Summary
Systematisk skåring av tarmbetennelse ved hjelp av et gratis dataassistert system er et kraftig verktøy for kvantitativt å sammenligne histopatologiske endringer i kolittmodeller preget av tilstedeværelse av sår og inflammatoriske endringer. Histologisk kolitt score evaluering styrker kliniske observasjoner og letter datatolkning.
Abstract
Murine kolittmodeller er verktøy som er mye brukt i studier fokusert på å forstå patologien til inflammatoriske tarmsykdommer. Robuste standarder for objektiv og reproduserbar kvantifisering av alvorlighetsgraden av sykdommen gjenstår imidlertid å definere. De fleste kolittanalysemetoder er avhengige av begrenset histologisk skåring av små tarmsegmenter, noe som fører til delvise eller partiske analyser. Her kombinerer vi høyoppløselig bildeoppkjøp og langsgående analyse av hele tykktarmen for å kvantifisere tarmskade og sårdannelse i det dekstranske natriumsulfatet (DSS) indusert modell av murin kolitt. Denne protokollen muliggjør generering av objektive og reproduserbare resultater uten omfattende brukeropplæring. Her gir vi omfattende detaljer om prøvepreparering og bildeanalyse ved hjelp av eksempler på data fra DSS-indusert kolitt. Denne metoden kan lett tilpasses andre modeller av murin kolitt som har betydelig betennelse forbundet med slimhinneskade. Vi viser at brøkdelen av betent/skadet og erodert/sårslimhinne i forhold til den totale lengden på tykktarmen paralleller nøye kliniske funn som vekttap blant DSS-indusert sykdomsprogresjon. Denne histologiske protokollen gir et pålitelig tids- og kostnadseffektivt hjelpemiddel for å standardisere analyser av sykdomsaktivitet på en objektiv måte i DSS-kolitteksperimenter.
Introduction
Den gastrointestinale epitelbarrieren spiller en sentral rolle i å skille lysende antigener og patogener fra underliggende vevsrom1. Epitelskade og slimhinnesår sett i patologiske tilstander som inflammatorisk tarmsykdom (IBD), iskemi eller kirurgisk skade er forbundet med kliniske symptomer som inkluderer diaré, vekttap, blod i avføring og magesmerter. Som svar på skade migrerer epitelceller og sprer seg for å re-epitelialisere og reparere mucosal barrierefeil. Oppløsning av betennelse og restitusjon av mucosal integritet er avgjørende for å gjenopprette intestinal mucosal homeostase og funksjon2,3,4.
Ulike dyremodeller har blitt brukt til å studere de underliggende molekylære mekanismene som er forbundet med skaden på tarmepitelbarrieren. Veletablerte og lett anvendelige modeller av kjemisk indusert kolitt er mye brukt, spesielt i studier relatert til inflammatorisk skade som IBD. En vanlig, reproduserbar og pålitelig murin kolitt modell bruker dextran natriumsulfat (DSS) mediert kolonisyreskade og betennelse. Alvorlighetsgraden av sykdommen varierer avhengig av musestamme, dose DSS, lengde på DSS-administrasjon og molekylvekt av DSS5,6,7.
Intestinal slimhinneskade under DSS-kolitt evalueres vanligvis ved hjelp av Disease Activity Index (DAI), en sammensatt poengsum bestemt av vekttap, fekalt blodinnhold og avføringskonsistens. Fekalt blodinnhold kan være mikroskopisk (oppdaget ved hjelp av en avføring guaiac acid test) eller makroskopisk; fekal konsistens er klassifisert som hard, myk eller flytende (dvs. diaré)5,8. Skåring av disse kliniske parametrene kan være subjektiv og kan variere avhengig av brukerens erfaring og skjevhet, selv om dataene generelt gir pålitelig informasjon og dermed er mye brukt av IBD-forskere. Derimot er det ingen allment akseptert metode for histologisk evaluering av slimhinneskade. Vanligvis blir utvalgte områder av tykktarmen inspisert av en trent patolog og scoret basert på flere parametere som vanligvis inkluderer kryptskade og leukocyttinfiltrasjon9,10,11. Men fordi antallet undersøkte parametere og mengden vev som analyseres varierer betydelig mellom individuelle rapporter, er sammenlignbarheten til mange publiserte studier begrenset. For å redusere observatørbias og forbedre konkordansen mellom studiene, bør en ideell histologisk scoringsprotokoll: 1) inkludere hele tykktarmens lengde, da tarmmukosal betennelse oftest er variabel og hopp over lesjoner er vanlig, 2) begrense analysen til spesifikke viktige og lett fortolkelige parametere for å redusere subjektivitet, 3) legge til rette for rask, konsistent behandling av et stort antall prøver, og 4) bruke allment tilgjengelige og rimelige verktøy for datainnsamling, analyse og presentasjon.
Her beskriver vi en teknikk for å behandle hele tykktarmen eller lange segmenter av tynntarmen i en "swiss roll" -konfigurasjon sammen med bruk av et gratis dataassistert skåringssystem for å analysere tarmmukosal betennelse og skade på grunn av DSS-indusert kolitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk som er beskrevet ble godkjent av University of Michigan's Committee on the Use and Care of Animals.
1. Vevshøsting
- Euthanize mus humant ved hjelp av isofluran anestesi etterfulgt av cervical dislokasjon, i samsvar med godkjente protokoller. For alle dyreforsøk ble godkjenning innhentet av et sertifisert kontrollutvalg i samsvar med nasjonale og institusjonelle retningslinjer for dyrehåndtering.
- Plasser musen på en dissekeringspute i en liggende stilling. Immobiliser museekstremiteter ved hjelp av 20 G x 1 1/2-tommers G nåler.
- Bruk tang og saks, lag et lite snitt på bukhuden og trekk den til siden for å eksponere bukhinnen.
- Åpne bukhulen med et midtlinje snitt i bukhinnen fra kjønnsbenet til sidene av magen.
- Fjern forsiktig vev og organer til tykktarmen er visualisert. Klipp bekkenbenet på begge sider av tykktarmen for å visualisere orgelet fullt ut, som strekker seg fra anus mot cecum.
- Fjern forsiktig fett, små årer og arterier festet til tykktarmen, mens du forsiktig dissekerer orgelet, kutter bare proksimalt til anus og bare distal til cecum.
MERK: Den dissekerte kolon bør forbli ved romtemperatur mens du fullfører den sveitsiske rulleprosedyren. - Skyll forsiktig tykktarmen med 1x PBS, ved hjelp av en fleksibel plast gavage nål satt inn gjennom anus for å fjerne fekalt innhold.
- Plasser tykktarmen i en rett linje, og åpne langsgående langs den mesenteriske arterien. Skjær tykktarmen langsgående fra den distale til den proksimale enden (Figur 1A). Den ene halvdelen av vevet kan brukes til histologisk analyse mens den andre kan behandles for vestlig blotter, PCR eller rulles inn i en annen sveitsisk rulle for fersk frossen immunfluorescensmikroskopi12.
2. Forberedelse av sveitsiske ruller
- Trim ekstra vev fra den proksimale tykktarmen ved hjelp av et barberblad til omtrent samme bredde langs hele tykktarmen oppnås.
- Juster tykktarmen for å eksponere lumen vendt opp, og flat vevet helt ved hjelp av en fleksibel gavage nål. Tilsett mer PBS, om nødvendig, for å holde vevet fuktig gjennom hele prosedyren.
- Fjern overflødig PBS ved hjelp av en papirsletting. Med en sprøyte og gavage nål, tilsett 10% nøytral bufret formalinoppløsning over vevet i 2-3 min for å fikse og flate vevet.
- Bruk rette tang til å gripe enden av det distale tykktarmen og vri tykktarmen i konsentriske sirkler fra den distale til proksimale enden (figur 1B).
MERK: Det er mulig å skyve innsiden av den sveitsiske rullen tilbake mens du ruller med pekefingeren for å sikre at vevet er inne i rullen. - Sett inn en 27 G nål for å feste kolonet i midten for å holde den sveitsiske rulleformen (Figur 1C).
- Plasser den sveitsiske rullen med nålen i en innbyggingskassett inne i en histologisk prøvebeholder.
MERK: Vevet må orienteres parallelt med kassetten før fiksering (Figur 1D). - Fest vevet i 10% nøytral bufret formalinoppløsning over natten ved 4 °C13.
- Etter overnatting fiksering, vask vevet 3x med PBS.
- Tilsett 70% etanol i vevet før parafininnbyggingsprosessen. Fjern nålen fra den sveitsiske rullen før du fortsetter. Vev kan lagres i etanol ved romtemperatur til parafininnbygging13.
- Plasser prøver i vevsprosessoren, legg inn i parafin og lag 4 μm seksjoner, montert på positivt ladede mikroskopilyder (Figur 1E). Dette kan være et valgfritt stoppepunkt.
MERK: Riktig vevsorientering er avgjørende for å oppnå seksjoner som er egnet for bildeanalyse. Parallell sveitsisk rullinnbygging i parafinkassetten vil resultere i fullstendige deler som passer for bildeanalyse (Figur 1F-1H). Skrå avsnitt må unngås for å unngå ufullstendige avsnitt (Figur 1I-1K). Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se diskusjonsdelen. - Flekkseksjoner med hematoksylin og eosin (H&E)13.
3. Digital skanning og analyse
MERK: For nøyaktig evaluering av slimhinneendringer, velg bare seksjoner som inneholder minst 90% av den totale kolonlengden.
- Skann fargelagte deler ved hjelp av en lysbildeskanner eller imager (se Tabell over materialer). Produserte bilder trenger en oppløsning på 0,25 mikron per piksel med 40x objektiv og 40x forstørrelse.
- Installer og last ned en passende programvare for digital analyse av skannede lysbilder (se Tabell over materialer).
- Åpne skannede bilder i bildebehandlingsprogramvaren (Figur 2A). Kontroller at hele kolonet er synlig, og at det ikke mangler områder i prøven.
- Aktiver etikettbilde- og skaleringslinjeverktøyene for å identifisere skannede lysbilder på riktig måte ved å klikke Etikett imager (Figur 2A).
- Åpne merknadsverktøyet ved å klikke Merknader, (Figur 2A) og opprett 3 forskjellige lag ved å klikke Nytt lag (Figur 2B) for å kvantifisere den totale lengden på den sveitsiske rullen, betennelse/skade og erosjon/sårdannelse. Velg en annen farge for hvert lag ved å klikke Lagfarge (Figur 2B).
- Mål lengden på hvert lag/kategori ved å klikke pennverktøyet (Figur 2A), ved hjelp av slimhinnen som referanse:
- Vis bildet ved 400 μm zoom (eller mer) for å lette tilstrekkelig visualisering av muskelslimhinnen.
MERK: Forstørrelsen styres enkelt ved hjelp av rullehjulet på musen, og må justeres etter behov mens du beveger deg over seksjonen for å tegne alle linjene. - Klikk pennverktøyet for å tegne en linje etter slimhinnen (Figur 2A). Flytt pekeren etter behov for å visualisere det tilstøtende området for analyse.
MERK: Hver gang pennen stoppes, genereres et lite nytt lagområde. Det kan visualiseres og redigeres med kategorien Lagområder (velg ønsket segment og klikk Slett lag i tilfelle feil eller rettelser, figur 2B).
- Vis bildet ved 400 μm zoom (eller mer) for å lette tilstrekkelig visualisering av muskelslimhinnen.
- Når alle lagene (Figur 2C) er definert, eksporterer du dataene ved hjelp av knappen Eksporter rutenett til tekstfil i alternativene for lagområder (Figur 2B).
MERK: Lagre filer ofte mens du oppretter lagene for å sikre at dataene lagres riktig. - Åpne tekstfilene og kopier dataene med en regnearkprogramvare. Totalt alle segmentene fra hver region og beregn prosentandel av skade og sårdannelse med hensyn til total lengde.
- For å beregne Histological Colitis Score (HCS) og for å evaluere alvorlighetsgraden av sykdommen, bør du vurdere tre hovedkarakteristikker som beskrevet nedenfor.
- Se etter sunn tarmslimhinne som er preget av organiserte epitelceller i krypt-luminalaksen, lamina propria med få immunceller og subjacent muscularis mucosa som grensesnitter slimhinnen og submucosa (Figur 3A).
- Se etter betennelse/skade som er preget av epitelkrypter som er svekket eller delvis mangler epitelceller og slimhinnebetennelse med nøytrofil infiltrasjon i krypter (Figur 3B).
- Kontroller om det finnes erosjon/sårdannelse som er preget av områder uten overflateepite eller områder som mangler epitelkrypter med eller uten tilhørende leukocytter (Figur 3C).
- Beregn HCS av skadede og ulcererte regioner uttrykt som en prosentandel av den totale lengden i følgende formel:
MERK: HCS kombinerer prosentandelen av betennelse/skade og erosjon/sårdannelse som gir en faktor på to til sistnevnte, basert på en rimelig antagelse om at fullstendig tap av epitelet resulterer i maksimalt tap av barriereintegritet og dermed verre sykdom. HCS representerer konsekvent de morfologiske endringene forårsaket av DSS indusert eksperimentell kolitt. Interessant nok har vi ikke sett en klar sammenheng mellom antall koloniale lymfoide aggregater eller follikler og klinisk sykdom alvorlighetsgrad i DSS kolitt, og derfor inkluderte vi ikke kvantifiseringen i denne analysen. - Ta et øyeblikksbilde av de representative bildene (klikk Øyeblikksbilde, Figur 2A), og lagre. Inkluder skalalinjer om nødvendig ved å klikke Vis/skjul skaleringslinje (Figur 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å illustrere påliteligheten til denne histologiske kolitt-scoreanalysen i sammenheng med slimhinneskade etter DSS-utfordring og påfølgende gjenoppretting fra kolitt, administrerte vi 2,5% DSS i drikkevannet til åtte 10 uker gamle mannlige C57BL6 villtypemus i 5 dager etterfulgt av en gjenopprettingsperiode med vanlig vann i 5 dager. Det var ingen endring i kroppsvekt under akutt administrering av DSS, fra dag 0 til 5 (figur 4A). Kroppsvekten ble dramatisk redusert etter dag 5, da mus begynte å drikke vanlig vann fra springen. Blod og myke avføring dukket opp etter 3 dager med DSS-administrasjon og fortsatte i de påfølgende 3 dagene på vann til dag 8 av eksperimentet (Figur 4B). Disse observasjonene antydet at de mest skadelige effektene av eksponering for DSS ble observert i utvinningsperioden mellom dag 5 og 8. Måling av kolonlengden på dag 10 bekreftet en betydelig forkortelse på slutten av eksperimentet (Figur 4C). Kolon ble høstet på dag 0, 2, 5, 7, 8 og 10 for å lage parafin sveitsiske ruller. Vev ble farget med H&E og HD-skanninger (figur 4D) ble analysert for å beregne histologisk kolitt score (figur 4E) og prosentandel av skade og sårdannelse (Figur 4F).
Figur 4D viser normal kryptarkitektur hos ubehandlede C576BL6-mus, overfladisk for muskelslimhinnen og støttet av lamina propria (dag 0, pil). Etter 2 dager med DSS-administrasjon ble det observert rekruttering av immunceller (dag 2, pil). På dag 5 oppstod epitelceller skadet, og det var en infiltrasjon av nøytrofiler over epitelet (kryptolitt) forbundet med epitelskade (dag 5, pil). Fra dag 5 til 8 ble områder med epiteltap med betennelse og sårdannelse notert (dag 7 og 8, piler). Sistnevnte observeres ofte når musene drikker vanlig vann fra springen under utvinningsfasen. Til slutt begynner epitelceller å regenerere og repopulate sårerte områder, sakte gjenopprette kolonislimhinnen på dag 10 (pil).
HCS gjenspeiler nøye enkel vurdering av prosentandel av betennelse / skade og erosjon / sårdannelse, og begge viser kvantitativt at det er betydelig skade på musens kolon under utvinning fra DSS på dag 5 til 10, som korrelerer med epitelale erosjoner og leukocyttinfiltrasjon vist i figur 4D. Data fra HCS skiller mellom alvorlighetsgraden av sykdommen med hensyn til betennelse forbundet med epitelskade versus erosjon /sårdannelse.
Disse observasjonene viser at det systematiske skåringssystemet til HCS foreslått i denne protokollen utgjør et pålitelig verktøy for å kvantifisere slimhinneskade.
Figur 1: Prøvepreparering er avgjørende for nøyaktig dataanalyse. (A) Distal kolon forlenget og åpnet langs den mesenteriske arterien. (B) Sveitsisk rulleprosess. (C) Nålinnsetting for å holde sveitsisk rulleform (D) parafin innebygd kassett. (E) Paraffin blokk. (F) Sveitsisk rulle parallell orientering for å unngå delvise seksjoner. (G) Komplett sveitsisk rull, skala bar: 2 mm. (H) Ideell del av colonic krypter, skala bar: 80 μm. (I) Skrå sveitsisk rulle orientering. (J) Ufullstendig sveitsisk rull, skala bar: 2mm. (K) Skrå del av colonic krypter, skala bar: 80 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvantitativ evaluering av slimhinneskade. (A) Grunnleggende verktøylinje med blant annet Snapshot, zoomglidebryter, vis/skjul skalalinje/akser/rutenett, etikettebilder, merknader og pennverktøyfunksjoner. (B) Merknader-menyen som viser lagfarge, nytt lag, slettelag, vise/skjule lag, slette område og eksportere rutenett til tekstfilknapper. (C) Oversikt over total lengde, skadde og sårlag, skalastang: 3 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Morfologi av mus intestinal slimhinne farget med hematoksylin &eosin etter akutt DSS-eksperimentell kolitt etterfulgt av utvinning. (A) Sunne tarmceller organisert i kolonikrypter omgitt av lamina propria og skilt fra submucosa av muskelslimhinnen, skala bar: 200 μm. (B) Akutt slimhinnebetennelse eller skade med infiltrasjon av nøytrofiler i slimhinnen og krypt epitel, assosiert med krypto epitelial forvrengning / tap og epitel attenuasjon, skala bar: 200 μm. (C) Ulcerated eller erodert områder med fullstendig epitel tap og tilhørende betennelse., skala bar: 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Histologisk kolitt Score og prosentandel av skade og sårdannelse korrelerer med kroppsvekt og avføringsindeks under DSS eksperimentell kolitt: (A) Kroppsvekt og (B) avføringsindekser evalueres daglig i villtype mus behandlet med 2,5% DSS i 5 dager (rød linje), etterfulgt av 5 dager med utvinning på vann (svart linje). Data er representative for to uavhengige eksperimenter med minst 4 mus per gruppe og uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM. Signifikans bestemmes av toveis ANOVA og Sidak multippel sammenligning, * p<0.033, * * p<0.002 og *** p<0.001. (C) Kolonlengde på mus ble målt på dag 10. Data er representative for to uavhengige eksperimenter med minst 3 mus per gruppe og uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM. Signifikans bestemmes av to-tailed Student's t test, ***p<0.001. (D) Hematoksylin og eosin (H&E)-farget vevsdeler av kolonislimhinne ble analysert for å beregne, skalastenger: 60 μm. (E) Histologisk kolitt score (HCS) og prosentandel av skade / sårdannelse i forhold til tykktarmens lengde. Data er representative for to eksperimenter med 2 mus per gruppe og uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM. Signifikans bestemmes av enveis ANOVA og Tukey multisammenligning, * p<0.033, * * p<0.002 og * *** p<0.001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt Histologiske Colitis Score-system utgjør et pålitelig verktøy for å kvantifisere vevsbetennelse og skade i tarmen. Denne tilnærmingen gir en forbedret forståelse av det histopatologiske tilstanden til hele orgelet uten skjevheten ved å velge små områder eller ufullstendige seksjoner. Blant de kritiske trinnene for å utføre denne protokollen er riktig forberedelse av sveitsiske ruller som tillater analyse av minst 90% av tykktarmens lengde; parallell orientering under parafininnbygging og seksjonering for å sikre rette og ensartede vevsseksjoner med langsgående syn på epitelkrypter; praksis og trening med veiledning fra en erfaren patolog for å bekrefte at traineer identifiserer forskjellene mellom akutt betennelse, epitelskade og erosjon/sårdannelse; og tilgang til en digital skanner med høy oppløsning.
Små justeringer og feilsøking er nødvendig for å orientere den sveitsiske rullen på riktig måte under parafininnbygging samt under seksjonering for å sikre at vevet er parallellorientert i forhold til parafinkassetten og bladet (Figur 1E-F). Å følge denne romlige orienteringen vil redusere antall ufullstendige seksjoner. Hvis tykktarmen er perfekt rullet på seg selv, vil de beste seksjonene, inkludert det meste av vevslengden, være plassert nær midten av den sveitsiske rullen (Figur 1F). Innsamling av flere seksjoner øker sjansen for å oppnå godt orienterte seksjoner der hele lengden på kryptene er synlig (Figur 1G-H). Unngå å seksjonere skrå sveitsiske ruller (Figur 1I-J), som er preget av sirkulærformede krypter eller krypterte smultringer (figur 1K). Ofte anbefales visualisering av seksjonene som samles inn under mikroskopet sterkt for å sikre riktig teknikk. En god seksjon fanger hele lengden av tykktarmen.
Ethvert instrument som gjør det mulig å fange hele lengden på den sveitsiske rullen og gir oppløsningen som trengs for å forstørre vevet for å visualisere kryptarkitekturen, er tilstrekkelig for evaluering av HCS. Noen mikroskoper tillater overlapping av små bilder og rekonstruerer hele vevsseksjoner. Imidlertid kan oppløsningen på disse bildene være dårlig etter å ha økt forstørrelsen for å score vevet. I tillegg kan overlappingen av seksjoner ikke være perfekt, og etterlater områder av vev som ikke er godt definert og umulig å score nøyaktig.
Blant fordelene ved scoringsprotokollen som foreslås her er klassifiseringen av vevet i bare to kategorier betennelse / skade eller erosjon / sårdannelse. Dette forenkler og akselererer klassifiseringen av vevsskade, samtidig som reproduserbarheten økes. Programvaren som brukes til analysen er tilgjengelig, gratis og enkel å bruke. HCS reflekterer nøyaktig slimhinneskader, da det gir mulighet for kvantifisering av sårområder langs hele tykktarmens lengde og gir riktig mer vekt mot denne patologien over betente, ikke-ulcererte regioner. Dette gjenspeiles tydelig nårHCS-dataenesammenlignes med prosentandelen av skade/sårdannelse (Figur 4E-F ). Scoringsanalyse av hver prøve tar omtrent 40 minutter. Med riktig opplæring, tilgang til skannede lysbilder, en datamaskin og programvaren, kan de fleste forskere utføre analysen. Det er imidlertid alltid tilrådelig å bekrefte scoringsresultater med en patolog for å sikre nøyaktighet og reproduserbarhet. Vurdering av tarmbetennelse kan utføres med hvilken som helst programvare som tillater høyoppløselig forstørrelse av lysbilder og lengdemålinger; For enkelhets skyld fokuserte vi imidlertid på programvaren som er oppført i materialtabelleni denne protokollen.
Vi har brukt dette poengsystemet til å analysere sykdom på tvers av ulike DSS-kolitteksperimenter. For eksempel utforsket Kelm et al.14 betydningen av glykosylering av CD44v6, en viktig regulator for epitelmigrasjon og spredning, ved hjelp av et nytt antistoff (GM35). De demonstrerte redusert sykdomsaktivitetsindeks scoring og forbedret HSC hos mus utfordret med akutt DSS etter målretting av sialyl lewis A glykaner på epitelial CD44v6, som bekrefter viktigheten av postoversettelsesendring av CD44-varianter for utvinning etter at DSS induserte skade14. I et annet eksempel brukte Reed et al.15 en kronisk DSS-modell for å studere slimhinneskade og reparasjon hos mus med en epitelspesifikk sletting av CD47, et transmembranprotein som er viktig for inflammatoriske og reparasjonsprosesser. Kolonskanninger ble analysert og scoret for å beregne prosentandelen av skade og sårdannelse som beskrevet ovenfor, noe som viser markert nedsatt slimhinnereparasjon hos mus som mangler epitel-CD4715. Den kroniske kolittmodellen i denne rapporten benyttet syklisk administrering av DSS for å analysere skade og reparasjon over tid.
Ytterligere publikasjoner fra vår gruppe og andre har vist fordelene ved dette poengsystemet og dets sammenheng med kliniske symptomer6,16,17. Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du forbereder og scorer sveitsiske ruller, ved hjelp av gratis og lett tilgjengelig programvare. Enkelheten i poengsummen som foreslås her er basert på bruk av bare to kategorier (betennelse / skade eller erosjon / sårdannelse) i skannede lysbilder for å lette scoringsprosessen og øke reproduserbarheten. Viktigst, scoringssystemet beskrevet her korrelerer også med kliniske parametere for tarmbetennelse. Til slutt er Histological Colitis Score et verktøy som kan brukes til kvantitativt å score DSS-kolitt og kan brukes på andre kolittmodeller forbundet med betennelse og epitelskade / tap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra NIH-finansiering DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 og University of Michigan Pathology Slide Scanning Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
