Summary
使用免费计算机辅助系统系统地对肠道炎症进行评分，是定量比较以溃疡和炎症变化为特征的结肠炎模型组织病理变化的有力工具。病理结肠炎评分评估加强临床观察，便于数据解释。
Abstract
Murine结肠炎模型是广泛应用于研究的工具，专注于了解炎症性肠道疾病的病理生物学。然而，对疾病严重程度进行客观和可重复量化的有力标准仍有待确定。大多数结肠炎分析方法依赖于对小段肠道的有限组织学评分，导致部分或偏置分析。在这里，我们结合了高分辨率图像采集和纵向分析整个结肠，以量化肠道损伤和溃疡在脱硫酸钠（DSS）诱导模型的穆林结肠炎。此协议允许在没有广泛的用户培训的情况下生成客观和可重复的结果。在这里，我们使用DSS诱导结肠炎的数据示例提供样品制备和图像分析的全面详细信息。这种方法可以很容易地适应其他模式的穆林结肠炎，有与粘膜损伤相关的重大炎症。我们证明，与结肠的完整长度相比，发炎/受伤和侵蚀/溃疡粘膜的分数与临床发现（如DSS引起的疾病进展中的体重减轻）密切相关。该组织学协议为DSS结肠炎实验中公正地标准化疾病活动分析提供了可靠的时间和具有成本效益的帮助。
Introduction
胃肠道上皮屏障在将发光抗原和病原与底层组织隔间1分离方面起着举足轻重的作用。在炎症性肠病 （IBD）、 缺血或手术损伤等病理条件下看到的上皮损伤和粘膜损伤与临床症状相关，这些症状包括腹泻、体重减轻、大便中的血液和腹痛。作为对损伤的反应，上皮细胞迁移和增殖，以重新上皮化和修复粘膜屏障缺陷。解决炎症和恢复粘性完整性是重建肠道粘胶平衡和功能2，3，4的关键。
各种动物模型被用来研究与肠道上皮屏障损伤相关的基本分子机制。化学诱发结肠炎的成熟和易于应用的模型被广泛使用，特别是在与炎症损伤相关的研究（如IBD）中。一种常见的、可重复的和可靠的粘膜结肠炎模型采用脱硫酸钠（DSS）调解结肠损伤和炎症。疾病的严重程度因小鼠菌株、DSS剂量、DSS给药时间长短和DSS5、6、7的分子量而异。
DSS结肠炎期间的肠道粘膜损伤通常使用疾病活动指数（DAI）进行评估，该指数是由体重减轻、粪便血液含量和粪便一致性决定的综合评分。粪便血液含量可以是微观的（使用粪便瓜亚酸测试检测）或宏观的：粪便一致性分为硬、软或液体（即腹泻）5，8。这些临床参数的评分可能是主观的，可能因用户的经验和偏差而异，尽管总体而言，这些数据提供了可靠的信息，因此IBD研究人员广泛使用。相比之下，没有普遍接受的粘膜损伤的病理学评估方法。最常见的情况是，结肠的选定区域由训练有素的病理学家检查，并根据几个参数进行评分，这些参数通常包括隐性损伤和白细胞渗透9、10、11。但是，由于被调查参数的数量和分析的组织数量在单个报告之间差异很大，因此许多已发表的研究的可比性有限。为了减少观察者偏见和增强相互学习的和谐，理想的组织学评分协议应：1） 包括结肠的整个长度，因为肠道粘膜炎症通常是可变的，跳过病变是常见的，2） 将分析限制在特定的关键和易于解释的参数，以降低主观性： 3） 促进快速、一致地处理大量样本;4） 使用广泛可用且负担得起的工具进行数据采集、分析和演示。
在这里，我们描述了一种技术，以"瑞士卷"配置处理小肠的整个结肠或长段，以及使用免费的计算机辅助评分系统来分析肠道粘膜炎症和损伤，因为DSS引起的结肠炎。
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Protocol
所有描述的动物实验都得到了密歇根大学动物使用和护理委员会的批准。
1. 组织收获
- 根据批准的协议，使用异氟烷麻醉进行人道安乐死小鼠，然后进行宫颈错位。对于所有动物实验，经认证的审查委员会根据国家和机构动物处理准则获得批准。
- 将鼠标放在解剖垫上，处于超平位置。使用 20 G x 1 1/2 英寸 G 针固定鼠标四肢。
- 使用钳子和剪刀，在腹部皮肤上做一个小切口，并拉到一边，以暴露腹膜。
- 打开腹腔，腹腔中线切口从阴骨到腹部两侧。
- 小心地去除组织和器官，直到大肠被可视化。切开结肠两侧的骨盆骨，使器官完全可视化，从肛门延伸到粪坑。
- 轻轻去除附着在结肠上的脂肪、小静脉和动脉，同时仔细解剖器官，切开靠近肛门的器官，然后解剖粪坑。
注意：解剖的结肠应保持室温，同时完成瑞士卷程序。 - 小心地用1倍PBS冲洗结肠，使用通过肛门插入的柔性塑料气孔针去除粪便含量。
- 将结肠置于直线中，沿中性动脉纵向打开。从解剖纵向到近端（图1A）分两次。一半的组织可用于组织学分析，而另一半可用于处理西斑，PCR或卷成第二个瑞士卷新鲜冷冻免疫荧光显微镜12。
2. 准备瑞士卷
- 使用剃须刀刀片从近结肠修剪额外的组织，直到沿整个结肠长度获得大致相同的宽度。
- 对齐结肠，使流明朝上暴露，并使用柔性气孔针完全平整组织。如果需要，添加更多 PBS 以在整个过程中保持组织湿润。
- 使用纸巾去除多余的 PBS。使用注射器和气针，在组织上加入10%中性缓冲形式素溶液2-3分钟，以修复和平整组织。
- 使用直钳抓住末端的分号结肠，并将结肠从分体扭曲成同心圆（图1B）。
注意：使用食指滚动时，可以向后推回瑞士卷的内部，以确保组织在卷内。 - 插入一个27G针针，将结肠固定在中间，以保持其瑞士卷形状（图1C）。
- 将瑞士卷与针头放入组织学标本容器内嵌入的盒式磁带中。
注意：组织必须与固定前的盒式磁带并行定位（图 1D）。 - 修复组织在10%中性缓冲形式素溶液过夜在4°C13.
- 隔夜固定后，用 PBS 清洗组织 3 倍。
- 在石蜡嵌入过程之前，在组织中加入 70% 的乙醇。在继续之前，先从瑞士卷中取出针头。组织可以在室温下储存在乙醇中，直到石蜡嵌入13。
- 将样品放入组织处理器中，嵌入石蜡中，并准备 4 个 μm 部分，安装在带正电荷显微镜滑梯上 （图 1E）。这可能是一个可选的停止点。
注意：适当的组织方向对于实现适合图像分析的部分至关重要。平行瑞士卷嵌入石蜡盒将导致整个部分用于图像分析 （图 1F-1H）.必须避免倾斜部分以防止不完整的部分（图 1I-1K）。有关详细信息，请参阅讨论部分。 - 染色部分与血氧林和欧辛 （H&E）13.
3. 数字扫描和分析
注意：要准确评估粘结变，只选择至少包含总结肠长度 90% 的部分。
- 使用幻灯片扫描器或成像仪扫描染色部分（参见 材料表）。生成的图像需要每像素 0.25 微米分辨率，目标为 40 倍，放大倍数为 40 倍。
- 安装并下载用于扫描幻灯片数字分析的适当软件（参见 材料表）。
- 打开图像处理软件中的扫描图像 （图 2A）。验证整个冒号是可见的，并且样品中没有缺失区域。
- 通过单击标签成像器 （图 2A）激活标签成像器和比例表工具，以正确识别扫描的幻灯片。
- 通过单击注释打开注释工具（图 2A），然后单击新层（图 2B）创建 3 个不同的层，以量化瑞士卷的总长度、炎症/损伤和侵蚀/溃疡。单击层颜色（图 2B）为每层选择不同的颜色。
- 使用肌肉粘膜作为参考，单击笔工具（图 2A）来测量每个层/类别的长度：
- 以 400 μm 变焦（或更多）查看图像，以便于对肌肉粘膜进行充分可视化。
注意：使用鼠标滚动轮轻松控制放大，在穿过部分以绘制所有线条时需要根据需要进行调整。 - 单击 笔 工具，在肌肉粘膜（图2A）之后绘制一条线。根据需要移动指点以可视化相邻区域以进行分析。
注：每次停止笔时，都会生成一个小的新层区域。它可以使用 "层区域 "选项卡可视化和编辑（选择所需的段落，并在出现错误或更正时单击 "删除层 "， 图 2B）。
- 以 400 μm 变焦（或更多）查看图像，以便于对肌肉粘膜进行充分可视化。
- 定义所有图（图 2C）后，使用 导出网格导 出数据到图区域选项中的文本文件按钮 （图 2B）。
注意：在创建图层以确保数据正确存储时，经常保存文件。 - 打开文本文件，使用电子表格软件复制数据。各区域的所有段数总计，并计算总长度的损伤和溃疡百分比。
- 要计算组织结肠炎评分 （HCS）并评估疾病的严重程度，请考虑以下详细信息的三个主要特征。
- 检查是否有健康的肠道粘膜，其特征是加密发光轴中组织上皮细胞，免疫细胞很少的拉米纳丙酸，以及连接粘膜和亚粘膜的亚贾森肌肉粘膜（图3A）。
- 检查炎症/损伤的特点是上皮隐士衰减或部分缺失上皮细胞和粘膜炎症与中性粒细胞渗透到墓穴 （图 3B）.
- 检查是否有侵蚀/溃疡，其特征是没有表面上皮的区域或完全缺乏上皮密码或没有相关白细胞的区域（图3C）。
- 计算受伤和溃疡区域的 HCS 表示为以下公式中总长度的百分比：
注：HCS 结合炎症/损伤和侵蚀/溃疡的百分比，为后者增加两个因子，基于一个合理的假设，即上皮的完全损失会导致障碍完整性的最大损失，从而导致疾病恶化。HCS 始终代表 DSS 诱导的实验性结肠炎引起的形态变化。有趣的是，我们没有看到结肠淋巴状聚集物或卵泡的数量与DSS结肠炎的临床疾病严重程度之间的明确相关性，因此，我们并没有将量化纳入这一分析。 - 拍摄具有代表性的图像的快照（单击 快照， 图 2A），然后保存。如果需要，请点击 显示/隐藏比例栏 （图 2A）包括比例栏。
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Representative Results
为了说明这种组虫结肠炎评分分析在DSS挑战和随后从结肠炎中恢复的粘膜损伤背景下的可靠性，我们在8只10周大的雄性C57BL6野生型小鼠的饮用水中施用了2.5%的DSS，为期5天，然后是常规水的恢复期为5天。在DSS的急性给用期间，体重没有变化，从第0天到第5天（图4A）。第5天之后，当老鼠开始喝普通的自来水时，体重急剧下降。血液和软凳子出现后，3天的DSS管理，并持续3天在水面上，直到实验的第8天（图4B）。这些观察表明，在第5天和第8天的恢复期内，观察到了接触DSS的最有害影响。第10天结肠长度的测量证实实验结束时显著缩短（图4C）。结肠在0天、2天、5天、7天、8天和10天收获，使石蜡瑞士卷。组织沾染了H&E，并分析了高清扫描（图4D），以计算组织结肠炎评分（图4E）和损伤和溃疡的百分比（图4F）。
图4D 显示未经处理的C576BL6小鼠的正常加密结构，表面对肌肉粘膜，并由拉米纳道具（第0天，箭头）支持。在DSS管理2天后，观察到免疫细胞招募（第2天，箭头）。第5天，上皮细胞出现损伤，中性粒细胞渗入上皮（隐性炎）与上皮损伤（第5天，箭头）有关。从第5天到第8天，注意到炎症和溃疡的上皮损失区域（第7天和第8天，箭头）。后者通常观察到老鼠在恢复阶段经常喝自来水。最后，上皮细胞开始再生和重新填充溃疡区，在第10天（箭头）缓慢恢复结肠粘膜。
HCS 密切反映了对炎症/损伤和侵蚀/溃疡百分比的简单评估，并定量地表明，在第 5 天到第 10 天从 DSS 恢复期间，小鼠的结肠有显著损害，这与 图 4D中显示的上皮侵蚀和白细胞渗透相关。HCS 提供的数据区分了与上皮损伤相关的炎症与侵蚀/溃疡相关的疾病的严重程度。
这些观察表明，本议定书中提议的氢氟碳化合物系统评分系统是量化粘膜损伤的可靠工具。
图1：样品制备对于准确的数据分析至关重要。 （A） 腹膜结肠完全延伸并沿中性动脉打开。（B） 瑞士滚动过程。（C） 针插入以保持瑞士卷形状（D） 石蜡嵌入盒式磁带。（E） 石蜡块。（F） 瑞士卷平行方向，以避免部分部分。（G） 完整的瑞士卷， 比例杆： 2 毫米 （H） 殖民地墓穴的理想部分， 比例杆： 80 μm. （I） 斜瑞士卷方向.（J） 不完整的瑞士卷， 比例杆： 2 毫米 （K） 殖民地墓穴的斜段， 比例杆： 80μm. 请点击这里查看此图的更大版本。
图2：对粘胶损伤进行定量评估。 （A） 具有快照、变焦滑块、显示/隐藏比例条/轴/网格、标签成像器、注释和笔工具功能等的基本工具栏。（B） 注释菜单显示层颜色、新层、删除层、显示/隐藏层、删除区域和导出网格到文本文件按钮。（C） 概述总长度、受伤和溃疡层、比例栏：3 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：急性DSS实验性结肠炎后沾染血氧林和异丙素的老鼠肠道粘膜的形态学，随后恢复。 （A） 健康肠道细胞组织在被拉米纳丙酸包围的结肠隐士中，由肌肉粘膜从亚木库萨分离，鳞片杆：200μm.（B） 急性粘膜炎症或损伤，中性粒细胞渗入粘膜和隐性上皮，与隐性上皮失真/损失和上皮衰减有关， 比例杆： 200 μm.（C） 溃疡或侵蚀区域与完全上皮损失和相关的炎症。， 规模酒吧： 200 μm. 请点击这里查看此图的更大版本。
图4：在DSS实验性结肠炎期间，组织结肠炎得分和损伤及溃疡的百分比与体重和粪便指数相关：（A）体重和（B）粪便指数在野生型小鼠中每天评估，治疗2.5%DSS5天（红线），然后在水（黑线）上恢复5天。数据代表了两个独立实验，每组至少有4只小鼠，表达为平均±SEM。 意义是由双向的ANOVA和Sidak多重比较决定的，*p<0.033，**p<0.002和***p<0.001。（C） 在第10天测量了小鼠的结肠长度。数据代表了两个独立的实验，每组至少有3只老鼠，表达为平均±SEM。 意义是由双尾学生的测试决定的，***p<0.001。（D） 对结肠粘膜的血氧林和黄霉素（H&E）染色组织部分进行分析，以计算、比例杆：60μm. （E） 组织结肠炎评分 （HCS） 和相对于结肠长度的损伤/溃疡百分比。数据代表每组2只小鼠的两项实验，表达为平均±SEM。 意义由单向ANOVA和Tukey多重比较决定，*p<0.033，**p<0.002和***p<0.001。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们的组织结肠炎评分系统是量化肠道组织炎症和损伤的可靠工具。这种方法提高了对整个器官组织病理状态的理解，而没有选择小区域或不完整部分的偏见。成功执行此协议的关键步骤之一是适当准备瑞士卷，以便分析至少 90% 的结肠长度：石蜡嵌入和切口期间平行方向，以确保具有上皮墓穴纵向视图的直线和均匀组织部分：在经验丰富的病理学家的监督下进行实践和培训，以确认受训人员识别急性炎症、上皮损伤和侵蚀/溃疡之间的区别：并访问高分辨率数字扫描仪。
在石蜡嵌入和切口期间，需要进行小的调整和故障排除，以适当定位瑞士卷，以确保组织与石蜡盒和刀片（图1E-F）平行。坚持此空间方向将减少不完整部分的数量。如果结肠完全滚动在自己身上，最好的部分，包括大部分组织长度将位于瑞士卷的中间附近（图1F）。收集几个部分大大增加了获得良好的导向部分的机会，其中整个密码的长度是可见的（图1G-H）。避免分割倾斜的瑞士卷（图1I-J），其特征是圆形的墓穴或墓穴甜甜圈（图1K）。强烈建议经常对显微镜下收集的部分进行可视化，以确保适当的技术。一个好的部分捕捉结肠的整个长度。
任何能够捕获瑞士卷的整个长度并提供放大组织以可视化墓穴结构所需的分辨率的仪器都足以评估 HCS。一些显微镜允许小图像的重叠和重建整个组织部分。但是，在增加对组织进行评分的放大倍数后，这些图像的分辨率可能很差。此外，部分的重叠可能并不完美，留下组织区域定义不明确，无法准确评分。
这里建议的评分协议的优势之一是组织分类在只有两类炎症/损伤或侵蚀/溃疡。这简化和加速了组织损伤的分类，同时增加了可重复性。用于分析的软件可访问、免费且易于使用。HCS 准确地反映了粘膜损伤，因为它允许量化结肠整个长度的溃疡区，并适当地为这种病理学提供比发炎、非溃疡区域更多的重量。当将 HCS 数据与受伤/溃疡百分比（图 4E-F）进行比较时，这一点得到了清晰反映。每个样本的评分分析大约需要 40 分钟。通过适当的培训、扫描幻灯片、计算机和软件的访问，大多数研究人员可以进行分析。但是，最好与病理学家确认评分结果，以确保准确性和可重复性。肠道炎症评估可以用任何软件进行，允许高分辨率放大幻灯片和长度测量：然而，为了简单起眼，在此协议中，我们专注于材料表中列出的软件。
我们一直在使用这个评分系统成功地分析各种DSS结肠炎实验中的疾病。例如，Kelm等人14 利用一种新的抗体（GM35）探索了CD44v6糖化的重要性，CD44v6是上皮迁移和增殖的重要调节剂。他们展示了在上皮CD44v6上瞄准了锡亚利刘易斯A甘油后，在受到急性DSS挑战的小鼠中降低疾病活动指数评分和改善HSC，证实了CD44变种的转化后修改对于DSS诱发损伤14后恢复的重要性。在另一个例子中，Reed等人15 使用慢性DSS模型研究小鼠的粘膜损伤和修复，上皮特异性删除CD47，CD47是一种对炎症和修复过程至关重要的跨膜蛋白。结肠扫描被分析和评分，以计算受伤和溃疡的百分比，如上述所述，显示明显受损的粘膜修复小鼠缺乏上皮CD4715。本报告中的慢性结肠炎模型采用DSS的周期性管理来分析随着时间的推移损伤和修复。
我们小组和其他团体的其他出版物已证明这个评分系统的优势，以及它与临床症状6，16，17的相关性。该协议详细描述了如何使用免费和易于访问的软件准备和评分瑞士卷。此处建议的评分简单性基于扫描幻灯片中仅使用两类（炎症/损伤或侵蚀/溃疡），以促进评分过程并增加可重复性。重要的是，此处描述的评分系统也与肠道炎症的临床参数相关联。总之，结肠炎评分是一种工具，可用于定量评分DSS-结肠炎，并可用于其他结肠炎模型与炎症和上皮损伤/损失有关。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢NIH资助DK055679、DK089763、DK079392、DK061739、DK072564和密歇根大学病理学幻灯片扫描服务的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
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