Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tilbakevendende Escherichia coli urinveisinfeksjon utløst av Gardnerella vaginalis Blære eksponering hos mus

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61967
Automatic Translation
1,2,6, 3,7, 1,2,4,8, 2,5
1Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Summary

En musemodell av uropatogen E. coli (UPEC) transuretral inokulasjon for å etablere latente intracellulære blærereservoarer og påfølgende blæreeksponering for G. vaginalis for å indusere tilbakevendende UPEC UTI er demonstrert. Det er også påvist oppregning av bakterier, urincytologi og in situ blærefiksering og prosessering for skanningelektronmikroskopi.

Abstract

Tilbakevendende urinveisinfeksjoner (rUTI) forårsaket av uropatogen Escherichia coli (UPEC) er vanlige og kostbare. Tidligere artikler som beskriver modeller av UVI hos hann- og hunnmus har illustrert prosedyrene for bakteriell inokulasjon og oppregning i urin og vev. Under en innledende blæreinfeksjon hos C57BL/6 mus etablerer UPEC latente reservoarer inne i blæreepitelceller som vedvarer etter clearance av UPEC-bakteriuri. Denne modellen bygger på disse studiene for å undersøke rUTI forårsaket av fremveksten av UPEC fra latente blærereservoarer. Den urogenitale bakterien Gardnerella vaginalis brukes som utløser av rUTI i denne modellen fordi den ofte er tilstede i urogenitale kanaler hos kvinner, spesielt i sammenheng med vaginal dysbiose som har vært assosiert med UTI. I tillegg beskrives også en metode for in situ blærefiksering etterfulgt av scanning elektronmikroskopi (SEM) analyse av blærevev, med potensiell anvendelse på andre studier som involverer blæren.

Introduction

Urinveisinfeksjoner (UTI) pålegger en betydelig helsebelastning over hele verden, noe som påvirker livskvaliteten til millioner av mennesker hvert år, spesielt kvinner1. Uropatogen Escherichia coli (UPEC) er den hyppigste årsaken til UVI1. Mange pasienter (ca. 20-30%) som utvikler UVI vil oppleve en tilbakevendende UVI (rUTI) innen 6 måneder til tross for antibiotikamediert clearance av den første infeksjonen. Dessverre lider så mange som 5% av premenopausale kvinner av 3 eller flere rUTI hvert år 3,4. Sekvensielle episoder av rUTI kan skyldes vedvarende samme UPEC-stamme fra indekstilfellet 5,6,7,8. Data fra menneskelige prøver og musemodeller tyder på at rUTI med samme belastning kan være forårsaket av UPEC som bor i hvilende reservoarer i blæren. Hos mennesker ble UPEC påvist i epitelceller og blærebiopsier hos pasienter med UVI 9,10,11,12,13. Studier på C57BL/6 mus har vist at noen stammer av UPEC kan etablere hvilende intracellulære reservoarer i blæren, som detektert ved fluorescensmikroskopi og ved homogenisering og kultur av blærevev, som opprettholdes i flere måneder etter oppløsning av bakteriuri 14,15,16. Behandling av blæren med midler som induserer eksfoliering av blæreepitelet (urotel), f.eks. protaminsulfat17 eller kitosan18, utløser fremveksten av UPEC fra reservoarer for å forårsake rUTI. Disse dataene antyder at hos kvinner som har blære UPEC-reservoarer fra en tidligere infeksjon, kan blæreeksponeringer som fører til urotelial eksfoliering utløse rUTI.

Det er økende bevis på at vaginal mikrobiota bidrar til urinveisinfeksjon 19,20. Gardnerella vaginalis er et hyppig medlem av både vaginal og urin mikrobiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. I skjeden er tilstedeværelsen av høye nivåer av G. vaginalis forbundet med en mikrobiell dysbiose kjent som bakteriell vaginose (BV), som påvirker ~ 30% av kvinnene 30,31,32. Kvinner med BV har høyere risiko for å oppleve UTI sammenlignet med kvinner med et vaginalt samfunn dominert av Lactobacillus 33,34,35,36,37. I musemodeller forårsaker G. vaginalis epiteleksfoliering både i vagina38 og i blæren39. I C57BL/6 mus som har UPEC-blærereservoarer, resulterer to sekvensielle blæreeksponeringer for G. vaginalis - men ikke for PBS - i gjenkomst av UPEC fra reservoarer for å forårsake UPEC rUTI. Fremveksten fremgår av utseendet av UPEC-titere i urin fra mus som tidligere hadde løst UPEC-bakteriuri og en påfølgende reduksjon i UPEC-blærehomogenattitere ved ofring sammenlignet med PBS-eksponerte kontrolldyr39. Interessant nok er det ikke en varig kolonisering av G. vaginalis i blæren. I de aller fleste tilfeller er to korte eksponeringer, hver med mindre enn 12 (h) levedyktig G. vaginalis i urin, tilstrekkelig til å fremkalle urotelial peeling og fremme rUTI.

Denne protokollen beskriver en musemodell av rUTI forårsaket av UPEC bosatt i intracellulære blærereservoarer, ved bruk av G. vaginalis blæreinokulasjon for å utløse tilbakefallet. Fremskrittet oppnådd av denne modellen er at G. vaginalis er en klinisk relevant biologisk utløser av rUTI sammenlignet med tidligere brukte kjemiske midler. Videre tillater den relativt kortvarige overlevelsen av G. vaginalis i musens urinveier undersøkelse av virkningen av forbigående mikrobielle eksponeringer på urotelet, som kan oppstå etter seksuell aktivitet. I tillegg til å skissere rUTI-modellen, beskriver denne protokollen også metoder for urincytologi og in situ blærefiksering og avbildning av urotelet ved skanning av elektronmikroskopi (SEM).

Denne protokollen av G. vaginalis-indusert tilbakevendende UPEC UTI bruker UPEC-stamme UTI89 med en kanamycinresistenskassett (UTI89kanR)40. Ikke alle stammer av UPEC testet var i stand til å danne intracellulære bakteriesamfunn under det akutte infeksjonsstadiet hos mus41 , og det er ennå ikke kjent om alle stammer av UPEC har evnen til å danne latente intracellulære reservoarer. Reservoardannelse bør bekreftes før bruk av andre UPEC-stammer i modellen. Denne protokollen bruker et spontant streptomycinresistent G. vaginalis-isolat , JCP8151BSmR38. Induksjon av rUTI ved JCP8151BSmR krever to sekvensielle G. vaginalis-inokulasjoner , gitt enten 12 timer eller 7 dager (d) fra hverandre39. Hvorvidt andre G. vaginalis-stammer induserer eksfoliering og /eller UPEC rUTI, gjenstår å bli bestemt med denne modellen. Det er viktig å bruke UPEC- og G. vaginalis-stammer med kjent antibiotikaresistens (som kanamycin eller spektinomycin for UPEC og streptomycin for G. vaginalis) fordi antibiotika kan tilsettes agarplater for å forhindre vekst av endogen musemikrobiota som ellers kan forstyrre oppregning av kolonidannende enheter (CFU) for å overvåke infeksjon. Dette er spesielt viktig for dyrking av urinprøver, fordi museurin ofte inneholder andre bakterier som kan vokse over på kulturplater uten antibiotika. Opprinnelsen til disse endogene bakteriene i museurin er ukjent, men reflekterer sannsynligvis periuretrale og urogenitale bakterier som ble plukket opp under urininnsamling.

G. vaginalis er en fakultativ anaerob bakterie, og derfor beskriver denne protokollen voksende G. vaginalis JCP8151BSmR i et anaerobt kammer. Hvis et anaerobt kammer ikke er tilgjengelig, kan andre metoder for å opprettholde anaerobe vekstforhold (for eksempel en GasPak-pose i en lufttett beholder) benyttes. Alternativt vil noen stammer av G. vaginalis (inkludert JCP8151BSmR) vokse i en standard vevskulturinkubator (5% CO2). Akkurat som bruk av andre G. vaginalis-stammer enn JCP8151BSmR krever testing for å sikre at bakteriene oppfører seg på samme måte i denne modellen, krever endrede vekstforhold empirisk bestemmelse av ideelle varigheter for kultur (på plater og i væske) og optisk tetthet (OD) 600 ekvivalenter for å oppnå ønskede levedyktige inokulumkonsentrasjoner. Videre er det ikke kjent om vekstforhold påvirker patobiologien til G. vaginalis.

Til slutt, når man vurderer om man skal bruke denne modellen, bør forskere være oppmerksomme på at det kan kreve større antall dyr per gruppe enn typiske UTI-musemodeller. Dette er delvis fordi induksjon av rUTI krever at musene løser UPEC-bakteriuri forårsaket av den første infeksjonen i blæren. Dermed er enhver mus som ikke klarer å fjerne bakteriuri (en fenotype som vanligvis indikerer pågående nyreinfeksjon) ikke inkludert i rUTI-fasen av protokollen. Antall mus som trengs for å drive disse studiene påvirkes også av frekvensen av "spontan" UPEC-fremvekst i urin (12-14% i gjennomsnitt). Til slutt har forskjellige musestammer forskjellige tilbøyeligheter til å utvikle kronisk bakteriuri versus intracellulær reservoardannelse42,43. Ved bruk av andre musestammer enn C57BL/6 i denne modellen må det bekreftes at dyrene utvikler hvilende UPEC intracellulære reservoarer.

Protocol

Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkjente alle museinfeksjoner og prosedyrer som en del av protokollnummer 20170081, som utløp 06/09/2020, og 20-0031, som utløper 03/18/2023. Samlet omsorg for dyrene var i samsvar med The Guide for Care and Use of Laboratory Animals fra National Research Council og USDA Animal Care Resource Guide. Eutanasiprosedyrer er i samsvar med AVMA-retningslinjene for eutanasi av dyr: 2020-utgaven.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk av musemodell. Tidslinjen utheves for å gjenspeile fasene eller prosedyrene i modellen som er skissert i protokollen. Fase 1 (oransje): Etablering av intracellulære UPEC-reservoarer. Mus blir transuretralt inokulert med UPEC og urinprøver samles inn og overvåkes for clearance av bakteriuri. Bare mus som rydder bakteriuri fortsetter til de påfølgende faser. Fase 2 (grønn): Blære eksponering for G. vaginalis. Mus er inokulert transurethrally med G. vaginalis to ganger. Tiden mellom de to sekvensielle eksponeringene er enten 12 timer (topppanelet) eller 1 uke (wk; bunnpanelet), avhengig av ønsket nedstrømsanalyse. Fase 3 (gul): UPEC rUTI. Urin samles daglig etter G. vaginalis eksponering og overvåkes for UPEC bakteriuri. I tillegg kan blærer og nyrer samles på det eksperimentelle endepunktet for å måle UPEC vevstitere. I eksponeringsmodellen på 1 wk gjenspeiles også G. vaginalis-indusert fremvekst av UPEC fra intracellulære reservoarer og påfølgende clearance fra urinveiene i en reduksjon i UPEC blærevevstitere (sammenlignet med PBS-eksponerte mus, se figur 3D). Denne reduksjonen i blæretitere ble ikke påvist i 12-timers eksponeringsmodellen, antagelig fordi det kreves mer tid for at tilstrekkelig reservoaroppkomst og clearance skal skje for å redusere vevstitere betydelig. Prosedyre A: Urincytologi utføres vanligvis 1 dpi (eller enda tidligere) under fase 1 for å undersøke akutt UPEC-infeksjon og i fase 3 for å vurdere urin PMN-innholdet, som korrelerer med UPEC-fremveksten. Urinprøver samlet på andre tidspunkter kan analyseres på samme måte. Prosedyre B: Blæreskanning elektronmikroskopi (SEM) for å undersøke urotelial eksfoliering utføres vanligvis i 12-timersmodellen ved 3 timer etter den andre G. vaginaliseksponeringen (15 timer etter administrering av den første eksponeringen på tidspunkt 0). Andre tidspunkter kan også vurderes, for eksempel 6-24 timer etter UPEC-inokulasjon som vist i fase 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Etablere UPEC-hvilende intracellulære reservoarer hos mus

  1. Forbered urinkateter (se 44,45,46,47 for videoer av dette trinnet).
    1. Gjenge 30 Gauge nåler med en lengde på PE10-slangen som strekker seg fra nålebunnen til flere mm utover nålespissen. Pass på at du ikke punkterer slangen med nålespissen. Alternativt kan du bruke pediatriske intravenøse kanyler46.
    2. Plasser tilberedte katetre i en petriskål og steriliser med UV-lys i minst 30 minutter. Bytt ut petriskållokket og fest det til det er nødvendig.
  2. Forbered UPEC inoculum (dag -3 til 0)
    1. Dag -3: Strek UTI89kanR fra -80 °C fryselager på en Luria-Bertani (LB) agarplate. Inkuberplate ved 37 °C i 18-24 timer.
      MERK: Det er ikke nødvendig å legge kanamycin til inokulum vekstmediet fordi kanamycinresistensen er stabilt integrert i UTI89kanR.
    2. Dag -2: Inokuler 20 ml LB-buljong i en steril 125 ml kolbe med en enkelt koloni av UTI89kanR. Ikke bruk en mindre kolbe fordi denne kulturmetoden er viktig for å indusere uttrykk for UPEC type 1 pilus som er nødvendig for blæreadhesjon.
    3. Rug statisk (uten risting) ved 37 °C i 18-24 timer. Ikke legg antibiotika til vekstmediet. Bruk bare ferske kolonier på LB-plater (18-24 timer gamle) for å starte flytende kulturer.
    4. Dag -1: Subkultur UTI89kanR ved å fjerne 20 μL kultur (forsiktig virvle kolben for å resuspendere faste bakterier) og legge til 20 ml fersk LB-buljong i en steril 125 ml kolbe. Inkuberes som i trinn 2, med unntak av en fast varighet på 18 timer. Ikke legg antibiotika til vekstmediet.
    5. Dag 0: Overfør hele kulturen til et 50 ml rør og spinn ved 3200 × g i en bordsentrifuge i 10 minutter til pelletsbakterier. Aspirer supernatant og resuspender bakteriepelleten i 10 ml PBS.
    6. Tilsett 100 μL av den konsentrerte bakteriesuspensjonen fra trinn 4 til 900 μL PBS i en kyvette og bestem den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) ved hjelp av et spektrofotometer som er blankt med PBS. Multipliser spektrofotometerverdien med 10 (for å ta hensyn til fortynningen) for å bestemme OD600 for suspensjonen (OD-suspensjon).
    7. For å oppnå ønsket inokulumkonsentrasjon på 1 x 107 CFU i 50 μL, fortynn (eller konsentrat) UTI89kanR-suspensjonen ved hjelp av følgende ligning, der ønsketOD-inokulum er 0,35 (verdien kan variere for andre UPEC-stammer) og Y er volumet av inokulum som kreves (100 μL per mus for å tillate ekstra for å eliminere bobler og fylle katetrene):
      X ml x ODsuspensjon = Y ml x ODinoculum
      For eksempel, hvisOD-suspensjonsverdien er 4,7 og 5 ml inokulum kreves:
      X ml × 4,7 = 5 × 0,35
      X = (5 × 0,35) / 4,7
      X = 0,372 ml
      Tilsett derfor 372 μL bakteriesuspensjon for å lage 5 ml (sluttvolum)
    8. Bruk en flerkanals pipette til å lage 1:10 serielle fortynninger av inokulumet ut til 10-6 i steril PBS i en 96-brønns plate. Spot fem 10 μL replikasjoner av alle 6 fortynninger på en LB og LB + kan plate, la flekkene tørke, og ruge ved 37 ° C over natten. LB-platen uten antibiotika brukes til å sikre at inokulumet ikke ble forurenset av en annen organisme (som vil vises som en ekstra kolonimorfologi som ikke er tilstede på kan-antibiotika-seleksjonsplaten). Begge platetyper skal gi samme resultat.
      MERK: Plater bør tørke på benken i en dag før bruk, slik at de vil absorbere den belagte væsken uten flekker som samler seg.
    9. Tell totalt antall kolonier på alle steder i fortynningen med distinkte kolonier og bruk verdien til å beregne den faktiske inokulumdosen som ble brukt i hvert eksperiment. Ikke bare stole på OD600-verdiene .
  3. Inokulere UTI89kanR i blæren hos bedøvede hunnmus (dag 0)
    MERK: Videoopptak av denne prosedyren har blitt publisert tidligere44,46. Se disse artiklene for en grundigere beskrivelse. Se avsnitt 5 i denne protokollen for mer informasjon om musekateterisering.
    1. Bedøve mus med isofluraninhalasjon i henhold til IACUC-godkjente metoder.
    2. Mens du venter på at mus skal bli bedøvet, fyll tuberkulinsprøyten med UTI89kanR inoculum og fest deretter et forberedt kateter. Trykk inn stempelet for å tømme luft fra kateteret, og dab deretter kateteret i sterilt kirurgisk smøremiddel.
    3. Plasser musen på ryggen og bekreft bedøvelsen ved å klemme foten på musen og observere fraværet av refleks eller respons. Finn blæren (føles som en ert i underlivet) mellom pekefingrene på hver hånd. Uttrykk urin ved å bevege fingrene mot hverandre for å påføre et forsiktig klemmetrykk på blæren.
    4. Sett kateteret gjennom musens urinrør inn i blæren og lever sakte 50 μL inokulum.
    5. Vent noen sekunder, og fjern deretter kateteret forsiktig ved å trekke rett ut. Sett musen tilbake til buret og overvåk til den gjenoppretter fra anestesi.
    6. Gjenta trinn 1.3.1 - 1.3.5 med flere mus, bytt kateter mellom hvert bur (5 mus). Om ønskelig kan samme prosedyre brukes til å inokulere en kontrollgruppe av mus med PBS, for eksempel for å vise en annen stamme av G. vaginalis fremkaller rUTI (over spontan / bakgrunnsnivå).

