다목적 미세유체 장치는 반확산 방법을 이용하여 효소의 결정화를 가능하게 하고, 침을 구함으로써 결정에 기판의 도입, 효소:기판 복합체의 3D 구조 측정을 실온에서 칩 내부의 결정의 직렬 분석에 의한 것으로 설명된다.
X선 분석 전에 잘 확산되는 결정과 처리의 준비는 생체 결정 연구의 두 가지 중요한 단계입니다. 우리는 효율적인 역확산 방법으로 결정의 생산을 가능하게 하는 다목적 미세 유체 칩을 설명합니다. 미세 유체 채널에서 제공하는 대류없는 환경은 결정 성장에 이상적이며 결정 효소의 활성 부위로 기판을 확산시키는 데 유용합니다. 여기에서 우리는 제시된 예에서 심령 박테리움 플라노코커스 할로크로우필루스의 CCA 추가 효소에 이 접근법을 적용했습니다. 결정화 및 기판 확산/담그 후, 효소:기판 복합체의 결정 구조는 칩 내부의 여러 결정의 연쇄 결정 및 분석에 의해 실온에서 결정되었다. 전체 절차는 수정 처리가 필요하지 않으므로 시료의 정품 회절 특성을 보존합니다.
결정학은 생물학적 거대 분자의 3D 아키텍처를 해독하는 방법입니다. 후자는 효소가 기판을 선택하고 처리하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 결정 구조의 결정은 표적 거대 분자의 결정화 및 X 선 회절1에의한 분석을 위한 결정의 컨디셔닝을 요구한다. 결정 준비 와 처리 모두 결정 품질 및 회절 특성에 영향을 미칠 수있는 중요하지만 섬세한 단계이며, 따라서 결과 3D 구조의 해상도 (즉, 정확도). 고품질 결정의 준비를 용이하게하고 회절 특성을 보존하기 위해 불필요한 처리를 제거하기 위해 ChipX2,3,4라는사용자 친화적이고 다목적 미세 유체 장치를 설계했습니다.
본 기사에서는 기존의 실험실 재료를 사용하여 ChipX 채널에 단백질 용액을 적재하여 역확산으로 결정을 준비하는 방법을 시연합니다. 이러한 결정화 방법은 결정화제의 확산에 의해 생성된 농도 그라데이션으로 인하여 효소 용액을 함유하는 미세유체 채널을 따라 초포화 및 잠재적 핵형성 조건의 효율적인 스크리닝을 제공한다5,6.
칩 설정은 간단하며 표준 실험실 파이프만 사용하며 비용이 많이 드는 장비가 필요하지 않습니다. ChipX에서 결정이 성장하면 효소의 리간드를 확산에 의해 도입할 수 있습니다. 회절 데이터는 싱크로트론 X선 소스를 사용하여 칩의 채널에 포함된 일련의 결정의 실온에서 수집됩니다. 여기에서 기술된 구조 적인 연구 결과는 그것의 아포 양식에 있는 tRNA 성숙 효소의 구조물의 결정으로 이끌어 내고 담그기 에 의해 소개된 그것의 CTP 기판의 아날로그와 복합체에서 이끌어 냈습니다. CCA 추가 효소에게 불린 이 단백질은 tRNA의 3’끝에 CCA 트리뉴클레오티드 꼬리를 중합합니다. 직렬 결정학에 의해 얻어진 2개의 3D 심상을 비교하면 극저온 결정학에 사용되는 것보다 생리적인 조건에서 리간드의 결합과 관련된 국소 형성적 변화를 나타낸다. 이 비디오에 기재된 프로토콜은 일반적으로 단백질, 핵산 또는 다중 성분 복합체인 임의의 생체 분자에 적용됩니다.
생체 결정학의 현재 프로토콜은 극저온 조건에서 질소 제트에서 회절 분석을 수행하기 전에 증기 확산 또는배치(13,14)와같은 방법을 사용하여 결정의 제조를포함하고,극저온 냉각15,16을 위한 마이크로루프로의 이송을 포함한다. 대조적으로, 직접 결정 극저온 냉각은 ChipX3에서 불가능하고 결정은 이 설치의 한계로 볼 수 있는 그들의 미세 유체 채널에서 추출될 수 없습니다. 그러나, 이 문서에 기재된 프로토콜은 실온(즉, 보다 생리적인 조건에서)에서 결정 구조의 판정을 위한 완전히 통합된 파이프라인을 제공한다. 실온에서의 데이터 수집은 방사선손상(19)의증가를 야기하지만, 이 효과는 빠른 데이터 수집 시간(각 결정에서 최대 60° 회전이 수집)과 여러 부분 데이터 집합의 병합에 의해 균형을 맞힙니다. ChipX 설계 및 재료 모두 배경 산란 및 회절 신호 감쇠3을감소시키기 위해 최적화되었으며, 채널(40 μm)의 절반크기에 해당하는 치수를 가진 결정에서 데이터 수집을 수행할 수 있다.
요약하자면 프로토콜의 주요 장점은 다음과 같습니다. 결정은 대류가없는 환경 (미세 유체 채널)에서 생산되며 고품질 의 결정에 매우 유리합니다. ChipX에서 구현된 반확산 방법은 초량도를 스크리닝하는 데 매우 효율적입니다. 결정적 분동이 칩 채널로 확산되면 적절한 핵형성 및 성장 조건을 결정하는 데 도움이 되는 농도 및 과포화 파를 생성한다5. 결정은 직접 처리되지 않지만, 칩 내부, 그 결과 실제 회절 특성을 보존하는 내부에서 분석되며(즉, 물리적 상호 작용 또는 극저온냉각에 의한 결정 모사이시티를 변경하지 않음)20. 회절 분석은 방사선 손상을 최소화하기 위해 낮은 용량 노출로 칩 채널을 따라 분산된 일련의 결정에서 수행되며, 전체 데이터 집합은 계열의 부분 데이터를 병합하여 조립된다. ChipX의 표준 발자국과 간단한 설계는 미래에 싱크로트론 또는 XFEL 시설을 사용하여 시투 데이터 수집의 완전한 자동화를 가능하게 할 것입니다. 프로토콜의 모든 단계는 ChipX에서 수행됩니다. 실험자 관점에서 칩 설정은 표준 파이펫으로 간단하고 쉽게 수행할 수 있으며 추가 장비가 필요하지 않습니다. 샘플 입구의 트리와 같은 채널 연결은 시스템의 데드 볼륨을 최소화하며, 이는 정화가 어렵거나 제한된 수량으로만 사용할 수 있는 샘플로 작업할 때 중요합니다.
결론적으로, ChipX에서 구현된 랩 온-어칩 접근법은 역확산 및 결정 구조 결정에 의한 결정화 공정을 단순화하고 효율적으로 소형화하여 샘플에서 단일 장치에서 3D 구조로 이동하도록 합니다. 그것은 널리 적용 가능하고 실온에서 일상적인 연쇄 생체 결정학 조사를위한 사용자 친화적이고 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 스위스 광원 (빌리겐, 스위스)이 빔 라인 X10SA (PXII)와 X06DA (PXIII), 구조 개선에 대한 그녀의 기여에 대한 알렉산드라 블루름, 성우와 프랑수아 슈넬 (Université de Strasbourg)의 비디오 편집을위한 자신의 지원에 대한 자신의 지원에 대한 클라리사 Worsdale에 빔 타임 할당을 인정합니다. 이 작품은 스트라스부르 대학인 프랑스 센터 내셔널 드 라 레체르체 시엔티피크(CNRS)의 지원을 받았습니다. 라벡스 컨소시엄 “NetRNA”(ANR-10-LABX-0036_NETRNA)는 프랑스 국립 프로그램 “Investissements d’Avenir”의 프레임에서 스트라스부르 대학의 우수 이니셔티브 (IdEx)에서 R.dW에 박사 자금 지원, 프랑스 – 독일 대학 (UFA-DFH, No. CT-30-19), 도이치 포르충스게마인샤프트(보조금 없음) 모 634/10-1). 저자는 PROCOPE 후버트 쿠리엔 협력 프로그램 (프랑스 외무부와 도이치 어 카에스타슈디엔스트)의 혜택을 받았다.
Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer – Representative results | |
UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |