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Immunology and Infection

재발 성 에스케리치아 콜라 이 요로 감염 Gardnerella 질 방광 노출에 의해 유발 마우스에서

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61967
Automatic Translation
1,2,6, 3,7, 1,2,4,8, 2,5
1Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Summary

재발성 UPEC UTI를 유도하기 위해 잠복성 세포내 방광 저장소와 G. 질리스에 대한 후속 방광 노출을 확립하는 비뇨병원성 대장균(UPEC) 경요도 접종의 마우스 모델이 입증된다. 또한 박테리아의 열거, 소변 세포학 및 주사 전자 현미경을위한 현장 방광 고정 및 처리가 입증되었습니다.

Abstract

비뇨기병원성 에스케리치아 콜리 (UPEC)에 의한 재발성 요로 감염(rUTI)은 흔하고 비용이 많이 듭니다. 수컷 및 암컷 마우스에서 UTI의 모델을 설명하는 이전 기사는 소변과 조직에서 박테리아 접종 및 열거를위한 절차를 설명했습니다. C57BL / 6 마우스에서 초기 방광 감염 동안, UPEC는 UPEC 세균뇨의 클리어런스 후 지속되는 방광 상피 세포 내부에 잠복 저장소를 설치합니다. 이 모델은 잠복 방광 저수지 내에서 UPEC의 출현으로 인한 rUTI를 조사하기 위해 이러한 연구를 기반으로합니다. 비뇨 생식기 박테리아 Gardnerella vaginalis 는 여성의 비뇨 생식기, 특히 UTI와 관련된 질 dysbiosis의 맥락에서 자주 존재하기 때문에이 모델에서 rUTI의 방아쇠로 사용됩니다. 또한, 방광 조직의 주사 전자 현미경 (SEM) 분석에 이어 계내 방광 고정을위한 방법도 설명되며, 방광과 관련된 다른 연구에 잠재적 인 적용이 가능합니다.

Introduction

요로 감염 (UTI)은 전 세계적으로 상당한 의료 부담을 부과하여 매년 수백만 명의 사람들, 특히 여성1의 삶의 질에 영향을 미칩니다. 비뇨 병원성 대장균 (UPEC)은 UTI1의 가장 빈번한 원인입니다. UTI를 개발하는 많은 환자 (약 20-30 %)는 초기 감염2의 항생제 매개 허가에도 불구하고 6 개월 이내에 재발 성 UTI (rUTI)를 경험할 것입니다. 불행히도, 폐경 전 여성의 5 %가 매년 3,4 개 이상의 rUTI로 고통받습니다. rUTI의 순차 적 에피소드는 인덱스 케이스 5,6,7,8로부터의 동일한 UPEC 균주의 지속성에 의해 야기될 수 있다. 인간 샘플 및 마우스 모델의 데이터는 동일한 균주 rUTI가 방광의 정지 저수지 내에 거주하는 UPEC에 의해 발생할 수 있음을 시사합니다. 인간에서, UPEC는 UTI 9,10,11,12,13 환자의 상피 세포 및 방광 생검에서 검출되었다. C57BL / 6 마우스에 대한 연구에 따르면 UPEC의 일부 균주는 형광 현미경 검사와 방광 조직의 균질화 및 배양에 의해 검출 된 바와 같이 방광에 정동작 세포 내 저장소를 설치할 수 있음을 입증했으며, 이는 세균뇨14,15,16의 분해 후 몇 달 동안 유지됩니다. 방광 상피 (urothelium)의 각질 제거를 유도하는 약제로 방광을 치료, 예를 들어 프로타민 설페이트17 또는 키토산18, rUTI를 일으키는 저장소에서 UPEC의 출현을 트리거. 이러한 데이터는 이전 감염으로부터 방광 UPEC 저수지를 보유하고있는 여성에서 비뇨 생식기 박리로 이어지는 방광 노출이 rUTI를 유발할 수 있음을 시사합니다.

질 microbiota가 요로 감염에 기여한다는 증거가 증가하고 있습니다19,20. Gardnerella 질은 질 및 비뇨기 microbiota21,22,23,24,25,26,27,28,29의 빈번한 구성원입니다. 질에서 높은 수준의 G. 질염의 존재는 세균성 질염 (BV)으로 알려진 미생물 dysbiosis와 관련이 있으며, 이는 여성 30,31,32의 ~30 %에 영향을 미칩니다. BV를 가진 여성은 락토바실러스33,34,35,36,37에 의해 지배되는 질 공동체를 가진 여성에 비해 UTI를 경험할 위험이 더 높습니다. 마우스 모델에서, G. 질리스는 질(38) 및 방광(39) 둘 다에서 상피 각질 제거를 일으킨다. UPEC 방광 저장소를 보유하고있는 C57BL / 6 마우스에서 G. 질염에 대한 두 번의 순차적 방광 노출은 PBS가 아닌 저장소에서 UPEC가 다시 출현하여 UPEC rUTI를 유발합니다. 출현은 이전에 UPEC 세균뇨를 해결한 마우스로부터의 소변에서 UPEC 역가의 출현 및 PBS 노출 대조군 동물39에 비해 희생시 UPEC 방광 균질물 역가의 후속 감소에 의해 입증된다. 흥미롭게도, 방광에 G. 질염에 의한 지속적인 식민지화는 없습니다. 대다수의 경우, 소변에서 생존 가능한 G. 질염의 12 (h) 미만을 가진 두 번의 짧은 노출은 비뇨 생식기 박리를 유도하고 rUTI를 촉진하기에 충분합니다.

이 프로토콜은 재발을 촉발시키기 위해 G. 질 방광 접종을 사용하여 세포 내 방광 저장소에 상주하는 UPEC에 의해 야기된 rUTI의 마우스 모델을 기술한다. 이 모델에 의해 달성 된 진보는 G. 질염 이 이전에 사용 된 화학 약품과 비교하여 rUTI의 임상 적으로 관련된 생물학적 트리거라는 것입니다. 또한, 마우스 요로에서 G. 질 의 비교적 수명이 짧은 생존은 성행위 후에 발생할 수있는 것처럼 일시적인 미생물 노출이 비뇨 생식기에 미치는 영향을 검사 할 수있게합니다. rUTI 모델을 개괄하는 것 외에도, 이 프로토콜은 주사 전자 현미경(SEM)에 의한 소변 세포학 및 계내 방광 고정 및 요로텔륨의 이미징을 위한 방법을 기술한다.

G. 질리스-유도된 재발성 UPEC UTI의 이 프로토콜은 카나마이신 내성 카세트(UTI89kanR)40을 담은 UPEC 균주 UTI89를 사용한다. UPEC 시험의 모든 균주가 마우스41에서 급성 감염 단계 동안 세포 내 박테리아 군집을 형성 할 수있는 것은 아니며 UPEC의 모든 균주가 잠복 세포 내 저장소를 형성 할 수있는 능력을 갖는지는 아직 알려지지 않았습니다. 저수지 형성은 모델에서 다른 UPEC 균주를 사용하기 전에 확인되어야 한다. 이 프로토콜은 자발적인 스트렙토마이신 내성 G. 질 단리물, JCP8151BSmR38을 사용한다. JCP8151BSmR에 의한 rUTI의 유도는 12 h 또는 7 일 (d) 간격으로 주어진 두 개의 순차적 인 G. 질 접종을 필요로한다 (d)39. 다른 G. 질 균주가 각질 제거 및/또는 UPEC rUTI를 유도하는지 여부는 이 모델로 결정되어야 한다. 항생제 내성이 알려진 UPEC 및 G. 질 균주 (예 : UPEC의 경우 카나 마이신 또는 스펙티노마이신 및 G. vaginalis의 경우 스트렙토 마이신)를 사용하는 것이 필수적인데, 이는 항생제를 한천 플레이트에 첨가하여 감염을 모니터링하기 위해 콜로니 형성 단위 (CFU)를 열거하는 것을 방해 할 수있는 내인성 마우스 미생물의 성장을 방지 할 수 있기 때문입니다. 이것은 마우스 소변이 항생제없이 배양 접시에서 자랄 수있는 다른 박테리아를 자주 포함하기 때문에 소변 표본을 배양하는 데 특히 중요합니다. 마우스 소변에서 이러한 내인성 박테리아의 기원은 알려지지 않았지만 소변 수집 중에 포착 된 요도 및 비뇨 생식기 박테리아를 반영 할 가능성이 큽니다.

G. 질리스는 교수성 혐기성 박테리아이며, 따라서, 이 프로토콜은 혐기성 챔버에서 G. 질 JCP8151BSmR을 성장시키는 것을 기술한다. 혐기성 챔버를 사용할 수없는 경우 혐기성 성장 조건을 유지하기위한 다른 방법 (예 : 밀폐 용기의 GasPak 파우치)을 사용할 수 있습니다. 대안적으로, G. 질염의 일부 균주 (JCP8151BSmR 포함)는 표준 조직-배양 배양기 (5%CO2)에서 성장할 것이다. JCP8151BSmR 이외의 G. vaginalis 균주를 사용하는 것이 박테리아가이 모델에서 유사하게 행동하는지 확인하기 위해 테스트가 필요한 것처럼, 성장 조건을 변경하려면 원하는 생존 가능한 접종 농도를 달성하기 위해 배양을위한 이상적인 지속 기간 (플레이트 및 액체) 및 광학 밀도 (OD) 600 등가물의 경험적 결정이 필요합니다. 더욱이, 성장 조건이 G. vaginalis의 병리학에 영향을 미치는지 여부는 알려져 있지 않다.

마지막으로,이 모델을 활용할지 여부를 고려할 때, 연구자들은 일반적인 UTI 마우스 모델보다 그룹 당 더 많은 수의 동물을 요구할 수 있음을 알아야합니다. 이것은 부분적으로 rUTI의 유도가 마우스가 방광의 초기 감염으로 인한 UPEC 박테리아를 해결하도록 요구하기 때문입니다. 따라서, 세균뇨를 제거하지 못하는 임의의 마우스 (일반적으로 진행중인 신장 감염을 나타내는 표현형)는 프로토콜의 rUTI 단계에 포함되지 않는다. 이러한 연구에 필요한 생쥐의 수는 또한 소변으로 "자발적인"UPEC 출현률 (평균 12-14 %)에 의해 영향을받습니다. 마지막으로, 상이한 마우스 균주는 만성 세균뇨 대 세포내 저수지 형성(42,43)을 발달시키기 위한 상이한 성향을 갖는다. 이 모델에서 C57BL/6 이외의 마우스 균주를 사용하는 경우, 동물이 정지된 UPEC 세포 내 저장소를 개발한다는 것을 확인해야 한다.

Protocol

워싱턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)는 프로토콜 번호 20170081의 일부로 모든 마우스 감염 및 절차를 승인했으며, 이는 2020 년 6 월 9 일 만료되었으며 20-0031 년 3 월 18 일 만료되었습니다. 동물의 전반적인 보살핌은 국가 연구위원회 및 USDA 동물 관리 자원 가이드의 실험실 동물 관리 및 사용을위한 가이드와 일치했습니다. 안락사 절차는 동물 안락사에 대한 AVMA 지침: 2020 에디션과 일치합니다.

Figure 1
그림 1. 마우스 모델의 회로도. 타임라인은 프로토콜에 설명된 모델의 단계 또는 절차를 반영하도록 강조 표시됩니다. 1 단계 (오렌지) : 세포 내 UPEC 저수지 구축. 마우스는 UPEC로 경요도 접종되고 소변 샘플은 박테리아뇨의 클리어런스를 위해 수집되고 모니터링됩니다. 박테리아뇨를 제거하는 마우스 만이 후속 단계로 진행됩니다. 2 단계 (녹색) : G. 질에 방광 노출. 마우스는 G. 질염으로 두 번 경요도로 접종됩니다. 두 순차적 노출 사이의 지속 시간은 원하는 다운스트림 분석에 따라 12시간(상단 패널) 또는 1주(wk; 하단 패널)입니다. 3 단계 (노란색) : UPEC rUTI. 소변은 G. 질 노출 후 매일 수집되며 UPEC 박테리아뇨를 모니터링합니다. 추가적으로, 방광 및 신장은 UPEC 조직 역가를 측정하기 위해 실험 종점에서 수집될 수 있다. 1 wk 노출 모델에서, G. 질리-유도된 세포내 저장소로부터의 UPEC의 출현 및 요로로부터의 후속 클리어런스는 또한 UPEC 방광 조직 역가의 감소에 반영된다 (PBS 노출 마우스와 비교하여, 도 3D 참조). 방광 역가의 이러한 감소는 12시간 노출 모델에서 명백하지 않았으며, 아마도 조직 역가를 유의하게 감소시키기 위해 충분한 저장소 출현 및 클리어런스가 일어나기 위해 더 많은 시간이 요구되기 때문일 것이다. 절차 A : 소변 세포학은 일반적으로 급성 UPEC 감염을 검사하기 위해 1 단계 동안 1 dpi (또는 그 이전)를 수행하고 UPEC 출현과 관련된 소변 PMN 함량을 평가하기 위해 3 단계 동안 수행됩니다. 다른 시점에서 수집된 소변 샘플은 유사하게 분석될 수 있다. 절차 B: 비뇨생식기 박리를 검사하기 위한 방광 주사 전자 현미경(SEM)은 전형적으로 두 번째 G. 질 노출 후 3h에서 12시간 모델에서 수행된다(시간 0에서 첫 번째 노출을 투여한 후 15시간). 다른 시간점들, 예컨대 단계 1에 나타낸 바와 같이 UPEC 접종 후 6-24 h와 같은 평가될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 마우스에 UPEC 정지 세포 내 저장소를 구축하십시오.

  1. 요로 카테터를 준비하십시오 (이 단계의 비디오는 44,45,46,47 참조).
    1. 바늘 바닥에서 바늘 끝을 넘어 몇 mm까지 연장되는 PE10 튜브 길이의 스레드 30 게이지 바늘. 바늘 끝으로 튜브에 구멍을 뚫지 않도록주의하십시오. 또는 소아 정맥 내 캐뉼라(46)를 사용하십시오.
    2. 준비된 카테터를 페트리 접시에 넣고 적어도 30 분 동안 자외선으로 살균하십시오. 페트리 접시 뚜껑을 교체하고 필요할 때까지 보관하십시오.
  2. UPEC 접종 준비 (하루 -3 ~ 0 일)
    1. 제-3일: UTI89kanR 을 -80°C 냉동고 스톡으로부터 루리아-베르타니(LB) 한천 플레이트 상에 스트리킹한다. 플레이트를 37°C에서 18-24시간 동안 인큐베이션한다.
      참고: 카나마이신 내성이 UTI89kanR에 안정적으로 통합되기 때문에 카나마이신을 접종 성장 배지에 첨가할 필요는 없다.
    2. 제-2일: 멸균된 125 mL 플라스크에 LB 브로스 20 mL를 UTI89kanR의 단일 콜로니로 접종한다. 이러한 배양 방법은 방광 접착에 필요한 UPEC 타입 1 필루스의 발현을 유도하는데 중요하기 때문에 더 작은 플라스크를 사용하지 마십시오.
    3. 37°C에서 18-24시간 동안 정적으로 (흔들림 없이) 인큐베이션한다. 성장 배지에 항생제를 첨가하지 마십시오. LB 플레이트 (18-24 시간 이전)에 신선한 식민지 만 사용하여 액체 배양을 시작하십시오.
    4. 제1일-1일: UTI89kanR 20 μL의 배양물을 제거하고(침전된 박테리아를 재현탁시키기 위해 플라스크를 부드럽게 소용돌이치게 함) 멸균된 125 mL 플라스크에 신선한 LB 브로스 20 mL를 첨가하였다. 확고한 18 h 지속 기간을 제외하고 단계 2에서와 같이 인큐베이션한다. 성장 배지에 항생제를 첨가하지 마십시오.
    5. 제0일: 전체 배양물을 50 mL 튜브로 옮기고 3200 × g 에서 탁상용 원심분리기에서 10분 동안 스핀하여 박테리아를 펠릿화한다. 흡인물 상청액을 박테리아 펠렛을 PBS 10 mL에 재현탁시켰다.
    6. 단계 4에서 900 μL의 PBS까지 농축된 박테리아 현탁액 100 μL를 큐벳에 첨가하고, PBS로 블랭킹된 분광광도계를 사용하여 600 nm(OD600)에서의 광학 밀도를 결정하였다. 분광 광도계 값에 10을 곱하여 (희석을 고려하여) 현탁액 (OD현탁액)의OD600을 결정하십시오.
    7. 50 μL에서 1 x 107 CFU의 원하는 접종 농도를 달성하기 위해, 다음 방정식을 사용하여 UTI89kanR 현탁액을 희석 (또는 농축)하고, 여기서 원하는 OD접종 물은 0.35 (값은 다른 UPEC 균주에 대해 변할 수 있음) 및 Y는 필요한 접종물의 부피 (기포를 제거하고 카테터를 채우기 위해 추가로 허용하기 위해 마우스 당 100 μL)이다.
      X mL x OD현탁액 = Y mL x OD접종물
      예를 들어, OD현탁액 값이 4.7이고 5 mL의 접종이 필요한 경우:
      X mL × 4.7 = 5 × 0.35
      X = (5 × 0.35) / 4.7
      X = 0.372 mL
      따라서 박테리아 현탁액 372 μL를 첨가하여 5 mL (최종 부피)를 만드십시오.
    8. 다중 채널 피펫을 사용하여 접종물의 1:10 연속 희석액을 96-웰 플레이트에서 멸균 PBS 중에서 10-6 으로 만든다. 모든 6개의 희석물을 LB 및 LB+kan 플레이트 상에 5개의 10 μL 반복실험으로 스팟하고, 스팟을 건조시키고, 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 항생제가없는 LB 플레이트는 접종물이 다른 유기체에 의해 오염되지 않았 음을 보장하기 위해 사용됩니다 (이는 kan 항생제 선택 플레이트에 존재하지 않는 추가적인 콜로니 형태학으로 나타날 것입니다). 두 플레이트 유형 모두 동일한 결과를 산출해야합니다.
      참고 : 플레이트는 사용하기 하루 전에 벤치 탑에서 건조시켜 반점이 합착되지 않고 도금 된 액체를 흡수 할 수 있도록해야합니다.
    9. 구별 가능한 콜로니로 희석의 모든 스팟에서 콜로니의 총 수를 계산하고 값을 사용하여 각 실험에 사용 된 실제 접종 용량을 계산하십시오. 단순히 OD600 값에 의존하지 마십시오.
  3. UTI89kanR 을 마취 된 암컷 마우스의 방광에 접종하십시오 (Day 0)
    참고: 이 절차의 비디오 녹화는 이전에게시되었습니다 44,46. 보다 자세한 설명은 이 논문을 참조하십시오. 마우스 카테터 삽입에 대한 자세한 내용은 이 프로토콜의 섹션 5를 참조하십시오.
    1. IACUC가 승인 한 방법에 따라 이소 플루란 흡입으로 마우스를 마취하십시오.
    2. 마우스가 마취되기를 기다리는 동안, UTI89kanR 접종물로 투베르쿨린 주사기를 채운 다음 준비된 카테터를 부착한다. 플런저를 눌러 카테터에서 공기를 비운 다음 카테터를 멸균 수술 윤활제에 담그십시오.
    3. 마우스를 뒤쪽에 놓고 마우스 풋패드를 단단히 쥐어 짜내고 반사 또는 반응의 부재를 관찰하여 마취를 확인합니다. 각 손의 검지 사이에 방광 (하복부의 완두콩처럼 느껴짐)을 찾습니다. 손가락을 서로 향하게 움직여 소변을 표현하여 방광에 부드러운 압박감을 가합니다.
    4. 마우스 요도를 통해 카테터를 방광에 넣고 50 μL의 접종물을 천천히 전달하십시오.
    5. 몇 초 정도 기다린 다음 카테터를 똑바로 잡아당겨 부드럽게 제거합니다. 마우스를 케이지로 돌려 놓고 마취에서 회복 될 때까지 모니터링하십시오.
    6. 추가 마우스와 함께 1.3.1 - 1.3.5 단계를 반복하여 각 케이지 (5 마우스) 사이의 카테터를 변경하십시오. 원하는 경우, 동일한 절차가 PBS로 마우스의 대조군을 접종하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 G. 질 리스의 또 다른 균주가 rUTI를 이끌어내는 것을 보여주기 위해 (자발적/배경 수준 이상).

2. UPEC 세균뇨증의 통관 모니터링 (1일~28일)

참고: 소변 수집 절차의 비디오는 이전에44에 게시되었습니다.

  1. 감염 후 1 d에서 그리고 매주 4 wk (감염 후 7, 14, 21 및 28 d) 동안44에 기재된 바와 같이 방광 촉진에 의해 모든 마우스로부터 소변 (최소 10 μL)을 수집한다. 소변은 UPEC 감염을 모니터링하기 위해 수집 후 몇 시간 이내에 배양해야합니다. 플레이팅될 때까지 소변을 4°C에서 보관하십시오. 소변은 또한 세포학에 사용될 수 있습니다 (섹션 4 참조). 때때로 방광에 염증이 심하면 10 μL의 소변을 얻을 수 없습니다. 이 경우 PBS는 최대 10 μL까지 첨가될 수 있지만, 소변 세균 역가 및 세포학 점수는 그에 따라 조정되어야 한다(예를 들어, 단지 5 μL 소변이 수집되고 5 μL PBS가 첨가되는 경우, 역가 및 스코어를 2로 곱함).
  2. 다중 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트에서 멸균 PBS에서 1:10 연속 희석액을 10-6으로 만듭니다. P10 다중 채널 피펫을 사용하여 관련 항생제 선택 마커를 함유하는 LB 플레이트의 왼쪽 가장자리에 수직 배향으로 컬럼 1로부터의 모든 6개의 희석물 중 10 μL를 스팟팅한다. 팁을 버리십시오.
  3. 나머지 샘플(컬럼 2, 컬럼 3 등)으로 도금을 반복합니다. 단일 플레이트는 5 개의 샘플을 나란히 수용 할 수 있습니다. 이렇게 하면 5 × 6 스폿 매트릭스가 있는 플레이트가 생성되며, 위에서 아래로 희석이 증가하고 샘플 수가 왼쪽에서 오른쪽으로 증가합니다(그림 2A).
  4. 스팟을 벤치탑에서 건조시키고, 이어서 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 다음 날, 콜로니가 구별되는 최소 희석 지점에 있는 콜로니의 수를 계산하고(그림 2B), 이 숫자를 사용하여 CFU/mL를 계산합니다.
    단일 소변 스폿 × 희석 인자 × 100 = CFU/mL 소변에서의 콜로니 수
  5. 그래프 소프트웨어를 사용하여 UTI89kanR 소변 역가를 플롯합니다(그림 2C). 28d에서 소변에서 검출 가능한 UTI89kanR 이없는 마우스를 확인하십시오 (C57BL / 6 마우스의 ~ 65-80 %). 이 마우스는 정지 된 세포 내 저장소를 보유하고 있으며 재발 성 UTI의 유도를 검사하기 위해 후속 실험 단계에서 사용됩니다. 28d에서 소변에 박테리아가있는 사람들은 후속 단계에 포함되지 않습니다.

3. G. 질염에 대한 방광 노출

  1. 마우스를 노출 그룹에 배정합니다 (Day 29). 이 단계의 주요 목표는 더 장기간의 박테리아뇨를 가진 모든 마우스가 동일한 노출 그룹에서 함께 갖는 것을 피하는 것인데, 이는 이것이 rUTI의 가능성에 영향을 미치는지 여부는 알 수 없기 때문이다.
    1. 소변 CFU 데이터(도 2D)를 사용하여, UTI89kanR 세균뇨가 더 이상 검출가능하지 않은 시점을 기준으로 마우스를 분류한다(도 2E).
    2. 마우스를 각 카테고리로부터 G. 질 또는 PBS 접종 그룹 중 하나로 무작위화하고; 예를 들어, 7 일째 전에 클리어 한 마우스의 절반은 G. 질염 을 얻고 절반은 PBS를 얻습니다. 8일에서 14일 사이에 클리어한 마우스의 절반은 G. 질염 을 얻을 것이고, 절반은 PBS 등을 얻을 것이다( 도 2E에서와 같이).
  2. G. 질 접종 준비 (혐기성 챔버에서 수행 된 모든 단계)
    참고 : 이상적인 배양 시간은 G. vaginalis의 다른 균주에 따라 다르며, 일부 균주는 정지 단계에 들어가고 심지어 다른 균주보다 더 빨리 죽기 시작합니다. 이것은 죽인 G. 질염 (JCP8151B)이 rUTI39를 촉발시킬 수 없다는 점을 고려할 때 특히 중요하다. 따라서, 인큐베이션 시간은 마우스에서 실험을 수행하기 전에 주어진 균주에 대해 경험적으로 결정되어야 한다. G. vaginalis 의 다른 / 모든 균주가이 모델에서 동일한 효과를 유발하는지 여부는 알 수 없습니다.
    1. 줄무늬 G. 질 균주를 -80°C 냉동고 스톡에서 NYCIII 플레이트 상으로 (항생제 없음). 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 혐기적으로 인큐베이션한다.
    2. 혐기성 챔버에서, 5 mL의 혐기성 NYCIII 배지를 NYCIII 플레이트로부터 1 μL 루풀한 세포 (단일 콜로니가 불충분함)로 접종하고, 18시간 동안 혐기성 조건 하에서 37°C에서 정적으로 배양배양한다. 성장 배지에 항생제를 포함하지 마십시오.
  3. 분광광도계를 이용하여 배양물의OD600 을 결정한다.
    1. 배양물의 정의된 부피(X)를 9600 × g 에서 1분 동안 원심분리하고, 배지를 흡인한다. 다음 방정식을 사용하여 50 μL에서 108 CFU를 달성하기 위해 원하는 접종물 OD를 달성하기 위해 펠렛을 재현탁시키는 PBS의 부피 (Y)를 계산하십시오.
      X mL × OD배양 물 = Y에 대한 Y mL × OD접종물 해결
      Y = (X ml × OD배양물) / OD접종물
      참고: JCP8151BSmR에 대한 OD접종은 5이지만 이것은 다른 G. 질 균주에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 예를 들어, 3 mL의 JCP8151BSmR을 OD 배양으로 밤새 액체배양하여 방사하는 경우 = 2.0:Y=(3 mL × 2.0)/5.0; 따라서 펠렛을 1.2 mL PBS에 재현탁시킨다.
    2. 박테리아 펠렛을 PBS에 원하는 농도로 재현탁시킨다. 접종물을 연속적으로 희석하고 플레이트 (상기 CFU 도금 프로토콜에 기재된 바와 같이) 각 실험에 사용된 실제 접종 용량을 결정한다. 단순히 OD 값에 의존하지 마십시오.
  4. UPEC 접종 후 29-31일째에, 마취된 마우스를 상기 단계 1.3에 기재된 바와 같이 G. 질 또는 PBS로 접종한다. PBS 대조군은 방광을 카테터화하는 행위가 UPEC 저장소의 어느 정도 재발을 유도 할 수있는 손상 및 비뇨 생식기 박리를 유도 할 수 있기 때문에 필수적입니다. 따라서 PBS-접종된 마우스는 G. vaginalis-접종된 마우스가 비교되는 대조군으로서 작용한다.
    참고: 28d에서의 최종 UPEC 세균뇨 결정은 CFU 플레이트의 하룻밤 인큐베이션이 필요합니다. 따라서, 이 단계가 수행될 수 있는 가장 빠른 단계는 초기 UPEC 접종 후 29일이다. 필요한 경우, 노출은 31 일째만큼 늦게 주어질 수 있습니다. 연구원은 실험간에 일관성이 있어야합니다.
  5. 제2 G. 질염 (또는 PBS 대조군) 접종을 제1 접종 후 12 h 또는 1 wk와 같은 원하는 시점에서 투여하기 위해 접종 제제를 반복한다. 두 번째 노출은 G. 질염을 가진 단일 접종 이 상당한 UPEC 출현(39)을 초래하지 않기 때문에 필요하다.

4. UPEC 재발 UTI 모니터링

  1. 각 G. 질 접종 후 원하는 시점에 마우스로부터 소변을 수집하십시오 (1, 2 및 3 d 접종 후 권장 됨).
    1. UTI89kanR CFU/mL를 결정하기 위해 선택적 플레이트(예를 들어, LB+카나마이신)에 연속적으로 희석 및 플레이트 소변을 묬. 원하는 경우, 소변 희석물을 선택적 플레이트 (예를 들어, NYCIII + 1 mg/mL 스트렙토마이신)에 플레이팅하여 G. vaginalis CFU/mL를 결정할 수도 있다. 그러나, G. 질 JCP8151BSmR 은 12시간 39분에 의해 대부분의 마우스의 소변으로부터 제거되었다. 따라서 대부분의 마우스에서 G. vaginalis 를 검출하기 위해서는 초기 시점이 필요합니다.
  2. 실험 종말점에서(예를 들어, 제2 G. 질내 접종 후 3 d), 승인된 방법(예를 들어, 이소플루란 마취 또는CO2 흡입 하에서의 자궁경부 탈구)에 따라 마우스를 희생시키고, 앞서 기술된 바와 같이 CFU 열거를 위해 방광 및 신장을 수집한다 44,46.

5. 소변 세포학

참고: 이 절차는 소변에 존재하는 세포 및/또는 박테리아의 시각화가 필요한 임의의 시점에서 수행될 수 있다. 도 1에 나타난 바와 같이, 소변 세포학은 일반적으로 급성 UPEC 감염을 검사하기 위해 1상 동안 1dpi(또는 심지어 그 이전)에서 수행되고, UPEC 출현을 나타내는 소변에서 다형핵(PMN) 세포의 존재를 평가하기 위해 3상 동안 수행된다.

  1. 90 μL의 PBS에 10 μL의 소변을 부착된 필터 및 슬라이드가 부착된 시토깔때기 카세트에 첨가한다. (가장 간단한 방법은 소변 배양에 사용되는 96-웰 플레이트의 1:10 희석액의 나머지를 사용하는 것입니다. 이러한 샘플은 4 °C에서 보관하면 소변 배양 후 최대 24 시간까지 사용할 수 있습니다). 카세트를 세포 원심 분리기에 넣고 600-800 x g 에서 6 분 동안 높은 가속으로 회전시킵니다.
  2. 슬라이드를 제거하고 하룻밤 사이에 말리십시오. 다음날, 제조자의 프로토콜에 따라 혈액학 염색 키트(예를 들어, 라이트스, 지엠사, 고정제 포함)로 염색한다.
  3. PMN 및 상피 세포의 존재에 대해 광 현미경으로 슬라이드를 분석하십시오. 원한다면, 이들은 각각의 고출력 시야에 존재하는 각 세포 유형의 풍부함에 기초한 정성적 스코어링 메트릭을 사용하여 스코어링될 수 있다(예를 들어, 0=없음, 1=적음, 2= 보통, 3=견고함). 슬라이드를 분석하는 개인이 잠재적 편향을 최소화하기 위해 실험 그룹에 눈이 멀었는지 확인하십시오.

6. 주사 전자 현미경에 의한 방광 이미징

참고: 이 절차는 요로텔륨의 시각화가 필요한 모든 시점에서 수행할 수 있습니다. 그림 1 (보라색 상자)에 표시된 바와 같이, UPEC-비뇨 생식기 상호 작용은 저수지 형성 단계 동안 UPEC 접종 후 6 h와 24 h 사이에서 가장 잘 시각화되며, G. 질염에 의해 촉발 된 비뇨 생식기 박리는 두 번째 G. 질 노출 후 3 h와 12 h 사이에서 가장 잘 시각화됩니다.

  1. 현장 방광 고정
    1. pH 7.4에서 2mM의 CaCl2와 함께 0.15M 소듐 카코딜레이트 완충액에 글루타르알데히드(2.5% 최종)와 파라포름알데히드(2 % 최종)를 첨가하여 방광 수확 직전에 고정제를 제조하였다. 새로 열린 유리 앰플에서 파라포름 알데히드와 글루타르 알데히드를 사용하십시오.이 두 고정제는 열린 용기에서 시간이 지남에 따라 산화됩니다.
      주의: 글루타르알데히드는 독성이 있고, 호흡기 자극제이며, 부식성이 있습니다. 파라포름알데히드는 가연성, 발암성, 자극제 및 생식 독소이다; 카코딜레이트 나트륨은 독성이 있고 발암성입니다.
    2. 50 mL의 고정 용액을 만들기 위해, 6.25 mL의 16% 파라포름알데히드, 2 mL의 50% 글루타르알데히드, 및 16.75 mL의 초순수를 4 mM CaCl2로 pH 7.4에서 카코딜레이트 나트륨의 0.3 M 용액25 mL에 첨가한다.
    3. 방광에 투여하기 전에 제조된 고정제를 37°C로 가온한다.
    4. 투베르쿨린 슬립 팁 주사기를 고정제로 채우고 카테터를 끝에 부착하고 반대쪽 주사기 표시를 향한 경사를 붙입니다. 바늘 끝에서 1-2 mm 정도 과도한 튜브를 잘라내어 바늘 팁이 노출되지 않도록주의하십시오. 주사기를 플릭하여 거품을 제거하고 플런저를 밀어 공기를 비우고 카테터를 마이크로 원심분리 튜브 위에 고정제로 채워 적절한 폐기를 위해 고정 장치를 수집하십시오.
    5. 마취시키고 승인된 방법을 사용하여 마우스를 희생시킨다(예를 들어, 마취 하에서의 자궁경부 탈구). 다리를 고정한 상태에서 해부 표면에 마우스를 놓습니다(고무 밴드 또는 핀 사용). 포셉과 한 쌍의 외과 용 가위로 마우스 골반 부위를 열어 방광을 노출시킵니다. 조심스럽게 인접한 지방을 옆으로 밀고 방광을 제자리에 두십시오.
    6. 바늘이 아래를 향하게하고 바늘 경사와 주사기 표시가 당신에게서 멀어지는 것을 마주 보는 지배적 인 손으로 주사기를 잡으십시오. 카테터 팁을 멸균 윤활제에 담그십시오.
    7. 카테터 끝을 요도 개구부에 놓고 주사기 배럴을 마우스 몸체 위로 30-45° 각도로 위치시킵니다.
    8. 팁과 함께 매우 작은 시계 방향 움직임을 사용하여 아래쪽으로 압력을 가하고 카테터를 요도에 부드럽게 삽입하십시오. 카테터 팁이 요도에 들어가면 주사기 배럴이 작동 표면과 평행 할 때까지 카테터를 요도 내로 계속 밀어 넣으면서 주사기를 마우스의 꼬리쪽으로 경첩하십시오. 전체 카테터 바늘 샤프트 (베이스를 포함하지 않음)가 마우스에 들어가서 카테터 팁을 방광 루멘 내에 위치시켜야합니다.
    9. 천천히 50-80 μL의 고정제를 전달하여 방광이 풍선처럼 팽창하게합니다. 카테터를 제자리에 유지하고 주사기를 약간 들어 올려 팁을 위로 기울이십시오.
    10. 다른 한편으로는, 지혈제를 열고 요도의 교차점에있는 카테터 바늘 아래에 하나의 단자를 밀어 넣습니다. 바늘과 접촉 할 때까지 지혈제를 부분적으로 닫으십시오.
    11. 카테터 바늘을 방광 밖으로 부드럽게 밀어 내면서 동시에 지혈제를 완전히 단속하고 잠그면 고정제의 손실을 방지합니다.
    12. 지혈제를 잡아서 방광이 위에 놓인 상태에서 작업 표면과 평행하도록하십시오. 부드럽게 들어 올려 지혈제 (방광의 반대편) 아래로 조심스럽게 잘라 지혈제가 여전히 부착 된 방광을 제거하십시오.
    13. 방광을 놓고 지혈제를 따뜻한 고정제가 들어있는 팔콘 튜브에 부착하십시오. 방광이 유체에 완전히 잠겨 있고 튜브 벽에 눌리지 않도록하십시오. 4°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
  2. 방광 처리 및 주사 전자 현미경 (SEM)을 통한 이미징
    1. 청소 된 양면 면도날로 방광을 양면하고 지혈제에 접하는 두 번째 컷을 만들어 방광을 방출하십시오. 이로 인해 2 개의 반 방광 "컵"이 생깁니다. 방광 외부에 남아있는 뚱뚱한 패드가 있으면 부드럽게 제거하십시오.
    2. 방광 반쪽을 소듐 카코딜레이트 완충액 (0.15 M, pH 7.4)에서 세 번 (각각 10 분) 헹구십시오.
    3. 조직을 실온에서 1 h 동안 0.15 M 카코딜레이트 완충액 중의 1% 오스뮴 테트록사이드로 착색시킨다. 오스뮴은 빛에 민감합니다. 따라서, 어두운 환경을 유지하기 위해 호일에 싸인 염색 용기로 이 단계를 수행하십시오.
      주의: 오스뮴 테트록사이드는 피부에 독성이 있고 부식성이 있습니다. 장갑으로 흄 후드에서이 단계를 수행하십시오.
    4. 방광 반쪽을 초순수로 세 번 (각각 10 분) 헹구십시오. 이 단계 동안, 삼투 된 오일은 언젠가 물 표면에서 볼 수 있습니다. 건조 단계 동안 오염을 방지하기 위해 흡인물 또는 이를 윅 오프하십시오.
    5. 등급화된 에탄올 시리즈(50, 70, 90, 100, 및 100%)를 각각 10분 동안 침수시켜 조직을 탈수시킨다.
    6. 고정된 조직을 임계점 건조기를 사용하여 건조시키고 가장 느린 속도로12CO2 교환을 수행한다. 빠름으로 설정된 배출 단계를 제외하고 모든 추가 설정을 느리게 설정하십시오.
    7. 깨끗한 양면 면도기로 각 방광을 다시 반쯤 양면하여 시편의 곡률을 줄이기 위해 총 4 개의 조각을 생성하여보다 효율적인 코팅을 위해, SEM에서의 이미징의 용이성을 위해, 건조 중에 말렸을 수있는 조직을 노출시킵니다.
    8. 방광 조각을 알루미늄 스터브의 전도성 탄소 접착제 탭에 부착하고 이쑤시개와 접촉하는 바닥 주위에 소량의 은색 접착제를 페인트하여 과도한 접착제가 방광의 내부 표면에 위킹되는 것을 방지하도록주의하십시오.
    9. 고진공 스퍼터 코터를 사용하여 샘플 스터브를 6nm의 이리듐으로 스퍼터 코팅하십시오. 샘플이 계속 충전되면 은색 페인트로 표면에 전도성 경로를 칠하고 추가 4nm의 이리듐으로 코팅하십시오.
    10. 주사 전자 현미경으로 샘플을 이미지화하십시오. 사용 된 현미경에 따라 조건이 다를 수 있지만 빔 전류가 200pA이고 작동 거리가 12-13mm인 3KeV의 가속 전압은 Everhart-Thornley (SE2) 전자 검출기를 사용할 때 Zeiss Merlin FE-SEM에서 잘 작동했습니다.

Representative Results

접종 후, UPEC 역가는 소변에서 검출가능하다(도 2B). 카나마이신을 함유하는 선택적 배지에 소변 샘플을 플레이트화하지 않으면 소변을 오염시키는 내인성 마우스 미생물의 과증식이 발생할 가능성이 큽니다. UPEC 세균뇨의 수준은 1일째에 높을 가능성이 높으며 이후 시간대에 감소하기 전에 첫 주 동안 증가할 수 있습니다(그림 2C). 마우스의 약 65-80%는 28dpi만큼 소변에서 검출 가능한 UPEC를 갖지 않을 것이다(그림 2C, 녹색 원). 이들 마우스는 모델의 후속 단계에서 사용될 수 있다. 박테리아로 남아있는 마우스(도 2C, 적색 타원)는 실험에서 제거되어야 한다.

12 h (그림 3A) 또는 1 wk 간격 (그림 3B)을 감안할 때 두 번의 순차적 인 G. 질 노출은 재발 성 세균뇨를 유발하기 위해 세포 내 저장소에서 UPEC가 출현하는 결과를 초래합니다. UPEC 세균뇨의 수준(만-휘트니 테스트)과 UPEC rUTI(피셔의 정확한 시험)를 표시하는 마우스의 분획 모두 PBS 대조군에 비해 G. 질염에 노출된 마우스에서 유의하게 더 높다. 소변 세포학 분석은 UPEC 출현을 나타냈던 G. 질리에 노출된 마우스로부터 소변에서 PMN을 검출한다(도 3C). 1 wk 간격으로 주어진 두 번의 노출을 갖는 모델에서, 방광 조직에서의 UPEC 역가는 PBS에 비해 G. 질리스-노출된 마우스에서 더 낮으며(도 3D), 아마도 저장소로부터의 UPEC의 출현 및 후속 클리어런스로 인한 것으로 추정된다.

SEM에 의한 계내 고정 방광 조직의 시각화는 PBS에만 노출된 대조군 마우스에서 방광 표면을 라이닝하는 큰 피상적 우산 비뇨생식기 세포를 드러낸다(도 4A). Urothelial 각질 제거는 표면 우산 세포의 손실에 의해 입증되며, G. 질 염에 노출 된 마우스에서 더 작은 기저 과도기 상피 세포를 드러냅니다 (그림 4B). 세포 내 저장소의 확립 동안 UPEC 접종 초기에 UPEC는 각질 제거 세포 밖으로 우로텔륨 및 필라멘트에서 볼 수 있습니다 (그림 4C).

Figure 2
그림 2. 1 단계 (저수지 형성) 동안 소변에서 UPEC 역가를 모니터링합니다. (A) 콜로니 형성 단위 (CFU) 도금의 개략도. (B) LB+카나마이신에 대한 소변에서 UPEC 역가의 대표적인 이미지. 검은 원은 CFU / mL를 계산하기 위해 계산해야하는 소변 샘플 반점을 나타냅니다. (C) C57BL/6 마우스에서 UPEC 세균뇨증의 시간 경과. 각 라인은 개별 마우스를 나타내며, 시간에 따른 UPEC 소변 역가를 추적합니다. 점선은 검출 한계(1000 CFU/mL)를 나타냅니다. 적색 타원은 UPEC 세균뇨를 해결하지 못한 네 마리의 마우스 (20 마리 중)를 나타내며 따라서 G. vaginalis-induced rUTI 모델에는 사용되지 않을 것입니다. 반대로, 녹색 원은 UPEC 세균뇨를 해결하고 후속 단계로 진행한 마우스를 나타냅니다. (d) 패널 C. 노란색, 검출가능한 CFU에서 그래프를 생성하는데 사용된 데이터의 표; 녹색, CFU 없음. (e) UPEC CFU가 소변에서 더 이상 검출되지 않은 시점을 기준으로 마우스를 노출 그룹으로 무작위화("해결일"). 패널 D의 왼쪽 열에 있는 마우스 번호는 패널 E에 제공된 마우스 번호와 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. G. 질염은 UPEC rUTI를 유발합니다. PBS (원) 또는 G. 질 (Gvag; 사각형)에 두 개의 순차적 요로 노출에 이어 소변에서 UPEC 역가는 12 h (A) 또는 1 주 (B) 간격으로 주어진다. 각 기호는 개별 마우스를 나타냅니다. 두 번째 노출 후 1-3d 사이의 각 마우스에서 검출된 가장 높은 CFU/mL UPEC가 플롯됩니다. 검출 가능한 세균뇨가 없는 마우스는 검출 한계(점선)로 플롯팅된다. (C) UPEC (화살촉) 및 다형성 핵 (PMN) 세포 (화살표)를 보여주는 소변 세포학 분석. 스케일 바 = 20 μm. (d) 방광 조직에서의 UPEC 역가는 1 wk 간격으로 주어진 두 개의 순차적 요로 노출 후 3 d를 수집하였다. 각 기호는 서로 다른 마우스를 나타내며 0은 감지 한계(점선)에 플롯됩니다. A, B 및 D에서 상자는 첫 번째 및 세 번째 사분위수에 있으며 중앙값은 최소값에서 최대로 표시됩니다. Mann-Whitney U 테스트 * P < 0.05; ** P < 0.01; P < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4. 방광의 SEM 분석은 제자리에서 고정. 방광은 PBS (A) 또는 G. 질 (C)에 두 번 노출 (12 시간 간격) 후 3 h 후에 마우스로부터 수집되었다. 점선은 단일 요로 상피 세포를 보여 주며, 이는 큰 표면 세포가 각질 제거되어 근본적인 과도기 상피를 드러내기 때문에 G. 질 노출 방광에서 더 작 습니다. (b) 방광은 UPEC로 초기 접종 후 6 시간 후, 모델의 1 단계 동안 수집하여 비뇨 생식기 박리 및 세포외 UPEC를 보여줍니다. (d) 방광 표면에 존재하는 불용성 지방 액적의 예. 스케일 바는 메인 이미지에서 20μm, 인셋에서 2μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 모델의 첫 번째 중요한 단계는 일차 UTI 단계 동안 UPEC 세균뇨를 제거하지 않은 마우스를 식별하기 위한 것입니다. 이 마우스는 G. 질 노출 후 UPEC 박테리아뇨의 비율을 혼란스럽게 할 것이므로 실험에서 제거해야합니다. 초기 UPEC 접종 후, 소변은 박테리아 클리어런스를 모니터링하기 위해 매주 수집해야합니다. C57BL/6 마우스의 약 65-80%가 4주 이내에 UTI89kanR 감염을 제거한다. 다른 사육된 마우스 균주는 UPEC 클리어런스42,43 및 저수지 형성에 대해 상이한 성향을 가지며, 따라서 이 모델에 적합하지 않을 수 있다. 두 번째 중요한 점은 경험적 연구가 G. vaginalis의 두 가지 순차적 접종 (12 h 또는 1 wk 간격)이 PBS에만 노출 된 대조군 마우스에서 발생하는 배경 자발적 출현보다 중요한 저수지 출현을 유발하는 데 필요하다는 것입니다. 두 순차적 노출 사이의 다른 기간은 테스트되지 않았지만 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다. UPEC 방광 역가의 감소는 G. 질 노출이 1 주 간격으로39 주 떨어진 모델에서만 관찰되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 두 개 이상의 노출을 투여 할 수 있지만, 경험적 증거는 반복적 인 카테터 삽입만으로도 출현이 증가하여 결과의 해석을 혼란스럽게하거나 노출 그룹과 대조군 간의 차이를 구별하기 위해 더 많은 수의 동물을 요구할 수 있음을 시사합니다. 마지막으로, 현장 방광 고정 방법에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 고정 장치가 고정 된 방광 내부에 남아 있는지 확인하기 위해서는 몇 가지 기술이 필요합니다. 수축 된 방광은 SEM으로 이미지화하기가 더 어려울 것입니다. 또한 고정제를 방광에 접종 할 때 매우 온화한 것이 필수적이며, 고정 함유 카테터로 요로 텔륨을 긁어 내면 G. vaginalis에 의해 유발되는 것과 독립적으로 비뇨 생식기 박리를 유도 할 수 있습니다. 고정 칵테일에 언급 된 모든 농도는 최종 농도입니다. 이들의 부적절한 비율은 세포의 불충분 한 고정 및 팽창 또는 수축을 초래할 수 있습니다. 정착제는 세포와 조직의 온도 충격을 피하기 위해 생리적 인 온도로 따뜻하게해야합니다. 온난화는 또한 원형질막을 통한 고정제의 확산 속도를 약간 향상시킵니다. SEM 분석을 위해 준비된 샘플에 대해 오스뮴 염색은 종종 생략 될 수 있지만, 임계점 건조 중에 지질을 안정화시키고 세포막의 균열을 방지하는이 프로토콜의 필수 단계입니다.

이 프로토콜은 다른 UPEC 및/또는 G. 질 균주가 저수지를 형성하고 출현을 촉발시키는 능력에 대해 각각 테스트하도록 수정될 수 있다. 다른 질 박테리아 (예를 들어, 락토바실러스 크리스파투스 PVAS100) 또는 열-사멸된 G. vaginalis에 대한 노출과 같은 다른 실험 인자가 또한 추가될 수 있으며, 이들 중 어느 것도 이 모델39에서 병리를 입증하지 못한다. 시험할 다른 박테리아 균주를 선택할 때, 표준 접종 농도가 모든 실험에서 사용될 수 있도록 일관된 성장을 입증하는 것이 중요하다. JCP8151BSmR의 성장은 혐기성 챔버에서 최적화되었습니다. 이 균주는 혐기성 GasPak 시스템에서 재배 될 수 있지만 강력한 박테리아 성장을 보장하기 위해서는 최적화가 필요합니다. 마지막으로, 모델에서 특정 단계의 타이밍을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 소변은 CFU 또는 숙주 반응을 모니터링하기 위해 UPEC 저수지 형성 단계 동안 초기 시점에서 수집 될 수 있습니다. 감염의 진행 또는 저수지의 확립에 대한 초기 시점 (3, 6, 12 hpi)에서 소변 샘플을 수집하는 부작용은이 모델에서 관찰되지 않았습니다. UPEC 저장소의 출현은 12 h 또는 1 wk를 주어진 두 개의 JCP8151BSmR 용량 후에 발생하는 것으로보고되었지만 다른 시간 간격은 아직 테스트되지 않았습니다. 또한, UPEC 저장소 형성 단계를 2주(4주가 아닌)로 감소시킴으로써 모델에 대한 전체 시간 길이를 감소시킬 수 있는데, 이는 많은 마우스가 이 시간에 의해 세균뇨를 맑게 하기 때문이다. 화학 각질 제거제에 대한 방광 노출 후 UPEC 출현을 조사한 이전 연구는 1 또는 2 wk UPEC 저수지 형성 단계17,18을 사용했습니다. 그러나 UPEC 박테리아 제거를위한 시간을 줄이면 실험에서 더 많은 동물을 도태 할 것을 요구할 수 있습니다. 마지막으로, 방광의 SEM 분석은 비뇨생식기에 대한 G. 질염의 효과의 지속기간을 관찰하기 위해 추가적인 시점에 수행될 수 있다.

문제 해결과 관련하여 방광 SEM 분석과 관련하여 특히 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 사용 된 마우스 배경과 존재하는 염증의 양에 따라 일부 방광은 매우 얇은 벽으로 나타납니다. 이 방광은 임계점 건조 중에 더 많이 말리는 경향이 있으며 카우리 껍질과 같은 모양을 만들 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 가장 좋은 방법은 컬링 된 계면을 따라 껍질 모양의 방광을 반으로 자른 다음 두 번째로 돌출 된 조직의 벌크를 제거하는 것입니다. 절단은 PTFE 코팅 양날의 면도날로 가장 잘 작동합니다. 과도한 지방은 때때로 오스뮴 염색 단계 동안 가용화 될 수 있습니다. 이로 인해 헹굼 및 탈수 단계 중에 씻겨 나가지 않고 후속 건조 중에 방광 표면에 침전 될 수있는 원치 않는 불용성 지방 방울이 발생할 수 있습니다. 이 물방울은 샘플 위에 흩어져있는 작은 구 또는 디스크와 같은 구조로 나타날 수 있습니다 (그림 4D). 이것은 가능한 한 많은 지방 조직이 방광 주위에서 제거되도록함으로써 완화 될 수 있습니다. 백금은 이리듐 코팅을 대체 할 수 있지만 미세한 구조적 세부 사항의 마스킹을 줄이기 위해 두께를 최소한으로 유지해야합니다. 코팅 중에 회전 스테이지를 사용하는 것이 좋습니다.

이 모델의 한 가지 한계는 많은 수의 마우스가 필요하다는 것입니다. C57BL/6 마우스의 65-80%만이 UPEC 세균뇨를 제거하고 후속 G. 질 또는 PBS 접종에 적합하다(도 2C 참조). 그룹당 10-12 마리의 마우스 (G. 질 접종 대 PBS)를 얻으려면 ~ 30 마리의 마우스가 초기에 UPEC에 감염되어야합니다. 또한, 통계적 유의성을 검출하는데 필요한 생물학적 반복실험을 달성하기 위해 다수의 실험이 요구될 가능성이 높다. 노출이 1 wk 간격으로 주어졌을 때, UPEC 출현은 PBS에 노출된 마우스의 14%에서 발생하였다(도 3B). 따라서, PBS 대조군에 비해 G. 질염 노출 마우스에서 UPEC rUTI의 유의한 증가를 검출(0.8; 알파=0.05[일방적]으로 구동)하는 것은 각 노출 그룹에 대해 적어도 40마리의 마우스의 누적 총합을 시험해야 한다. 또 다른 고려 사항은 이러한 실험이 비용이 많이 들고 노동 집약적이라는 것입니다. 마우스는 UPEC 클리어런스를 위해 매주 모니터링해야하며 실험 시간은 G. vaginalis가 12 시간 프레임에서 두 번 또는 1 주 간격으로 두 번 주어 졌는지 여부에 따라 4-5 주입니다. SEM은 노동 집약적이며 현미경 가용성 및 서비스 요금에 따라 비용이 많이 들 수 있습니다. SEM을 위해 전체 방광을 준비하는 것은 분석을위한 풍부한 물질을 제공하지만 단점은 각 방광을 분석하는 데 시간이 많이 걸릴 수 있다는 것입니다. 따라서, 소변 및 조직 역가에 사용되는 더 높은 동물 수와 비교하여 제한된 수의 방광만이 SEM에 의해 분석될 수 있을 가능성이 있다. 또한, 방광 "컵"의 곡면의 고품질 이미지를 얻으려면 가시성을 저해 할 수있는 그림자로 인한 기술이 필요합니다. 방광 SEM은 비뇨 생식기 각질 제거를 시각화하는 데 유용한 도구이지만,이 방법은 크게 질적입니다. 샘플이 둥근 모양으로 고정되어 있고 고정제에 글루타르알데히드를 사용하기 때문에 광 현미경을 통해 형광 발현 박테리아를 스크리닝하는 것은 불가능합니다. 면역 염색 및 화학 염료는 대부분의 항원과 오스뮴을 가교시키고 항원 부위를 가리고 조직을 어둡게하는 글루타르 알데히드의 사용으로 인해이 과정과 양립 할 수 없습니다. 즉, SEM 기술은 세포 크기48,49와 같은 추가적인 프로브를 사용하지 않고 정량적으로 평가할 수 있는 파라미터에 유용하다.

이 모델은 앞서 설명한 방법 이상의 몇 가지 이점을 제공합니다. 그것은 방광 저장소에서 출현으로 인한 UPEC rUTI의 메커니즘을 검사 할 수 있으며, 외부 소스에서 방광으로 재 도입되는 것과는 대조적입니다. 방광 저장소에서 출현으로 인한 rUTI의 다른 모델은 화학 약제 (프로타민 설페이트 또는 키토산)를 사용하여 비뇨 생식기 박리17,18을 유발하며, 이는 여성에서 rUTI의 트리거가 아닙니다. G. 질염은 일부 여성23,26에서 카테터 삽입 또는 초음부 흡인을 통해 방광에서 직접 수집 된 소변에서 검출 된 널리 퍼진 비뇨 생식기 박테리아입니다. 이 사실은 BV (G. 질이 질에서 자란다)와 UTI 사이의 알려진 연관성과 결합하여 G. vaginalis가 rUTI의 임상적으로 그럴듯한 방아쇠임을 시사한다. 마지막으로, 현장 방광 고정 방법은 방광 초구조를 보존하고 손상을 제한하여 방광 층이 서로 분리되지 않도록합니다. 우로텔륨을 시각화하기 위한 이전의 방법들은 전통적으로 사용자가 고정제(48)에서 뻗은 방광을 침수하기 전에 방광을 무균적으로 수확, 이분, 스트레치 및 해부 트레이 상에 핀핑한다. 이 방법은 매우 평평한 샘플을 초래하지만 조직의 고르거나 자연스러운 스트레칭을 보장하지 않으며 연신 (주름이 심한 조직을 초래)이있는 영역을 초래할 수 있으며 방광층 분리를 일으킬 수 있습니다. 또한, 조직을 스트레칭하고 고정시키는 방광의 이러한 물리적 조작은 비뇨 생식기 박리를 포함한 손상을 일으킬 수 있습니다. 또 다른 방법은 파라핀에 묻히고 마이크로톰으로 얇은 절편을 얻기 전에 고정제로 방광을 잠수시키는 것입니다. 얇은 절편은 박테리아와 숙주 단백질 국소화를 검사하는 면역 조직 화학 실험에 매우 중요하지만 얇은 섹션은 비뇨 생식기 표면의 시각화를 허용하지 않습니다. 이 SEM 방법을 사용하면 전체 방광의 표면을 한 번에 검사 할 수 있습니다.

설명된 바와 같이, 이 모델의 향후 적용에는 다른 UPEC 균주가 세포 내 저장소를 형성하는지 여부를 결정하기 위해 테스트하고 다른 G. 질 균주를 테스트하여 rUTI를 유발하는 각질 제거 및 UPEC 출현을 유도하는지 여부를 평가하는 것이 포함됩니다 . C57BL/6 마우스 이외의 다른 마우스 균주도 검사할 수 있지만, 만성 방광염이 발병하는 경향이 높은 마우스(예: C3H 배경의 마우스)는 실험에서 도태해야 하므로 권장되지 않습니다. C57BL/6 마우스의 추가적인 이점은 많은 유전적 녹아웃 균주가 상업적으로 입수가능하다는 것이다. 이러한 균주는 저수지 형성 및/또는 출현과 관련된 숙주 인자를 심문할 기회를 제공한다.

Disclosures

저자들은 이 연구와 관련하여 이해상충이 없다고 선언한다.

Acknowledgments

저자들은 감염 실험에 대한 기술 지원을 받은 린 포스터, SEM에 접근하기 위한 워싱턴 대학 셀루어 이미징 센터(WUCCI)의 제임스 피츠패트릭, UTI89kanR UPEC 균주에 대한 스콧 헐트그렌, 원고를 비판적으로 읽은 데이비드 훈스타드에게 감사를 표한다.

이 연구는 국립 과학 재단 (VPO # DGE 대학원 연구 펠로우십 - 1143954), 워싱턴 대학 의과 대학의 여성 전염병 연구 센터 (NMG에 파일럿 연구 상), 미국 심장 협회 : #12POST12050583 (NMG) 및 #14POST20020011 (NMG), 국립 보건원 (NIAID) : R01 AI114635 (ALL) 및 NIDDK의 지원을 받았습니다. R21 DK092586 (모두), P50 DK064540-11 (SJH, 프로젝트 II PI : ALL) 및 K01 DK110225-01A1 (NMG). 일부 동물 연구는 NCRR 그랜트 C06 RR015502에 의해 지원되는 시설에서 수행되었다. 워싱턴 대학 세포 영상 센터 (WUCCI; SEM이 수행 된 곳)와 MSJ는 워싱턴 대학 의과 대학, 워싱턴 대학의 어린이 발견 연구소 및 세인트 루이스 아동 병원 (CDI-CORE-2015-505), 반스 - 유대인 병원 재단 (3770) 및 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NS086741)의 지원을 받았다. 기금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을하지 못했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G x 1/2 needles BD 305106 for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat McKesson 487377 in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater Leica SEM sample processing
aluminum SEM stub Ted Pella 16111 SEM sample processing
Calcium chloride EMS 12340 in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab  Ted Pella 16084-1 SEM sample processing
Conductive silver paint Ted Pella 16034 SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier Leica SEM sample processing
Cytofunnel metal clip Simport M964B cytospun urinalysis
Ethanol EMS 15050 SEM sample processing
Glucose  Sigma G7528 for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde EMS 16320 in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit Fisher 23123869 cytospun urinalysis
HEPES Cellgro  25-060-Cl for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium Ted Pella 91120 SEM sample processing
isofluorane mouse anaesthesia
kanamycin Gibco 11815024 add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar BD DF0445174 UPEC growth plates
Luria-Bertani broth BD DF0446173 UPEC growth media
Merlin FE-SEM Zeiss scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 SEM sample processing
NaCl  Sigma S3014 for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope Olympus cytospun urinalysis
osmium tetroxide EMS 19170 SEM sample processing
paraformaldehyde EMS 15710 in situ bladder fixation
polyethylene tubing Intramedic 427401 for catheters
Proteose Peptone #3  Fisher  DF-122-17-4 for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade EMS 72000 cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300002 cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter Simport M965FWDV cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel Simport M964-1D cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated) Thermo Scientific 5991055 cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate EMS 12310 in situ bladder fixation
spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
streptomycin Gibco 11860038 add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe BD 309659 for catheters
Yeast Extract  Fisher DF0127-17-9 for NYCIII G. vaginalis growth media

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O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, … More

O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61967, doi:10.3791/61967 (2020).

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