2. Overvåking av clearance av UPEC-bakteriuri (dag 1 til 28)

MERK: Video av urininnsamlingsprosedyren er publisert tidligere44.

  1. Samle urin (minimum 10 μL) fra alle mus ved blærepalpasjon som beskrevet44 ved 1 d etter infeksjon og ukentlig for 4 wk (7, 14, 21 og 28 d etter infeksjon). Urin bør dyrkes innen få timer etter innsamling for å overvåke UPEC-infeksjon. Oppbevar urinen ved 4 °C til den er belagt. Urin kan også brukes til cytologi (se avsnitt 4). Av og til hvis blæren er svært betent, kan ikke 10 μL urin oppnås; I dette tilfellet kan PBS tilsettes opptil 10 μL, men urinbakterietiter og cytologiskår må justeres tilsvarende (f.eks. hvis bare 5 μL urin samles inn og 5 μL PBS tilsettes, multipliser titeres og score med 2).
  2. Med en flerkanals pipette, gjør 1:10 serielle fortynninger ut til 10-6 i steril PBS i en 96-brønns plate. Bruk en P10 flerkanalspipette til å oppdage 10 μL av alle 6 fortynninger fra kolonne 1 i vertikal retning på venstre kant av en LB-plate som inneholder den relevante antibiotikavalgmarkøren. Kast tips.
  3. Gjenta platingen med de resterende prøvene (kolonne 2, deretter kolonne 3, etc.). En enkelt plate har plass til 5 prøver side om side. Dette gir en plate med en 5 × 6-punktmatrise, med økende fortynninger fra topp til bunn og økende prøvetall fra venstre til høyre (figur 2A).
  4. La flekkene tørke på benken, og rug deretter på 37 °C over natten. Neste dag teller du antall kolonier på det minst fortynnede stedet der koloniene er forskjellige (figur 2B) og bruker dette tallet til å beregne CFU/ml:
    Antall kolonier i enkelt urinpunkt × fortynningsfaktor × 100 = CFU/ml urin
  5. Plot UTI89kanR urintitere ved hjelp av grafisk programvare (figur 2C). Identifiser mus som ikke har påviselig UTI89kanR i urin ved 28 d (~ 65-80% av C57BL / 6 mus). Disse musene har hvilende intracellulære reservoarer og brukes i den påfølgende eksperimentelle fasen for å undersøke induksjon av tilbakevendende UTI. De med bakterier i urinen ved 28 d er ikke inkludert i de påfølgende trinnene.

3. Blære eksponering for G. vaginalis

  1. Tilordne mus til eksponeringsgrupper (dag 29). Det primære målet med dette trinnet er å unngå å ha alle musene med mer langvarig bakteriuri sammen i samme eksponeringsgruppe, siden det er ukjent om dette påvirker sannsynligheten for rUTI.
    1. Ved hjelp av urin-CFU-dataene (figur 2D) kategoriserer musene basert på tidspunktet da UTI89kanR-bakteriuri ikke lenger var påviselig (figur 2E).
    2. Randomiser musene fra hver kategori i enten G. vaginalis - eller PBS-inokulasjonsgruppene; f.eks. halvparten av musene som ryddet før dag 7 får G. vaginalis og halvparten vil få PBS; halvparten av musene som ryddet mellom dag 8 og 14 vil få G. vaginalis og halvparten vil få PBS, etc. (som i figur 2E).
  2. Forbered G. vaginalis inoculum (alle trinn utføres i et anaerobt kammer)
    MERK: Ideelle kulturinkubasjonstider varierer mellom forskjellige stammer av G. vaginalis, med noen stammer som går inn i den stasjonære fasen og til og med begynner å dø raskere enn andre. Dette er spesielt viktig gitt at drept G. vaginalis (JCP8151B) ikke var i stand til å utløse rUTI39. Dermed bør inkubasjonstiden bestemmes empirisk for en gitt stamme før du utfører eksperimenter hos mus. Det er ukjent om andre/alle stammer av G. vaginalis vil utløse de samme effektene i denne modellen.
    1. Streak G. vaginalis stamme fra -80 ° C fryselager på en NYCIII plate (uten antibiotika). Inkuber plate ved 37 °C anaerobt i 24 timer.
    2. I det anaerobe kammeret inokulerer du 5 ml anaerobe NYCIII-medier med en 1 μL-sløyfe av celler (en enkelt koloni er utilstrekkelig) fra NYCIII-platen og inkuberer kulturen statisk ved 37 ° C under anaerobe forhold i 18 timer. Ikke ta med antibiotika i vekstmediet.
  3. Bestem OD600 av kulturen ved hjelp av et spektrofotometer.
    1. Sentrifuger et definert volum (X) kultur ved 9600 × g i 1 min og aspirer mediet. Beregn volumet (Y) av PBS for å suspendere pelleten på nytt for å oppnå ønsket inokulum OD for å oppnå 108 CFU i 50 μL ved hjelp av følgende ligning:
      X ml × ODkultur = Y ml × ODinoculum løse for Y
      Y = (X ml ×OD-kultur) / ODinokulum
      MERK:OD-inokulumet for JCP8151BSmR er 5, men dette må bestemmes empirisk for andre G. vaginalis-stammer . For eksempel, hvis spinning 3 ml av en JCP8151BSmR over natten flytende kultur med ODkultur = 2,0: Y = (3 ml × 2,0) / 5,0; resuspendert pellet i 1,2 ml PBS
    2. Resuspender bakteriepelleten i PBS til ønsket konsentrasjon. Serielt fortynne og plate inokulum (som beskrevet i CFU plating protokollen ovenfor) for å bestemme den faktiske inoculum dose som har blitt brukt i hvert eksperiment. Ikke bare stole på OD-verdiene.
  4. På dag 29-31 etter UPEC-inokulasjon inokulerer du bedøvede mus med G. vaginalis eller PBS som beskrevet i trinn 1.3 ovenfor. En PBS-kontrollgruppe er viktig, da kateterisering av blæren muligens kan indusere skade og urotelial eksfoliering som kan fremkalle en viss grad av UPEC-reservoarrekomst. PBS-inokulerte mus tjener derfor som kontrollen som G. vaginalis-inokulerte mus sammenlignes med.
    MERK: Den endelige UPEC-bakteriuribestemmelsen ved 28 d krever inkubering av CFU-platen over natten. Derfor er det tidligste dette trinnet kan utføres 29 dager etter den første UPEC-inokulasjonen. Om nødvendig kan eksponeringen gis så sent som på dag 31. Forskere bør være konsekvente mellom eksperimenter.
  5. Gjenta inokulumpreparatet for å administrere en andre G. vaginalis (eller PBS-kontroll) inokulasjon ved ønsket tidspunkt, for eksempel 12 timer eller 1 wk etter den første inokulasjonen. En annen eksponering er nødvendig fordi en enkelt inokulasjon med G. vaginalis ikke resulterer i signifikant UPEC-fremvekst39.

4. Overvåking av UPEC tilbakevendende UTI

  1. Samle urin fra mus ved ønskede tidspunkter etter hver G. vaginalis-inokulasjon (1, 2 og 3 d etter inokulasjon anbefales).
    1. Serielt fortynnet og plate urin på selektive plater (f.eks LB + kanamycin) for å bestemme UTI89kanR CFU / ml. Om ønskelig kan urinfortynninger også belagt på selektive plater (f.eks. NYCIII + 1 mg/ml streptomycin) for å bestemme G. vaginalis CFU/ml. Imidlertid ble G. vaginalis JCP8151BSmR fjernet fra urinen til de fleste mus med 12 t 39. Derfor vil tidligere tidspunkter være nødvendige for å oppdage G. vaginalis hos de fleste mus.
  2. Ved det eksperimentelle endepunktet (f.eks. 3 d etter den andre G. vaginalis-inokulasjonen) ofrer musene i henhold til godkjente metoder (f.eks. cervikal dislokasjon under isofluranbedøvelse eller CO 2-inhalasjon) og samler blærer og nyrer for CFU-opplisting, som beskrevet tidligere 44,46.

5. Urin cytologi

MERK: Denne prosedyren kan utføres når som helst hvor visualisering av celler og / eller bakterier som er tilstede i urinen er ønsket. Som angitt i figur 1, utføres urincytologi vanligvis ved 1 dpi (eller enda tidligere) under fase 1 for å undersøke akutt UPEC-infeksjon og i fase 3 for å vurdere tilstedeværelsen av polymorfonukleære (PMN) celler i urin som viser UPEC-fremvekst.

  1. Tilsett 10 μL urin til 90 μL PBS i en cytofunnelkassett med festet filter og skyv. (Den enkleste metoden er å bruke resten av 1:10-fortynningene fra 96-brønnsplaten som brukes til urindyrking; disse prøvene kan brukes opptil 24 timer etter urdyrking hvis de lagres ved 4 °C). Plasser kassetter i cyto-sentrifuge og spinn ved 600-800 x g i 6 min med høy akselerasjon.
  2. Fjern lysbilder og la tørke over natten. Neste dag, beis med et hematologifargesett (f.eks. Wrights, Giemsa, inkludert fikseringsmiddel) i henhold til produsentens protokoll.
  3. Analyser lysbildene ved lysmikroskopi for tilstedeværelse av PMN og epitelceller. Hvis ønskelig, kan disse skåres ved hjelp av en kvalitativ skåringsberegning basert på overfloden av hver celletype som er tilstede i hvert kraftige synsfelt (f.eks. 0 = ingen, 1 = få, 2 = moderat, 3 = robust). Sørg for at personen som analyserer lysbildene er blindet for eksperimentgruppene for å minimere potensiell skjevhet.

6. Imaging blærer ved skanning elektronmikroskopi

MERK: Denne prosedyren kan utføres når som helst hvor visualisering av urotelet er ønsket. Som angitt i figur 1 (lilla bokser), visualiseres UPEC-uroteliale interaksjoner best mellom 6 timer og 24 timer etter UPEC-inokulasjon under reservoardannelsesfasen, og urotelial eksfoliering utløst av G. vaginalis visualiseres best mellom 3 timer og 12 timer etter den andre G. vaginaliseksponeringen .

  1. In situ blærefiksering
    1. Forbered fiksering umiddelbart før blærehøsting ved å tilsette glutaraldehyd (2,5% endelig) og paraformaldehyd (2% endelig) i 0,15 M natriumkakedylatbuffer med 2 mM CaCl2 ved pH 7,4. Bruk paraformaldehyd og glutaraldehyd fra nyåpnede glassampuller, da begge fikseringsmidlene oksiderer over tid i åpnede beholdere.
      FORSIKTIG: Glutaraldehyd er giftig, åndedrettsirriterende og etsende; paraformaldehyd er brannfarlig, kreftfremkallende, irriterende og reproduktivt toksin; natriumkakodylat er giftig og kreftfremkallende.
    2. For å lage 50 ml fikseringsløsning, tilsett 6,25 ml 16% paraformaldehyd, 2 ml 50% glutaraldehyd og 16,75 ml ultrarent vann til 25 ml av en 0,3 M løsning av natriumkakodylat ved pH 7,4 med 4 mM CaCl2.
    3. Varm det tilberedte fikseringsmiddelet til 37 °C før administrering til blæren.
    4. Fyll tuberkulin glidespisssprøyte med fikseringsmiddel og fest et kateter til enden, skrå mot motsatte sprøytemarkeringer. Klipp av overflødig slange 1-2 mm fra enden av nålen, pass på at nålespissen ikke eksponeres. Knips sprøyten for å fjerne bobler og skyv stempelet for å tømme luft og fyll kateteret med fikseringsmiddel over et mikrosentrifugerør for å samle opp fikseringsmiddel for riktig avhending.
    5. Bedøve og ofre musen ved hjelp av en godkjent metode (f.eks. Cervikal dislokasjon under anestesi). Plasser musen på dissekeringsoverflaten med bena festet (med gummibånd eller pinner). Åpne bekkenområdet med tang og en kirurgisk saks for å eksponere blæren. Skyv forsiktig til side det tilstøtende fettet, men la blæren være på plass.
    6. Hold sprøyten med den dominerende hånden med nålen pekende nedover og kanylekanten og sprøytemerkene vendt bort fra deg. Dypp kateterspissen i sterilt smøremiddel.
    7. Plasser kateterspissen ved urinrørsåpningen, og hold sprøytesylinderen unna plassert i en vinkel på 30–45° over musekroppen.
    8. Påfør nedadgående trykk ved hjelp av en svært liten bevegelse med klokken med spissen og sett kateteret forsiktig inn i urinrøret. Når kateterspissen kommer inn i urinrøret, hengslet sprøyten mot musens hale mens du fortsetter å skyve kateteret lenger inn i urinrøret til sprøytesylinderen er parallell med arbeidsflaten. Hele kateternålakselen (ikke inkludert basen) skal komme inn i musen, og plassere kateterspissen i blærens lumen.
    9. Leverer sakte 50-80 μL fikseringsmiddel, noe som får blæren til å blåse opp som en ballong. Hold kateteret på plass og løft sprøyten litt, og vipp spissen opp.
    10. Med den andre hånden, åpne en hemostat og skyv en spiss under kateternålen i krysset mellom urinrøret. Lukk hemostat delvis til den bare kommer i kontakt med nålen.
    11. Skyv kateternålen forsiktig ut av blæren samtidig som du klemmer ned og låser hemostat helt for å forhindre tap av fikseringsmiddelet.
    12. Grip hemostat slik at den er parallell med arbeidsflaten med blæren hvilende på toppen. Løft opp forsiktig og forsiktig kuttet under hemostat (motsatt side av blæren) for å fjerne blæren med hemostat fortsatt festet.
    13. Plasser blæren og festet hemostat i et Falcon-rør som inneholder oppvarmet fikseringsmiddel. Sørg for at blæren er helt nedsenket i væsken og ikke presset mot rørets vegger. Rug ved 4 °C i 24 timer.
  2. Blærebehandling og avbildning med scanning elektronmikroskopi (SEM)
    1. Sagittalt bisect blæren med et renset, dobbeltsidig barberblad, og gjør et andre kutt tangentielt til hemostat for å frigjøre blæren. Dette resulterer i 2 halvblære "kopper". Hvis det finnes gjenværende fettputer på utsiden av blæren, fjern dem forsiktig.
    2. Skyll blærehalvdelene tre ganger (10 min hver) i natriumkakodylatbuffer (0,15 M, pH 7,4).
    3. Beis vevet med 1% osmiumtetroksid i 0,15 M kakodylatbuffer i 1 time ved romtemperatur. Osmium er følsomt for lys; Utfør derfor dette trinnet med fargebeholderen innpakket i folie for å opprettholde et mørkt miljø.
      FORSIKTIG: Osmiumtetroksid er giftig og etsende for huden. Gjør dette trinnet i avtrekkshetten med hansker.
    4. Skyll blæren halvdeler tre ganger (10 min hver) i ultrarent vann. Under disse trinnene kan osmicated olje en gang ses på overflaten av vannet. Aspirer eller vend dette av for å forhindre forurensning under tørketrinnene.
    5. Dehydrer vev ved å senke seg i en gradert etanolserie (50, 70, 90, 100 og 100%) i 10 minutter hver.
    6. Tørk det faste vevet ved hjelp av en kritisk punkttørker som utfører 12 CO2-utvekslinger med den laveste hastigheten. Still inn alle tilleggsinnstillinger til sakte, bortsett fra ventilasjonstrinnet som er satt til raskt.
    7. Bisect hver blærehalvdel igjen med en ren dobbeltsidig barberhøvel for å generere 4 totale stykker for å redusere krumningen av prøven for mer effektivt belegg, for enkel avbildning i SEM, og for å eksponere vev som kan ha krøllet seg under tørking.
    8. Fest blærebitene til en ledende karbonlimflik på en aluminiumsstubb og mal en liten mengde sølvlim rundt bunnkontakten med en tannpirker, og pass på at overflødig lim transporterer på blærens indre overflate.
    9. Bruk en høyvakuum sputter coater til sputter belegg prøvestubbene med 6 nm iridium. Hvis prøvene fortsetter å lade, må du sørge for at en ledende bane er malt til overflaten med sølvmaling og belegg med ytterligere 4 nm iridium.
    10. Bilde prøvene med en skanning elektronmikroskop. Selv om forholdene kan variere avhengig av mikroskopet som brukes, fungerte en akselerasjonsspenning på 3 KeV med en strålestrøm på 200 pA og en arbeidsavstand på 12-13 mm godt på en Zeiss Merlin FE-SEM ved bruk av Everhart-Thornley (SE2) elektrondetektor.

Representative Results

Etter inokulasjon kan UPEC-titere påvises i urin (figur 2B). Unnlatelse av å plate urinprøver på selektive medier som inneholder kanamycin, vil sannsynligvis føre til overvekst av endogen musemikrobiota som forurenser urinen. Nivået av UPEC-bakteriuri vil sannsynligvis være høyt på dag 1 og kan øke i løpet av den første uken før det avtar ved senere tidspunkter (figur 2C). Omtrent 65-80% av musene vil ikke ha noen påviselig UPEC i urinen med 28 dpi (figur 2C, grønn sirkel). Disse musene kan brukes i de påfølgende trinnene i modellen. Mus som forblir bakteriuriske (figur 2C, rød ellipse) bør elimineres fra forsøket.

To sekvensielle G. vaginaliseksponeringer gitt 12 timer (figur 3A) eller 1 wk fra hverandre (figur 3B) resulterer i fremveksten av UPEC fra intracellulære reservoarer for å forårsake tilbakevendende bakteriuri. Både nivået av UPEC-bakteriuri (Mann-Whitney-test) og fraksjonen av mus som viser UPEC rUTI (Fishers eksakte test) er signifikant høyere hos mus utsatt for G. vaginalis sammenlignet med PBS-kontrollgruppen. Urincytologianalyse påviser PMN i urin fra G. vaginalis-eksponerte mus som viste UPEC-fremvekst (figur 3C). I modellen med to eksponeringer gitt 1 wk fra hverandre, er UPEC-titere i blærevev lavere i G. vaginalis-eksponerte mus sammenlignet med PBS (figur 3D), antagelig på grunn av fremveksten av UPEC fra reservoarer og påfølgende clearance.

Visualisering av in situ-fast blærevev ved SEM avslører store overfladiske paraply urotelceller som fôrer blæreoverflaten i kontrollmus utsatt bare for PBS (figur 4A). Urotelial eksfoliering påvises ved tap av overfladiske paraplyceller, som avslører mindre underliggende overgangsepitelceller hos mus eksponert for G. vaginalis (figur 4B). Tidlig etter UPEC-inokulasjon under etablering av intracellulære reservoarer, er UPEC synlig på urotelet og filamentering ut av eksfolierende celler (figur 4C).

Figure 2
Figur 2. Overvåking av UPEC-titere i urin i fase 1 (reservoardannelse). (A) Skjematisk av kolonidannende enheter (CFU) plating. (B) Representativt bilde av UPEC-titere i urin på LB+kanamycin. Svarte sirkler indikerer urinprøveflekker som bør telles for å beregne CFU / ml. (C) Tidsforløp for UPEC-bakteriuri hos C57BL/6 mus. Hver linje representerer en individuell mus, som sporer UPEC-urintiterne over tid. Stiplet linje angir deteksjonsgrensen (1000 CFU/ml). Rød ellipse indikerer fire mus (av 20) som ikke klarte å løse UPEC-bakteriuri og derfor ikke ville bli brukt til G. vaginalis-indusert rUTI-modellen. Omvendt indikerer grønn sirkel mus som løste UPEC-bakteriuri og fortsatte til påfølgende faser. (D) Tabell over data som brukes til å generere graf i panel C. Gul, detekterbar CFU; grønn, ingen CFU. (E) Randomisering av mus til eksponeringsgrupper basert på tidspunktet da UPEC CFU ikke lenger ble påvist i urin ("Day resolved"). Musenumrene i venstre kolonne i panel D er de samme musenumrene som er gitt i panel E. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. G. vaginalis utløser UPEC rUTI. UPEC-titere i urin etter to sekvensielle urinveiseksponeringer for PBS (sirkler) eller G. vaginalis (Gvag; kvadrater) gitt 12 timer (A) eller 1 wk (B) fra hverandre. Hvert symbol representerer en individuell mus. Den høyeste CFU/ml UPEC som oppdages fra hver mus mellom 1-3 d etter den andre eksponeringen, plottes. Mus uten påviselig bakteriuri plottes ved deteksjonsgrensen (stiplet linje). (C) Urincytologianalyse som viser UPEC (pilspisser) og polymorfonukleære (PMN) celler (piler). Skala bar = 20 μm. (D) UPEC-titere i blærevev samlet 3 d etter to sekvensielle urinveiseksponeringer gitt 1 wk fra hverandre. Hvert symbol representerer en annen mus og nuller er plottet på grensen for deteksjon (stiplet linje). I A, B og D er boksene i første og tredje kvartil med median markert og værhår fra min til maks. Mann-Whitney U tester * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. SEM analyse av blærer fast in situ. Blærer ble samlet fra mus 3 timer etter to eksponeringer (12 timer fra hverandre) til PBS (A) eller G. vaginalis (C). Stiplede linjer illustrerer en enkelt urinepitelcelle, som er mindre i G. vaginalis-eksponerte blærer fordi de store overfladiske cellene har eksfoliert bort og avslørt det underliggende overgangsepitelet. (B) Blære samlet 6 timer etter første inokulasjon med UPEC, under fase 1 av modellen, som viser urotelial eksfoliering og ekstracellulær UPEC. (D) Eksempel på uoppløselige fettdråper tilstede på blæreoverflaten. Skalastengene er 20 μm i hovedbildene og 2 μm i innfellingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Det første kritiske trinnet i denne modellen for å identifisere mus som ikke har ryddet UPEC-bakteriuri under den primære UTI-fasen. Disse musene må fjernes fra forsøket, da de ellers ville forvirre frekvensen av UPEC-bakteriuri etter G. vaginalis-eksponering. Etter den første UPEC-inokulasjonen bør urin samles ukentlig for å overvåke bakteriell clearance. Omtrent 65-80% av C57BL/6 mus vil fjerne en UTI89kanR-infeksjon innen 4 uker. Andre innavlede musestammer har forskjellige tilbøyeligheter til UPEC-klaring42,43 og reservoardannelse og er derfor kanskje ikke egnet for denne modellen. Det andre kritiske punktet er at empiriske studier har fastslått at to sekvensielle inokulasjoner av G. vaginalis (enten 12 timer eller 1 wk fra hverandre) er nødvendige for å utløse betydelig reservoaroppkomst over bakgrunnen spontan fremvekst som oppstår i kontrollmus utsatt bare for PBS. Andre tidsperioder mellom de to sekvensielle eksponeringene er ikke testet, men kan gi lignende resultater. Det er viktig å merke seg at en reduksjon i UPEC blæretitere bare ble observert i modellen der G. vaginalis eksponeringer ble gitt 1 wk fra hverandre39. Mens mer enn to eksponeringer kan administreres, tyder empirisk bevis på at gjentatt kateterisering alene øker fremveksten, noe som kan forvirre tolkningen av resultatene eller kreve større antall dyr for å skille forskjeller mellom eksponeringsgrupper og kontroller. Til slutt har in situ blærefikseringsmetoden flere kritiske trinn. Noen ferdigheter er nødvendig for å sikre at fikseringsmiddelet forblir inne i de klemmede blærene. Deflaterte blærer vil være vanskeligere å avbilde med SEM. Det er også viktig å være veldig forsiktig når man inokulerer fikseringsmiddelet i blæren, da skraping av urotelet med det fikseringsholdige kateteret kan indusere urotelial eksfoliering uavhengig av hva som utløses av G. vaginalis. Alle konsentrasjoner nevnt i den fikserende cocktailen er endelige konsentrasjoner. Feil forhold mellom disse kan føre til utilstrekkelig fiksering og hevelse eller krymping av cellene. Fikseringsmidler bør varmes opp til fysiologiske temperaturer for å unngå temperatursjokk i celler og vev. Oppvarming gir også en liten forbedring av diffusjonshastigheten til fikseringsmidler gjennom plasmamembraner. Mens osmiumfarging ofte kan utelates for prøver utarbeidet for SEM-analyse, er det et viktig skritt i denne protokollen for å stabilisere lipider og forhindre sprekker i cellemembraner under kritisk punkttørking.

Denne protokollen kan modifiseres for å teste andre UPEC- og / eller G. vaginalis-stammer for deres evne til å danne reservoarer og utløse deres fremvekst, henholdsvis. Andre eksperimentelle faktorer kan også legges til, for eksempel eksponering for andre vaginale bakterier (f.eks. Lactobacillus crispatus PVAS100) eller varmedrept G. vaginalis, hvorav ingen viser patologi i denne modellen39. Ved valg av andre bakteriestammer som skal testes, er det viktig å påvise konsistent vekst slik at en standard inokulumkonsentrasjon kan brukes i alle forsøk. Veksten av JCP8151BSmR har blitt optimalisert i et anaerobt kammer. Denne stammen kan sannsynligvis dyrkes i et anaerobt GasPak-system, men dette vil kreve optimalisering for å sikre robust bakterievekst. Til slutt kan det være mulig å endre tidspunktet for visse trinn i modellen. For eksempel kan urin samles på tidligere tidspunkter under UPEC-reservoardannelsesfasen for å overvåke CFU eller vertsrespons. En negativ effekt av urinprøvetaking på tidlige tidspunkter (3, 6, 12 hpi) på infeksjonsprogresjon eller etablering av reservoarer er ikke observert i denne modellen. Fremveksten av UPEC-reservoarer er rapportert å oppstå etter to JCP8151BSmR-doser gitt 12 timer eller 1 wk, men andre tidsintervaller er ennå ikke testet. Det kan også være mulig å redusere den totale tiden for modellen ved å redusere UPEC-reservoardannelsesfasen til 2 uker (i stedet for 4 uker), siden mange av musene fjerner bakteriuri på dette tidspunktet. Tidligere studier som undersøkte UPEC-fremveksten etter blæreeksponering for kjemiske eksfolieringsmidler, brukte en 1 eller 2 wk UPEC reservoardannelsesfase17,18. Imidlertid kan redusert tid for UPEC-bakteriuriclearance komme på bekostning av å kreve at flere dyr skal kastes fra forsøket. Endelig kan SEM-analyse av blæren utføres ved flere tidspunkter for å observere varigheten av effekten av G. vaginalis på urotelet.

Når det gjelder feilsøking, er det noen viktige hensyn spesielt med hensyn til blæren SEM analyse. Avhengig av musebakgrunnen som brukes og mengden betennelse tilstede, vil noen blærer presentere med svært tynne vegger. Disse blærene har en tendens til å krølle seg mer under kritisk punkttørking og kan resultere i en cowrie skalllignende form. Hvis dette skjer, er den beste metoden å kutte den skallformede blæren i to langs det krøllede grensesnittet og deretter en gang til for å fjerne hoveddelen av det overhengende vevet. Skjæring fungerer best med et PTFE-belagt tveegget barberblad. Overflødig fett kan noen ganger oppløses under osmiumfargingstrinnene. Dette kan resultere i uønskede uoppløselige fettdråper som kanskje ikke vaskes av under skyllings- og dehydreringstrinnene, og som kan sette seg på blæreoverflaten under påfølgende tørking. Disse dråpene kan vises som enten små kuler eller skivelignende strukturer spredt over prøven (figur 4D). Dette kan reduseres ved å sikre at så mye fettvev fjernes fra rundt blæren som mulig. Platina kan erstattes med iridiumbelegg, men tykkelsen bør holdes på et minimum for å redusere maskeringen av fine strukturelle detaljer. Bruk av et roterende trinn under belegg anbefales på det sterkeste.

En begrensning ved denne modellen er at den krever et stort antall mus. Bare 65-80% av C57BL/6 mus vil fjerne upec bakteriuri og være egnet for påfølgende G. vaginalis eller PBS inokulasjon (se figur 2C). For å oppnå 10-12 mus per gruppe (G. vaginalis inokulasjon vs. PBS), bør ~ 30 mus i utgangspunktet infiseres med UPEC. Videre er det sannsynligvis nødvendig med flere eksperimenter for å oppnå de biologiske replikasjonene som er nødvendige for å oppdage statistisk signifikans. Når eksponeringer ble gitt 1 wk fra hverandre, oppstod UPEC hos 14% av musene utsatt for PBS (figur 3B). For å oppdage en signifikant økning i UPEC rUTI i G. vaginalis-eksponerte mus i forhold til PBS-kontroller (drevet ved 0,8; alfa = 0,05 [ensidig]) må man derfor teste en kumulativ total på minst 40 mus for hver eksponeringsgruppe. En ekstra vurdering er at disse eksperimentene er dyre og arbeidskrevende. Mus må overvåkes ukentlig for UPEC-clearance, og det eksperimentelle tidsforløpet er 4-5 wk, avhengig av om G. vaginalis gis to ganger i en tidsramme på 12 timer eller to ganger 1 wk fra hverandre. SEM er arbeidskrevende og kan være kostbart, avhengig av tilgjengeligheten av mikroskop og serviceavgifter. Å forberede hele blæren for SEM gir rikelig materiale for analyse, men ulempen er at det kan være tidkrevende å analysere hver blære. Dermed er det sannsynlig at bare et begrenset antall blærer kan analyseres med SEM sammenlignet med de høyere dyretallene som brukes til urin- og vevstitere. I tillegg krever det å skaffe høykvalitetsbilder av de buede overflatene til blærens "kopper" ferdigheter på grunn av skygger som kan hindre synlighet. Selv om blære SEM er et nyttig verktøy for å visualisere urotelial eksfoliering, er denne metoden i stor grad kvalitativ. Fordi prøven er festet i en rund form, og på grunn av bruk av glutaraldehyd i fiksativet, er det ikke mulig å screene for fluorescerende bakterier via lysmikroskopi. Immunostaining og kjemiske fargestoffer er uforenlige med denne prosessen på grunn av bruk av glutaraldehyd som vil kryssbinde de fleste antigener og osmium, og som vil maskere antigensteder og mørke vevet. Når det er sagt, er SEM-teknikken nyttig for parametere som kan evalueres kvantitativt uten bruk av ekstra sonder, for eksempel cellestørrelse 48,49.

Denne modellen gir flere fordeler utover tidligere beskrevne metoder. Det tillater undersøkelse av mekanismer for UPEC rUTI forårsaket av fremvekst fra blærereservoarer, i motsetning til gjeninnføring i blæren fra en ekstern kilde. Andre modeller av rUTI på grunn av fremvekst fra blærereservoarer bruker kjemiske midler (protaminsulfat eller kitosan) for å forårsake urotelial eksfoliering 17,18, som ikke ville være utløsere av rUTI hos kvinner. G. vaginalis er en utbredt urogenital bakterie som er påvist i urin hentet direkte fra blæren via kateterisering eller suprapubisk aspirasjon hos noen kvinner23,26. Dette faktum, kombinert med den kjente sammenhengen mellom BV (hvor G. vaginalis vokser i skjeden) og UTI, antyder at G. vaginalis er en klinisk plausibel utløser av rUTI. Til slutt bevarer in situ blærefikseringsmetoden blærens ultrastruktur og begrenser skade, slik at blærelagene ikke skiller seg fra hverandre. Tidligere metoder for å visualisere urotelet har tradisjonelt fått brukeren til å høste, skjære, strekke og feste blæren aseptisk på et disseksjonsbrett før han senker den strakte blæren ifikseringsmiddel 48. Denne metoden resulterer i en veldig flat prøve, men sikrer ikke jevn eller naturlig strekking av vevet og kan resultere i områder som er over og under strukket (noe som resulterer i svært rynket vev) og kan forårsake blærelagsseparasjon. I tillegg kan disse fysiske manipulasjonene av blæren for å strekke og pinne vevet forårsake skade, inkludert urotelial peeling. En annen metode er å senke intakte blærer i fikseringsmiddel før de legges inn i parafin og får tynne seksjoner med en mikrotom. Tynne seksjoner er uvurderlige for immunhistokjemieksperimenter for å undersøke bakterier og vertsproteinlokalisering, men en tynn seksjon tillater ikke visualisering av uroteloverflaten. Denne SEM-metoden gjør det mulig å undersøke overflaten av hele blæren samtidig.

Som beskrevet inkluderer fremtidige anvendelser av denne modellen testing av andre UPEC-stammer for å avgjøre om de danner intracellulære reservoarer og testing av andre G. vaginalis-stammer for å vurdere om de fremkaller eksfoliering og UPEC-fremvekst for å forårsake rUTI. Andre musestammer utover C57BL / 6 mus kan også testes, selv om mus med høy tilbøyelighet til å utvikle kronisk blærebetennelse (som mus på C3H-bakgrunn) ikke anbefales, siden for mange mus må kastes fra forsøket. En ekstra fordel med C57BL/6 mus er at mange genetiske knockoutstammer er kommersielt tilgjengelige. Slike stammer gir mulighet for å avhøre vertsfaktorene som er involvert i reservoardannelse og/eller fremvekst.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter knyttet til denne studien.

Acknowledgments

Forfatterne takker Lynne Foster for teknisk assistanse i infeksjonseksperimenter, James Fitzpatrick ved Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) for tilgang til SEM, Scott Hultgren for UTI89kanR UPEC-stammen og David Hunstad for kritisk lesing av manuskriptet.

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (Graduate Research Fellowship til VPO # DGE - 1143954), av Center for Women's Infectious Disease Research ved Washington University School of Medicine (Pilot Research Award til NMG), av American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) og #14POST20020011 (NMG), og av National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) og NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, prosjekt II PI:ALL) og K01 DK110225-01A1 (NMG). Noen av dyreforsøkene ble utført i et anlegg støttet av NCRR-tilskudd C06 RR015502. Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; hvor SEM ble utført) og MSJ ble støttet av Washington University School of Medicine, Children's Discovery Institute of Washington University og St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) og National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G x 1/2 needles BD 305106 for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat McKesson 487377 in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater Leica SEM sample processing
aluminum SEM stub Ted Pella 16111 SEM sample processing
Calcium chloride EMS 12340 in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab  Ted Pella 16084-1 SEM sample processing
Conductive silver paint Ted Pella 16034 SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier Leica SEM sample processing
Cytofunnel metal clip Simport M964B cytospun urinalysis
Ethanol EMS 15050 SEM sample processing
Glucose  Sigma G7528 for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde EMS 16320 in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit Fisher 23123869 cytospun urinalysis
HEPES Cellgro  25-060-Cl for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium Ted Pella 91120 SEM sample processing
isofluorane mouse anaesthesia
kanamycin Gibco 11815024 add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar BD DF0445174 UPEC growth plates
Luria-Bertani broth BD DF0446173 UPEC growth media
Merlin FE-SEM Zeiss scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 SEM sample processing
NaCl  Sigma S3014 for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope Olympus cytospun urinalysis
osmium tetroxide EMS 19170 SEM sample processing
paraformaldehyde EMS 15710 in situ bladder fixation
polyethylene tubing Intramedic 427401 for catheters
Proteose Peptone #3  Fisher  DF-122-17-4 for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade EMS 72000 cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300002 cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter Simport M965FWDV cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel Simport M964-1D cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated) Thermo Scientific 5991055 cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate EMS 12310 in situ bladder fixation
spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
streptomycin Gibco 11860038 add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe BD 309659 for catheters
Yeast Extract  Fisher DF0127-17-9 for NYCIII G. vaginalis growth media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1-13 (2014).
  2. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80 (3), 331-333 (1990).
  3. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, Suppl 1A 5-13 (2002).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Ikaheimo, R., et al. Recurrence of urinary tract infection in a primary care setting: analysis of a 1-year follow-up of 179 women. Clinical Infectious Diseases. 22 (1), 91-99 (1996).
  6. Russo, T. A., Stapleton, A., Wenderoth, S., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Chromosomal restriction fragment length polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent urinary tract infections in young women. Journal of Infectious Diseases. 172 (2), 440-445 (1995).
  7. Luo, Y., et al. Similarity and divergence of phylogenies, antimicrobial susceptibilities, and virulence factor profiles of Escherichia coli isolates causing recurrent urinary tract infections that persist or result from reinfection. Journal of Clinical Microbiology. 50 (12), 4002-4007 (2012).
  8. Schreiber, H. L. t, et al. Bacterial virulence phenotypes of Escherichia coli and host susceptibility determine risk for urinary tract infections. Science Translational Medicine. 9 (382), (2017).
  9. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), 329 (2007).
  10. Elliott, T. S., Reed, L., Slack, R. C., Bishop, M. C. Bacteriology and ultrastructure of the bladder in patients with urinary tract infections. Journal of Infection. 11 (3), 191-199 (1985).
  11. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  12. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  13. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. 431 (21), 4368-4379 (2019).
  14. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  15. Kerrn, M. B., Struve, C., Blom, J., Frimodt-Moller, N., Krogfelt, K. A. Intracellular persistence of Escherichia coli in urinary bladders from mecillinam-treated mice. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 383-386 (2005).
  16. Eto, D. S., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Actin-gated intracellular growth and resurgence of uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology. 8 (4), 704-717 (2006).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Blango, M. G., Ott, E. M., Erman, A., Veranic, P., Mulvey, M. A. Forced resurgence and targeting of intracellular uropathogenic Escherichia coli reservoirs. PLoS One. 9 (3), 93327 (2014).
  19. Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Covert pathogenesis: Transient exposures to microbes as triggers of disease. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007586 (2019).
  20. Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Roles of the vagina and the vaginal microbiota in urinary tract infection: evidence from clinical correlations and experimental models. GMS Infectious Diseases. 8, (2020).
  21. Janulaitiene, M., et al. Prevalence and distribution of Gardnerella vaginalis subgroups in women with and without bacterial vaginosis. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 394 (2017).
  22. Fredricks, D. N. Molecular methods to describe the spectrum and dynamics of the vaginal microbiota. Anaerobe. 17 (4), 191-195 (2011).
  23. Hilt, E. E., et al. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 52 (3), 871-876 (2014).
  24. Klein, S., et al. Significant increase in cultivation of Gardnerella vaginalis, Alloscardovia omnicolens, Actinotignum schaalii, and Actinomyces spp. in urine samples with total laboratory automation. European Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 37 (7), 1305-1311 (2018).
  25. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome in urgency urinary incontinence. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 341 (2015).
  26. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome: a comparison of women with and without urgency urinary incontinence. mBio. 5 (4), 01283 (2014).
  27. Gottschick, C., et al. The urinary microbiota of men and women and its changes in women during bacterial vaginosis and antibiotic treatment. Microbiome. 5 (1), 99 (2017).
  28. Malki, K., et al. Genomes of Gardnerella Strains Reveal an Abundance of Prophages within the Bladder Microbiome. PLoS One. 11 (11), 0166757 (2016).
  29. Kramer, H., et al. Diversity of the midstream urine microbiome in adults with chronic kidney disease. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1123-1130 (2018).
  30. Allsworth, J. E., Peipert, J. F. Prevalence of bacterial vaginosis: 2001-2004 National Health and Nutrition Examination Survey data. Obstetrics & Gynecology. 109 (1), 114-120 (2007).
  31. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4680-4687 (2011).
  32. Hillier, S. L. Diagnostic microbiology of bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 169 (2), Pt 2 455-459 (1993).
  33. Amatya, R., Bhattarai, S., Mandal, P. K., Tuladhar, H., Karki, B. M. Urinary tract infection in vaginitis: a condition often overlooked. Nepal Medical College Journal. 15 (1), 65-67 (2013).
  34. Harmanli, O. H., Cheng, G. Y., Nyirjesy, P., Chatwani, A., Gaughan, J. P. Urinary tract infections in women with bacterial vaginosis. Obstetrics & Gynecology. 95 (5), 710-712 (2000).
  35. Sharami, S. H., Afrakhteh, M., Shakiba, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology. 27 (3), 252-254 (2007).
  36. Hillebrand, L., Harmanli, O. H., Whiteman, V., Khandelwal, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 186 (5), 916-917 (2002).
  37. Sumati, A. H., Saritha, N. K. Association of urinary tract infection in women with bacterial vaginosis. Journal of Global Infectious Diseases. 1 (2), 151-152 (2009).
  38. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
  39. Gilbert, N. M., O'Brien, V. P., Lewis, A. L. Transient microbiota exposures activate dormant Escherichia coli infection in the bladder and drive severe outcomes of recurrent disease. PLoS Pathogens. 13 (3), 1006238 (2017).
  40. Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Uropathogenic Escherichia coli flagella aid in efficient urinary tract colonization. Infection and Immunity. 73 (11), 7657-7668 (2005).
  41. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  42. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001042 (2010).
  43. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and Immunity. 66 (6), 2798-2802 (1998).
  44. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), e52892 (2015).
  45. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A Murine Model for Escherichia coli Urinary Tract Infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 159-175 (2016).
  46. Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
  47. Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. Journal of Visualized Experiments. (42), e2070 (2010).
  48. O'Brien, V. P., et al. A mucosal imprint left by prior Escherichia coli bladder infection sensitizes to recurrent disease. Nature Microbiology. 2, 16196 (2016).
  49. O'Brien, V. P., Dorsey, D. A., Hannan, T. J., Hultgren, S. J. Host restriction of Escherichia coli recurrent urinary tract infection occurs in a bacterial strain-specific manner. PLoS Pathogens. 14 (12), 1007457 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 166 UTI tilbakevendende UVI latent infeksjon bakteriell vaginose transuretral kateter vagina urin anaerob blære nyre urinmikrobiota vaginal mikrobiota skanning elektronmikroskopi
Tilbakevendende <em>Escherichia coli </em>urinveisinfeksjon utløst av <em>Gardnerella vaginalis </em>Blære eksponering hos mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, … More

O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61967, doi:10.3791/61967 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter