Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tilbagevendende Escherichia coli urinvejsinfektion udløst af Gardnerella vaginalis Blæreeksponering hos mus

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61967
Automatic Translation
1,2,6, 3,7, 1,2,4,8, 2,5
1Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Summary

En musemodel af uropatogen E. coli (UPEC) transuretral podning for at etablere latente intracellulære blærereservoirer og efterfølgende blæreeksponering for G. vaginalis for at inducere tilbagevendende UPEC UTI er demonstreret. Også demonstreret er optælling af bakterier, urincytologi og in situ blærefiksering og behandling til scanning elektronmikroskopi.

Abstract

Tilbagevendende urinvejsinfektioner (rUTI) forårsaget af uropatogen escherichia coli (UPEC) er almindelige og dyre. Tidligere artikler, der beskriver modeller af UTI hos han- og hunmus, har illustreret procedurerne for bakteriel podning og optælling i urin og væv. Under en indledende blæreinfektion hos C57BL/6-mus etablerer UPEC latente reservoirer inde i blæreepitelceller, der vedvarer efter clearance af UPEC-bakteriuri. Denne model bygger på disse undersøgelser for at undersøge rUTI forårsaget af fremkomsten af UPEC fra latente blærereservoirer. Den urogenitale bakterie Gardnerella vaginalis bruges som udløser af rUTI i denne model, fordi den ofte er til stede i kvinders urogenitale kanaler, især i forbindelse med vaginal dysbiose, der har været forbundet med UTI. Derudover beskrives også en metode til in situ blærefiksering efterfulgt af scanning elektronmikroskopi (SEM) analyse af blærevæv med potentiel anvendelse på andre undersøgelser, der involverer blæren.

Introduction

Urinvejsinfektioner (UTI) pålægger en betydelig sundhedsbyrde på verdensplan og påvirker livskvaliteten for millioner af mennesker hvert år, især kvinder1. Uropatogen escherichia coli (UPEC) er den hyppigste årsag til UTI1. Mange patienter (ca. 20-30%), der udvikler UTI, vil opleve en tilbagevendende UTI (rUTI) inden for 6 måneder på trods af antibiotikamedieret clearance af den oprindelige infektion2. Desværre lider så mange som 5% af præmenopausale kvinder af 3 eller flere rUTI hvert år 3,4. Sekventielle episoder af rUTI kan være forårsaget af persistens af den samme UPEC-stamme fra indekstilfældet 5,6,7,8. Data fra humane prøver og musemodeller tyder på, at rUTI af samme stamme kan være forårsaget af UPEC, der befinder sig i hvilende reservoirer i blæren. Hos mennesker blev UPEC påvist i epitelceller og blærebiopsier hos patienter med UTI 9,10,11,12,13. Undersøgelser i C57BL/6-mus har vist, at nogle stammer af UPEC kan etablere hvilende intracellulære reservoirer i blæren, som påvist ved fluorescensmikroskopi og ved homogenisering og dyrkning af blærevæv, der opretholdes i flere måneder efter opløsning af bakteriuri 14,15,16. Behandling af blæren med midler, der inducerer eksfoliering af blæreepitelet (urotelium), fx protaminsulfat17 eller chitosan18, udløser fremkomst af UPEC fra reservoirer for at forårsage rUTI. Disse data tyder på, at hos kvinder, der har blære UPEC-reservoirer fra en tidligere infektion, kan blæreeksponeringer, der fører til urotelial eksfoliering, udløse rUTI.

Der er stigende beviser for, at den vaginale mikrobiota bidrager til urinvejsinfektion19,20. Gardnerella vaginalis er et hyppigt medlem af både vaginal og urin mikrobiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. I vagina er tilstedeværelsen af høje niveauer af G. vaginalis forbundet med en mikrobiel dysbiose kendt som bakteriel vaginose (BV), som påvirker ~ 30% af kvinderne 30,31,32. Kvinder med BV har en højere risiko for at opleve UTI sammenlignet med kvinder med et vaginalt samfund domineret af Lactobacillus 33,34,35,36,37. I musemodeller forårsager G. vaginalis epitel eksfoliering både i vagina38 og i blæren39. I C57BL/6-mus, der huser UPEC-blærereservoirer, resulterer to sekventielle blæreeksponeringer for G. vaginalis - men ikke pbs - i genopståen af UPEC fra reservoirer for at forårsage UPEC rUTI. Fremkomsten fremgår af forekomsten af UPEC-titere i urin fra mus, der tidligere havde løst UPEC-bakteriuri og et efterfølgende fald i UPEC-blærehomogenattitre ved ofring sammenlignet med PBS-eksponerede kontroldyr39. Interessant nok er der ikke en varig kolonisering af G. vaginalis i blæren. I langt de fleste tilfælde er to korte eksponeringer, hver med mindre end 12 (h) levedygtig G. vaginalis i urinen, tilstrækkelige til at fremkalde uroteleksfoliering og fremme rUTI.

Denne protokol beskriver en musemodel af rUTI forårsaget af UPEC bosiddende i intracellulære blærereservoirer ved hjælp af G. vaginalis blærepodning for at udløse gentagelsen. Fremskridtet opnået med denne model er, at G. vaginalis er en klinisk relevant biologisk udløser af rUTI sammenlignet med tidligere anvendte kemiske agenser. Endvidere tillader den relativt kortvarige overlevelse af G. vaginalis i musens urinveje undersøgelse af virkningen af forbigående mikrobielle eksponeringer på urotelium, som det kan forekomme efter seksuel aktivitet. Ud over at skitsere rUTI-modellen beskriver denne protokol også metoder til urincytologi og in situ blærefiksering og billeddannelse af urotelet ved scanning af elektronmikroskopi (SEM).

Denne protokol af G. vaginalis-induceret tilbagevendende UPEC UTI bruger UPEC stamme UTI89 bærer en kanamycin resistens kassette (UTI89kanR)40. Ikke alle testede stammer af UPEC var i stand til at danne intracellulære bakteriesamfund under det akutte infektionsstadium hos mus41 , og det vides endnu ikke, om alle stammer af UPEC har evnen til at danne latente intracellulære reservoirer. Reservoirdannelse skal bekræftes inden brug af andre UPEC-stammer i modellen. Denne protokol bruger et spontant streptomycinresistent G. vaginalis-isolat , JCP8151BSmR38. Induktion af rUTI af JCP8151BSmR kræver to sekventielle G. vaginalis-podninger , givet enten 12 timer eller 7 dage (d) fra hinanden39. Hvorvidt andre G. vaginalis-stammer inducerer eksfoliering og/eller UPEC rUTI, skal stadig bestemmes med denne model. Det er vigtigt at bruge UPEC- og G. vaginalis-stammer med kendt antibiotikaresistens (såsom kanamycin eller spectinomycin til UPEC og streptomycin til G. vaginalis), fordi antibiotika kan tilsættes til agarplader for at forhindre vækst af endogen musemikrobiota, der ellers kunne forstyrre opregnende kolonidannende enheder (CFU) for at overvåge infektion. Dette er især vigtigt for dyrkning af urinprøver, fordi museurin ofte indeholder andre bakterier, der kan vokse på kulturplader uden antibiotika. Oprindelsen af disse endogene bakterier i museurin er ukendt, men afspejler sandsynligvis periuretrale og urogenitale bakterier, der afhentes under urinopsamling.

G. vaginalis er en fakultativ anaerob bakterie, og derfor beskriver denne protokol voksende G. vaginalis JCP8151BSmR i et anaerobt kammer. Hvis et anaerobt kammer ikke er tilgængeligt, kan andre metoder til opretholdelse af anaerobe vækstbetingelser (såsom en GasPak-pose i en lufttæt beholder) anvendes. Alternativt vil nogle stammer af G. vaginalis (herunder JCP8151BSmR) vokse i en standard vævskulturinkubator (5% CO2). Ligesom brug af andre G. vaginalis-stammer end JCP8151BSmR kræver test for at sikre, at bakterierne opfører sig på samme måde i denne model, kræver ændrede vækstbetingelser empirisk bestemmelse af ideelle varigheder for dyrkning (på plader og i væske) og optisk densitet (OD) 600 ækvivalenter for at opnå ønskede levedygtige podekoncentrationer. Desuden vides det ikke, om vækstbetingelser påvirker patobiologien af G. vaginalis.

Endelig, når man overvejer, om man skal bruge denne model, skal forskere være opmærksomme på, at det kan kræve et større antal dyr pr. Gruppe end typiske UTI-musemodeller. Dette skyldes til dels, at induktion af rUTI kræver, at musene løser UPEC-bakteriurien forårsaget af den første infektion i blæren. Således er enhver mus, der ikke rydder bakteriuri (en fænotype, der normalt indikerer igangværende nyreinfektion), ikke inkluderet i protokollens rUTI-fase. Antallet af mus, der er nødvendige for at drive disse undersøgelser, påvirkes også af hastigheden af "spontan" UPEC-fremkomst i urinen (12-14% i gennemsnit). Endelig har forskellige musestammer forskellige tilbøjeligheder til at udvikle kronisk bakteriuri versus intracellulær reservoirdannelse42,43. Hvis der anvendes andre musestammer end C57BL/6 i denne model, skal det bekræftes, at dyrene udvikler hvilende UPEC intracellulære reservoirer.

Protocol

Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkendte alle museinfektioner og procedurer som en del af protokolnummer 20170081, der udløb 06/09/2020, og 20-0031, der udløber 03/18/2023. Den overordnede pleje af dyrene var i overensstemmelse med The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals fra National Research Council og USDA Animal Care Resource Guide. Eutanasiprocedurer er i overensstemmelse med AVMA-retningslinjerne for eutanasi af dyr: 2020-udgaven.

Figure 1
Figur 1. Skematisk af musemodel. Tidslinjen er fremhævet for at afspejle faserne eller procedurerne i den model, der er skitseret i protokollen. Fase 1 (orange): Etablering af intracellulære UPEC-reservoirer. Mus podes transuretralt med UPEC, og urinprøver indsamles og overvåges for clearance af bakteriuri. Kun mus, der rydder bakteriuri, fortsætter til de efterfølgende faser. Fase 2 (grøn): Blære eksponering for G. vaginalis. Mus podes transuretralt med G. vaginalis to gange. Varigheden af tiden mellem de to sekventielle eksponeringer er enten 12 timer (øverste panel) eller 1 uge (wk; bundpanel), afhængigt af den ønskede downstream-analyse. Fase 3 (gul): UPEC rUTI. Urin opsamles dagligt efter G. vaginalis eksponering og overvåges for UPEC bakteriuri. Derudover kan blærer og nyrer indsamles ved det eksperimentelle endepunkt for at måle UPEC-vævstitre. I 1 wk eksponeringsmodellen afspejles G. vaginalis-induceret fremkomst af UPEC fra intracellulære reservoirer og efterfølgende clearance fra urinvejene også i et fald i UPEC blærevævstitre (sammenlignet med PBS-eksponerede mus, se figur 3D). Dette fald i blæretitre var ikke tydeligt i 12 timers eksponeringsmodellen, formodentlig fordi der kræves mere tid for tilstrækkelig reservoirspiring og clearance til at forekomme for signifikant at reducere vævstitre. Procedure A: Urincytologi udføres typisk 1 dpi (eller endnu tidligere) i fase 1 for at undersøge akut UPEC-infektion og i fase 3 for at vurdere urinens PMN-indhold, som korrelerer med UPEC-fremkomsten. Urinprøver indsamlet på andre tidspunkter kan analyseres på samme måde. Procedure B: Blærescanning elektronmikroskopi (SEM) til undersøgelse af uroteleksfoliering udføres typisk i 12 timers modellen ved 3 timer efter den anden G. vaginalis-eksponering (15 timer efter administration af den første eksponering på tidspunktet 0). Andre tidspunkter kan også vurderes, såsom 6-24 timer efter UPEC-podning som vist i fase 1. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Etablere UPEC hvilende intracellulære reservoirer i mus

  1. Forbered urinkatetre (se 44,45,46,47 for videoer af dette trin).
    1. Gevind 30 Målernåle med en længde af PE10-slange, der strækker sig fra nålebasen til flere mm ud over nålespidsen. Pas på ikke at punktere slangen med nålespidsen. Alternativt kan du bruge pædiatriske intravenøse kanyler46.
    2. Læg tilberedte katetre i en petriskål og steriliser med UV-lys i mindst 30 min. Udskift petriskållåg og fastgør det til opbevaring, indtil det er nødvendigt.
  2. Forbered UPEC-pode (dag -3 til 0)
    1. Dag -3: Streak UTI89kanR fra -80 °C fryselager på en Luria-Bertani (LB) agarplade. Inkuberingspladen ved 37 °C i 18-24 timer.
      BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at tilføje kanamycin til inokulumvækstmediet, fordi kanamycinresistensen er stabilt integreret i UTI89kanR.
    2. Dag -2: Pod 20 ml LB bouillon i en steril 125 ml kolbe med en enkelt koloni af UTI89kanR. Brug ikke en mindre kolbe, da denne dyrkningsmetode er vigtig for at fremkalde ekspression af UPEC type 1 pilus, der er nødvendig for blæreadhæsion.
    3. Inkuberes statisk (uden omrystning) ved 37 °C i 18-24 timer. Tilsæt ikke antibiotika til vækstmediet. Brug kun friske kolonier på LB-plader (18-24 timer gamle) for at starte flydende kulturer.
    4. Dag -1: Subkultur UTI89kanR ved at fjerne 20 μL kultur (hvirvl forsigtigt kolben for at resuspendere bundfældede bakterier) og tilsætte til 20 ml frisk LB bouillon i en steril 125 ml kolbe. Inkuberes som i trin 2, bortset fra en fast varighed på 18 timer. Tilsæt ikke antibiotika til vækstmediet.
    5. Dag 0: Overfør hele kulturen til et 50 ml rør og drej ved 3200 × g i en bordpladecentrifuge i 10 minutter for at pelletere bakterier. Aspirer supernatant og resuspend bakteriepellet i 10 ml PBS.
    6. Der tilsættes 100 μL af den koncentrerede bakteriesuspension fra trin 4 til 900 μL PBS i en kuvette, og den optiske massefylde bestemmes ved 600 nm (OD600) ved hjælp af et spektrofotometer, der er blevet aflagt med PBS. Multiplicer spektrofotometerværdien med 10 (for at tage højde for fortyndingen) for at bestemme OD600 for suspensionen (OD-suspension).
    7. For at opnå den ønskede podekoncentration på 1 x 107 CFU i 50 μL fortyndes (eller koncentreres) UTI89kanR-suspensionen ved hjælp af følgende ligning, hvor det ønskedeOD-inokulum er 0,35 (værdien kan variere for andre UPEC-stammer), og Y er det krævede volumen af pode (100 μL pr. mus for at tillade ekstra til eliminering af bobler og påfyldning af katetre):
      X ml xOD-suspension = Y ml xOD-podning
      For eksempel, hvisOD-suspensionsværdien er 4,7 og 5 ml pode, kræves:
      X ml × 4,7 = 5 × 0,35
      X = (5 × 0,35) / 4,7
      X = 0,372 ml
      Tilsæt derfor 372 μL bakteriel suspension for at fremstille 5 ml (endeligt volumen)
    8. Brug en flerkanalspipette til at foretage 1:10 serielle fortyndinger af podelegemet ud til 10-6 i steril PBS i en 96-brønds plade. Spot fem 10 μL replikater af alle 6 fortyndinger på en LB- og LB + kan-plade, lad pletterne tørre og inkubere ved 37 ° C natten over. LB-pladen uden antibiotika bruges til at sikre, at podestoffet ikke var forurenet af en anden organisme (som ville fremstå som en ekstra kolonimorfologi, der ikke findes på antibiotikaudvælgelsespladen). Begge pladetyper skal give det samme resultat.
      BEMÆRK: Plader skal have lov til at tørre på bordpladen i en dag før brug, så de absorberer den belagte væske uden pletter, der samler sig.
    9. Tæl det samlede antal kolonier i alle fortyndingspletter med kolonier, der kan skelnes, og brug værdien til at beregne den faktiske podedosis, der er anvendt i hvert forsøg. Stol ikke blot på OD600-værdierne .
  3. Pod UTI89kanR i blærerne hos bedøvede hunmus (dag 0)
    BEMÆRK: Videooptagelser af denne procedure er tidligere blevet offentliggjort44,46. Se disse papirer for en mere grundig beskrivelse. Se afsnit 5 i denne protokol for flere detaljer om kateterisering af mus.
    1. Bedøv mus med isofluran inhalation i henhold til IACUC-godkendte metoder.
    2. Mens du venter på, at mus bliver bedøvet, skal du fylde tuberkulinsprøjten med UTI89kanR inokulum og derefter anbringe et forberedt kateter. Tryk stemplet ned for at tømme luft fra kateteret, og dup derefter kateteret i sterilt kirurgisk smøremiddel.
    3. Placer musen på ryggen og bekræft bedøvelse ved at klemme musens trædepude fast og observere fraværet af en refleks eller reaktion. Find blæren (føles som en ærter i underlivet) mellem pegefingrene på hver hånd. Udtryk urin ved at flytte fingrene mod hinanden for at anvende et blidt klemmetryk på blæren.
    4. Indsæt kateteret gennem musens urinrør i blæren og aflever langsomt 50 μL pode.
    5. Vent et par sekunder, og fjern derefter kateteret forsigtigt ved at trække lige ud. Returner musen til buret og overvåg, indtil den kommer sig efter anæstesi.
    6. Gentag trin 1.3.1 - 1.3.5 med yderligere mus, og skift kateter mellem hvert bur (5 mus). Hvis det ønskes, kan den samme procedure bruges til at inokulere en kontrolgruppe af mus med PBS, for eksempel for at vise en anden stamme af G. vaginalis fremkalder rUTI (over spontan / baggrundsniveau).

2. Overvågning af godkendelse af UPEC-bakteriuri (dag 1 til 28)

BEMÆRK: Video af urinopsamlingsproceduren er tidligere offentliggjort44.

  1. Opsamle urin (minimum 10 μL) fra alle mus ved blærepalpation som beskrevet44 ved 1 d efter infektion og ugentligt for 4 wk (7, 14, 21 og 28 d efter infektion). Urin skal dyrkes inden for få timer efter opsamling for at overvåge UPEC-infektion. Urinen opbevares ved 4 °C, indtil den er belagt. Urin kan også anvendes til cytologi (se punkt 4). Lejlighedsvis, hvis blæren er meget betændt, kan der ikke opnås 10 μL urin; i dette tilfælde kan PBS tilsættes op til 10 μL, men urinbakterietiterings- og cytologiscoren skal justeres i overensstemmelse hermed (f.eks. hvis der kun opsamles 5 μL urin og tilsættes 5 μL PBS, multipliceres titere og scores med 2).
  2. Med en flerkanalspipette fremstilles 1:10 serielle fortyndinger ud til 10-6 i steril PBS i en 96-brønds plade. Brug en P10 flerkanalspipette til at få øje på 10 μL af alle 6 fortyndinger fra kolonne 1 i lodret retning på venstre kant af en LB-plade, der indeholder den relevante antibiotikaudvælgelsesmarkør. Kassér tips.
  3. Pletteringen gentages med de resterende prøver (kolonne 2, derefter kolonne 3 osv.). En enkelt plade kan rumme 5 prøver side om side. Dette producerer en plade med en 5 × 6-punkts matrix med stigende fortyndinger fra top til bund og stigende prøveantal fra venstre mod højre (figur 2A).
  4. Lad pletterne tørre på bordpladen, og inkuber derefter ved 37 °C natten over. Den næste dag skal du tælle antallet af kolonier på det mindst fortyndede sted, hvor kolonierne er forskellige (figur 2B), og bruge dette tal til at beregne CFU / ml:
    Antal kolonier i enkelt urinplet × fortyndingsfaktor × 100 = CFU/ml urin
  5. Plot UTI89kanR urintitre ved hjælp af grafsoftware (figur 2C). Identificer mus, der ikke har nogen påviselig UTI89kanR i urinen ved 28 d (~ 65-80% af C57BL / 6 mus). Disse mus har hvilende intracellulære reservoirer og anvendes i den efterfølgende eksperimentelle fase til at undersøge induktion af tilbagevendende UTI. Dem med bakterier i urinen ved 28 d er ikke inkluderet i de efterfølgende trin.

3. Blære eksponering for G. vaginalis

  1. Tildel mus til eksponeringsgrupper (dag 29). Det primære mål med dette trin er at undgå at have alle mus med mere langvarig bakteriuri sammen i samme eksponeringsgruppe, da det er ukendt, om dette påvirker sandsynligheden for rUTI.
    1. Ved hjælp af urin CFU-data (figur 2D) kategoriseres musene baseret på det tidspunkt, hvor UTI89kanR-bakteriuri ikke længere kunne påvises (figur 2E).
    2. Randomiser musene fra hver kategori i enten G. vaginalis eller PBS podningsgrupper; f.eks. får halvdelen af de mus, der klarede før dag 7 , G. vaginalis , og halvdelen får PBS; halvdelen af de mus, der ryddede mellem dag 8 og 14, får G. vaginalis , og halvdelen får PBS osv. (som i figur 2E).
  2. Forbered G. vaginalis inokulum (alle trin udført i et anaerobt kammer)
    BEMÆRK: Ideelle kulturinkubationstider varierer mellem forskellige stammer af G. vaginalis, hvor nogle stammer går ind i den stationære fase og endda begynder at dø hurtigere end andre. Dette er især vigtigt, da dræbte G. vaginalis (JCP8151B) ikke var i stand til at udløse rUTI39. Inkubationstiderne bør således bestemmes empirisk for en given stamme, inden der udføres forsøg på mus. Det vides ikke, om andre/alle stammer af G. vaginalis vil udløse de samme effekter i denne model.
    1. Streak G. vaginalis stamme fra -80 ° C fryselager på en NYCIII plade (uden antibiotika). Pladen inkuberes ved 37 °C anaerobt i 24 timer.
    2. I det anaerobe kammer inokuleres 5 ml anaerobe NYCIII-medier med en 1 μL sløjfefuld celler (en enkelt koloni er utilstrækkelig) fra NYCIII-pladen og inkuberer kulturen statisk ved 37 ° C under anaerobe forhold i 18 timer. Medtag ikke antibiotika i vækstmediet.
  3. Bestem OD600 af kulturen ved hjælp af et spektrofotometer.
    1. Centrifuger et defineret volumen (X) kultur ved 9600 × g i 1 minut og aspirerer mediet. Volumenet (Y) af PBS for at suspendere pelleten igen for at opnå den ønskede pode-OD for at opnå 108 CFU i 50 μL ved hjælp af følgende ligning:
      X ml ×OD-kultur = Y ml ×OD-inokulumløsning for Y
      Y = (X ml ×OD-kultur) /OD-inokulum
      BEMÆRK:OD-inokulum for JCP8151BSmR er 5, men dette skal bestemmes empirisk for andre G. vaginalis-stammer . For eksempel, hvis spinding 3 ml af en JCP8151BSmR natlig væskekultur medOD-kultur = 2,0: Y = (3 ml × 2,0) / 5,0; derfor resuspend pellet i 1,2 ml PBS
    2. Resuspender bakteriepelletten i PBS til den ønskede koncentration. Serielt fortyndet og plade inokulumet (som beskrevet i CFU-pletteringsprotokollen ovenfor) for at bestemme den faktiske podedosis, der er blevet brugt i hvert eksperiment. Stol ikke blot på OD-værdierne.
  4. På dag 29-31 efter UPEC-podning vaccineres bedøvede mus med G. vaginalis eller PBS som beskrevet i trin 1.3 ovenfor. En PBS-kontrolgruppe er afgørende, da kateterisering af blæren muligvis kan fremkalde skade og uroteleksfoliering, der kan fremkalde en vis grad af UPEC-reservoirgenopståelse. PBS-podede mus fungerer derfor som den kontrol, som G. vaginalis-podede mus sammenlignes med.
    BEMÆRK: Den endelige UPEC-bakteriuribestemmelse ved 28 d kræver inkubation natten over af CFU-pladen. Derfor er det tidligste, dette trin kan udføres, 29 dage efter den første UPEC-podning. Om nødvendigt kan eksponeringen gives så sent som dag 31. Forskere bør være konsekvente mellem eksperimenter.
  5. Gentag podepræparatet for at administrere en anden G. vaginalis (eller PBS-kontrol) podning på det ønskede tidspunkt, såsom 12 timer eller 1 wk efter den første podning. En anden eksponering er nødvendig, fordi en enkelt podning med G. vaginalis ikke resulterer i signifikant UPEC-fremkomst39.

4. Overvågning af UPEC tilbagevendende UTI

  1. Indsamle urin fra mus på ønskede tidspunkter efter hver G. vaginalis podning (1, 2 og 3 d post-podning anbefales).
    1. Seriel fortyndet og pladeurin på selektive plader (f.eks. LB + kanamycin) for at bestemme UTI89kanR CFU / ml. Hvis det ønskes, kan urinfortyndinger også belagt på selektive plader (f.eks. NYCIII + 1 mg / ml streptomycin) for at bestemme G. vaginalis CFU / ml. G. vaginalis JCP8151BSmR blev imidlertid fjernet fra urinen hos de fleste mus med 12 timer 39. Derfor ville tidligere tidspunkter være nødvendige for at detektere G. vaginalis hos de fleste mus.
  2. Ved det eksperimentelle endepunkt (f.eks. 3 d efter den anden G. vaginalis-podning) ofrer musene efter godkendte metoder (f.eks. cervikal dislokation under isofluranbedøvelse eller CO2 -indånding) og opsamler blærer og nyrer til CFU-optælling, som beskrevet tidligere 44,46.

5. Urincytologi

BEMÆRK: Denne procedure kan udføres på ethvert tidspunkt, hvor visualisering af celler og / eller bakterier, der er til stede i urinen, ønskes. Som angivet i figur 1 udføres urincytologi typisk ved 1 dpi (eller endnu tidligere) under fase 1 for at undersøge akut UPEC-infektion og i fase 3 for at vurdere tilstedeværelsen af polymorfonukleære (PMN) celler i uriner, der viser UPEC-fremkomst.

  1. Der tilsættes 10 μL urin til 90 μL PBS i en cytofunnelkassette med påsat filter og dias. (Den enkleste metode er at anvende resten af 1:10 fortyndingerne fra pladen med 96 brønde, der anvendes til urindyrkning; disse prøver kan anvendes op til 24 timer efter urindyrkning, hvis de opbevares ved 4 °C). Anbring kassetter i cytocentrifuge og drej ved 600-800 x g i 6 minutter med høj acceleration.
  2. Fjern dias og lad tørre natten over. Den næste dag plettes med et hæmatologisk farvningssæt (f.eks. Wright's, Giemsa, inklusive fikseringsmiddel) i henhold til producentens protokol.
  3. Analyser diasene ved lysmikroskopi for tilstedeværelsen af PMN'er og epitelceller. Hvis det ønskes, kan disse scores ved hjælp af en kvalitativ scoringsmetrik baseret på overfloden af hver celletype, der er til stede i hvert højtydende synsfelt (f.eks. 0 = ingen, 1 = få, 2 = moderat, 3 = robust). Sørg for, at den person, der analyserer diasene, er blindet for de eksperimentelle grupper for at minimere potentiel bias.

6. Billeddannelse af blærer ved scanning af elektronmikroskopi

BEMÆRK: Denne procedure kan udføres når som helst, hvor visualisering af urotelet ønskes. Som angivet i figur 1 (lilla kasser) visualiseres UPEC-urotelialinteraktioner bedst mellem 6 timer og 24 timer efter UPEC-podning under reservoirdannelsesfasen, og urotelial eksfoliering udløst af G. vaginalis visualiseres bedst mellem 3 timer og 12 timer efter den anden G. vaginalis eksponering.

  1. In situ blærefiksering
    1. Der forberedes fikseringsmiddel umiddelbart før blærehøst ved at tilsætte glutaraldehyd (2,5 % endelig) og paraformaldehyd (2 % endelig) i 0,15 M natriumcacodylatbuffer med 2 mMCaCl2 ved pH 7,4. Brug paraformaldehyd og glutaraldehyd fra nyåbnede glasampuller, da begge fikseringsmidler oxiderer over tid i åbne beholdere.
      FORSIGTIG: Glutaraldehyd er giftigt, åndedrætsirriterende og ætsende; paraformaldehyd er brandfarligt, kræftfremkaldende, irriterende og reproduktivt toksin; natriumcacodylat er giftigt og kræftfremkaldende.
    2. For at fremstille 50 ml fikseringsopløsning tilsættes 6,25 ml 16% paraformaldehyd, 2 ml 50% glutaraldehyd og 16,75 ml ultrarent vand til 25 ml af en 0,3 M opløsning af natriumcacodylat ved pH 7,4 med 4 mM CaCl2.
    3. Det tilberedte fikseringsmiddel opvarmes til 37 °C, inden blærerne administreres.
    4. Fyld tuberkulin glidespidssprøjte med fikseringsmiddel, og fastgør et kateter til enden, skråt mod modsatte sprøjtemarkeringer. Klip den overskydende slange af 1-2 mm fra enden af nålen, og pas på ikke at udsætte nålespidsen. Svirp sprøjten for at fjerne bobler, og skub stemplet til tom luft, og fyld kateteret med fikseringsmiddel over et mikrocentrifugerør for at opsamle ethvert fikseringsmiddel til korrekt bortskaffelse.
    5. Bedøv og ofr musen ved hjælp af en godkendt metode (f.eks. Cervikal dislokation under anæstesi). Placer musen på dissekeringsoverfladen med benene fastgjort (med gummibånd eller stifter). Åbn musens bækkenområde med tang og en kirurgisk saks for at udsætte blæren. Skub forsigtigt det tilstødende fedt til side, men lad blæren være på plads.
    6. Hold sprøjten med den dominerende hånd med nålen pegende nedad og nålens skråning og sprøjtemarkeringer vendt væk fra dig. Dyp kateterspidsen i sterilt smøremiddel.
    7. Placer kateterspidsen ved urinrørsåbningen, og hold sprøjtetønden væk placeret i en vinkel på 30-45 ° over musekroppen.
    8. Påfør nedadgående tryk ved hjælp af en meget lille bevægelse med uret med spidsen og indsæt forsigtigt kateteret i urinrøret. Når kateterspidsen kommer ind i urinrøret, skal du hænge sprøjten mod musens hale, mens du fortsætter med at skubbe kateteret længere ind i urinrøret, indtil sprøjtetønden er parallel med arbejdsfladen. Hele kateternålakslen (ikke inklusive basen) skal komme ind i musen og placere kateterspidsen i blærens lumen.
    9. Aflever langsomt 50-80 μL fikseringsmiddel, hvilket får blæren til at blæse op som en ballon. Hold kateteret på plads og hæv sprøjten lidt, vip spidsen op.
    10. Med den anden hånd skal du åbne en hæmostat og glide en spids under kateternålen ved krydset mellem urinrøret. Luk hæmostaten delvist, indtil den bare kommer i kontakt med nålen.
    11. Skub forsigtigt kateternålen ud af blæren, mens du samtidig klemmer ned og låser hæmostaten helt for at forhindre tab af fikseringsmidlet.
    12. Greb hæmostaten, så den er parallel med arbejdsfladen med blæren hvilende ovenpå. Løft forsigtigt og omhyggeligt under hæmostaten (modsatte side af blæren) for at fjerne blæren med hæmostaten stadig fastgjort.
    13. Anbring blære og vedhæftet hæmostat i et Falcon-rør indeholdende opvarmet fikseringsmiddel. Sørg for, at blæren er helt nedsænket i væsken og ikke presset mod rørets vægge. Inkuberes ved 4 °C i 24 timer.
  2. Blærebehandling og billeddannelse med scanningselektronmikroskopi (SEM)
    1. Skær blæren med et renset, dobbeltsidet barberblad, og lav et andet snit, der tangerer hæmostaten for at frigive blæren. Dette resulterer i 2 halvblære "kopper". Hvis der findes resterende fedtpuder på ydersiden af blæren, skal du forsigtigt fjerne dem.
    2. Blærehalvdelene skylles tre gange (10 min hver) i natriumcacodylatbuffer (0,15 M, pH 7,4).
    3. Pletter vævet med 1% osmiumtetroxid i 0,15 M cacodylatbuffer i 1 time ved stuetemperatur. Osmium er følsomt over for lys; Udfør derfor dette trin med farvningsbeholderen indpakket i folie for at opretholde et mørkt miljø.
      FORSIGTIG: Osmiumtetroxid er giftigt og ætsende for huden. Gør dette trin i røghætten med handsker.
    4. Skyl blærehalvdelene tre gange (10 minutter hver) i ultrarent vand. Under disse trin kan osmiceret olie engang ses på overfladen af vandet. Aspirere eller væge dette af for at forhindre forurening under tørretrinnene.
    5. Dehydrere væv ved at nedsænke i en gradueret ethanolserie (50, 70, 90, 100 og 100%) i 10 minutter hver.
    6. Tør det faste væv ved hjælp af en kritisk punkttørrer, der udfører 12 CO2 -udvekslinger med den langsomste hastighed. Indstil alle yderligere indstillinger til langsom, undtagen udluftningstrinnet, der er indstillet til hurtigt.
    7. Skær hver blære halvt igen med en ren dobbeltsidet barbermaskine for at generere 4 stykker i alt for at reducere krumningen af prøven for mere effektiv belægning, for at lette billeddannelsen i SEM og for at udsætte væv, der kan have krøllet under tørring.
    8. Klæbe blærestykkerne til en ledende carbonklæbemiddelfane på en aluminiumsstub og mal en lille mængde sølvklæbemiddel omkring bundkontakten med et tandstikker, idet du sørger for at forhindre overskydende klæbemiddel i at transportere på blærens indre overflade.
    9. Brug en højvakuum sputter coater til at sputter belægge prøvestubbene med 6 nm iridium. Hvis prøverne fortsætter med at oplade, skal du sikre dig, at en ledende sti males til overfladen med sølvmaling og belægges med yderligere 4 nm iridium.
    10. Forestil dig prøverne med et scanningselektronmikroskop. Mens forholdene kan variere afhængigt af det anvendte mikroskop, fungerede en accelererende spænding på 3 KeV med en strålestrøm på 200 pA og en arbejdsafstand på 12-13 mm godt på en Zeiss Merlin FE-SEM, når du brugte Everhart-Thornley (SE2) elektrondetektor.

Representative Results

Efter podning kan UPEC-titere påvises i urinen (figur 2B). Manglende plade urinprøver på selektive medier indeholdende kanamycin vil sandsynligvis resultere i overvækst af endogen musemikrobiota, der forurener urinen. Niveauet af UPEC bakteriuri vil sandsynligvis være højt på dag 1 og kan stige i løbet af den første uge, før det falder på senere tidspunkter (figur 2C). Ca. 65-80% af musene vil ikke have nogen påviselig UPEC i urinen med 28 dpi (figur 2C, grøn cirkel). Disse mus kan bruges i de efterfølgende trin i modellen. Mus, der forbliver bakteriuriske (figur 2C, rød ellipse) bør elimineres fra forsøget.

To sekventielle G. vaginalis-eksponeringer givet 12 timer (figur 3A) eller 1 wk fra hinanden (figur 3B) resulterer i fremkomsten af UPEC fra intracellulære reservoirer for at forårsage tilbagevendende bakteriuri. Både niveauet af UPEC-bakteriuri (Mann-Whitney-test) og andelen af mus, der viser UPEC rUTI (Fishers nøjagtige test), er signifikant højere hos mus udsat for G. vaginalis sammenlignet med PBS-kontrolgruppen. Urincytologianalyse detekterer PMN'er i urinen fra G. vaginalis-eksponerede mus, der viste UPEC-fremkomst (figur 3C). I modellen med to eksponeringer givet 1 wk fra hinanden er UPEC-titere i blærevæv lavere i G. vaginalis-eksponerede mus sammenlignet med PBS (figur 3D), formodentlig på grund af fremkomsten af UPEC fra reservoirer og efterfølgende clearance.

Visualisering af in situ-fikseret blærevæv ved SEM afslører store overfladiske paraplyurotelceller, der forer blæreoverfladen i kontrolmus, der kun udsættes for PBS (figur 4A). Urotelial eksfoliering fremgår af et tab af overfladiske paraplyceller, der afslører mindre underliggende overgangsepitelceller hos mus udsat for G. vaginalis (figur 4B). Tidligt efter UPEC-podning under etablering af intracellulære reservoirer er UPEC synlig på urotelium og filamentering ud af eksfolierende celler (figur 4C).

Figure 2
Figur 2. Overvågning af UPEC-titere i urinen i fase 1 (reservoirdannelse). (A) Skematisk af kolonidannende enheder (CFU) plettering. (B) Repræsentativt billede af UPEC-titere i urinen på LB+kanamycin. Sorte rande angiver urinprøvepletter, der skal tælles for at beregne CFU / ml. (C) Tidsforløb for UPEC-bakteriuri i C57BL/6-mus. Hver linje repræsenterer en individuel mus, der sporer UPEC-urintitrene over tid. Stiplet linje angiver detektionsgrænsen (1000 CFU/ml). Rød ellipse indikerer fire mus (ud af 20), der ikke kunne løse UPEC-bakteriuri og derfor ikke ville blive brugt til G. vaginalis-induceret rUTI-model. Omvendt indikerer grøn cirkel mus, der løste UPEC bakteriuri og fortsatte til efterfølgende faser. (D) Tabel over data, der anvendes til at generere graf i panel C. Gul, påviselig CFU; grøn, ingen CFU. (E) Randomisering af mus i eksponeringsgrupper baseret på det tidspunkt, hvor UPEC CFU ikke længere blev påvist i urinen ("Dag løst"). Musenumrene i venstre kolonne i panel D er de samme musenumre, der er angivet i panel E. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. G. vaginalis udløser UPEC rUTI. UPEC-titere i urinen efter to sekventielle urinvejseksponeringer for PBS (cirkler) eller G. vaginalis (Gvag; kvadrater) givet 12 timer (A) eller 1 wk (B) fra hinanden. Hvert symbol repræsenterer en individuel mus. Den højeste CFU/ml UPEC, der er påvist fra hver mus mellem 1-3 d efter den anden eksponering, afbildes. Mus uden påviselig bakteriuri afbildes ved detektionsgrænsen (stiplet linje). (C) Urincytologianalyse, der viser UPEC (pilespidser) og polymorfonukleære (PMN) celler (pile). Skala bar = 20 μm. (D) UPEC-titere i blærevæv indsamlet 3 d efter to sekventielle urinvejseksponeringer givet 1 wk fra hinanden. Hvert symbol repræsenterer en anden mus, og nuller afbildes ved detektionsgrænsen (stiplet linje). I A, B og D er kasser i første og tredje kvartil med medianen markeret og whiskers fra min til max <. ** P < 0,01; P < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. SEM-analyse af blærer fikseret in situ. Blærer blev indsamlet fra mus 3 timer efter to eksponeringer (12 timer fra hinanden) for PBS (A) eller G. vaginalis (C). Stiplede linjer illustrerer en enkelt urinepitelcelle, som er mindre i G. vaginalis-eksponerede blærer, fordi de store overfladiske celler har eksfolieret væk og afsløret det underliggende overgangsepiteletel. (B) Blære opsamlet 6 timer efter indledende podning med UPEC i fase 1 af modellen, der viser urotel eksfoliering og ekstracellulær UPEC. (D) Eksempel på uopløselige fedtdråber, der findes på blæreoverfladen. Skalabjælker er 20 μm i hovedbillederne og 2 μm i indsatsen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Det første kritiske trin i denne model til at identificere mus, der ikke har ryddet UPEC-bakteriuri i den primære UTI-fase. Disse mus skal fjernes fra eksperimentet, da de ellers ville forvirre satserne for UPEC-bakteriuri efter G. vaginalis eksponering. Efter den indledende UPEC-podning skal urin opsamles ugentligt for at overvåge bakteriel clearance. Ca. 65-80% af C57BL /6 mus vil rydde en UTI89kanR infektion inden for 4 uger. Andre indavlede musestammer har forskellige tilbøjeligheder til UPEC-clearance42,43 og reservoirdannelse og er derfor muligvis ikke egnede til denne model. Det andet kritiske punkt er, at empiriske undersøgelser har fastslået, at to sekventielle podninger af G. vaginalis (enten 12 timer eller 1 wk fra hinanden) er nødvendige for at udløse signifikant reservoirfremkomst over baggrunden spontan fremkomst, der forekommer i kontrolmus, der kun udsættes for PBS. Andre varigheder af tid mellem de to sekventielle eksponeringer er ikke blevet testet, men kunne give lignende resultater. Det er vigtigt at bemærke, at en reduktion i UPEC blæretitre kun blev observeret i modellen, hvor G. vaginalis eksponeringer blev givet 1 wk fra hinanden39. Mens mere end to eksponeringer kan administreres, tyder empiriske beviser på, at gentagen kateterisering alene øger fremkomsten, hvilket kan forvirre fortolkningen af resultaterne eller kræve et større antal dyr for at skelne forskelle mellem eksponeringsgrupper og kontroller. Endelig har in situ blærefikseringsmetoden flere kritiske trin. En vis færdighed er nødvendig for at sikre, at fikseringsmidlet forbliver inde i de fastspændte blærer. Deflaterede blærer vil være vanskeligere at forestille sig af SEM. Det er også vigtigt at være meget forsigtig, når man poder fikseringsmidlet i blæren, da skrabning af urotelet med det fikseringsholdige kateter kan fremkalde urotelial eksfoliering uafhængigt af, hvad der udløses af G. vaginalis. Alle koncentrationer, der er nævnt i den fikserende cocktail, er endelige koncentrationer. Forkerte forhold mellem disse kan resultere i utilstrækkelig fastgørelse og hævelse eller krympning af cellerne. Fikseringsmidler bør opvarmes til fysiologiske temperaturer for at undgå temperaturchok i celler og væv. Opvarmning giver også en lille forbedring af diffusionshastigheden af fikseringsmidler gennem plasmamembraner. Mens osmiumfarvning ofte kan udelades for prøver, der er forberedt til SEM-analyse, er det et vigtigt skridt i denne protokol at stabilisere lipider og forhindre revner i cellulære membraner under kritisk punkttørring.

Denne protokol kan ændres for at teste andre UPEC- og / eller G. vaginalis-stammer for deres evne til at danne reservoirer og udløse deres fremkomst. Andre eksperimentelle faktorer kan også tilføjes, såsom eksponering for andre vaginale bakterier (f.eks. Lactobacillus crispatus PVAS100) eller varmedræbt G. vaginalis, hvoraf ingen viser patologi i denne model39. Ved valg af andre bakteriestammer, der skal testes, er det vigtigt at demonstrere konsekvent vækst, således at en standard podekoncentration kan anvendes i alle forsøg. Væksten af JCP8151BSmR er optimeret i et anaerobt kammer. Denne stamme kunne sandsynligvis dyrkes i et anaerobt GasPak-system, men dette ville kræve optimering for at sikre robust bakterievækst. Endelig kan det være muligt at ændre timingen af visse trin i modellen. For eksempel kan urin opsamles på tidligere tidspunkter under UPEC-reservoirdannelsesfasen for at overvåge CFU eller værtsresponser. En negativ virkning af indsamling af urinprøver på tidlige tidspunkter (3, 6, 12 hpi) på progression af infektion eller etablering af reservoirer er ikke blevet observeret i denne model. Fremkomsten af UPEC-reservoirer er rapporteret at forekomme efter to JCP8151BSmR-doser givet 12 timer eller 1 wk, men andre tidsintervaller er endnu ikke blevet testet. Det kan også være muligt at reducere den samlede tid for modellen ved at reducere UPEC-reservoirdannelsesfasen til 2 uger (snarere end 4 uger), da mange af musene rydder bakteriuri på dette tidspunkt. Tidligere undersøgelser, der undersøgte UPEC-fremkomsten efter blæreeksponering for kemiske eksfolieringsmidler, anvendte en 1 eller 2 wk UPEC-reservoirdannelsesfase17,18. En reduktion af tiden til UPEC-godkendelse af bakteriuri kan dog komme på bekostning af at kræve, at flere dyr skal aflives fra forsøget. Endelig kan SEM-analyse af blæren udføres på yderligere tidspunkter for at observere varigheden af virkningen af G. vaginalis på urotelium.

Med hensyn til fejlfinding er der nogle vigtige overvejelser specifikt med hensyn til blære SEM-analysen. Afhængigt af den anvendte musebaggrund og mængden af betændelse til stede, vil nogle blærer præsentere med meget tynde vægge. Disse blærer har tendens til at krølle mere under kritisk punkttørring og kan resultere i en cowrie shell-lignende form. Hvis dette sker, er den bedste metode at skære den skalformede blære i halvdelen langs den krøllede grænseflade og derefter en anden gang for at fjerne størstedelen af det overhængende væv. Skæring fungerer bedst med et PTFE-belagt tveægget barberblad. Overskydende fedt kan undertiden opløses under osmiumfarvningstrinnene. Dette kan resultere i uønskede uopløselige fedtdråber, der muligvis ikke vaskes af under skylnings- og dehydreringstrinnene, og som kan sætte sig på blæreoverfladen under efterfølgende tørring. Disse dråber kan vises som enten små kugler eller disklignende strukturer spredt over prøven (figur 4D). Dette kan afbødes ved at sikre, at så meget fedtvæv fjernes fra omkring blæren som muligt. Platin kan erstattes af iridiumbelægning, men tykkelser bør holdes på et minimum for at reducere maskering af fine strukturelle detaljer. Brug af et roterende trin under belægning anbefales stærkt.

En begrænsning ved denne model er, at den kræver et stort antal mus. Kun 65-80% af C57BL/6-mus vil rydde deres UPEC-bakteriuri og være egnede til efterfølgende G. vaginalis- eller PBS-podning (se figur 2C). For at opnå 10-12 mus pr. gruppe (G. vaginalis inokulation vs. PBS) skal ~30 mus i første omgang inficeret med UPEC. Endvidere kræves der sandsynligvis flere eksperimenter for at opnå de biologiske replikater, der er nødvendige for at detektere statistisk signifikans. Når eksponeringer blev givet 1 wk fra hinanden, forekom UPEC-fremkomst hos 14% af mus udsat for PBS (figur 3B). Påvisning af en signifikant stigning i UPEC rUTI i G. vaginalis eksponerede mus i forhold til PBS-kontroller (drevet ved 0,8; alfa = 0,05 [ensidig]) kræver test af et kumulativt total på mindst 40 mus for hver eksponeringsgruppe. En yderligere overvejelse er, at disse eksperimenter er dyre og arbejdskrævende. Mus skal overvåges ugentligt for UPEC-clearance, og det eksperimentelle tidsforløb er 4-5 wk afhængigt af om G. vaginalis gives to gange inden for en 12 timers tidsramme eller to gange 1 wk fra hinanden. SEM er arbejdskrævende og kan være dyrt afhængigt af mikroskoptilgængelighed og servicegebyrer. Forberedelse af hele blæren til SEM giver rigeligt materiale til analyse, men ulempen er, at analyse af hver blære kan være tidskrævende. Det er således sandsynligt, at kun et begrænset antal blærer kan analyseres af SEM sammenlignet med de højere dyretal, der anvendes til urin- og vævstitre. Derudover kræver opnåelse af højkvalitetsbilleder af blærens "kopper" dygtighed på grund af skygger, der kan hindre synligheden. Selvom blære SEM er et nyttigt værktøj til visualisering af uroteleksfoliering, er denne metode stort set kvalitativ. Da prøven er fastgjort i en rund form, og på grund af brugen af glutaraldehyd i fikseringsmidlet, er screening for fluorescerende ekspressive bakterier via lysmikroskopi ikke mulig. Immunostaining og kemiske farvestoffer er uforenelige med denne proces på grund af brugen af glutaraldehyd, der vil krydsbinde de fleste antigener og osmium, og som vil maskere antigensteder og mørkere vævet. Når det er sagt, er SEM-teknikken nyttig til parametre, der kan evalueres kvantitativt uden brug af yderligere sonder, såsom cellestørrelse48,49.

Denne model giver flere fordele ud over tidligere beskrevne metoder. Det tillader undersøgelse af mekanismer af UPEC rUTI forårsaget af fremkomst fra blærereservoirer, i modsætning til genindførelse i blæren fra en ekstern kilde. Andre modeller af rUTI på grund af fremkomst fra blærereservoirer bruger kemiske agenser (protaminsulfat eller chitosan) til at forårsage urotel eksfoliering 17,18, hvilket ikke ville være udløsere af rUTI hos kvinder. G. vaginalis er en udbredt urogenital bakterie, der er blevet påvist i urin opsamlet direkte fra blæren via kateterisering eller suprapubisk aspiration hos nogle kvinder23,26. Denne kendsgerning kombineret med den kendte sammenhæng mellem BV (hvor G. vaginalis vokser i vagina) og UTI tyder på, at G. vaginalis er en klinisk plausibel udløser af rUTI. Endelig bevarer in situ blærefikseringsmetoden blærens ultrastruktur og begrænser skader, hvilket sikrer, at blærelagene ikke adskiller sig fra hinanden. Tidligere metoder til visualisering af urotelet har traditionelt brugeren aseptisk høstet, skåret, stræk og fastgør blæren på en dissektionsbakke, før den strakte blære nedsænkes i fiksering48. Denne metode resulterer i en meget flad prøve, men sikrer ikke jævn eller naturlig strækning af vævet og kan resultere i områder, der er over og under strakt (hvilket resulterer i stærkt rynket væv) og kan forårsage blærelagsseparation. Derudover kan disse fysiske manipulationer af blæren for at strække og fastgøre vævet forårsage skade, herunder urotel eksfoliering. En anden metode er at nedsænke intakte blærer i fikseringsmiddel, før de indlejres i paraffin og erhverver tynde sektioner med et mikrotom. Tynde sektioner er uvurderlige til immunhistokemiske eksperimenter for at undersøge bakterier og værtsproteinlokalisering, men en tynd sektion tillader ikke visualisering af uroteloverfladen. Denne SEM-metode gør det muligt at undersøge overfladen af hele blæren på én gang.

Som beskrevet omfatter fremtidige anvendelser af denne model test af andre UPEC-stammer for at afgøre, om de danner intracellulære reservoirer og test af andre G. vaginalis-stammer for at vurdere, om de fremkalder eksfoliering og UPEC-fremkomst for at forårsage rUTI. Andre musestammer ud over C57BL/6-mus kan også testes, selvom mus med en høj tilbøjelighed til at udvikle kronisk blærebetændelse (såsom mus på C3H-baggrund) ikke anbefales, da for mange mus skal fjernes fra forsøget. En yderligere fordel ved C57BL/6-mus er, at mange genetiske knockout-stammer er kommercielt tilgængelige. Sådanne stammer giver mulighed for at forhøre sig om de værtsfaktorer, der er involveret i reservoirdannelse og/eller fremkomst.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter i forbindelse med denne undersøgelse.

Acknowledgments

Forfatterne takker Lynne Foster for teknisk bistand i infektionseksperimenter, James Fitzpatrick ved Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) for adgang til SEM, Scott Hultgren for UTI89kanR UPEC-stammen og David Hunstad for kritisk læsning af manuskriptet.

