 3A: לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3B
איור 3B: אובדן חלבון CD19 לעומת היווצרות אינדל. (A)כרומטוגרמות מתארות פסגות רצף של דוגמת ההסתרה (KO) של הפקד ו- CD19. התיבה האפורה בפסגות הפקד מדגישה את רצף היעד של CD19 gRNA עם אתר החיתוך החזוי המצוין על-ידי חץ. CD19 KO הראה רצף "פסגות כפולות" סביב אתר החיתוך החזוי, המציין הכנסה/מחיקה של נוקלאוטידים לאחר ההפסקה הכפולה. (B) גרף עמודות המציג תוצאות עקביות בין אובדן חלבון % CD19 לבין היווצרות % indel ב- CD19 locus (p ≥ 0.05). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מבנה וקטורי RAAV6 AAVS1 MND-GFP. קלטת הביטוי מכילה רצף חזק של מקדם סינתטי (MND), ומיד אחריו רצף קידוד משופר של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ורצף אדנילציה פולי (Poly A). זרועות הומולוגיה AAVS1 לאגף במעלה הזרם של מקדם MND במורד הזרם של רצפי פולי A. EGFP יתבטא תחת הרגולציה של מקדם MND. אורכי רצף מצוינים מעל כל רכיב של המבנה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5A
איור 5A: לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5B
איור 5B: לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5C
איור 5C: שילוב ספציפי לאתר בתיווך CRISPR/Cas9 ו- rAAV6 של קלטת הכתבים של EGFP בתאי B ביום ה-12 שלאחר ההנדסה. (A) התוויית זרימה מייצגת אינה מציגה תאים B חיוביים ל- EGFP בפקד או במדגם הווקטורי בלבד לעומת 64.4% מתאי EGFP חיוביים B מדגם ה- knockin (KI). (B) תגובת שרשרת פולימראז צומת של מדגם KI מראה את הלהקה החזויה 1.5 Kbps; לא נמצאה רצועה בפקד או בדוגמת וקטור בלבד. מים שימשו כדי להבטיח שום זיהום במהלך תהליך PCR. (C) גרף עמודות מתאר את צמיחת התאים של הפקד, את הווקטור בלבד ואת דגימות EGFP-KI על פני תקופה של 3 ימים לאחר ההנדסה. קו מנותק מציין את קלט התא 1 ×10 6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שם רצף gRNA
CD19 5'-GCTGTGCTGGTGTCAA-3'
AAVS1 5'-GTCACCAATCCTGTCTCTAG-3'

טבלה 1: רצפי gRNA.

ריאגנטים עוצמת קול לתגובה אחת
פתרון תא ראשי P3 16.4 מ"ל
תוספת 1 3.6 מ"ל
הכולל 20 מ"ל

טבלה 2: הכנת תערובת מגיבים של Nucleofection.

תיאור רצף מטרה
פריימטרים קדמיים של CD19 5'-AAATTCAGGAGGGGGGGAAG-3' להגביר את לוקוס CD19 לניתוח Indel
תמיר הפוך CD19 5'-GCGGACCTCCTCTTCCATG-3' להגביר את לוקוס CD19 לניתוח Indel
פריימר קדימה של PCR צומת 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' PCR של צומת
צומת PCR הפוך פריימר 5'-גאגאגטגטגאקאקקטק-3 PCR של צומת

טבלה 3: נעשה שימוש בפריימריז.

תיאור פלואורופור שיבוט
CD19 אנטי-אנושי PerCP (פרCP) HIB19
צבע הכדאיות eפלור 780 -

טבלה 4: נוגדן ציטומטרי זרימה וצבע הכדאיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנדסת גנום מדויקת בתאי B אנושיים ראשוניים הייתה מאתגרת עד לאחרונה9,10. פרסמנו בעבר פרוטוקולים באמצעות CRISPR/Cas9 כדי להנדס תאי B אנושיים ראשוניים9. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים משופרים עבור בידוד B-cell, הרחבה, והנדסה כדי לאפשר KO יעיל של CD19 או לדפוק ב EGFP.

כאן אנו מראים כי פרוטוקול ההתרחבות שלנו מאפשר התרחבות מהירה של תאי B בתרבות להרחבה של עד פי 44 תוך 7 ימים (איור 1). פרוטוקול זה הראה קצב התרחבות מהיר יותר מאלה שדווחו על ידי Johnson et al.9 ו- Hung et al.10 הצעדים הקריטיים להבטחת התרחבות בריאה ומהירה של תאי B ראשוניים מחדשים את המדיום עם גורמי הפעלה טריים כל יומיים ומבטיחים שמספר תאי B הכוללים בתרבות לא יעלה על 2 × 106 תאים / מ"ל.

מצאנו גם שהפרוטוקול המשופר שלנו להדבקת מערכת CRISPR/Cas9 עבור CD19 KO הביא ליעילות גבוהה של CD19 KO(איור 2 ואיור 3). בדומה למחקר קודם9, ראינו ירידה קלה בהתאוששות התא ואת הכדאיות לאחר electroporation ב 24 שעות. זה מציין כי electroporation משפיע על בריאות התא הכוללת של תאי B ראשוניים; עם זאת, התאים בסופו של דבר ריבאונד בתוך 48 שעות (נתונים לא מוצגים).

היתרון של שימוש בפרוטוקול electroporator זה הוא שאנחנו יכולים electroporate דגימות בקצב הרבה יותר מהר (16 תגובות בפחות מ 1 דקות), ואילו פרוטוקוליםקודמים 9,10 לקחת בערך 10-12 דקות עבור 16 תגובות. בנוסף, מערכת transfection זה מבטל את הקשת החשמלית הפוטנציאלית של electroporator שנצפה במחקריםקודמים 9,10. יתר על כן, ניתן לשנות את קנה המידה של שיטה הנדסית זו עבור מספר גדול יותר של תאי B באמצעות cuvettes גדולים יותר, זמינים מסחרית (נתונים שאינם מוצגים).

כמה צעדים קריטיים כדי להבטיח בריאות אופטימלית הכוללת של התא ויעילות KO: ראשית, להבטיח כי אמצעי הרחבת B-cell מוכן מראש שווה לפחות 15 דקות לפני השימוש. שנית, הנפח הכולל של מצע transfection לא יעלה על 20% (v / v) של מגיב הגרעין. שלישית, יש להרחיב/להפעיל את התאים למשך 48 ± 2 שעות לקבלת תוצאות מיטביות. רביעית, הקש בעדינות על קובט האלקטרופורציה לפני הצבת האלקטרופורטור כדי להבטיח שתמיסת תגובת ההעתקה מכסה את תחתית הקובט. החמישית, הקפד לנוח את התאים electroporated ב cuvette רק 15 דקות ב RT; השארת תאים בגרעין מגיב לאחר electroporation במשך זמן רב מדי יכול לפגוע בהישרדות התא הכולל. שישית, הקפד להדגיר את התאים עם מדיה cuvette במשך לא יותר מ 30 דקות. שביעית, הצבת 106 תאים electroporated ב 1 מ"ל עבור 48 h הראשון נוטה לעזור לתאים להתאושש מהר יותר מאשר culturing אותם בצפיפות נמוכה יותר (נתונים לא מוצגים). לבסוף, שימוש בחלבון Cas9 mRNA או Cas9 יגרום ליעילות עריכה דומה (נתונים שאינם מוצגים); עם זאת, השתמשנו Cas9 mRNA לנוחות ועלות.

שני חששות עיקריים בעת שימוש CRISPR/Cas9 הם השפעות מחוץ ליעד ו translocations כרומוזומלי. השפעות מחוץ ליעד הנגרמות על ידי זוגות בסיס לא תואמים של sgRNA לרצף היעד, להוביל לאתרי קשירה אפשריים רבים על הגנום וליצור מרובים, גנים לא רצויים KOs. לכן, יש לקחת בחשבון את הציון החזוי מחוץ ליעד יחד עם הציון ביעד כדי למזער את הבעיה. טרנסלוקציה כרומוזומלית יכולה להתרחש עקב השפעות מחוץ ליעד או כאשר מפילים גנים מרובים. זה יכול לגרום לאירועים קטסטרופליים באופן ניסיוני וקליני. עורכי בסיס12 לשנות נוקלאוטידים יחיד (שתי מחלקות: עורך בסיס ציטוצין ועורך בסיס אדנין) כדי לשבש את אלמנט שחבור, כדי ליצור קודון עצירה מוקדמת, או כדי ליצור מוטציה נקודה, המוביל לגן היעד KO ללא DSB (נבדק בהרחבה במקומותאחרים 12). לכן, הגישה הבסיסית לעריכת יכול לשמש KOs יחיד או מרובה גנים לעקוף טרנסלוקציות כרומוזומליות.

אנו גם מדגימים כי CRISPR/Cas9, יחד עם rAAV6, ניתן להשתמש כדי לתווך ביעילות KI ספציפי לאתר וביטוי של EGFP ב- AAVS1 לוקוס. ראינו ביטוי EGFP לפחות 12 ימים לאחר ההנדסה. ראינו גם שתי אוכלוסיות חיוביות ל-EGFP: ביטוי EGFP גבוה ובינוני במדגם KI ביום 12 (איור 5A),ואילו המדגם הווקטורי בלבד הראה אחוז מינימלי של תאים עם ביטוי EGFP ביניים. אנו משערים כי תופעה זו של "אוכלוסיות גבוהות ובינוניות" נובעת משילוב ביאלי של הווקטור. חקירה נוספת באמצעות PCRפורש 13 של תאי ביניים וגבוהים EGFP ניתן לעשות כדי לאשר השערה זו. שתי אזהרות על שימוש ב- AAV כווקטור: ראשית, לווקטורים של AAV יש קיבולת מטען קטנה, עד 4.7 קילו-בייס, הגורמת לבעיות בעת דפיקות בגן גדול. הקטנת גודל זרועות ההומולוגיה תאפשר לינה של גן גדול יותר, אשר בתורו יקטין את יעילות KI (נתונים לא מוצגים). לחלופין, ניתן להשתמש בשילוב בו זמני או רציף של וקטורים רבים לטעינתגנים 14,15. מחקרים דיווחו על תגובה חיסונית וסיווג של תאים שעברו עירוי AAV במודלים של בעלי חיים חיסוניים16,17. לחלופין, ניתן לחקור תבנית HDR של תורם שאינו מבוסס ויראלי כדי לעקוף בעיה זו.

לסיכום, הוכחנו תהליכים מקיפים, צעד אחר צעד של בידוד, התרחבות והנדסה של תאי B שהביאו ליעילות גבוהה של שינויים בגנים. שיטה הנדסית זו יכולה לשמש עבור הגן KO וללמוד את הפונקציות של גנים בתאי B. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש להנדסת תאי B כדי לבטא נוגדן רקומביננטי להילחם נגד זיהום. לבסוף, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מהנדס תאי B כדי לבטא ולהפריץ אנזימים טיפוליים שיכולים לשמש כטיפול מבוסס תאים אוטולוגי לטיפול באנזימופתיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

הוגש פטנט על שיטות ייצור ושימוש בתאי B ערוכים בגנום עם M.J.J. , K.L., ו B.S.M כממציאים. B.S.M היא יועצת ובעלת מניות Immusoft Inc. Immusoft Inc מימנה מחקר במעבדה של B.S.M.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי הקרן לחקר הסרטן לילדים (CCRF) ו NIH R01 AI146009 כדי B.S.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug IDT 1081059 smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza V4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer Quality Biological 118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA Trilink Biotechnology L-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg Invivogen TLRL-2006-5 different sizes available
Cryostor CS10, 100 mL STEMCELL Technology 7930
CTS Immune Cell SR Thermo Fisher Scientific A2596101
EasySep human B cells isolation kit STEMCELL Technology 17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780 eBiosciences 65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-free R&D Systems CCM031 B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube Corning 352059
Fetal Bovine Serum (FBS) R&D Systems S11550 For thawing B cells only
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps BioExpress T-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS GE lifesciences SH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unit Lonza AAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unit Lonza AAF-1002X
Mega CD40 Ligand Enzo Life Sciences ALX-522-110-C010
Mr. Frosty Sigma-Aldrich C1562-1EA For freezing cells
Pen/Strep 100X Sigma-Aldrich TMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19 biolegend 302228 smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) Vigene Biosciences N/A large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ug R&D Systems 217-IL-250 different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ug R&D Systems 247-ILB-025 different sizes available
The Big Easy EasySep Magnet STEMCELL Technology 18001 different sizes available
Tris-EDTA (TE) buffer Fisher Scientific BP2476100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
  3. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
  4. Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
  5. Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
  6. Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
  7. Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
  8. Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
  9. Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
  10. Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
  11. Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
  12. Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
  13. Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
  14. Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
  15. Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
  16. Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
  17. Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 165 CRISPR/Cas9 הנדסת גנום AAV רקומביננטי עריכת גנים תאי B אנושיים ראשוניים
הנדסת גנום של תאי B אנושיים ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laoharawee, K., Johnson, M. J.,… More

Laoharawee, K., Johnson, M. J., Lahr, W. S., Peterson, J. J., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (165), e61855, doi:10.3791/61855 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter