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Immunology and Infection

चूहों में गार्डनेरेला योनि मूत्राशय एक्सपोजर द्वारा ट्रिगर आवर्तक एस्चेरिचिया कोलाई मूत्र पथ संक्रमण

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61967
Automatic Translation
1,2,6, 3,7, 1,2,4,8, 2,5
1Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Summary

आवर्तक यूपीईसी यूटीआई को प्रेरित करने के लिए अव्यक्त इंट्रासेल्युलर मूत्राशय जलाशयों और बाद में मूत्राशय के संपर्क में जी योनि के संपर्क को स्थापित करने के लिए यूरोपैथोजेनिक ई कोलाई (यूपीईसी) ट्रांसयूरेथ्रल टीकाकरण का एक माउस मॉडल प्रदर्शित किया जाता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को स्कैन करने के लिए बैक्टीरिया, मूत्र कोशिका विज्ञान और सीटू मूत्राशय निर्धारण और प्रसंस्करण की गणना भी प्रदर्शित की जाती है।

Abstract

यूरोपैथोजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई (यूपीईसी) के कारण आवर्तक मूत्र पथ के संक्रमण (आरयूटीआई) आम और महंगे हैं। नर और मादा चूहों में यूटीआई के मॉडल का वर्णन करने वाले पिछले लेखों ने मूत्र और ऊतकों में जीवाणु टीकाकरण और गणना के लिए प्रक्रियाओं को चित्रित किया है। 6 चूहों में प्रारंभिक मूत्राशय संक्रमण के दौरान, यूपीईसी मूत्राशय उपकला कोशिकाओं के अंदर अव्यक्त जलाशयों की स्थापना करता है जो यूपीईसी बैक्टीरिया की निकासी के बाद भी बने रहते हैं। यह मॉडल अव्यक्त मूत्राशय जलाशयों के भीतर से यूपीईसी के उद्भव के कारण आरयूटीआई की जांच करने के लिए इन अध्ययनों पर बनाता है। मूत्रजननांग जीवाणु गार्डनेरेला योनिलिस का उपयोग इस मॉडल में आरयूटीआई के ट्रिगर के रूप में किया जाता है क्योंकि यह अक्सर महिलाओं के मूत्रजननांग पथ में मौजूद होता है, खासकर योनि डिस्बिओसिस के संदर्भ में जो यूटीआई से जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, मूत्राशय के ऊतकों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) विश्लेषण को स्कैन करने के बाद सीटू मूत्राशय निर्धारण के लिए एक विधि का भी वर्णन किया गया है, मूत्राशय से जुड़े अन्य अध्ययनों के लिए संभावित अनुप्रयोग के साथ।

Introduction

मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) दुनिया भर में एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य देखभाल बोझ लगाते हैं, जो हर साल लाखों लोगों के जीवन की गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं, विशेष रूप से महिलाएं1. यूरोपैथोजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई (यूपीईसी) यूटीआई1 का सबसे लगातार कारण है। यूटीआई विकसित करने वाले कई रोगियों (लगभग 20-30%) कोप्रारंभिक संक्रमण की एंटीबायोटिक-मध्यस्थता निकासी के बावजूद 6 महीने के भीतर आवर्तक यूटीआई (आरयूटीआई) का अनुभव होगा। दुर्भाग्य से, प्रीमेनोपॉज़ल महिलाओं में से 5% हर साल 3 या अधिक आरयूटीआई से पीड़ितहोती हैं। आरयूटीआई के अनुक्रमिक एपिसोड इंडेक्स केस 5,6,7,8 से एक ही यूपीईसी तनाव की दृढ़ता के कारण हो सकते हैं। मानव नमूनों और माउस मॉडल के आंकड़ों से पता चलता है कि मूत्राशय में क्विसेंट जलाशयों के भीतर रहने वाले यूपीईसी के कारण समान तनाव आरयूटीआई हो सकता है। मनुष्यों में, यूटीआई 9,10,11,12,13 के रोगियों की उपकला कोशिकाओं और मूत्राशय बायोप्सी में यूपीईसी का पता चला था। सी 57 बीएल / 6 चूहों में अध्ययन से पता चला है कि यूपीईसी के कुछ उपभेद मूत्राशय में क्विसेंट इंट्रासेल्युलर जलाशयों को स्थापित कर सकते हैं, जैसा कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और मूत्राशय के ऊतकों के समरूपता और संस्कृति द्वारा पता लगाया गया है, जो बैक्टीरिया14,15,16 के संकल्प के बाद महीनों तक बनाए रखा जाता है। एजेंटों के साथ मूत्राशय का उपचार जो मूत्राशय उपकला (यूरोथेलियम) के छूटने को प्रेरित करता है, उदाहरण के लिए प्रोटामाइन सल्फेट17 या चिटोसन18, जलाशयों से यूपीईसी के उद्भव को ट्रिगर करता है ताकि आरयूटीआई का कारण बन सके। इन आंकड़ों से पता चलता है कि पूर्व संक्रमण से मूत्राशय यूपीईसी जलाशयों को आश्रय देने वाली महिलाओं में, मूत्राशय के संपर्क में आने से यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन आरयूटीआई ट्रिगर हो सकता है।

बढ़ते सबूत हैं कि योनि माइक्रोबायोटा मूत्र पथ के संक्रमण19,20 में योगदान देता है। गार्डनेरेला योनि योनि 21,22,23,24,25,26,27,28,29 दोनों का लगातार सदस्य है। योनि में, जी योनिलिस के उच्च स्तर की उपस्थिति एक माइक्रोबियल डिस्बिओसिस से जुड़ी होती है जिसे बैक्टीरियल वेजिनोसिस (बीवी) के रूप में जाना जाता है, जो ~ 30% महिलाओं 30,31,32 को प्रभावित करता है। लैक्टोबैसिलस33,34,35,36,37 के प्रभुत्व वाले योनि समुदाय वाली महिलाओं की तुलना में बीवी वाली महिलाओं को यूटीआई का अनुभव करने का अधिक खतरा होता है। माउस मॉडल में, जी योनि योनि 38 और मूत्राशय39 में उपकला छूटना का कारण बनता है। यूपीईसी मूत्राशय जलाशयों को आश्रय देने वाले सी 57 बीएल / 6 चूहों में, जी योनिलिस के लिए दो अनुक्रमिक मूत्राशय एक्सपोजर - लेकिन पीबीएस के लिए नहीं - यूपीईसी आरयूटीआई का कारण बनने के लिए जलाशयों से यूपीईसी के पुन: उद्भव के परिणामस्वरूप। उद्भव चूहों से मूत्र में यूपीईसी टाइटर्स की उपस्थिति से प्रमाणित होता है जो पहले यूपीईसी बैक्टीरिया को हल कर चुके थे और पीबीएस-उजागर नियंत्रण जानवरों39 की तुलना में बलिदान पर यूपीईसी मूत्राशय होमोजेनेट टाइटर्स में बाद में कमी आई थी। दिलचस्प बात यह है कि मूत्राशय में जी योनिलिस द्वारा स्थायी उपनिवेशण नहीं है। अधिकांश मामलों में, दो छोटे एक्सपोज़र, प्रत्येक मूत्र में व्यवहार्य जी योनिलिस के 12 (एच) से कम के साथ, यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन को प्राप्त करने और आरयूटीआई को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त हैं।

यह प्रोटोकॉल पुनरावृत्ति को ट्रिगर करने के लिए जी योनि मूत्राशय टीकाकरण का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर मूत्राशय जलाशयों में रहने वाले यूपीईसी के कारण आरयूटीआई के एक माउस मॉडल का वर्णन करता है। इस मॉडल द्वारा प्राप्त अग्रिम यह है कि जी योनिलिस पहले इस्तेमाल किए गए रासायनिक एजेंटों की तुलना में आरयूटीआई का नैदानिक रूप से प्रासंगिक जैविक ट्रिगर है। इसके अलावा, माउस मूत्र पथ में जी योनि का अपेक्षाकृत अल्पकालिक अस्तित्व यूरोथेलियम पर क्षणिक माइक्रोबियल एक्सपोजर के प्रभाव की परीक्षा की अनुमति देता है, जैसा कि यौन गतिविधि के बाद हो सकता है। आरयूटीआई मॉडल को रेखांकित करने के अलावा, यह प्रोटोकॉल मूत्र कोशिका विज्ञान और सीटू मूत्राशय निर्धारण और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) को स्कैन करके यूरोथेलियम के इमेजिंग के तरीकों का भी वर्णन करता है।

योनि-प्रेरित आवर्तक यूपीईसी यूटीआई का यह प्रोटोकॉल यूपीईसी तनाव यूटीआई 89 का उपयोग करता है जो एक कनामाइसिन प्रतिरोध कैसेट (यूटीआई 89केएनआर) 40 को प्रभावित करता है। परीक्षण किए गए यूपीईसी के सभी उपभेद चूहों41 में तीव्र संक्रमण चरण के दौरान इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया समुदायों को बनाने में सक्षम नहीं थे और यह अभी तक ज्ञात नहीं है कि यूपीईसी के सभी उपभेदों में अव्यक्त इंट्रासेल्युलर जलाशयों को बनाने की क्षमता है या नहीं। मॉडल में अन्य यूपीईसी उपभेदों के उपयोग से पहले जलाशय गठन की पुष्टि की जानी चाहिए। यह प्रोटोकॉल एक सहज स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी जी योनिलिस आइसोलेट, जेसीपी 8151 बीएसएमआर 38 का उपयोग करता है। जेसीपी 8151 बीएसएमआर द्वारा आरयूटीआई के प्रेरण के लिए दो अनुक्रमिक जी योनि टीकाकरण की आवश्यकता होती है, जो39 के अलावा 12 घंटे या 7 दिन (डी) दिए जाते हैं। योनि उपभेदों को एक्सफोलिएशन और / या यूपीईसी आरयूटीआई को प्रेरित करता है या नहीं, इस मॉडल के साथ निर्धारित किया जाना बाकी है। ज्ञात एंटीबायोटिक प्रतिरोध (जैसे यूपीईसी के लिए कनामाइसिन या स्पेक्टिनोमाइसिन और जी योनिलिस के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ यूपीईसी और जी योनि उपभेदों का उपयोग करना आवश्यक है क्योंकि एंटीबायोटिक दवाओं को अंतर्जात माउस माइक्रोबायोटा के विकास को रोकने के लिए अगर प्लेटों में जोड़ा जा सकता है जो अन्यथा संक्रमण की निगरानी के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गणना में हस्तक्षेप कर सकते हैं। यह मूत्र के नमूनों को संवर्धन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि माउस मूत्र में अक्सर अन्य बैक्टीरिया होते हैं जो एंटीबायोटिक दवाओं के बिना संस्कृति प्लेटों पर बढ़ सकते हैं। माउस मूत्र में इन अंतर्जात बैक्टीरिया की उत्पत्ति अज्ञात है, लेकिन संभवतः मूत्र संग्रह के दौरान उठाए गए पेरियूरेथ्रल और मूत्रजननांग बैक्टीरिया को दर्शाता है।

योनि एक संकाय अवायवीय जीवाणु है और इसलिए, यह प्रोटोकॉल एक अवायवीय कक्ष में बढ़ते जी योनिलिस जेसीपी 8151 बीएसएमआर का वर्णन करता है। यदि एक एनारोबिक कक्ष उपलब्ध नहीं है, तो अवायवीय विकास की स्थिति (जैसे कि एक एयरटाइट कंटेनर में गैसपैक पाउच) को बनाए रखने के लिए अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, जी योनिलिस (जेसीपी 8151 बीएसएमआर सहित) के कुछ उपभेद एक मानक ऊतक-संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ2) में बढ़ेंगे। जैसे ही जेसीपी 8151 बीएसएमआर के अलावा जी योनि उपभेदों का उपयोग करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण की आवश्यकता होती है कि बैक्टीरिया इस मॉडल में समान व्यवहार करते हैं, विकास की स्थिति को बदलने के लिए संस्कृति (प्लेटों पर और तरल में) और ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) 600 समकक्षों के लिए आदर्श अवधि के अनुभवजन्य निर्धारण की आवश्यकता होती है ताकि वांछित व्यवहार्य इनोकुलम सांद्रता प्राप्त की जा सके। इसके अलावा, यह ज्ञात नहीं है कि विकास की स्थिति जी योनि विज्ञान के रोग विज्ञान को प्रभावित करती है या नहीं।

अंत में, इस मॉडल का उपयोग करने पर विचार करते समय, शोधकर्ताओं को पता होना चाहिए कि इसे विशिष्ट यूटीआई माउस मॉडल की तुलना में प्रति समूह बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता हो सकती है। यह आंशिक रूप से है क्योंकि आरयूटीआई के प्रेरण के लिए आवश्यक है कि चूहे मूत्राशय के प्रारंभिक संक्रमण के कारण यूपीईसी बैक्टीरिया को हल करें। इस प्रकार, कोई भी माउस जो बैक्टीरिया को साफ करने में विफल रहता है (एक फेनोटाइप आमतौर पर चल रहे गुर्दे के संक्रमण का संकेत देता है) प्रोटोकॉल के आरयूटीआई चरण में शामिल नहीं है। इन अध्ययनों को शक्ति देने के लिए आवश्यक चूहों की संख्या मूत्र में "सहज" यूपीईसी उद्भव की दर (औसतन 12-14%) से भी प्रभावित होती है। अंत में, विभिन्न माउस उपभेदों में क्रोनिक बैक्टीरिया बनाम इंट्रासेल्युलर जलाशय गठन42,43 विकसित करने के लिए अलग-अलग प्रवृत्तियां हैं। यदि इस मॉडल में सी 57 बीएल / 6 के अलावा माउस उपभेदों का उपयोग करते हैं, तो यह पुष्टि की जानी चाहिए कि जानवर शांत यूपीईसी इंट्रासेल्युलर जलाशयों का विकास करते हैं।

Protocol

वाशिंगटन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) ने प्रोटोकॉल संख्या 20170081 के हिस्से के रूप में सभी माउस संक्रमण और प्रक्रियाओं को मंजूरी दी, जो 06/09/2020 और 20-0031 समाप्त हो गई, जो 03/18/2023 को समाप्त हो रही है। जानवरों की समग्र देखभाल राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद और यूएसडीए पशु देखभाल संसाधन गाइड से प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुरूप थी। इच्छामृत्यु प्रक्रियाएं जानवरों की इच्छामृत्यु के लिए एवीएमए दिशानिर्देशों के अनुरूप हैं: 2020 संस्करण।

Figure 1
चित्र 1. माउस मॉडल की योजनाबद्ध. प्रोटोकॉल में उल्लिखित मॉडल के चरणों या प्रक्रियाओं को प्रतिबिंबित करने के लिए समयरेखा पर प्रकाश डाला गया है। चरण 1 (नारंगी): इंट्रासेल्युलर यूपीईसी जलाशयों की स्थापना। चूहों को यूपीईसी के साथ ट्रांसयूरेथ्रेली टीका लगाया जाता है और मूत्र के नमूने एकत्र किए जाते हैं और बैक्टीरिया की निकासी के लिए निगरानी की जाती है। केवल बैक्टीरिया समाशोधन चूहे बाद के चरणों में आगे बढ़ते हैं। चरण 2 (हरा): मूत्राशय जी योनिलिस के संपर्क में। चूहों को दो बार जी योनिलिस के साथ ट्रांसयूरेथ्रेली टीका लगाया जाता है। वांछित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के आधार पर दो अनुक्रमिक एक्सपोज़र के बीच समय की अवधि या तो 12 घंटे (शीर्ष पैनल) या 1 सप्ताह (डब्ल्यूके; नीचे पैनल) है। चरण 3 (पीला): यूपीईसी आरयूटीआई। योनि के संपर्क में आने के बाद मूत्र दैनिक रूप से एकत्र किया जाता है और यूपीईसी बैक्टीरिया के लिए निगरानी की जाती है। इसके अतिरिक्त, मूत्राशय और गुर्दे को यूपीईसी ऊतक टाइटर्स को मापने के लिए प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर एकत्र किया जा सकता है। इंट्रासेल्युलर जलाशयों से यूपीईसी के जी योनि-प्रेरित उद्भव और मूत्र पथ से बाद की निकासी भी यूपीईसी मूत्राशय ऊतक टाइटर्स में कमी में परिलक्षित होती है (पीबीएस-उजागर चूहों की तुलना में, चित्रा 3 डी देखें)। मूत्राशय टाइटर्स में यह कमी 12 घंटे एक्सपोजर मॉडल में स्पष्ट नहीं थी, संभवतः क्योंकि ऊतक टाइटर्स को काफी कम करने के लिए पर्याप्त जलाशय उद्भव और निकासी के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती है। प्रक्रिया ए: मूत्र कोशिका विज्ञान आमतौर पर तीव्र यूपीईसी संक्रमण की जांच करने के लिए चरण 1 के दौरान और मूत्र पीएमएन सामग्री का आकलन करने के लिए चरण 3 के दौरान 1 डीपीआई (या उससे भी पहले) किया जाता है, जो यूपीईसी उद्भव से संबंधित है। अन्य समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए मूत्र के नमूनों का इसी तरह विश्लेषण किया जा सकता है। प्रक्रिया बी: मूत्राशय स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन की जांच करने के लिए आमतौर पर दूसरे जी योनि एक्सपोजर (समय 0 पर पहले एक्सपोजर को प्रशासित करने के बाद 15 घंटे) के बाद 3 घंटे में 12 घंटे मॉडल में किया जाता है। अन्य टाइमपॉइंट्स का भी आकलन किया जा सकता है, जैसे कि यूपीईसी टीकाकरण के बाद 6-24 घंटे जैसा कि चरण 1 में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1. चूहों में यूपीईसी शांत इंट्रासेल्युलर जलाशयों की स्थापना

  1. मूत्र कैथेटर तैयार करें (इस चरण के वीडियो के लिए 44,45,46,47 देखें)।
    1. सुई टिप से परे कई मिमी करने के लिए सुई आधार से फैली पीई 10 ट्यूबिंग की लंबाई के साथ थ्रेड 30 गेज सुइयों। सुई टिप के साथ ट्यूबिंग पंचर नहीं करने के लिए ध्यान रखें। वैकल्पिक रूप से, बाल चिकित्सा अंतःशिरा प्रवेशनी46 का उपयोग करें।
    2. एक पेट्री डिश में तैयार कैथेटर रखें और कम से कम 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ निष्फल करें। पेट्री डिश ढक्कन को बदलें और आवश्यकता होने तक भंडारण के लिए सुरक्षित करें।
  2. यूपीईसी इनोकुलम तैयार करें (दिन -3 से 0)
    1. दिन -3: एक लूरिया-बर्तानी (एलबी) अगर प्लेट पर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर स्टॉक से स्ट्रीक यूटीआई 89केएनआर । 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं।
      नोट: इनोकुलम ग्रोथ मीडिया में कनामाइसिन जोड़ना आवश्यक नहीं है क्योंकि कनामाइसिन प्रतिरोध यूटीआई 89केएनआर में स्थिर रूप से एकीकृत है।
    2. दिन -2: यूटीआई 89केएनआर की एक कॉलोनी के साथ एक बाँझ 125 एमएल फ्लास्क में एलबी शोरबा के 20 मिलीलीटर को टीका लगाएं। एक छोटे फ्लास्क का उपयोग न करें क्योंकि यह संस्कृति विधि यूपीईसी टाइप 1 पाइलस की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए महत्वपूर्ण है जो मूत्राशय आसंजन के लिए आवश्यक है।
    3. 18-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रूप से (मिलाते हुए बिना) सेते हैं। विकास माध्यम में एंटीबायोटिक्स न जोड़ें। तरल संस्कृतियों को शुरू करने के लिए केवल एलबी प्लेटों (18-24 घंटे पुरानी) पर ताजा कॉलोनियों का उपयोग करें।
    4. दिन -1: उपसंस्कृति यूटीआई 89केएनआर संस्कृति के 20 μL को हटाकर (धीरे-धीरे बसे हुए बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करने के लिए फ्लास्क घुमाएं) और बाँझ 125 एमएल फ्लास्क में ताजा एलबी शोरबा के 20 एमएल में जोड़कर। चरण 2 के रूप में सेते हैं, एक फर्म 18 घंटे की अवधि को छोड़कर। विकास माध्यम में एंटीबायोटिक्स न जोड़ें।
    5. दिन 0: पूरी संस्कृति को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और गोली बैक्टीरिया के लिए 10 मिनट के लिए टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 3200 × ग्राम पर स्पिन करें। एस्पिरेट सतह पर तैरनेवाला और पीबीएस के 10 मिलीलीटर में बैक्टीरिया गोली को फिर से निलंबित करें।
    6. एक क्युवेट में पीबीएस के चरण 4 से 900 μL तक केंद्रित जीवाणु निलंबन के 100 μL जोड़ें और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम (आयुध डिपो 600) पर ऑप्टिकल घनत्व निर्धारित करें जिसे पीबीएस के साथ खाली कर दिया गया है। निलंबन (आयुध डिपोनिलंबन) के आयुध डिपो 600 निर्धारित करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर मूल्य को10 (कमजोर पड़ने के लिए खाते में) से गुणा करें।
    7. 50 μL में 1 x 107 सीएफयू की वांछित इनोकुलम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके यूटीआई 89केएनआर निलंबन को पतला (या ध्यान केंद्रित करें), जिसमें वांछित ओडीइनोकुलम 0.35 है (मान अन्य यूपीईसी उपभेदों के लिए भिन्न हो सकता है) और वाई आवश्यक इनोकुलम की मात्रा है (बुलबुले को खत्म करने और कैथेटर भरने के लिए अतिरिक्त अनुमति देने के लिए प्रति माउस 100 μL):
      एक्स एमएल एक्स ओडीनिलंबन = वाई एमएल एक्स ओडीइनोकुलम
      उदाहरण के लिए, यदि ओडीनिलंबन मान 4.7 है और इनोकुलम के 5 एमएल की आवश्यकता होती है:
      एक्स एमएल × 4.7 = 5 × 0.35
      एक्स = (5 × 0.35) /
      एक्स = 0.372 एमएल
      इसलिए, 5 एमएल (अंतिम मात्रा) बनाने के लिए बैक्टीरिया निलंबन के 372 μL जोड़ें
    8. एक मल्टी चैनल विंदुक का प्रयोग करें एक 96 अच्छी तरह से थाली में बाँझ पीबीएस में 10-6 करने के लिए इनोकुलम के 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाने के लिए। एक एलबी और एलबी + कान प्लेट पर सभी 6 कमजोर पड़ने के पांच 10 μL प्रतिकृतियां स्पॉट करें, स्पॉट को सूखने दें, और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एंटीबायोटिक दवाओं के बिना एलबी प्लेट का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि इनोकुलम किसी अन्य जीव द्वारा दूषित नहीं था (जो एक अतिरिक्त कॉलोनी आकृति विज्ञान के रूप में दिखाई देगा जो कान एंटीबायोटिक चयन प्लेट पर मौजूद नहीं है)। दोनों प्लेट प्रकारों को एक ही परिणाम देना चाहिए।
      नोट: प्लेटों को उपयोग करने से पहले एक दिन के लिए बेंचटॉप पर सूखने की अनुमति दी जानी चाहिए ताकि वे स्पॉट के बिना मढ़वाया तरल को अवशोषित कर सकें।
    9. अलग-अलग कॉलोनियों के साथ कमजोर पड़ने के सभी धब्बों में कॉलोनियों की कुल संख्या की गणना करें और प्रत्येक प्रयोग में उपयोग की जाने वाली वास्तविक इनोकुलम खुराक की गणना करने के लिए मूल्य का उपयोग करें। केवल ओडी600 मानों पर भरोसा न करें।
  3. संवेदनाहारी मादा चूहों के मूत्राशय में यूटीआई 89केएनआर का टीकाकरण करें (दिन 0)
    नोट: इस प्रक्रिया की वीडियो रिकॉर्डिंग पहले44,46 प्रकाशित की गई है। अधिक गहन विवरण के लिए इन पत्रों को देखें। माउस कैथीटेराइजेशन पर अधिक जानकारी के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुभाग 5 देखें।
    1. आईएसीयूसी-अनुमोदित विधियों के अनुसार आइसोफ्लूरेन साँस लेना के साथ एनेस्थेटाइज़ चूहों।
    2. चूहों को संवेदनाहारी बनने की प्रतीक्षा करते समय, यूटीआई 89केएनआर इनोकुलम के साथ तपेदिक सिरिंज भरें और फिर एक तैयार कैथेटर चिपकाएं। कैथेटर से शून्य हवा के लिए सवार को दबाएं, फिर कैथेटर को बाँझ सर्जिकल स्नेहक में दबाएं।
    3. अपनी पीठ पर माउस की स्थिति और दृढ़ता से माउस फुटपैड निचोड़ और एक पलटा या प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति का अवलोकन करके संवेदनाहारी की पुष्टि। प्रत्येक हाथ की तर्जनी के बीच मूत्राशय (पेट के निचले हिस्से में मटर की तरह लगता है) का पता लगाएं। मूत्राशय पर कोमल निचोड़ने का दबाव लागू करने के लिए उंगलियों को एक दूसरे की ओर ले जाकर मूत्र व्यक्त करें।
    4. मूत्राशय में माउस मूत्रमार्ग के माध्यम से कैथेटर डालें और धीरे-धीरे इनोकुलम के 50 μL वितरित करें।
    5. कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें और फिर सीधे बाहर खींचकर कैथेटर को धीरे-धीरे हटा दें। माउस को अपने पिंजरे में लौटाएं और जब तक यह संज्ञाहरण से ठीक न हो जाए तब तक निगरानी करें।
    6. प्रत्येक पिंजरे (5 चूहों) के बीच कैथेटर बदलने, अतिरिक्त चूहों के साथ 1.3.1 - 1.3.5 चरणों को दोहराएं। यदि वांछित है, तो पीबीएस के साथ चूहों के एक नियंत्रण समूह को टीका लगाने के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए जी योनिलिस का एक और तनाव दिखाने के लिए आरयूटीआई (सहज /

2. यूपीईसी बैक्टीरिया की निगरानी निकासी (दिन 1 से 28)

नोट: मूत्र संग्रह प्रक्रिया का वीडियो पहले44 प्रकाशित किया गया है।

  1. मूत्राशय की धड़कन द्वारा सभी चूहों से मूत्र (न्यूनतम 10 μL) एकत्र करें जैसा कि 1 डी पोस्ट संक्रमण पर44 और 4 डब्ल्यूके (7, 14, 21 और 28 डी पोस्ट संक्रमण) के लिए साप्ताहिक वर्णित है। यूपीईसी संक्रमण की निगरानी के लिए संग्रह के कुछ घंटों के भीतर मूत्र को सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। मढ़वाया तक मूत्र को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। मूत्र का उपयोग साइटोलॉजी के लिए भी किया जा सकता है (धारा 4 देखें)। कभी-कभी यदि मूत्राशय बहुत सूजन है, तो मूत्र के 10 μL प्राप्त नहीं किया जा सकता है; इस मामले में पीबीएस को 10 μL तक जोड़ा जा सकता है, लेकिन मूत्र जीवाणु टिटर और साइटोलॉजी स्कोर को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, यदि केवल 5 μL मूत्र एकत्र किया जाता है और 5 μL पीबीएस जोड़ा जाता है, तो टाइटर्स और स्कोर को 2 से गुणा करें)।
  2. एक मल्टी-चैनल पिपेट के साथ, 96-अच्छी तरह से प्लेट में बाँझ पीबीएस में 10-6 तक 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाएं। प्रासंगिक एंटीबायोटिक चयन मार्कर युक्त एक एलबी प्लेट के बाएं किनारे पर एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में स्तंभ 1 से सभी 6 कमजोर पड़ने के 10 μL हाजिर करने के लिए एक P10 मल्टी चैनल विंदुक का प्रयोग करें। युक्तियों को त्यागें।
  3. शेष नमूनों (कॉलम 2, फिर कॉलम 3, आदि) के साथ चढ़ाना दोहराएं। एक एकल प्लेट 5 नमूनों को अगल-बगल समायोजित कर सकती है। यह ऊपर से नीचे तक कमजोर पड़ने और बाएं से दाएं (चित्रा 2 ए) तक नमूना संख्या में वृद्धि के साथ 5 × 6 स्पॉट मैट्रिक्स के साथ एक प्लेट का उत्पादन करता है।
  4. स्पॉट को बेंचटॉप पर सूखने दें, फिर रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। अगले दिन, कम से कम पतला स्थान में कॉलोनियों की संख्या की गणना करें जिसमें कॉलोनियां अलग हैं (चित्रा 2 बी) और सीएफयू / एमएल की गणना करने के लिए इस संख्या का उपयोग करें:
    # एकल मूत्र स्थान में कॉलोनियों का × कमजोर पड़ने का कारक × 100 = सीएफयू /
  5. ग्राफिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 2 सी) का उपयोग करके यूटीआई 89केएनआर मूत्र टाइटर्स प्लॉट करें। उन चूहों की पहचान करें जिनके पास 28 डी (~ 67 बीएल / 6 चूहों का ~ 65-80%) पर मूत्र में कोई पता लगाने योग्य यूटीआई 89केएनआर नहीं है। ये चूहे शांत इंट्रासेल्युलर जलाशयों को बंद कर देते हैं और आवर्तक यूटीआई के प्रेरण की जांच करने के लिए बाद के प्रयोगात्मक चरण में उपयोग किए जाते हैं। 28 डी पर मूत्र में बैक्टीरिया वाले लोगों को बाद के चरणों में शामिल नहीं किया जाता है।

3. मूत्राशय जी योनि के संपर्क में

  1. एक्सपोजर समूहों (दिन 29) के लिए चूहों को असाइन करें। इस कदम का प्राथमिक लक्ष्य एक ही एक्सपोजर समूह में अधिक लंबे समय तक बैक्टीरिया वाले सभी चूहों को एक साथ रखने से बचना है, क्योंकि यह अज्ञात है कि क्या यह आरयूटीआई की संभावना को प्रभावित करता है।
    1. मूत्र सीएफयू डेटा (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके, उस समय बिंदु के आधार पर चूहों को वर्गीकृत करें जिस पर यूटीआई 8 9केएनआर बैक्टीरिया अब पता लगाने योग्य नहीं था (चित्रा 2 ई)।
    2. प्रत्येक श्रेणी से चूहों को या तो जी योनि या पीबीएस टीकाकरण समूहों में यादृच्छिक करें; उदाहरण के लिए, आधे चूहों जो दिन 7 से पहले साफ हो गए थे, उन्हें जी योनि और आधे को पीबीएस मिलेगा; 8 और 14 दिनों के बीच साफ करने वाले आधे चूहों को जी योनि और आधे को पीबीएस, आदि मिलेगा (जैसा कि चित्रा 2 ई में है)।
  2. जी योनि इनोकुलम तैयार करें (एक अवायवीय कक्ष में किए गए सभी चरण)
    नोट: आदर्श संस्कृति इनक्यूबेशन बार जी योनि के विभिन्न उपभेदों के बीच भिन्न होती है, कुछ उपभेदों के स्थिर चरण में प्रवेश करते हैं और यहां तक कि दूसरों की तुलना में अधिक तेज़ी से मरने लगते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि मारे गए जी योनिलिस (जेसीपी 8151 बी) आरयूटीआई39 को ट्रिगर करने में असमर्थ था। इस प्रकार, चूहों में प्रयोग करने से पहले किसी दिए गए तनाव के लिए इनक्यूबेशन समय अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। यह अज्ञात है कि क्या जी योनि के अन्य / सभी उपभेद इस मॉडल में समान प्रभाव को ट्रिगर करेंगे।
    1. योनि एक NYCIII प्लेट (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) पर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर स्टॉक से तनाव। 24 घंटे के लिए अवायवीय रूप से 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं।
    2. एनारोबिक चैंबर में, एनवाईसीआईआईआई प्लेट से कोशिकाओं के 1 μL लूपफुल (एक एकल कॉलोनी अपर्याप्त है) के साथ एनारोबिक एनवाईसीआईआईआई मीडिया के 5 एमएल को टीका लगाएं और 18 घंटे के लिए एनारोबिक स्थितियों के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रूप से संस्कृति सेते हैं। विकास माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं को शामिल न करें।
  3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संस्कृति केआयुध डिपो 600 का निर्धारण करें।
    1. 1 मिनट के लिए 9600 × ग्राम पर संस्कृति की एक परिभाषित मात्रा (एक्स) अपकेंद्रित्र और मीडिया की आकांक्षा। निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके 50 μL में 108 सीएफयू प्राप्त करने के लिए वांछित इनोकुलम ओडी को प्राप्त करने के लिए गोली को फिर से निलंबित करने के लिए पीबीएस की मात्रा (वाई) की गणना करें:
      एक्स एमएल × ओडीसंस्कृति = वाई एमएल × वाई के लिए ओडीइनोकुलम हल
      वाई = (एक्स मिलीलीटर× ओडी संस्कृति) /
      नोट: जेसीपी 8151 बीएसएमआर के लिए ओडीइनोकुलम 5 है लेकिन इसे अन्य जी योनि उपभेदों के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि ओडी संस्कृति = 2.0 के साथ जेसीपी 8151 बीएसएमआर रातोंरात तरलसंस्कृति के 3 एमएल कताई करते हैं: वाई = (3 एमएल × 2.0) / इसलिए 1.2 एमएल पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें
    2. वांछित एकाग्रता के लिए पीबीएस में जीवाणु गोली को फिर से निलंबित करें। क्रमिक रूप से पतला और प्लेट इनोकुलम (जैसा कि ऊपर सीएफयू चढ़ाना प्रोटोकॉल में वर्णित है) प्रत्येक प्रयोग में उपयोग की जाने वाली वास्तविक इनोकुलम खुराक निर्धारित करने के लिए। केवल ओडी मूल्यों पर भरोसा न करें।
  4. यूपीईसी टीकाकरण के बाद दिन 29-31 पर, जी योनि या पीबीएस के साथ संवेदनाहारी चूहों को टीका लगाएं जैसा कि ऊपर चरण 1.3 में वर्णित है। एक पीबीएस नियंत्रण समूह आवश्यक है, क्योंकि मूत्राशय को कैथीटेराइज करने का कार्य संभवतः क्षति और यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन को प्रेरित कर सकता है जो कुछ हद तक यूपीईसी जलाशय पुनरुत्थान प्राप्त कर सकता है। पीबीएस-टीका लगाए गए चूहे इसलिए नियंत्रण के रूप में काम करते हैं जिससे जी योनि-टीका लगाए गए चूहों की तुलना की जाती है।
    नोट: 28 डी पर अंतिम यूपीईसी बैक्टीरिया निर्धारण के लिए सीएफयू प्लेट के रात भर इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है। इसलिए, सबसे पहले यह कदम प्रारंभिक यूपीईसी टीकाकरण के 29 दिन बाद किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, तो एक्सपोजर 31 दिन के रूप में देर से दिया जा सकता है। शोधकर्ताओं को प्रयोगों के बीच सुसंगत होना चाहिए।
  5. वांछित समय बिंदु पर एक दूसरे जी योनि ( या पीबीएस नियंत्रण) टीकाकरण को प्रशासित करने के लिए इनोकुलम तैयारी को दोहराएं, जैसे कि पहले टीकाकरण के बाद 12 घंटे या 1 डब्ल्यूके। एक दूसरा एक्सपोजर आवश्यक है क्योंकि जी योनि के साथ एक एकल टीकाकरण के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण यूपीईसी उद्भव39 नहीं होता है।

4. यूपीईसी आवर्तक यूटीआई की निगरानी

  1. प्रत्येक जी योनि टीकाकरण के बाद वांछित समय बिंदुओं पर चूहों से मूत्र इकट्ठा करें (1, 2, और 3 डी पोस्ट-टीकाकरण की सिफारिश की गई)।
    1. एमएल निर्धारित करने के लिए चयनात्मक प्लेटों (जैसे, एलबी + केनामाइसिन) पर क्रमिक रूप से पतला और प्लेट मूत्र। यदि वांछित है, तो मूत्र कमजोर पड़ने को चयनात्मक प्लेटों (जैसे, एनवाईसीआईआईआई + 1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) पर भी चढ़ाया जा सकता है ताकि जी योनि सीएफयू / हालांकि, जी योनिलिस जेसीपी 8151 बीएसएमआर को अधिकांश चूहों के मूत्र से 12 घंटे 39 तक साफ कर दिया गया था। इसलिए, अधिकांश चूहों में जी योनि का पता लगाने के लिए पहले के टाइमपॉइंट आवश्यक होंगे।
  2. प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर (उदाहरण के लिए, दूसरे जी योनि टीकाकरण के बाद 3 डी), अनुमोदित तरीकों के अनुसार चूहों का बलिदान करें (उदाहरण के लिए, आइसोफ्लूरेन संज्ञाहरण या सीओ2 साँस लेना के तहत ग्रीवा अव्यवस्था) और सीएफयू गणना के लिए मूत्राशय और गुर्दे इकट्ठा करें, जैसा कि पहले 44,46 वर्णित है।

5. मूत्र कोशिका विज्ञान

नोट: यह प्रक्रिया किसी भी समय की जा सकती है जिस पर मूत्र में मौजूद कोशिकाओं और / या बैक्टीरिया का दृश्य वांछित है। जैसा कि चित्रा 1 में संकेत दिया गया है, मूत्र कोशिका विज्ञान आमतौर पर तीव्र यूपीईसी संक्रमण की जांच करने के लिए चरण 1 के दौरान 1 डीपीआई (या उससे भी पहले) पर किया जाता है और चरण 3 के दौरान मूत्र में पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर (पीएमएन) कोशिकाओं की उपस्थिति का आकलन करने के लिए जो यूपीईसी उद्भव प्रदर्शित करते हैं।

  1. संलग्न फिल्टर और स्लाइड के साथ एक साइटोफुन्ल कैसेट में पीबीएस के 90 μL में मूत्र के 10 μL जोड़ें। (सबसे सरल तरीका मूत्र संवर्धन के लिए उपयोग की जाने वाली 96-अच्छी तरह से प्लेट से शेष 1: 10 कमजोर पड़ने का उपयोग करना है; इन नमूनों का उपयोग मूत्र संवर्धन के बाद 24 घंटे तक किया जा सकता है यदि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है)। उच्च त्वरण के साथ 6 मिनट के लिए साइटो-अपकेंद्रित्र और 600-800 एक्स जी पर स्पिन में कैसेट रखें।
  2. स्लाइड निकालें और रात भर सूखने दें। अगले दिन, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक हेमेटोलॉजी धुंधला किट (जैसे, राइट, गीमसा, फिक्सेटिव सहित) के साथ दाग।
  3. पीएमएन और उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा स्लाइड का विश्लेषण करें। यदि वांछित है, तो इन्हें देखने के प्रत्येक उच्च शक्ति वाले क्षेत्र में मौजूद प्रत्येक सेल प्रकार की प्रचुरता के आधार पर गुणात्मक स्कोरिंग मीट्रिक का उपयोग करके स्कोर किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 0 = कोई नहीं, 1 = कुछ, 2 = मध्यम, 3 = मजबूत)। सुनिश्चित करें कि स्लाइड का विश्लेषण करने वाला व्यक्ति संभावित पूर्वाग्रह को कम करने के लिए प्रयोगात्मक समूहों के लिए अंधा है।

6. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा इमेजिंग मूत्राशय

नोट: यह प्रक्रिया किसी भी समय की जा सकती है जिस पर यूरोथेलियम का दृश्य वांछित है। जैसा कि चित्रा 1 (बैंगनी बक्से) में दर्शाया गया है, जलाशय गठन चरण के दौरान यूपीईसी टीकाकरण के बाद 6 घंटे और 24 घंटे के बीच यूपीईसी-यूरोथेलियल इंटरैक्शन की सबसे अच्छी कल्पना की जाती है, और जी योनि द्वारा ट्रिगर किए गए यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन को दूसरे जी योनि जोखिम के बाद 3 घंटे और 12 घंटे के बीच सबसे अच्छा कल्पना की जाती है।

  1. सीटू मूत्राशय निर्धारण में
    1. पीएच 7.4 पर सीएसीएल 2 के 2 एमएम के साथ 0.15 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर में ग्लूटाराल्डिहाइड (2.5% अंतिम) और पैराफॉर्मलडिहाइड (2 % अंतिम) जोड़कर मूत्राशय की फसल से तुरंत पहले फिक्सेटिव तैयार करें। नए खुले ग्लास एम्प्यूल्स से पैराफॉर्मलाडेहाइड और ग्लूटाराल्डिहाइड का उपयोग करें, क्योंकि दोनों फिक्सेटिव खुले कंटेनरों में समय के साथ ऑक्सीकरण करते हैं।
      सावधानी: ग्लूटाराल्डिहाइड विषाक्त, एक श्वसन अड़चन और संक्षारक है; पैराफॉर्मलडिहाइड ज्वलनशील, कार्सिनोजेनिक, एक अड़चन और एक प्रजनन विष है; सोडियम कैकोडाइलेट विषाक्त और कार्सिनोजेनिक है।
    2. 50 मिलीलीटर फिक्सेटिव समाधान बनाने के लिए, 16% पैराफॉर्मलाडेहाइड के 6.25 एमएल, 50% ग्लूटाराल्डेहाइड के 2 एमएल, और 16.75 एमएल अल्ट्राप्योर पानी को 4 एमएम सीएसीएल 2 के साथ पीएच 7.4 पर पीएच 7.4 पर सोडियम कैकोडाइलेट के 0.3 एम समाधान के25 एमएल में जोड़ें।
    3. मूत्राशय को प्रशासित करने से पहले तैयार फिक्सेटिव को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    4. फिक्सेटिव के साथ ट्यूबरकुलिन स्लिप-टिप सिरिंज भरें और अंत में एक कैथेटर चिपकाएं, बेवल विपरीत सिरिंज चिह्नों का सामना करना पड़ रहा है। सुई के अंत से अतिरिक्त टयूबिंग 1-2 मिमी को स्निप करें, ध्यान रखें कि सुई टिप को उजागर न करें। बुलबुले को हटाने के लिए सिरिंज झटका और प्लंजर को शून्य हवा में धक्का दें और उचित निपटान के लिए किसी भी फिक्सेटिव को इकट्ठा करने के लिए एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब पर फिक्सेटिव के साथ कैथेटर भरें।
    5. एक अनुमोदित विधि (जैसे, संज्ञाहरण के तहत ग्रीवा अव्यवस्था) का उपयोग करके माउस को संवेदनाहारी और बलिदान करें। (रबर बैंड या पिन के साथ) सुरक्षित पैरों के साथ विदारक सतह पर माउस रखें। मूत्राशय को बेनकाब करने के लिए संदंश और सर्जिकल कैंची की एक जोड़ी के साथ माउस श्रोणि क्षेत्र खोलें। ध्यान से आसन्न वसा को एक तरफ धक्का दें लेकिन मूत्राशय को जगह में छोड़ दें।
    6. नीचे की ओर इशारा करते हुए सुई के साथ प्रमुख हाथ से सिरिंज पकड़ो और सुई बेवल और सिरिंज के निशान आपसे दूर का सामना करना पड़ रहा है। बाँझ स्नेहक में कैथेटर टिप डुबकी।
    7. मूत्रमार्ग खोलने पर कैथेटर टिप की स्थिति, सिरिंज बैरल दूर माउस शरीर पर एक 30-45 ° कोण पर तैनात पकड़े।
    8. टिप के साथ एक बहुत छोटी दक्षिणावर्त गति का उपयोग करके नीचे की ओर दबाव लागू करें और धीरे-धीरे मूत्रमार्ग में कैथेटर डालें। जैसा कि कैथेटर टिप मूत्रमार्ग में प्रवेश करती है, सिरिंज को माउस की पूंछ की ओर घुमाएं, जबकि सिरिंज बैरल काम करने की सतह के समानांतर होने तक कैथेटर को मूत्रमार्ग में आगे स्लाइड करना जारी रखें। पूरे कैथेटर सुई शाफ्ट (आधार सहित नहीं) मूत्राशय लुमेन के भीतर कैथेटर टिप की स्थिति, माउस में प्रवेश करना चाहिए।
    9. धीरे-धीरे 50-80 μL फिक्सेटिव वितरित करें, जिससे मूत्राशय गुब्बारे की तरह फुलाए। कैथेटर को जगह में रखें और सिरिंज को थोड़ा ऊपर उठाएं, टिप को झुकाएं।
    10. दूसरे हाथ से, एक हेमोस्टैट खोलें और मूत्रमार्ग के चौराहे पर कैथेटर सुई के नीचे एक शूल स्लाइड करें। आंशिक रूप से हेमोस्टैट को बंद करें जब तक कि यह सुई के साथ संपर्क न करे।
    11. धीरे-धीरे कैथेटर सुई को मूत्राशय से बाहर स्लाइड करें, जबकि एक साथ नीचे क्लैंपिंग करें और फिक्सेटिव के नुकसान को रोकने के लिए हेमोस्टैट को पूरी तरह से लॉक करें।
    12. हेमोस्टैट को पकड़ें ताकि यह शीर्ष पर आराम करने वाले मूत्राशय के साथ काम की सतह के समानांतर हो। हेमोस्टैट के साथ मूत्राशय को हटाने के लिए हेमोस्टैट (मूत्राशय के विपरीत पक्ष) के नीचे धीरे-धीरे और सावधानीपूर्वक काटें।
    13. मूत्राशय और संलग्न हेमोस्टैट को एक फाल्कन ट्यूब में रखें जिसमें गर्म फिक्सेटिव होता है। सुनिश्चित करें कि मूत्राशय पूरी तरह से तरल पदार्थ में डूबा हुआ है और ट्यूब की दीवारों के खिलाफ दबाया नहीं गया है। 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) के साथ मूत्राशय प्रसंस्करण और इमेजिंग
    1. धनु रूप से मूत्राशय को एक साफ, डबल-पक्षीय रेजर ब्लेड के साथ विभाजित करें, और मूत्राशय को छोड़ने के लिए हेमोस्टैट के लिए एक दूसरा कट स्पर्शरेखा बनाएं। इसके परिणामस्वरूप 2 अर्ध-मूत्राशय "कप" होते हैं। यदि मूत्राशय के बाहरी हिस्से पर कोई शेष वसा पैड मौजूद है, तो धीरे-धीरे उन्हें हटा दें।
    2. सोडियम कैकोडाइलेट बफर (0.15 एम, पीएच 7.4) में मूत्राशय के हिस्सों को तीन बार (10 मिनट प्रत्येक) कुल्लाएं।
    3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.15 एम कैकोडाइलेट बफर में 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड के साथ ऊतक को दाग दें। ऑस्मियम प्रकाश के प्रति संवेदनशील है; इसलिए, अंधेरे वातावरण को बनाए रखने के लिए पन्नी में लिपटे धुंधला पोत के साथ इस चरण को करें।
      चेतावनी: ऑस्मियम टेट्रोक्साइड त्वचा के लिए विषाक्त और संक्षारक है। दस्ताने के साथ धूआं हुड में इस कदम को करें।
    4. मूत्राशय के हिस्सों को अल्ट्राप्योर पानी में तीन बार (10 मिनट प्रत्येक) कुल्ला। इन चरणों के दौरान, ऑस्मिकेटेड तेल कभी-कभी पानी की सतह पर देखा जा सकता है। सुखाने के चरणों के दौरान संदूषण को रोकने के लिए एस्पिरेट या बाती इसे बंद करें।
    5. प्रत्येक 10 मिनट के लिए एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला (50, 70, 90, 100, और 100%) में डूबकर ऊतकों को निर्जलित करें।
    6. सबसे धीमी गति से 12 सीओ2 एक्सचेंजों का प्रदर्शन करने वाले महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर का उपयोग करके निश्चित ऊतक को सुखाएं। सभी अतिरिक्त सेटिंग्स को धीमा करने के लिए सेट करें, वेंटिंग चरण को छोड़कर जो तेजी से सेट है।
    7. एसईएम में इमेजिंग में आसानी के लिए, और सुखाने के दौरान कर्ल किए गए ऊतक को उजागर करने के लिए, अधिक कुशल कोटिंग के लिए नमूने की वक्रता को कम करने के लिए 4 कुल टुकड़े उत्पन्न करने के लिए एक साफ डबल-पक्षीय रेजर के साथ प्रत्येक मूत्राशय को आधा फिर से विभाजित करें।
    8. मूत्राशय के टुकड़ों को एल्यूमीनियम स्टब पर एक प्रवाहकीय कार्बन चिपकने वाला टैब का पालन करें और टूथपिक के साथ नीचे संपर्क के चारों ओर चांदी चिपकने वाला की एक छोटी मात्रा पेंट करें, मूत्राशय की आंतरिक सतह पर अतिरिक्त चिपकने वाले को रोकने के लिए ध्यान रखें।
    9. इरिडियम के 6 एनएम के साथ नमूना स्टब्स को स्पटर कोट करने के लिए एक उच्च वैक्यूम स्पटर कोटर का उपयोग करें। यदि नमूने चार्ज करना जारी रखते हैं, तो सुनिश्चित करें कि एक प्रवाहकीय पथ इरिडियम के अतिरिक्त 4 एनएम के साथ चांदी के पेंट और कोट के साथ सतह पर चित्रित किया गया है।
    10. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ नमूनों की छवि। जबकि उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप के आधार पर स्थितियां भिन्न हो सकती हैं, एवरहार्ट-थॉर्नले (एसई 2) इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करते समय 200 पीए के बीम करंट और 12-13 मिमी की कामकाजी दूरी के साथ 3 केवी का एक त्वरित वोल्टेज ज़ीस मर्लिन एफई-एसईएम पर अच्छी तरह से काम करता है।

Representative Results

टीकाकरण के बाद, यूपीईसी टाइटर्स मूत्र (चित्रा 2 बी) में पता लगाने योग्य हैं। कनामाइसिन युक्त चयनात्मक मीडिया पर मूत्र के नमूनों को प्लेट करने में विफलता के परिणामस्वरूप अंतर्जात माउस माइक्रोबायोटा मूत्र को दूषित करने की संभावना होगी। यूपीईसी बैक्टीरिया का स्तर संभवतः दिन 1 पर उच्च होगा और बाद के समय बिंदुओं (चित्रा 2 सी) पर घटने से पहले पहले सप्ताह के दौरान बढ़ सकता है। चूहों के लगभग 65-80% 28 डीपीआई (चित्रा 2 सी, हरे सर्कल) द्वारा मूत्र में कोई पता लगाने योग्य यूपीईसी नहीं होगा। इन चूहों का उपयोग मॉडल के बाद के चरणों में किया जा सकता है। चूहों है कि बैक्टीरियूरिक बने रहते हैं (चित्रा 2 सी, लाल दीर्घवृत्त) प्रयोग से समाप्त किया जाना चाहिए।

योनि एक्सपोजर 12 घंटे (चित्रा 3 ए) या 1 डब्ल्यूके अलग (चित्रा 3 बी) दिए गए हैं, जिसके परिणामस्वरूप आवर्तक बैक्टीरिया का कारण बनने के लिए इंट्रासेल्युलर जलाशयों से यूपीईसी का उद्भव होता है। यूपीईसी बैक्टीरिया (मान-व्हिटनी परीक्षण) के स्तर और यूपीईसी आरयूटीआई (फिशर का सटीक परीक्षण) प्रदर्शित करने वाले चूहों का अंश पीबीएस नियंत्रण समूह की तुलना में जी योनिलिस के संपर्क में आने वाले चूहों में काफी अधिक है। मूत्र कोशिका विज्ञान विश्लेषण जी योनि-उजागर चूहों से मूत्र में पीएमएन का पता लगाता है जो यूपीईसी उद्भव (चित्रा 3 सी) प्रदर्शित करता है। 1 डब्ल्यूके के अलावा दिए गए दो एक्सपोजर वाले मॉडल में, मूत्राशय के ऊतकों में यूपीईसी टाइटर्स पीबीएस (चित्रा 3 डी) की तुलना में जी योनि-उजागर चूहों में कम होते हैं, संभवतः जलाशयों से यूपीईसी के उद्भव और बाद में निकासी के कारण।

एसईएम द्वारा सीटू-फिक्स्ड मूत्राशय ऊतक के दृश्य से पता चलता है कि केवल पीबीएस (चित्रा 4 ए) के संपर्क में नियंत्रण चूहों में मूत्राशय की सतह को अस्तर करने वाली बड़ी सतही छतरी यूरोथेलियल कोशिकाएं हैं। यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन सतही छाता कोशिकाओं के नुकसान से प्रमाणित होता है, जो जी योनिलिस (चित्रा 4 बी) के संपर्क में आने वाले चूहों में छोटे अंतर्निहित संक्रमणकालीन उपकला कोशिकाओं का खुलासा करता है। इंट्रासेल्युलर जलाशयों की स्थापना के दौरान यूपीईसी टीकाकरण के बाद, यूपीईसी यूरोथेलियम पर दिखाई देता है और एक्सफोलिएटिंग कोशिकाओं (चित्रा 4 सी) से बाहर निकलता है।

Figure 2
चित्र 2. चरण 1 (जलाशय गठन) के दौरान मूत्र में यूपीईसी टाइटर्स की निगरानी करना। (ए) कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) चढ़ाना की योजनाबद्ध। (बी) एलबी + केनामाइसिन पर मूत्र में यूपीईसी टाइटर्स की प्रतिनिधि छवि। काले घेरे मूत्र के नमूने के धब्बे को इंगित करते हैं जिन्हें सीएफयू / एमएल की गणना करने के लिए गिना जाना चाहिए। (सी) सी 57 बीएल /6 चूहों में यूपीईसी बैक्टीरिया का समय पाठ्यक्रम। प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्तिगत माउस का प्रतिनिधित्व करती है, समय के साथ यूपीईसी मूत्र टाइटर्स का पता लगाती है। बिंदीदार रेखा पता लगाने की सीमा (1000 सीएफयू / एमएल) को इंगित करती है। लाल दीर्घवृत्त चार चूहों (20 में से) को इंगित करता है जो यूपीईसी बैक्टीरिया को हल करने में विफल रहे और इसलिए जी योनि-प्रेरित आरयूटीआई मॉडल के लिए उपयोग नहीं किया जाएगा। इसके विपरीत, ग्रीन सर्कल चूहों को इंगित करता है जो यूपीईसी बैक्टीरिया को हल करते हैं और बाद के चरणों में आगे बढ़ते हैं। (डी) पैनल सी पीला, पता लगाने योग्य सीएफयू में ग्राफ उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा की तालिका; हरा, कोई सीएफयू नहीं। (ई) उस समय बिंदु के आधार पर एक्सपोजर समूहों में चूहों का यादृच्छिककरण जिस पर यूपीईसी सीएफयू अब मूत्र में नहीं पाया गया था ("दिन हल")। पैनल डी के बाएं कॉलम में माउस नंबर पैनल ई में दिए गए समान माउस नंबर हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3. जी योनिलिस यूपीईसी आरयूटीआई को ट्रिगर करता है। पीबीएस (सर्कल) या जी योनिलिस (जीवीएजी; वर्ग) के दो अनुक्रमिक मूत्र पथ के जोखिम के बाद मूत्र में यूपीईसी टाइटर्स 12 घंटे (ए) या 1 डब्ल्यूके (बी) अलग दिए गए हैं। प्रत्येक प्रतीक एक व्यक्तिगत माउस का प्रतिनिधित्व करता है। दूसरे एक्सपोजर के बाद 1-3 डी के बीच प्रत्येक माउस से पता चला उच्चतम सीएफयू / एमएल यूपीईसी प्लॉट किया जाता है। कोई पता लगाने योग्य बैक्टीरिया वाले चूहों को पता लगाने की सीमा (बिंदीदार रेखा) पर प्लॉट किया जाता है। (सी) मूत्र कोशिका विज्ञान विश्लेषण यूपीईसी (एरोहेड्स) और पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर (पीएमएन) कोशिकाओं (तीर) दिखा रहा है। स्केल बार = 20 μm। (डी) मूत्राशय के ऊतकों में यूपीईसी टाइटर्स ने दो अनुक्रमिक मूत्र पथ के एक्सपोजर के बाद 3 डी एकत्र किए, जो 1 डब्ल्यूके अलग दिए गए थे। प्रत्येक प्रतीक एक अलग माउस का प्रतिनिधित्व करता है और शून्य का पता लगाने की सीमा (बिंदीदार रेखा) पर प्लॉट किया जाता है। ए, बी और डी में, बक्से पहले और तीसरे चतुर्थक पर औसत चिह्नित और मूंछों के साथ न्यूनतम से अधिकतम तक होते हैं मान-व्हिटनी यू परीक्षण * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. सीटू में तय मूत्राशय का एसईएम विश्लेषण। मूत्राशय पीबीएस (ए) या जी योनिलिस (सी) के लिए दो एक्सपोजर (12 घंटे अलग) के बाद 3 घंटे चूहों से एकत्र किए गए थे। बिंदीदार रेखाएं एक एकल मूत्र उपकला कोशिका का वर्णन करती हैं, जो जी योनि-उजागर मूत्राशय में छोटी होती है क्योंकि बड़ी सतही कोशिकाएं अंतर्निहित संक्रमणकालीन उपकला का खुलासा करती हैं। (बी) मूत्राशय ने यूपीईसी के साथ प्रारंभिक टीकाकरण के बाद 6 घंटे एकत्र किए, मॉडल के चरण 1 के दौरान, यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन और बाह्य यूपीईसी दिखा रहा है। (डी) मूत्राशय की सतह पर मौजूद अघुलनशील वसा की बूंदों का उदाहरण। स्केल बार मुख्य छवियों में 20 μm और इनसेट में 2 μm हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्राथमिक यूटीआई चरण के दौरान यूपीईसी बैक्टीरिया को साफ नहीं करने वाले चूहों की पहचान करने के लिए इस मॉडल में पहला महत्वपूर्ण कदम। इन चूहों को प्रयोग से हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि वे अन्यथा जी योनि के संपर्क के बाद यूपीईसी बैक्टीरिया की दरों को भ्रमित करेंगे। प्रारंभिक यूपीईसी टीकाकरण के बाद, बैक्टीरिया निकासी की निगरानी के लिए मूत्र को साप्ताहिक रूप से एकत्र किया जाना चाहिए। सी 57 बीएल / 6 चूहों का लगभग 65-80% 4 सप्ताह के भीतर यूटीआई 89केएनआर संक्रमण को साफ कर देगा। अन्य इनब्रेड माउस उपभेदों में यूपीईसी निकासी42,43 और जलाशय गठन के लिए अलग-अलग प्रवृत्तियां हैं और इस प्रकार इस मॉडल के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि अनुभवजन्य अध्ययनों ने निर्धारित किया है कि जी योनिलिस (या तो 12 घंटे या 1 डब्ल्यूके अलग) के दो अनुक्रमिक टीकाकरण पृष्ठभूमि सहज उद्भव के ऊपर महत्वपूर्ण जलाशय उद्भव को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक हैं जो केवल पीबीएस के संपर्क में नियंत्रण चूहों में होता है। दो अनुक्रमिक एक्सपोज़र के बीच समय की अन्य अवधि का परीक्षण नहीं किया गया है, लेकिन समान परिणाम प्राप्त कर सकते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यूपीईसी मूत्राशय टाइटर्स में कमी केवल उस मॉडल में देखी गई थी जिसमें जी योनि संबंधी एक्सपोजर को39 के अलावा 1 डब्ल्यूके दिया गया था। जबकि दो से अधिक एक्सपोज़र प्रशासित किए जा सकते हैं, अनुभवजन्य साक्ष्य बताते हैं कि बार-बार कैथीटेराइजेशन अकेले उद्भव को बढ़ाता है, जो परिणामों की व्याख्या को भ्रमित कर सकता है या एक्सपोज़र समूहों और नियंत्रणों के बीच अंतर को अलग करने के लिए बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती है। अंत में, इन सीटू मूत्राशय निर्धारण विधि में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ कौशल की आवश्यकता होती है कि फिक्सेटिव क्लैंप किए गए मूत्राशय के अंदर रहता है। एसईएम द्वारा अपस्फीत मूत्राशय की छवि बनाना अधिक कठिन होगा। मूत्राशय में फिक्सेटिव को टीका लगाते समय बहुत कोमल होना भी आवश्यक है, क्योंकि फिक्सेटिव युक्त कैथेटर के साथ यूरोथेलियम को स्क्रैप करने से यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन प्रेरित हो सकता है जो जी। फिक्सेटिव कॉकटेल में उल्लिखित सभी सांद्रता अंतिम सांद्रता हैं। इनमें से अनुचित अनुपात के परिणामस्वरूप अपर्याप्त फिक्सिंग और सूजन या कोशिकाओं का संकोचन हो सकता है। कोशिकाओं और ऊतकों में तापमान के झटके से बचने के लिए फिक्सेटिव को शारीरिक तापमान पर गर्म किया जाना चाहिए। वार्मिंग प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से फिक्सेटिव की प्रसार दर में मामूली सुधार भी प्रदान करता है। जबकि एसईएम विश्लेषण के लिए तैयार नमूनों के लिए ऑस्मियम धुंधला अक्सर छोड़ा जा सकता है, यह लिपिड को स्थिर करने और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के दौरान सेलुलर झिल्ली के क्रैकिंग को रोकने के लिए इस प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम है।

इस प्रोटोकॉल को जलाशयों को बनाने और क्रमशः उनके उद्भव को ट्रिगर करने की उनकी क्षमता के लिए अन्य यूपीईसी और / या जी योनि उपभेदों का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। अन्य प्रयोगात्मक कारकों को भी जोड़ा जा सकता है, जैसे कि अन्य योनि बैक्टीरिया (जैसे, लैक्टोबैसिलस क्रिस्पेटस पीवीएएस 100) या गर्मी से मारे गए जी योनिलिस के संपर्क में, जिनमें से कोई भी इस मॉडल39 में विकृति का प्रदर्शन नहीं करता है। परीक्षण करने के लिए अन्य जीवाणु उपभेदों का चयन करते समय, लगातार विकास का प्रदर्शन करना महत्वपूर्ण है जैसे कि सभी प्रयोगों में एक मानक इनोकुलम एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है। जेसीपी 8151 बीएसएमआर की वृद्धि को एक एनारोबिक चैंबर में अनुकूलित किया गया है। इस तनाव की खेती संभवतः एक एनारोबिक गैसपैक प्रणाली में की जा सकती है, लेकिन इसके लिए मजबूत जीवाणु विकास सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। अंत में, मॉडल में कुछ चरणों के समय को संशोधित करना संभव हो सकता है। उदाहरण के लिए, सीएफयू या मेजबान प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए यूपीईसी जलाशय गठन चरण के दौरान मूत्र को पहले के समय बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता है। संक्रमण की प्रगति या जलाशयों की स्थापना पर प्रारंभिक समय बिंदुओं (3, 6, 12 एचपीआई) पर मूत्र के नमूने एकत्र करने का प्रतिकूल प्रभाव इस मॉडल में नहीं देखा गया है। यूपीईसी जलाशयों का उद्भव दो जेसीपी 8151 बीएसएमआर खुराक के बाद होने की सूचना मिली है, जो 12 घंटे या 1 डब्ल्यूके दिए गए हैं, लेकिन अन्य समय अंतराल अभी तक परीक्षण नहीं किए गए हैं। यूपीईसी जलाशय गठन चरण को 2 सप्ताह (4 सप्ताह के बजाय) तक कम करके मॉडल के लिए समय की समग्र लंबाई को कम करना भी संभव हो सकता है, क्योंकि कई चूहे इस समय तक बैक्टीरिया को साफ करते हैं। रासायनिक एक्सफोलिएंट्स के मूत्राशय के संपर्क के बाद यूपीईसी उद्भव की जांच करने वाले पिछले अध्ययनों ने 1 या 2 डब्ल्यूके यूपीईसी जलाशय गठन चरण17,18 का उपयोग किया। हालांकि, यूपीईसी बैक्टीरिया निकासी के लिए समय की मात्रा को कम करना प्रयोग से अधिक जानवरों को मारने की आवश्यकता की कीमत पर आ सकता है। अंत में, मूत्राशय का एसईएम विश्लेषण यूरोथेलियम पर जी योनिलिस के प्रभाव की अवधि का निरीक्षण करने के लिए अतिरिक्त समय बिंदुओं पर किया जा सकता है।

समस्या निवारण के संबंध में, मूत्राशय एसईएम विश्लेषण के संबंध में विशेष रूप से कुछ महत्वपूर्ण विचार हैं। उपयोग की जाने वाली माउस पृष्ठभूमि और सूजन की मात्रा के आधार पर, कुछ मूत्राशय बहुत पतली दीवारों के साथ पेश करेंगे। ये मूत्राशय महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के दौरान अधिक कर्ल करते हैं और इसके परिणामस्वरूप कौड़ी खोल जैसा आकार हो सकता है। यदि ऐसा होता है, तो सबसे अच्छा तरीका कर्ल इंटरफ़ेस के साथ शेल के आकार के मूत्राशय को आधे में काटना है और फिर ओवरहैंगिंग ऊतक के थोक को हटाने के लिए दूसरी बार है। कटिंग पीटीएफई-लेपित डबल-धार वाले रेजर ब्लेड के साथ सबसे अच्छा काम करता है। अतिरिक्त वसा कभी-कभी ऑस्मियम धुंधला चरणों के दौरान घुलनशील हो सकता है। इसके परिणामस्वरूप अवांछित अघुलनशील वसा की बूंदें हो सकती हैं जो कुल्ला और निर्जलीकरण चरणों के दौरान नहीं धो सकती हैं और जो बाद में सुखाने के दौरान मूत्राशय की सतह पर बस सकती हैं। ये बूंदें या तो छोटे गोले या नमूने (चित्रा 4 डी) पर बिखरे हुए डिस्क जैसी संरचनाओं के रूप में दिखाई दे सकती हैं। यह सुनिश्चित करके कम किया जा सकता है कि मूत्राशय के चारों ओर से जितना संभव हो उतना वसा ऊतक हटा दिया जाए। प्लैटिनम को इरिडियम कोटिंग के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन ठीक संरचनात्मक विवरणों के मास्किंग को कम करने के लिए मोटाई को कम से कम रखा जाना चाहिए। कोटिंग के दौरान घूर्णन चरण के उपयोग की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

इस मॉडल की एक सीमा यह है कि इसके लिए बड़ी संख्या में चूहों की आवश्यकता होती है। 6 चूहों का केवल 65-80% अपने यूपीईसी बैक्टीरिया को साफ करेगा और बाद में जी योनि या पीबीएस टीकाकरण के लिए उपयुक्त होगा (चित्रा 2 सी देखें)। प्रति समूह 10-12 चूहों (जी योनि टीकाकरण बनाम पीबीएस) प्राप्त करने के लिए, ~ 30 चूहों को शुरू में यूपीईसी से संक्रमित होना चाहिए। इसके अलावा, सांख्यिकीय महत्व का पता लगाने के लिए आवश्यक जैविक प्रतिकृतियों को प्राप्त करने के लिए कई प्रयोगों की आवश्यकता होती है। जब एक्सपोज़र को 1 डब्ल्यूके अलग दिया गया था, तो यूपीईसी उद्भव पीबीएस (चित्रा 3 बी) के संपर्क में आने वाले चूहों के 14% में हुआ। इस प्रकार, जी योनि में यूपीईसी आरयूटीआई में महत्वपूर्ण वृद्धि का पता लगाने से पीबीएस नियंत्रण (0.8; अल्फा = 0.05 [एकतरफा]) के सापेक्ष चूहों को उजागर किया जाता है) प्रत्येक एक्सपोजर समूह के लिए कम से कम 40 चूहों के संचयी कुल का परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। एक अतिरिक्त विचार यह है कि ये प्रयोग महंगे और श्रम-गहन हैं। चूहों को यूपीईसी निकासी के लिए साप्ताहिक निगरानी की जानी चाहिए और प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम 4-5 डब्ल्यूके है जो इस बात पर निर्भर करता है कि जी योनिलिस को 12 घंटे की समय सीमा में दो बार या दो बार 1 डब्ल्यूके अलग दिया जाता है या नहीं। एसईएम श्रम-गहन है और माइक्रोस्कोप उपलब्धता और सेवा शुल्क के आधार पर महंगा हो सकता है। एसईएम के लिए पूरे मूत्राशय को तैयार करना विश्लेषण के लिए प्रचुर मात्रा में सामग्री प्रदान करता है लेकिन दोष यह है कि प्रत्येक मूत्राशय का विश्लेषण समय लेने वाला हो सकता है। इस प्रकार, यह संभावना है कि मूत्र और ऊतक टाइटर्स के लिए उपयोग की जाने वाली उच्च पशु संख्या की तुलना में एसईएम द्वारा केवल सीमित संख्या में मूत्राशय का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, मूत्राशय "कप" की घुमावदार सतहों की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए छाया के कारण कौशल की आवश्यकता होती है जो दृश्यता को बाधित कर सकती है। यद्यपि मूत्राशय एसईएम यूरोथेलियल छूटना की कल्पना करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, यह विधि काफी हद तक गुणात्मक है। क्योंकि नमूना एक गोल आकार में तय किया गया है, और फिक्सेटिव में ग्लूटाराल्डिहाइड के उपयोग के कारण, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से फ्लोरोसेंटली व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया के लिए स्क्रीनिंग संभव नहीं है। इम्यूनोस्टेनिंग और रासायनिक रंग ग्लूटाराल्डिहाइड के उपयोग के कारण इस प्रक्रिया के साथ असंगत हैं जो अधिकांश एंटीजन और ऑस्मियम को क्रॉसलिंक करेंगे और यह एंटीजन साइटों को मुखौटा करेगा और ऊतक को अंधेरा कर देगा। उस ने कहा, एसईएम तकनीक उन मापदंडों के लिए उपयोगी है जिन्हें अतिरिक्त जांच के उपयोग के बिना मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, जैसे कि सेल आकार48,49।

यह मॉडल पहले वर्णित विधियों से परे कई फायदे प्रदान करता है। यह मूत्राशय जलाशयों से उभरने के कारण यूपीईसी आरयूटीआई के तंत्र की परीक्षा की अनुमति देता है, जैसा कि बाहरी स्रोत से मूत्राशय में पुन: परिचय के विपरीत है। मूत्राशय जलाशयों से उभरने के कारण आरयूटीआई के अन्य मॉडल रासायनिक एजेंटों (प्रोटामाइन सल्फेट या चिटोसन) का उपयोग यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन17,18 का कारण बनते हैं, जो महिलाओं में आरयूटीआई के ट्रिगर नहीं होंगे। योनि एक प्रचलित मूत्रजननांग जीवाणु है जो कुछ महिलाओं में कैथीटेराइजेशन या सुपरप्यूबिक आकांक्षा के माध्यम से मूत्राशय से सीधे एकत्र मूत्र में पाया गयाहै 23,26. यह तथ्य, बीवी (जिसमें जी योनि योनि में उगता है) और यूटीआई के बीच ज्ञात सहयोग के साथ मिलकर, यह सुझाव देता है कि जी योनि आरयूटीआई का नैदानिक रूप से प्रशंसनीय ट्रिगर है। अंत में, इन सीटू मूत्राशय निर्धारण विधि मूत्राशय अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करती है और क्षति को सीमित करती है, यह सुनिश्चित करती है कि मूत्राशय की परतें एक दूसरे से अलग न हों। यूरोथेलियम की कल्पना करने के लिए पिछले तरीकों में पारंपरिक रूप से उपयोगकर्ता को फिक्सेटिव48 में फैले मूत्राशय को डुबोने से पहले मूत्राशय को विच्छेदन ट्रे पर कटाई, द्विभाजन, खिंचाव और पिन करना होता है। इस विधि के परिणामस्वरूप एक बहुत ही सपाट नमूना होता है लेकिन ऊतक के समान या प्राकृतिक खिंचाव सुनिश्चित नहीं होता है और इसके परिणामस्वरूप ऐसे क्षेत्र हो सकते हैं जो अधिक और नीचे फैले हुए हैं (जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक झुर्रीदार ऊतक होते हैं) और मूत्राशय की परत पृथक्करण का कारण बन सकते हैं। इसके अतिरिक्त, ऊतक को फैलाने और पिन करने के लिए मूत्राशय के ये शारीरिक जोड़तोड़ यूरोथेलियल छूटना सहित नुकसान पहुंचा सकते हैं। एक अन्य विधि पैराफिन में एम्बेड करने और माइक्रोटोम के साथ पतले वर्गों को प्राप्त करने से पहले फिक्सेटिव में बरकरार मूत्राशय को डुबोना है। बैक्टीरिया और मेजबान प्रोटीन स्थानीयकरण की जांच करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों के लिए पतले खंड अमूल्य हैं लेकिन एक पतला खंड यूरोथेलियल सतह के दृश्य की अनुमति नहीं देता है। यह एसईएम विधि पूरे मूत्राशय की सतह को एक बार में जांचने की अनुमति देती है।

जैसा कि वर्णित है, इस मॉडल के भविष्य के अनुप्रयोगों में यह निर्धारित करने के लिए अन्य यूपीईसी उपभेदों का परीक्षण करना शामिल है कि क्या वे इंट्रासेल्युलर जलाशय बनाते हैं और अन्य जी योनि उपभेदों का परीक्षण करते हैं ताकि यह आकलन किया जा सके कि क्या वे आरयूटीआई का कारण बनने के लिए छूटना और यूपीईसी उद्भव प्राप्त करते हैं। 6 चूहों से परे अन्य माउस उपभेदों का भी परीक्षण किया जा सकता है, हालांकि क्रोनिक सिस्टिटिस (जैसे सी 3 एच पृष्ठभूमि पर चूहों) के विकास के लिए उच्च प्रवृत्ति वाले चूहों की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि बहुत सारे चूहों को प्रयोग से मारने की आवश्यकता होगी। 6 चूहों का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि कई आनुवंशिक नॉकआउट उपभेद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इस तरह के उपभेद जलाशय गठन और / या उद्भव में शामिल मेजबान कारकों से पूछताछ करने का अवसर प्रदान करते हैं।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास इस अध्ययन से संबंधित हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक संक्रमण प्रयोगों में तकनीकी सहायता के लिए लिन फोस्टर, एसईएम तक पहुंच के लिए वाशिंगटन यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर सेलुआर इमेजिंग (डब्ल्यूयूसीसीआई) में जेम्स फिट्जपैट्रिक, यूटीआई 89केएनआर यूपीईसी तनाव के लिए स्कॉट हल्टग्रेन और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डेविड हंस्टैड को धन्यवाद देते हैं।

यह काम नेशनल साइंस फाउंडेशन (वीपीओ # डीजीई - 1143954 के लिए ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप) द्वारा समर्थित था, वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (एनएमजी के लिए पायलट रिसर्च अवार्ड) में महिला संक्रामक रोग अनुसंधान केंद्र द्वारा, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन: #12POST12050583 (एनएमजी) और #14POST20020011 (एनएमजी), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, एनआईएआईडी: आर 01 एआई 114635 (एएलएल) और एनआईडीडीके द्वारा: आर 21 डीके 092586 (सभी), पी 50 डीके 064540-11 (एसजेएच, परियोजना द्वितीय पीआई: एएलएल) और के 01 डीके 110225-01 ए 1 (एनएमजी)। कुछ जानवरों के अध्ययन एनसीआरआर अनुदान सी 06 आरआर 015502 द्वारा समर्थित सुविधा में किए गए थे। वाशिंगटन यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर सेलुलर इमेजिंग (डब्ल्यूयूसीसीआई; जहां एसईएम का प्रदर्शन किया गया था) और एमएसजे को वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, वाशिंगटन विश्वविद्यालय के चिल्ड्रन डिस्कवरी इंस्टीट्यूट और सेंट लुइस चिल्ड्रन हॉस्पिटल (सीडीआई-कोर-2015-505), फाउंडेशन फॉर बार्न्स-यहूदी अस्पताल (3770), और नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनएस 086741) द्वारा समर्थित किया गया था। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G x 1/2 needles BD 305106 for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat McKesson 487377 in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater Leica SEM sample processing
aluminum SEM stub Ted Pella 16111 SEM sample processing
Calcium chloride EMS 12340 in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab  Ted Pella 16084-1 SEM sample processing
Conductive silver paint Ted Pella 16034 SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier Leica SEM sample processing
Cytofunnel metal clip Simport M964B cytospun urinalysis
Ethanol EMS 15050 SEM sample processing
Glucose  Sigma G7528 for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde EMS 16320 in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit Fisher 23123869 cytospun urinalysis
HEPES Cellgro  25-060-Cl for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium Ted Pella 91120 SEM sample processing
isofluorane mouse anaesthesia
kanamycin Gibco 11815024 add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar BD DF0445174 UPEC growth plates
Luria-Bertani broth BD DF0446173 UPEC growth media
Merlin FE-SEM Zeiss scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 SEM sample processing
NaCl  Sigma S3014 for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope Olympus cytospun urinalysis
osmium tetroxide EMS 19170 SEM sample processing
paraformaldehyde EMS 15710 in situ bladder fixation
polyethylene tubing Intramedic 427401 for catheters
Proteose Peptone #3  Fisher  DF-122-17-4 for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade EMS 72000 cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300002 cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter Simport M965FWDV cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel Simport M964-1D cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated) Thermo Scientific 5991055 cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate EMS 12310 in situ bladder fixation
spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
streptomycin Gibco 11860038 add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe BD 309659 for catheters
Yeast Extract  Fisher DF0127-17-9 for NYCIII G. vaginalis growth media

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चूहों में <em>गार्डनेरेला योनि मूत्राशय </em>एक्सपोजर द्वारा ट्रिगर आवर्तक <em>एस्चेरिचिया कोलाई </em>मूत्र पथ संक्रमण
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O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, … More

O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61967, doi:10.3791/61967 (2020).

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