Summary
Систематический скоринг воспаления кишечника с помощью бесплатной компьютерной системы является мощным инструментом для количественного сравнения гистопатологических изменений в моделях колита, характеризующихся наличием язв и воспалительных изменений. Оценка гистологического колита усиливает клинические наблюдения и облегчает интерпретацию данных.
Abstract
Модели мурин-колита являются инструментами, которые широко используются в исследованиях, ориентированных на понимание патобиологии воспалительных кишечных расстройств. Однако еще не определены надежные стандарты объективной и воспроизводимой количественной оценки тяжести заболевания. Большинство методов анализа колита полагаются на ограниченный гистологический скоринг небольших сегментов кишечника, что приводит к частичному или предвзятому анализу. Здесь мы объединяем получение изображений с высоким разрешением и продольный анализ всей толстой кишки для количественной оценки кишечных повреждений и язв в декстране сульфата натрия (DSS) индуцированной модели мурин-колита. Этот протокол позволяет получать объективные и воспроизводимые результаты без тщательного обучения пользователей. Здесь мы предоставляем исчерпывающую информацию о подготовке образца и анализе изображений на примерах данных из индуцированного Колита DSS. Этот метод может быть легко адаптирован к другим моделям мурин-колита, которые имеют значительное воспаление, связанное с слизистой травмы. Мы демонстрируем, что доля воспаленных / раненых и эрозии / язвенной слизистой оболочки по отношению к полной длине толстой кишки тесно параллели клинических выводов, таких как потеря веса среди DSS-индуцированной прогрессии заболевания. Этот гистологический протокол обеспечивает надежное время и экономически эффективную помощь для стандартизации анализа активности болезни в беспристрастной манере в экспериментах DSS колита.
Introduction
Эпителиальный барьер желудочно-кишечного тракта играет ключевую роль в отделении светящихся антигенов и патогенных микроорганизмов от основных отсековтканей 1. Эпителиальная травма и слизистые раны, замеченные в патологических состояниях, таких как воспалительные заболевания кишечника (IBD), ишемия, или хирургические травмы связаны с клиническими симптомами, которые включают диарею, потеря веса, кровь в стуле, и боли в животе. В ответ на травмы эпителиальные клетки мигрируют и размножаются для повторной эпителиализы и ремонта дефектов слизистой оболочки. Разрешение воспаления и восстановление слизистой целостности имеют решающее значение для восстановления кишечного слизистого гомеостазаи функции 2,3,4.
Различные модели животных были использованы для изучения основных молекулярных механизмов, которые связаны с повреждением кишечного эпителиального барьера. Широко используются хорошо известные и легко применимые модели химически индуцированного колита, особенно в исследованиях, связанных с воспалительными травмами, такими как IBD. Общие, воспроизводимые, и надежные модели мурин колит использует декстран сульфат натрия (DSS) опосредовано травмы толстой кишки и воспаление. Тяжесть заболевания варьируется в зависимости от штамма мыши, дозы DSS, длины Введения DSS, и молекулярного веса DSS5,6,7.
Повреждение слизистой оболочки кишечника во время DSS колита, как правило, оценивается с помощью индекса активности болезни (DAI), композитный балл определяется потеря веса, содержание фекальной крови, и консистенции стула. Содержание фекальной крови может быть микроскопическим (обнаружено с помощью теста на гуюаку стула) или макроскопическим; фекальная консистенция классифицируется как твердый, мягкий или жидкий (т.е.диарея) 5,8. Оценка этих клинических параметров может быть субъективной и может варьироваться в зависимости от опыта пользователя и предвзятости, хотя в целом, данные предоставляют достоверную информацию и, таким образом, широко используются исследователями IBD. В отличие от этого, не существует общепринятого метода гистологической оценки слизистой оболочки. Чаще всего, выбранные участки толстой кишки проверяются обученным патологоанатомом и забил на основе нескольких параметров, которые обычно включают травмы склепа и проникновениялейкоцитов 9,10,11. Однако, поскольку количество исследованных параметров и количество анализируемой ткани значительно варьируется между отдельными отчетами, сопоставимость многих опубликованных исследований ограничена. Чтобы уменьшить предвзятость наблюдателя и повысить межобученную согласие, идеальный гистологический протокол скоринга должен: 1) включать всю длину толстой кишки, так как воспаление слизистой оболочки кишечника чаще всего является переменным и пропускать поражения являются общими, 2) ограничить анализ конкретных ключевых и легко интерпретируемых параметров для снижения субъективности, 3) облегчить быструю, последовательную обработку большого количества образцов, и 4) использовать широко доступные и доступные инструменты для получения данных.
Здесь мы описываем технику обработки всей толстой кишки или длинные сегменты тонкой кишки в "швейцарский рулон" конфигурации наряду с использованием бесплатной компьютерной системы скоринга для анализа кишечных слизистых воспалений и повреждений из-за DSS-индуцированного колита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом Мичиганского университета по использованию и уходу за животными.
1. Урожай тканей
- Эвтанизировать мышей гуманно с помощью изофлюрановой анестезии с последующим вывихом шейки матки, в соответствии с утвержденными протоколами. Для всех экспериментов на животных одобрение было получено сертифицированным советом по обзору в соответствии с Национальными и Институциональными руководящими принципами обращения с животными.
- Поместите мышь на вскрытую площадку в положении лежа. Обездвижить конечности мыши с помощью 20 G х 1 1/2-дюймовый G иглы.
- Используя миппы и ножницы, сделайте небольшой разрез на брюшной коже и потяните его в сторону, чтобы разоблачить брюшной полости.
- Откройте брюшную полость с разрезом средней линии в брюшной полости от лобковой кости до боков живота.
- Тщательно удалите ткани и органы до визуализации толстой кишки. Вырезать тазовой кости по обе стороны толстой кишки, чтобы полностью визуализировать орган, простирающийся от ануса к cecum.
- Аккуратно удалить жир, маленькие вены и артерии, прикрепленные к толстой кишке, при тщательном вскрытии органа, резки только проксимальные к анусу и просто дистальной cecum.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытая толстая кишка должна оставаться при комнатной температуре при завершении швейцарской процедуры рулона. - Тщательно промыть толстой кишки с 1x PBS, используя гибкую пластиковую иглу гавейдж вставляется через анус для удаления фекального содержимого.
- Распоистите толстую кишку по прямой и откройте продольно вдоль мезентерической артерии. Раздвоить толстой кишки продольно от дистального до проксимального конца(рисунок 1A). Одна половина ткани может быть использована для гистологического анализа, а другая может быть обработана для западной помарки, ПЦР или свернута во второй швейцарский рулон для свежей замороженной микроскопии иммунофлюоресценции12.
2. Подготовка швейцарских рулонов
- Обрезать дополнительные ткани из проксимальной толстой кишки с помощью лезвия бритвы, пока примерно такой же ширины по длине всей толстой кишки получается.
- Выровнять толстой кишки подвергать люмен лицом вверх, и сгладить ткани полностью с помощью гибкой иглы гаважа. Добавить больше PBS, если это необходимо, чтобы сохранить ткань влажной на протяжении всей процедуры.
- Удалите избыток PBS с помощью бумажной салфетки. С помощью шприца и иглы гаважа добавьте 10% нейтральный буферный раствор формалина над тканью в течение 2-3 минут, чтобы исправить и сгладить ткань.
- Используйте прямые типсы, чтобы захватить конец дистальной толстой кишки и скрутить толстой кишки в концентрические круги от дистального до проксимального конца (Рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно отодвинуть внутреннюю часть швейцарского рулона во время прокатки с помощью указательного пальца, чтобы обеспечить ткань внутри рулона. - Вставьте 27 G иглы, чтобы приколоть толстой кишки в середине, чтобы держать его швейцарской формырулона ( Рисунок 1C).
- Поместите швейцарский рулон с иглой в встраиваемую кассету внутри гистологического контейнера образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань должна быть ориентирована параллельно с кассетой перед фиксацией(рисунок 1D). - Зафиксить ткань в 10% нейтральном буферном растворе формалина на ночь при 4 градусахпо Цельсию 13.
- После ночной фиксации, мыть ткани 3x с PBS.
- Добавьте 70% этанола в ткань до процесса встраивания парафина. Удалите иглу из швейцарского рулона, прежде чем продолжить. Ткань может храниться в этаноле при комнатной температуре до встраивания парафина13.
- Поместите образцы в процессор тканей, встраивайтесь в парафин и подготовьте 4 мкм секций, установленных на положительно заряженных слайдах микроскопии(рисунок 1E). Это может быть дополнительной точкой остановки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная ориентация тканей имеет решающее значение для достижения разделов, пригодных для анализа изображений. Параллельный швейцарский рулон встраивания в парафин кассеты приведет к полным разделам, присвоенным для анализа изображений(рисунок 1F-1H). Косые разделы следует избегать, чтобы предотвратить неполные разделы(рисунок 1I-1K). Для получения более подробной информации см. - Пятна разделов с гематоксилином и эозином (ХЗЕ)13.
3. Цифровое сканирование и анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Для точной оценки слизистых изменений, выберите только разделы, которые включают по крайней мере 90% от общей длины толстой кишки.
- Сканирование окрашенных секций с помощью сканера слайдов или изображения (см. Таблицу материалов). Изображения производятся необходимо разрешение 0,25 микрон на пиксель с 40x цели и 40x увеличение.
- Установка и загрузка соответствующего программного обеспечения для цифрового анализа отсканированных слайдов (см. таблицу материалов).
- Открытые отсканированные изображения в программном обеспечении обработки изображений(рисунок 2A). Убедитесь, что вся толстая кишка видна и что отсутствуют области образца.
- Активируйте изображение метки и инструменты масштаба бара, чтобы правильно идентифицировать отсканированные слайды, нажав на изображение Label (рисунок 2A).
- Откройте инструмент аннотации, нажав Аннотации, (Рисунок 2A) и создать 3 различных слоев, нажав новый слой (Рисунок 2B) для количественной общей длины швейцарский рулон, воспаление / травмы, и эрозии / язвы. Выберите другой цвет для каждого слоя, нажав цвет слоя (рисунок 2B).
- Измерьте длину каждого слоя/категории, нажав на инструмент Pen(рисунок 2A),используя слизистую оболочку мускулистых в качестве эталона:
- Просмотр изображения на 400 мкм зум (или более), чтобы облегчить адекватную визуализацию слизистой оболочки мускулистых.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение легко контролируется с помощью колеса прокрутки мыши и должны быть скорректированы по мере необходимости при перемещении по разделу, чтобы нарисовать все линии. - Нажмите на инструмент Pen, чтобы нарисовать линию после мышечной слизистой оболочки(рисунок 2A). Перемести указатель по мере необходимости, чтобы визуализировать прилегающую область для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз, когда перо остановлено, будет генерироваться небольшой новый слой. Его можно визуализировать и редактировать с помощью вкладки области слоя (выберите нужный сегмент и нажмите Удалите слой в случае ошибок или исправлений, рисунок 2B).
- Просмотр изображения на 400 мкм зум (или более), чтобы облегчить адекватную визуализацию слизистой оболочки мускулистых.
- После того, как всеслои (рисунок 2C) определены, экспортировать данные с помощью кнопки Export Grid to Text File внутри вариантов регионов слоя(рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранить файлы часто при создании слоев для обеспечения правильного хранения данных. - Откройте текстовые файлы и копируйте данные с помощью программного обеспечения электронной таблицы. Итого все сегменты из каждого региона и рассчитать процент травмы и язвы по отношению к общей длине.
- Для расчета гистологического колита Оценка (HCS) и оценить тяжесть заболевания, рассмотреть три основные характеристики, как подробно ниже.
- Проверьте здоровую слизистую оболочку кишечника, которая характеризуется организованными эпителиальными клетками в склепе-люминальной оси, ламина проприя с несколькими иммунными клетками и субджацентной мышечной слизистой оболочкой, которая взаимодействует слизистой оболочки и субмукосы(рисунок 3A).
- Проверьте на воспаление / травмы, которая характеризуется эпителиальных склепов, которые затуманены или частично отсутствует эпителиальных клеток и слизистой оболочки воспаление с нейтрофилом проникновения в склепы (Рисунок 3B).
- Проверьте наличие эрозии/ язвы, которая характеризуется областями, лишенными поверхностного эпителия или областями, полностью не имеющими эпителиальных склепов с или без связанных с ними лейкоцитов(рисунок 3C).
- Рассчитайте HCS травмированных и язвенных регионов, выраженных в процентах от общей длины в следующей формуле:
ПРИМЕЧАНИЕ: HCS сочетает в себе процент воспаления / травмы и эрозии / язвы добавив в два фактора к последнему, на основе разумного предположения, что полная потеря эпителия приводит к максимальной потере барьерной целостности и, следовательно, хуже болезни. HCS последовательно представляет морфологические изменения, вызванные DSS индуцированного экспериментального колита. Интересно, что мы не видели четкой корреляции между числами толстой лимфоидных агрегатов или фолликулов и клинической тяжести заболевания при DSS-колите, и поэтому мы не учитывали количественную оценку в этом анализе. - Сделайте снимок репрезентативных изображений (нажмите Снимок, Рисунок 2A), и сохраните. Включите полосы масштаба, если это необходимо, нажав на Show/Hide Scale Bar (рисунок 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать надежность этого гистологического анализа оценки колита в контексте слизистой оболочки после вызова DSS и последующего восстановления от колита, мы ввели 2,5% DSS в питьевой воде восьми 10 недель самца C57BL6 диких мышей типа в течение 5 дней с последующим периодом восстановления с обычной водой в течение 5 дней. Не было никаких изменений в массе тела во время острого введения DSS, с дня 0 до 5(рисунок 4A). Вес тела резко снизился после 5-го дня, когда мыши начали пить обычную водопроводную воду. Кровь и мягкие табуреты появились после 3 дней введения DSS и продолжались в течение последующих 3 дней на воде до дня 8 эксперимента(рисунок 4B). Эти наблюдения показали, что наиболее пагубные последствия воздействия ДСС наблюдались в период восстановления между днями 5 и 8. Измерение длины толстой кишки в день 10 подтвердило значительное сокращение в конце эксперимента(рисунок 4C). Колонны были собраны в дни 0, 2, 5, 7, 8 и 10, чтобы парафин швейцарских рулонах. Ткань была окрашена СЗЭ и высокой четкости сканирования (Рисунок 4D) были проанализированы для расчета Гистологического колита Оценка (Рисунок 4E) и процент травмы и язвы (Рисунок 4F).
Рисунок 4D показывает нормальную архитектуру склепа у необработанных мышей C576BL6, поверхностный для слизистой оболочки мускулистых и поддерживается ламина проприя (день 0, стрелка). После 2 дней введения DSS, набор иммунных клеток наблюдался (день 2, стрелка). На 5-й день эпителиальные клетки оказались поврежденными, и произошло проникновение нейтрофилов через эпителий (криптит), связанный с эпителиальной травмой (день 5, стрелка). С 5 по 8 день были отмечены области эпителиальной потери с воспалением и язвой (день 7 и 8, стрелы). Последний обычно наблюдается, как мыши пьют обычную водопроводную воду во время фазы восстановления. Наконец, эпителиальные клетки начинают восстанавливаться и заселяться язвенными участками, медленно восстанавливая слизистую оболочку толстой кишки на 10-й день (стрелка).
HCS тесно отражает простую оценку процента воспаления / травмы и эрозии / язвы, и как количественно продемонстрировать, что существует значительный ущерб толстой кишки мышей во время восстановления от DSS на день 5 до 10, что коррелирует с эпителиальной эрозии и проникновения лейкоцитов показано на рисунке 4D. Данные, представленные HCS, различают тяжесть заболевания в отношении воспаления, связанного с эпителиальной травмой, и эрозии/язвы.
Эти наблюдения свидетельствуют о том, что система систематического скоринга ВГС, предложенная в этом протоколе, представляет собой надежный инструмент количественной оценки ущерба, причиненного слизистой оболочкой.
Рисунок 1: Пример подготовки имеет решающее значение для точного анализа данных. ( A ) Дистальная толстая кишка полностью расширена и открыта вдоль мезентерической артерии. (B)Швейцарский процесс прокатки. (C) Вставка иглы для ведения швейцарской формы рулона(D)парафин встраивания кассеты. (E)Парафин блок. (F) Швейцарская рулонная параллельная ориентация, чтобы избежать частичных секций. (G)Полный швейцарский рулон, шкала бар: 2мм.( H ) Идеальный раздел толстой кишки склепы, шкала бар: 80 мкм. (I) Косой швейцарской ориентации рулона. (J)Неполный швейцарский рулон, шкала бар: 2 мм. (K) Косой раздел колонии склепы, шкала бар: 80 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Количественная оценка слизистой оболочки. (A ) Основной бар инструментов с снимок, зум ползунок, шоу / скрыть масштаб бар / осей / сетки, этикетка imager, аннотации, и перо инструмент функции, среди других. (B)Аннотации меню отображения цвета слоя, новый слой, удалить слой, показать / скрыть слой, удалить регион и экспорт сетки кнопок текстового файла. (C) Обзор общей длины, раненых и язвенных слоев, шкала бар: 3 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Морфология слизистой оболочки кишечника мыши окрашенных гематоксилина и эозина после острого DSS-экспериментального колита с последующим восстановлением.() Здоровые кишечные клетки, организованные в склепах толстой кишки в окружении ламина проприя и отделены от субмукосы мышечной слизистой оболочки, шкала бар: 200 мкм. (B) Острый слизистой воспаления или травмы с проникновением нейтрофилов в слизистую оболочку и склеп эпителия, связанные с склеп эпителиального искажения / потери и эпителиальной лечения, шкала бар: 200 мкм. (C) Ulcerated или эрозии областях с полной эпителиальной потери и связанных с ними воспаление., масштаб бар: 200 мкм.
Рисунок 4: Гистологический колит Оценка и процент травмы и язвы коррелирует с массой тела и индексом стула во время экспериментального колита DSS: (A) Вес тела и (B) стул индексы оцениваются ежедневно в диких мышей типа лечение 2,5% DSS в течение 5 дней (красная линия), а затем 5 дней восстановления на воде (черная линия). Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов с по крайней мере 4 мышей в группе и выражаются как среднее значение ± SEM. Значение определяется двухголюй ANOVA и Sidak многократное сравнение, p<0.033, p<0.002, и P<0.001. (C)Длина толстой кишки мышей была измерена в день 10. Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов с по крайней мере 3 мышей в группе и выражаются как среднее значение ± SEM. Значение определяется двуххвостый тест студента, P<0.001. (D) Гематоксилин и эозин (ХЗЕ) окрашенных тканей разделы слизистой оболочки толстой кишки были проанализированы для расчета, масштаб баров: 60 мкм. (E) Гистологический колит Оценка (HCS) и процент травм / язвы по отношению к длине толстой кишки. Данные являются репрезентативными для двух экспериментов с 2 мышами в группе и выражаются как среднее значение ± SEM. Значение определяется одним из способов ANOVA и Tukey множественным сравнением, p<0.033, p<0.002 и P<0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша гистологическая система оценки колита представляет собой надежный инструмент для количественной оценки воспаления тканей и повреждений кишечника. Такой подход обеспечивает лучшее понимание гистопатологического состояния всего органа без смещения выбора небольших участков или неполных секций. К числу важнейших шагов для успешного выполнения этого протокола относятся надлежащая подготовка швейцарских рулонов, которые позволяют провести анализ по крайней мере 90% длины толстой кишки; параллельная ориентация во время встраивания парафина и секции для обеспечения прямых и однородных секций тканей с продольными видами эпителиальных склепов; практика и обучение под наблюдением опытного патологоанатома, чтобы подтвердить, что стажеры определить различия между острым воспалением, эпителиальной травмы, и эрозии / язвы; и доступ к цифровому сканеру высокого разрешения.
Небольшие корректировки и устранение неполадок необходимы для надлежащей ориентации швейцарского рулона во время встраивания парафина, а также во время секций, чтобы гарантировать, что ткань параллельно ориентирована по отношению к парафиновой кассете и лезвию(рисунок 1E-F). Соблюдение этой пространственной ориентации позволит сократить количество неполных секций. Если толстая кишка идеально проката на себя, лучшие разделы, включая большую часть длины ткани будут расположены в середине швейцарского рулона (Рисунок 1F). Сбор нескольких секций значительно повышает вероятность получения хорошо ориентированных секций, где видна вся длина склепов(рисунок 1G-H). Избегайте секционирования косых швейцарскихрулонов (рисунок 1I-J),характеризующийся круговыми склепами или пончиками из склепа(рисунок 1K). Часто визуализация секций, собранных под микроскопом, настоятельно рекомендуется для обеспечения надлежащей техники. Хороший раздел захватывает всю длину толстой кишки.
Любой инструмент, позволяющий захватить всю длину швейцарского рулона и обеспечивает разрешение, необходимое для увеличения ткани, чтобы визуализировать архитектуру склепа, является достаточным для оценки HCS. Некоторые микроскопы позволяют перекрывать небольшие изображения и реконструировать целые участки тканей. Тем не менее, разрешение этих изображений может быть плохим после увеличения увеличения оценка ткани. Кроме того, перекрытие секций может быть не идеальным, оставляя области ткани, которые не очень четко определены и невозможно точно оценка.
Среди преимуществ протокола скоринга, предложенного здесь, классификация тканей только в двух категориях воспаление/травма или эрозия/язва. Это упрощает и ускоряет классификацию повреждений тканей, увеличивая при этом воспроизводимость. Программное обеспечение, используемое для анализа, доступно, бесплатно и просто в использовании. HCS точно отражает слизистые повреждения, так как это позволяет количественно язвенных областях по всей длине толстой кишки и надлежащим образом обеспечивает больше веса к этой патологии над воспаленной, не язвенной области. Это четко отражено при сопоставлении данных HCS с процентом травм/язв(рисунок 4E-F). Скоринг анализ каждого образца занимает около 40 минут. При надлежащей подготовке, доступе к отсканированным слайдам, компьютеру и программному обеспечению большинство исследователей могут выполнять анализ. Тем не менее, это всегда целесообразно, чтобы подтвердить результаты скоринга с патологоанатомом для обеспечения точности и воспроизводимости. Оценка воспаления кишечника может быть выполнена с любым программным обеспечением, которое позволяет высокое разрешение увеличения слайдов и измерения длины; однако, для простоты, в этом протоколе мы сосредоточились на программном обеспечении, перечисленное в таблице материалов.
Мы использовали эту систему скоринга для успешного анализа заболеваний в различных экспериментах DSS колита. Например, Kelm et al.14 исследовали важность гликозилирования CD44v6, важного регулятора эпителиальной миграции и распространения, используя новые антитела (GM35). Они продемонстрировали снижение индекса активности заболеваний скоринга и улучшение HSC у мышей оспаривается с острым DSS после ориентации сиаляля Льюиса гликанов на эпителиальный CD44v6, подтверждающие важность пост-трансляционной модификации вариантов CD44 для восстановления после DSS индуцированнойтравмы 14. В другом примере, Reed et al.15 использовали хроническую модель DSS для изучения слизистой травмы и ремонта у мышей с эпителиальным специфическим удалением CD47, трансмембранного белка, важного для воспалительных и ремонтных процессов. Сканирование толстой кишки были проанализированы и забил, чтобы вычислить процент травмы и язвы, как описано выше, демонстрируя заметно нарушения слизистой оболочки ремонт у мышей не хватает эпителиального CD4715. Модель хронического колита в настоящем докладе использовала циклическое администрирование DSS для анализа травм и ремонта с течением времени.
Дополнительные публикации из нашей группы и других продемонстрировали преимущества этой системы скоринга и ее корреляцию склиническими симптомами 6,16,17. Этот протокол подробно описывает, как подготовить и оценка швейцарских рулонов, используя бесплатное и легко доступное программное обеспечение. Простота скоринга, предложенного здесь, основана на использовании только двух категорий (воспаление/травма или эрозия/язва) в отсканированных слайдах для облегчения процесса подсчета очков и повышения воспроизводимости. Важно отметить, что описанная здесь система скоринга также коррелирует с клиническими параметрами воспаления кишечника. В заключение, Гистологический колит Оценка является инструментом, который может быть использован для количественно оценка DSS-колит и может быть применен к другим моделям колита, связанных с воспалением и эпителиальной травмы / потери.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны NIH финансирования DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 и Мичиганского университета патологии слайд сканирования услуг.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