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (Graduate Research Fellowship til VPO # DGE - 1143954), af Center for Women's Infectious Disease Research ved Washington University School of Medicine (Pilot Research Award til NMG), af American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) og #14POST20020011 (NMG) og af National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) og NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, projekt II PI:ALL) og K01 DK110225-01A1 (NMG). Nogle af dyreforsøgene blev udført i et anlæg støttet af NCRR-bevilling C06 RR015502. Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; hvor SEM blev udført) og MSJ blev støttet af Washington University School of Medicine, Children's Discovery Institute of Washington University og St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) og National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G x 1/2 needles BD 305106 for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat McKesson 487377 in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater Leica SEM sample processing
aluminum SEM stub Ted Pella 16111 SEM sample processing
Calcium chloride EMS 12340 in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab  Ted Pella 16084-1 SEM sample processing
Conductive silver paint Ted Pella 16034 SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier Leica SEM sample processing
Cytofunnel metal clip Simport M964B cytospun urinalysis
Ethanol EMS 15050 SEM sample processing
Glucose  Sigma G7528 for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde EMS 16320 in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit Fisher 23123869 cytospun urinalysis
HEPES Cellgro  25-060-Cl for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium Ted Pella 91120 SEM sample processing
isofluorane mouse anaesthesia
kanamycin Gibco 11815024 add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar BD DF0445174 UPEC growth plates
Luria-Bertani broth BD DF0446173 UPEC growth media
Merlin FE-SEM Zeiss scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 SEM sample processing
NaCl  Sigma S3014 for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope Olympus cytospun urinalysis
osmium tetroxide EMS 19170 SEM sample processing
paraformaldehyde EMS 15710 in situ bladder fixation
polyethylene tubing Intramedic 427401 for catheters
Proteose Peptone #3  Fisher  DF-122-17-4 for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade EMS 72000 cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300002 cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter Simport M965FWDV cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel Simport M964-1D cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated) Thermo Scientific 5991055 cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate EMS 12310 in situ bladder fixation
spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
streptomycin Gibco 11860038 add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe BD 309659 for catheters
Yeast Extract  Fisher DF0127-17-9 for NYCIII G. vaginalis growth media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1-13 (2014).
  2. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80 (3), 331-333 (1990).
  3. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, Suppl 1A 5-13 (2002).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Ikaheimo, R., et al. Recurrence of urinary tract infection in a primary care setting: analysis of a 1-year follow-up of 179 women. Clinical Infectious Diseases. 22 (1), 91-99 (1996).
  6. Russo, T. A., Stapleton, A., Wenderoth, S., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Chromosomal restriction fragment length polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent urinary tract infections in young women. Journal of Infectious Diseases. 172 (2), 440-445 (1995).
  7. Luo, Y., et al. Similarity and divergence of phylogenies, antimicrobial susceptibilities, and virulence factor profiles of Escherichia coli isolates causing recurrent urinary tract infections that persist or result from reinfection. Journal of Clinical Microbiology. 50 (12), 4002-4007 (2012).
  8. Schreiber, H. L. t, et al. Bacterial virulence phenotypes of Escherichia coli and host susceptibility determine risk for urinary tract infections. Science Translational Medicine. 9 (382), (2017).
  9. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), 329 (2007).
  10. Elliott, T. S., Reed, L., Slack, R. C., Bishop, M. C. Bacteriology and ultrastructure of the bladder in patients with urinary tract infections. Journal of Infection. 11 (3), 191-199 (1985).
  11. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  12. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  13. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. 431 (21), 4368-4379 (2019).
  14. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  15. Kerrn, M. B., Struve, C., Blom, J., Frimodt-Moller, N., Krogfelt, K. A. Intracellular persistence of Escherichia coli in urinary bladders from mecillinam-treated mice. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 383-386 (2005).
  16. Eto, D. S., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Actin-gated intracellular growth and resurgence of uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology. 8 (4), 704-717 (2006).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Blango, M. G., Ott, E. M., Erman, A., Veranic, P., Mulvey, M. A. Forced resurgence and targeting of intracellular uropathogenic Escherichia coli reservoirs. PLoS One. 9 (3), 93327 (2014).
  19. Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Covert pathogenesis: Transient exposures to microbes as triggers of disease. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007586 (2019).
  20. Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Roles of the vagina and the vaginal microbiota in urinary tract infection: evidence from clinical correlations and experimental models. GMS Infectious Diseases. 8, (2020).
  21. Janulaitiene, M., et al. Prevalence and distribution of Gardnerella vaginalis subgroups in women with and without bacterial vaginosis. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 394 (2017).
  22. Fredricks, D. N. Molecular methods to describe the spectrum and dynamics of the vaginal microbiota. Anaerobe. 17 (4), 191-195 (2011).
  23. Hilt, E. E., et al. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 52 (3), 871-876 (2014).
  24. Klein, S., et al. Significant increase in cultivation of Gardnerella vaginalis, Alloscardovia omnicolens, Actinotignum schaalii, and Actinomyces spp. in urine samples with total laboratory automation. European Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 37 (7), 1305-1311 (2018).
  25. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome in urgency urinary incontinence. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 341 (2015).
  26. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome: a comparison of women with and without urgency urinary incontinence. mBio. 5 (4), 01283 (2014).
  27. Gottschick, C., et al. The urinary microbiota of men and women and its changes in women during bacterial vaginosis and antibiotic treatment. Microbiome. 5 (1), 99 (2017).
  28. Malki, K., et al. Genomes of Gardnerella Strains Reveal an Abundance of Prophages within the Bladder Microbiome. PLoS One. 11 (11), 0166757 (2016).
  29. Kramer, H., et al. Diversity of the midstream urine microbiome in adults with chronic kidney disease. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1123-1130 (2018).
  30. Allsworth, J. E., Peipert, J. F. Prevalence of bacterial vaginosis: 2001-2004 National Health and Nutrition Examination Survey data. Obstetrics & Gynecology. 109 (1), 114-120 (2007).
  31. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4680-4687 (2011).
  32. Hillier, S. L. Diagnostic microbiology of bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 169 (2), Pt 2 455-459 (1993).
  33. Amatya, R., Bhattarai, S., Mandal, P. K., Tuladhar, H., Karki, B. M. Urinary tract infection in vaginitis: a condition often overlooked. Nepal Medical College Journal. 15 (1), 65-67 (2013).
  34. Harmanli, O. H., Cheng, G. Y., Nyirjesy, P., Chatwani, A., Gaughan, J. P. Urinary tract infections in women with bacterial vaginosis. Obstetrics & Gynecology. 95 (5), 710-712 (2000).
  35. Sharami, S. H., Afrakhteh, M., Shakiba, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology. 27 (3), 252-254 (2007).
  36. Hillebrand, L., Harmanli, O. H., Whiteman, V., Khandelwal, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 186 (5), 916-917 (2002).
  37. Sumati, A. H., Saritha, N. K. Association of urinary tract infection in women with bacterial vaginosis. Journal of Global Infectious Diseases. 1 (2), 151-152 (2009).
  38. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
  39. Gilbert, N. M., O'Brien, V. P., Lewis, A. L. Transient microbiota exposures activate dormant Escherichia coli infection in the bladder and drive severe outcomes of recurrent disease. PLoS Pathogens. 13 (3), 1006238 (2017).
  40. Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Uropathogenic Escherichia coli flagella aid in efficient urinary tract colonization. Infection and Immunity. 73 (11), 7657-7668 (2005).
  41. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  42. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001042 (2010).
  43. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and Immunity. 66 (6), 2798-2802 (1998).
  44. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), e52892 (2015).
  45. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A Murine Model for Escherichia coli Urinary Tract Infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 159-175 (2016).
  46. Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
  47. Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. Journal of Visualized Experiments. (42), e2070 (2010).
  48. O'Brien, V. P., et al. A mucosal imprint left by prior Escherichia coli bladder infection sensitizes to recurrent disease. Nature Microbiology. 2, 16196 (2016).
  49. O'Brien, V. P., Dorsey, D. A., Hannan, T. J., Hultgren, S. J. Host restriction of Escherichia coli recurrent urinary tract infection occurs in a bacterial strain-specific manner. PLoS Pathogens. 14 (12), 1007457 (2018).

Tags

Immunologi og infektion udgave 166 UTI tilbagevendende UTI latent infektion bakteriel vaginose transuretral kateter vagina urin anaerob blære nyre urinmikrobiota vaginal mikrobiota scanning elektronmikroskopi
Tilbagevendende <em>Escherichia coli </em>urinvejsinfektion udløst af <em>Gardnerella vaginalis </em>Blæreeksponering hos mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, … More

O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61967, doi:10.3791/61967 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter