Summary
La puntuación sistemática de la inflamación intestinal utilizando un sistema asistido por computadora libre es una poderosa herramienta para comparar cuantitativamente los cambios histopatológicos en los modelos de colitis caracterizados por la presencia de úlceras y cambios inflamatorios. La evaluación de la puntuación de colitis histológica fortalece las observaciones clínicas y facilita la interpretación de los datos.
Abstract
Los modelos de colitis murina son herramientas que se emplean ampliamente en estudios centrados en la comprensión de la patobiología de los trastornos inflamatorios intestinales. Sin embargo, quedan por definir normas sólidas para la cuantificación objetiva y reproducible de la gravedad de la enfermedad. La mayoría de los métodos de análisis de colitis se basan en una puntuación histológica limitada de pequeños segmentos del intestino, lo que conduce a análisis parciales o sesgados. Aquí, combinamos la adquisición de imágenes de alta resolución y el análisis longitudinal de todo el colon para cuantificar la lesión intestinal y la ulceración en el modelo inducido de sulfato sódico dextrano (DSS) de colitis murina. Este protocolo permite la generación de resultados objetivos y reproducibles sin una amplia formación del usuario. Aquí, proporcionamos detalles completos sobre la preparación de muestras y el análisis de imágenes utilizando ejemplos de datos de colitis inducida por DSS. Este método se puede adaptar fácilmente a otros modelos de colitis murina que tienen inflamación significativa asociada con lesiones mucosa. Demostramos que la fracción de mucosa inflamada/lesionada y erosionada/ulcerada en relación con la longitud completa del colon es paralela a los hallazgos clínicos como la pérdida de peso en medio de la progresión de la enfermedad inducida por el SSD. Este protocolo histológico proporciona un tiempo fiable y una ayuda rentable para estandarizar los análisis de la actividad de la enfermedad de una manera imparcial en los experimentos de colitis del SDS.
Introduction
La barrera epitelial gastrointestinal desempeña un papel fundamental en la separación de antígenos luminales y patógenos de los compartimentos de tejido subyacentes1. Las lesiones epiteliales y las heridas mucosas observadas en condiciones patológicas como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la isquemia o lesiones quirúrgicas están asociadas con síntomas clínicos que incluyen diarrea, pérdida de peso, sangre en las heces y dolor abdominal. En respuesta a lesiones, las células epiteliales migran y proliferan para volver a epitelializar y reparar defectos de barrera mucosa. La resolución de la inflamación y restitución de la integridad mucosa son cruciales para restablecer la homeostasis mucosa intestinal y la función2,3,4.
Se han empleado varios modelos animales para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes que están asociados con el daño a la barrera epitelial intestinal. Modelos bien establecidos y fácilmente aplicables de colitis inducida químicamente son ampliamente utilizados, particularmente en estudios relacionados con lesiones inflamatorias como la EII. Un modelo de colitis de murina común, reproducible y confiable emplea sulfato de sodio dextrano (DSS) mediación de lesiones en colones e inflamación. La gravedad de la enfermedad varía dependiendo de la cepa del ratón, dosis de DSS, duración de la administración del SSD y peso molecular del DSS5,6,7.
El daño de la mucosa intestinal durante la colitis del SDS generalmente se evalúa utilizando el Índice de Actividad de la Enfermedad (DAI, por suspens), una puntuación compuesta determinada por la pérdida de peso, el contenido de sangre fecal y la consistencia de las heces. El contenido sanguíneo fecal puede ser microscópico (detectado usando una prueba de ácido guaiac de heces) o macroscópico; consistencia fecal se clasifica como dura, suave o líquida (es decir, diarrea)5,8. La puntuación de estos parámetros clínicos puede ser subjetiva y puede variar dependiendo de la experiencia y el sesgo del usuario, aunque en general, los datos proporcionan información fiable y por lo tanto es ampliamente utilizado por los investigadores del EII. Por el contrario, no existe un método generalmente aceptado para la evaluación histológica del daño mucoso. Más comúnmente, las áreas seleccionadas del colon son inspeccionadas por un patólogo entrenado y puntuadas en base a varios parámetros que generalmente incluyen lesión de cripta e infiltración de leucocitos9,10,11. Sin embargo, debido a que el número de parámetros investigados y la cantidad de tejido analizado varía considerablemente entre los informes individuales, la comparabilidad de muchos estudios publicados es limitada. Para reducir el sesgo de los observadores y mejorar la concordancia entre estudios, un protocolo de puntuación histológica ideal debe: 1) incluir toda la longitud del colon, ya que la inflamación de la mucosa intestinal es más a menudo variable y las lesiones de salto son comunes, 2) limitar el análisis a parámetros clave específicos y fácilmente interpretables para reducir la subjetividad, 3) facilitar el procesamiento rápido y consistente de un gran número de muestras, y 4) utilizar herramientas ampliamente disponibles y asequibles para la adquisición, análisis y presentación de datos.
Aquí describimos una técnica para procesar segmentos enteros de colon o largos del intestino delgado en una configuración de "rollo suizo" junto con el uso de un sistema gratuito de puntuación asistida por computadora para analizar la inflamación y el daño de la mucosa intestinal debido a la colitis inducida por el DSS.
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Protocol
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Michigan.
1. Cosecha de tejidos
- Eutanasia ratones humanamente usando anestesia isoflurano seguida de dislocación cervical, de acuerdo con los protocolos aprobados. Para todos los experimentos con animales, la aprobación fue obtenida por una junta de revisión certificada de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales para el manejo de animales.
- Coloque el ratón en una almohadilla de disección en una posición supina. Inmovilizar las extremidades del ratón utilizando agujas G de 20 G x 1 1/2 pulgada G.
- Usando fórceps y tijeras, haz una pequeña incisión en la piel abdominal y tira de ella hacia un lado para exponer el peritoneo.
- Abra la cavidad abdominal con una incisión de línea media en el peritoneo desde el hueso púbico hasta los lados del abdomen.
- Retire cuidadosamente los tejidos y órganos hasta que se visualice el intestino grueso. Corte el hueso pélvico a ambos lados del colon para visualizar completamente el órgano, extendiéndose desde el ano hacia el cecum.
- Retire suavemente la grasa, las venas pequeñas y las arterias unidas al colon, mientras disecciona cuidadosamente el órgano, cortando sólo proximal al ano y simplemente distal al cecum.
NOTA: El colon diseccionado debe permanecer a temperatura ambiente mientras se completa el procedimiento de balanceo suizo. - Enjuague cuidadosamente el colon con 1x PBS, utilizando una aguja de gavage de plástico flexible insertada a través del ano para eliminar el contenido fecal.
- Coloque el colon en línea recta y abra longitudinalmente a lo largo de la arteria mesenterica. Bisect el colon longitudinalmente desde el distal hasta el extremo proximal (Figura 1A). La mitad del tejido se puede utilizar para el análisis histológico, mientras que el otro se puede procesar para la mancha occidental, PCR o enrollado en un segundo rollo suizo para la microscopía de inmunofluorescencia congelada fresca12.
2. Preparación de rollos suizos
- Recorte el tejido adicional del colon proximal usando una cuchilla de afeitar hasta que se obtenga aproximadamente la misma anchura a lo largo de la longitud de todo el colon.
- Alinee el colon para exponer el lúmenes de frente hacia arriba, y aplane el tejido completamente usando una aguja de gavage flexible. Agregue más PBS, si es necesario, para mantener el tejido húmedo durante todo el procedimiento.
- Retire el exceso de PBS con una toallita de papel. Con una aguja de jeringa y gavage, agregue una solución de formalina tamponada neutra al 10% sobre el tejido durante 2-3 minutos para arreglar y aplanar el tejido.
- Utilice fórceps rectos para agarrar el extremo del dos punto distal y girar el dos punto en círculos concéntricos desde el extremo distal hasta el proximal (Figura 1B).
NOTA: Es posible empujar hacia atrás el interior del rollo suizo mientras se enrolla usando el dedo índice para asegurarse de que el tejido está dentro del rollo. - Inserte una aguja de 27 G para fijar el colon en el medio para mantener su forma de rollo suizo (Figura 1C).
- Coloque el rollo suizo con la aguja en un casete de incrustación dentro de un recipiente histológico de la muestra.
NOTA: El tejido debe orientarse en paralelo con respecto al cassette antes de la fijación (Figura 1D). - Fijar el tejido en 10% solución de formalina amortiguada neutra durante la noche a 4 °C13.
- Después de la fijación durante la noche, lave el tejido 3 veces con PBS.
- Agregue un 70% de etanol al tejido antes del proceso de incrustación de parafina. Retire la aguja del rollo suizo antes de continuar. El tejido se puede almacenar en etanol a temperatura ambiente hasta la incrustación de parafina13.
- Coloque las muestras en el procesador de tejido, incrustadas en parafina, y prepare secciones de 4 μm, montadas en diapositivas de microscopía cargadas positivamente(Figura 1E). Esto puede ser un punto de parada opcional.
NOTA: La orientación adecuada del tejido es fundamental para lograr secciones adecuadas para el análisis de imágenes. La incrustación paralela del rollo suizo en el casete de parafina dará como resultado secciones completas apropiadas para el análisis de imágenes (Figura 1F-1H). Se deben evitar secciones oblicuas para evitar secciones incompletas (Figura 1I-1K). Para obtener más información, consulte la sección Discusión. - Mancha secciones con hematoxilina y eosina (H&E)13.
3. Escaneo y análisis digital
NOTA: Para una evaluación precisa de los cambios de la mucosa, seleccione solo las secciones que incluyan al menos el 90% de la longitud total del colon.
- Escanee secciones manchadas utilizando un escáner de diapositivas o un imager (consulte Tabla de materiales). Las imágenes producidas necesitan una resolución de 0,25 micras por píxel con un objetivo de 40x y una ampliación de 40x.
- Instale y descargue un software adecuado para el análisis digital de diapositivas escaneadas (consulte Tabla de materiales).
- Abra imágenes escaneadas en el software de procesamiento de imágenes (Figura 2A). Compruebe que todo el punto es visible y que no faltan áreas de la muestra.
- Active las herramientas de imager de etiquetas y barra de escala para identificar correctamente las diapositivas escaneadas haciendo clic en Label imager (Figura 2A).
- Abra la herramienta de anotaciones haciendo clic en Anotaciones(Figura 2A) y cree 3 capas diferentes haciendo clic en Nueva capa (Figura 2B) para cuantificar la longitud total del rollo suizo, inflamación / lesión, y erosión / ulceración. Elija un color diferente para cada capa haciendo clic en Color de capa ( Figura2B).
- Mida la longitud de cada capa/categoría haciendo clic en la herramienta Pluma(Figura 2A),utilizando la mucosa muscularis como referencia:
- Ver la imagen a 400 μm zoom (o más) para facilitar la visualización adecuada de la mucosa muscularis.
NOTA: La ampliación se controla fácilmente utilizando la rueda de desplazamiento del ratón y tendrá que ajustarse según sea necesario mientras se mueve a través de la sección para dibujar todas las líneas. - Haga clic en la herramienta Pluma para dibujar una línea siguiendo la mucosa muscularis(Figura 2A). Mueva el puntero según sea necesario para visualizar el área adyacente para su análisis.
NOTA: Cada vez que se detenga el lápiz, se generará una nueva región de capa pequeña. Se puede visualizar y editar con la pestaña Regiones de capa (seleccione el segmento deseado y haga clic en Eliminar capa en caso de errores o correcciones, Figura 2B).
- Ver la imagen a 400 μm zoom (o más) para facilitar la visualización adecuada de la mucosa muscularis.
- Una vez definidas todas las capas(Figura 2C),exporte los datos mediante el botón Exportar cuadrícula a archivo de texto dentro de las opciones de regiones de capa ( Figura2B).
NOTA: Guarde archivos a menudo mientras crea las capas para asegurarse de que los datos se almacenan correctamente. - Abra los archivos de texto y copie los datos con un software de hoja de cálculo. Totalizar todos los segmentos de cada región y calcular el porcentaje de lesiones y ulceración con respecto a la longitud total.
- Para calcular la Puntuación de Colitis Histológica (HCS) y evaluar la gravedad de la enfermedad, considere tres características principales como se detalla a continuación.
- Compruebe si hay mucosa intestinal saludable que se caracteriza por células epiteliales organizadas en el eje cripta-luminal, propria lamina con pocas células inmunes, y mucosa musculares subyacentes que interconecta la mucosa y la submucosa(Figura 3A).
- Compruebe si hay inflamación/lesión que se caracteriza por criptas epiteliales atenuadas o parcialmente faltantes de células epiteliales e inflamación mucosa con infiltración de neutrófilos en criptas (Figura 3B).
- Compruebe la presencia de erosión/ulceración que se caracteriza por áreas desprovistas de epitelio superficial o zonas completamente carentes de criptas epiteliales con o sin leucocitos asociados(Figura 3C).
- Calcule el HCS de las regiones lesionadas y ulceradas expresadas como porcentaje de la longitud total en la siguiente fórmula:
NOTA: El HCS combina el porcentaje de inflamación/lesión y erosión/ulceración añadiendo un factor de dos a este último, basado en una suposición razonable de que la pérdida completa del epitelio resulta en la pérdida máxima de la integridad de la barrera y, por lo tanto, en una enfermedad peor. El HCS representa constantemente los cambios morfológicos causados por la colitis experimental inducida por DSS. Curiosamente, no hemos visto una correlación clara entre el número de agregados linfoides colonicos o folículos y la gravedad de la enfermedad clínica en la colitis del SDS y, por lo tanto, no incluimos la cuantificación en este análisis. - Tome una instantánea de las imágenes representativas (haga clic en Instantánea, Figura 2A)y guárdela. Incluya barras de escala si es necesario haciendo clic en Mostrar u ocultar barra de escala ( Figura2A).
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Representative Results
Para ilustrar la fiabilidad de este análisis histológico de puntuación de colitis en el contexto de daño mucosa después del desafío DSS y posterior recuperación de la colitis, administramos 2.5% DSS en el agua potable de ocho ratones macho de 10 semanas C57BL6 tipo salvaje durante 5 días seguido de un período de recuperación con agua regular durante 5 días. No hubo ningún cambio en el peso corporal durante la administración aguda del DSS, desde el día 0 hasta el 5(Figura 4A). El peso corporal disminuyó drásticamente después del día 5, cuando los ratones comenzaron a beber agua del grifo regular. La sangre y las heces blandas aparecieron después de 3 días de administración del SSD y continuaron durante los siguientes 3 días en el agua hasta el día 8 del experimento(Figura 4B). Estas observaciones sugirieron que los efectos más perjudiciales de la exposición al SSD se observaron durante el período de recuperación entre los días 5 y 8. La medición de la longitud del colon el día 10 confirmó un acortamiento significativo al final del experimento (Figura 4C). Los colones fueron cosechados en los días 0, 2, 5, 7, 8 y 10 para hacer rollos suizos de parafina. Se tiñó tejido con H&E y se analizaron escaneos de alta definición(Figura 4D)para calcular la Puntuación de Colitis Histológica(Figura 4E)y porcentaje de lesiones y ulceración(Figura 4F).
La Figura 4D muestra la arquitectura normal de la cripta en ratones C576BL6 sin tratar, superficial a la mucosa muscularis y apoyado por la propria lamina (día 0, flecha). Después de 2 días de administración del SSD, se observó el reclutamiento de células inmunes (día 2, flecha). El día 5, las células epiteliales aparecieron dañadas, y hubo una infiltración de neutrófilos a través del epitelio (criptoitis) asociado con lesión epitelial (día 5, flecha). Desde el día 5 hasta los 8, se observaron áreas de pérdida epitelial con inflamación y ulceración (días 7 y 8, flechas). Este último se observa comúnmente como los ratones beben agua del grifo regular durante la fase de recuperación. Finalmente, las células epiteliales comienzan a regenerarse y repoblar áreas ulceradas, restaurando lentamente la mucosa colonica en el día 10 (flecha).
El HCS refleja de cerca la simple evaluación del porcentaje de inflamación/lesión y erosión/ulceración, y ambos demuestran cuantitativamente que hay daños significativos en el colon de ratones durante la recuperación del DSS en el día 5 al 10, que se correlaciona con erosiones epiteliales e infiltración de leucocitos que se muestra en la Figura 4D. Los datos proporcionados por HCS distinguen entre la gravedad de la enfermedad con respecto a la inflamación asociada con la lesión epitelial frente a la erosión /ulceración.
Estas observaciones demuestran que el sistema de puntuación sistemática del HCS propuesto en este protocolo constituye una herramienta fiable para cuantificar el daño mucoso.
Figura 1: La preparación de la muestra es crucial para un análisis preciso de los datos. (A) Colon distal completamente extendido y abierto a lo largo de la arteria mesenterica. (B) Proceso de rodadura suizo. (C) Inserción de aguja para mantener la forma del rollo suizo (D) casete de incrustación de parafina. (E) Bloque de parafina. (F) Orientación paralela del rollo suizo para evitar secciones parciales. (G) Rollo suizo completo, barra de escala: 2 mm. (H) Sección ideal de criptas en colones, barra de escala: 80 μm. (I) Orientación de rollo suizo oblicuo. (J) Rollo suizo incompleto, barra de escala: 2mm. (K) Sección oblicua de criptas en colones, barra de escala: 80 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación cuantitativa de daños en la mucosa. (A) Barra de herramientas básica con instantánea, control deslizante de zoom, mostrar / ocultar barra de escala / ejes / cuadrícula, imager de etiquetas, anotaciones, y características de la herramienta pluma, entre otros. B) Menú anotaciones que muestra el color de la capa, nueva capa, capa de eliminación, mostrar /ocultar capa, eliminar región y exportar cuadrícula a los botones del archivo de texto. (C) Visión general de la longitud total, capas lesionadas y ulceradas, barra de escala: 3 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Morfología de la mucosa intestinal del ratón manchada con hematoxilina &eosina después de la colitis aguda DSS-experimental seguida de la recuperación. (A) Células intestinales sanas organizadas en criptas cíclicas rodeadas de propria lamina y separadas de la submucosa por la mucosa muscularis, barra de escala: 200 μm. (B) Inflamación mucosa aguda o lesión con infiltración de neutrófilos en la mucosa y cripta epitelio, asociado con distorsión/pérdida epitelial cripta y atenuación epitelial, barra de escala: 200 μm. (C) Áreas ulceradas o erosionadas con pérdida epitelial completa e inflamación asociada., barra de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Colitis histológica Puntuación y porcentaje de lesiones y ulceración se correlaciona con el peso corporal y el índice de heces durante la colitis experimental DSS: (A) El peso corporal yb) los índices de heces se evalúan diariamente en ratones de tipo salvaje tratados con 2,5% DSS durante 5 días (línea roja), seguidos de 5 días de recuperación en agua (línea negra). Los datos son representativos de dos experimentos independientes con al menos 4 ratones por grupo y se expresan como media ± SEM. Significance está determinado por la comparación múltiple bidireccional de ANOVA y Sidak, *p<00.033, **p<0002 y ***p<0.001. (C) La longitud del colon de los ratones se midió en el día 10. Los datos son representativos de dos experimentos independientes con al menos 3 ratones por grupo y se expresan como media ± SEM<. (D) Se analizaron secciones de tejido manchado de hematoxilina y eosina (H&E) de mucosa colonica para calcular, barras de escala: 60 μm. (E) Puntuación de colitis histológica (HCS) y porcentaje de lesión/ulceración en relación con la longitud del colon. Los datos son representativos de dos experimentos con 2 ratones por grupo y se expresan como media ± SEM. Significance está determinado por la comparación múltiple unidireccional de ANOVA y Tukey, *p<0.033, **p<0.002 y ***p<0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro sistema de puntuación de colitis histológica constituye una herramienta confiable para cuantificar la inflamación del tejido y el daño en el intestino. Este enfoque proporciona una mejor comprensión del estado histopatológico de todo el órgano sin el sesgo de seleccionar áreas pequeñas o secciones incompletas. Entre los pasos críticos para ejecutar con éxito este protocolo se encuentran la preparación adecuada de rollos suizos que permiten el análisis de al menos el 90% de la longitud del colon; orientación paralela durante la incrustación y sección de parafinas para garantizar secciones de tejido rectas y uniformes con vistas longitudinales de las criptas epiteliales; práctica y capacitación con la supervisión de un patólogo experimentado para confirmar que los aprendices identifican las diferencias entre inflamación aguda, lesión epitelial y erosión / ulceración; y acceso a un escáner digital de alta resolución.
Se requieren pequeños ajustes y solución de problemas para orientar adecuadamente el rollo suizo durante la incrustación de parafina, así como durante la sección para asegurarse de que el tejido está orientado paralelamente en relación con el casete y la hoja de parafina (Figura 1E-F). Adherirse a esta orientación espacial reducirá el número de secciones incompletas. Si el colon está perfectamente enrollado sobre sí mismo, las mejores secciones, incluida la mayor parte de la longitud del tejido, se ubicarán cerca del centro del rollo suizo(Figura 1F). La recopilación de varias secciones aumenta en gran medida la posibilidad de obtener secciones bien orientadas donde toda la longitud de las criptas es visible (Figura 1G-H). Evite la sección de rollos suizos oblicuos (Figura 1I-J), caracterizado por criptas de forma circular o rosquillas de cripta (Figura 1K). A menudo se recomienda encarecidamente visualizar las secciones recogidas bajo el microscopio para garantizar una técnica adecuada. Una buena sección captura toda la longitud del dos punto.
Cualquier instrumento que permita capturar toda la longitud del rollo suizo y proporciona la resolución necesaria para magnificar el tejido para visualizar la arquitectura de la cripta es adecuado para la evaluación del HCS. Algunos microscopios permiten la superposición de imágenes pequeñas y reconstruyen secciones de tejido enteras. Sin embargo, la resolución de estas imágenes podría ser pobre después de aumentar la ampliación para puntuar el tejido. Además, la superposición de secciones puede no ser perfecta, dejando áreas de tejido que no están bien definidas e imposibles de puntuar con precisión.
Entre las ventajas del protocolo de puntuación propuesto aquí están la clasificación del tejido en sólo dos categorías de inflamación / lesión o erosión / ulceración. Esto simplifica y acelera la clasificación del daño tisular, al tiempo que aumenta la reproducibilidad. El software utilizado para el análisis es accesible, gratuito y fácil de usar. El HCS refleja con precisión el daño de la mucosa, ya que permite cuantificar las áreas ulceradas a lo largo de toda la longitud del colon y proporciona adecuadamente más peso hacia esta patología sobre las regiones inflamadas y no ulceradas. Esto se refleja claramente cuando se comparan los datos del HCS frente al porcentaje de lesión/ulceración (Figura 4E-F). El análisis de puntuación de cada muestra tarda aproximadamente 40 minutos. Con la formación adecuada, el acceso a diapositivas escaneadas, una computadora y el software, la mayoría de los investigadores pueden realizar el análisis. Sin embargo, siempre es recomendable confirmar los resultados de puntuación con un patólogo para garantizar la precisión y reproducibilidad. La evaluación de la inflamación intestinal se puede realizar con cualquier software que permita una ampliación de alta resolución de diapositivas y mediciones de longitud; sin embargo, para simplificar, en este protocolo nos centramos en el software que aparece en la Tabla de Materiales.
Hemos estado utilizando este sistema de puntuación para analizar con éxito la enfermedad a través de varios experimentos de colitis DSS. Por ejemplo, Kelm et al.14 exploraron la importancia de la glicosilación del CD44v6, un importante regulador de la migración epitelial y la proliferación, utilizando un anticuerpo novedoso (GM35). Demostraron una reducción de la puntuación del índice de actividad de la enfermedad y una mejora del HSC en ratones desafiados con DSS agudos después de la focalización de sialyl lewis A glicanos en CD44v6 epitelial, confirmando la importancia de la modificación post traslacional de las variantes CD44 para la recuperación después de la lesión inducida por DSS14. En otro ejemplo, Reed et al.15 utilizó un modelo crónico de DSS para estudiar lesiones mucosas y reparar en ratones con una eliminación epitelial específica de CD47, una proteína transmembrana importante para procesos inflamatorios y de reparación. Se analizaron y puntuaron las exploraciones de colon para calcular el porcentaje de lesiones y ulceración descritas anteriormente, demostrando una reparación de la mucosa marcadamente deteriorada en ratones que carecían de CD47epitelial 15. El modelo de colitis crónica en este informe empleó la administración cíclica del DSS para analizar lesiones y repararlas a lo largo del tiempo.
Publicaciones adicionales de nuestro grupo y otras han demostrado las ventajas de este sistema de puntuación y su correlación con los síntomas clínicos6,16,17. Este protocolo describe en detalle cómo preparar y puntuar rollos suizos, utilizando software gratuito y de fácil acceso. La simplicidad de la puntuación propuesta aquí se basa en el uso de sólo dos categorías (inflamación / lesión o erosión / ulceración) en diapositivas escaneadas para facilitar el proceso de puntuación y aumentar la reproducibilidad. Es importante destacar que el sistema de puntuación descrito aquí también se correlaciona con los parámetros clínicos de la inflamación intestinal. En conclusión, la Puntuación de Colitis Histológica es una herramienta que se puede utilizar para puntuar cuantitativamente DSS-colitis y se puede aplicar a otros modelos de colitis asociados con inflamación y lesión epitelial / pérdida.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer el apoyo de la financiación de los NIH DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 y los Servicios de Escaneo de Diapositivas patológicas de la Universidad de Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
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