Summary
Ücretsiz bilgisayar destekli bir sistem kullanılarak bağırsak iltihabının sistematik olarak puanlanması, ülser ve enflamatuar değişikliklerin varlığı ile karakterize kolit modellerindeki histopatolojik değişiklikleri nicel olarak karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Histolojik kolit skoru değerlendirmesi klinik gözlemleri güçlendirir ve veri yorumlamayı kolaylaştırır.
Abstract
Murine kolit modelleri, enflamatuar bağırsak bozukluklarının patobiyolojisini anlamaya odaklanan çalışmalarda yoğun olarak kullanılan araçlardır. Bununla birlikte, hastalık şiddetinin objektif ve tekrarlanabilir nicelemesi için sağlam standartlar tanımlanmaya devam etmektedir. Kolit analiz yöntemlerinin çoğu, küçük bağırsak segmentlerinin sınırlı histolojik puanlamasına dayanır ve kısmi veya taraflı analizlere yol açar. Burada, dektran sodyum sülfat (DSS) kaynaklı murine kolit modelinde bağırsak yaralanması ve ülserasyonunu ölçmek için tüm kolonun yüksek çözünürlüklü görüntü alımını ve boyuna analizini birleştiriyoruz. Bu protokol, kapsamlı kullanıcı eğitimi olmadan objektif ve tekrarlanabilir sonuçların üretilmesine izin verir. Burada, DSS kaynaklı kolitten elde edilen verilerin örneklerini kullanarak numune hazırlama ve görüntü analizi hakkında kapsamlı ayrıntılar sunuyoruz. Bu yöntem, mukozal yaralanma ile ilişkili önemli inflamasyona sahip diğer murine kolit modellerine kolayca uyarlanabilir. Kolonun tam uzunluğuna göre iltihaplı/yaralı ve aşınmış/ülserli mukoza fraksiyonunun DSS kaynaklı hastalık ilerlemesi sırasında kilo kaybı gibi klinik bulgularla yakından paralellik gösterdiğini gösteriyoruz. Bu histolojik protokol, DSS kolit deneylerinde hastalık aktivitesinin analizlerini tarafsız bir şekilde standartlaştırmak için güvenilir bir zaman ve uygun maliyetli yardım sağlar.
Introduction
Gastrointestinal epitel bariyeri, luminal antijenlerin ve patojenlerin alttaki doku bölmelerinden ayrılmasında önemli bir rol oynar1. İnflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD), iskemi veya cerrahi yaralanma gibi patolojik durumlarda görülen epitel yaralanması ve mukozal yaralar ishal, kilo kaybı, dışkıda kan ve karın ağrısı gibi klinik semptomlarla ilişkilidir. Yaralanmaya yanıt olarak, epitel hücreleri mukozal bariyer kusurlarını yeniden epitelleştirmek ve onarmak için göç eder ve çoğalır. enflamasyonun çözülmesi ve mukozal bütünlüğün iadesi, bağırsak mukozal homeostazının ve fonksiyon 2 ,3,4'ün yeniden kurulması için çok önemlidir.
Bağırsak epitel bariyerinin hasarı ile ilişkili alttaki moleküler mekanizmaları incelemek için çeşitli hayvan modelleri gütlenmiştir. Kimyasal olarak indüklenen kolitin iyi kurulmuş ve kolayca uygulanabilir modelleri, özellikle IBD gibi enflamatuar yaralanma ile ilgili çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaygın, tekrarlanabilir ve güvenilir bir murine kolit modeli, dektran sodyum sülfat (DSS) aracılı kolon yaralanması ve iltihabını kullanmaktadır. Hastalığın şiddeti fare suşuna, DSS dozu, DSS uygulama uzunluğu ve DSS5, 6,7moleküler ağırlığına bağlı olarak değişir.
DSS kolit sırasında bağırsak mukozal hasarı genellikle kilo kaybı, dışkı kan içeriği ve dışkı kıvamına göre belirlenen bileşik bir puan olan Hastalık Aktivite Endeksi (DAI) kullanılarak değerlendirilir. Dışkı kan içeriği mikroskobik (dışkı guaiac asit testi kullanılarak tespit edilebilir) veya makroskopik olabilir; dışkı kıvamı sert, yumuşak veya sıvı (yani ishal) olarak sınıflandırılır5,8. Bu klinik parametrelerin puanlaması öznel olabilir ve kullanıcının deneyimine ve önyargısına bağlı olarak değişebilir, ancak genel olarak veriler güvenilir bilgi sağlar ve bu nedenle IBD araştırmacıları tarafından yaygın olarak kullanılır. Buna karşılık, mukozal hasarın histolojik olarak değerlendirilmesi için genel olarak kabul edilen bir yöntem yoktur. En yaygın olarak, kolonun seçilen alanları eğitimli bir patolog tarafından incelenir ve genellikle kript yaralanması ve lökosit infiltrasyonunu9, 10,11içeren çeşitli parametrelere göre puanlanır. Bununla birlikte, araştırılan parametrelerin sayısı ve analiz edilen doku miktarı bireysel raporlar arasında önemli ölçüde değiştiğinden, yayınlanan birçok çalışmanın karşılaştırılabilme kabiliyeti sınırlıdır. Gözlemci önyargısını azaltmak ve çalışmalar arası uyumluluğu artırmak için ideal bir histolojik puanlama protokolü: 1) bağırsak mukoza iltihabı en sık değişken olduğu ve atlama lezyonları yaygın olduğu için kolonun tüm uzunluğunu içermelidir, 2) öznellik azaltmak için analizi belirli anahtar ve kolayca yorumlanabilir parametrelerle sınırlayın, 3) çok sayıda örneğin hızlı, tutarlı bir şekilde işlenmesini kolaylaştırmak ve 4) veri toplama, analiz ve sunum için yaygın ve uygun fiyatlı araçlar kullanmak.
Burada, ince bağırsağın tüm kolon veya uzun segmentlerini bir "İsviçre rulosu" konfigürasyonunda işlemek için bir teknik ve DSS kaynaklı kolit nedeniyle bağırsak mukozal iltihabını ve hasarını analiz etmek için ücretsiz bir bilgisayar destekli puanlama sisteminin kullanımını açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm hayvan deneyleri Michigan Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Doku hasadı
- Onaylanan protokollere uygun olarak fareleri izofluran anestezisi ve ardından servikal çıkık kullanarak insanca ötenazi. Tüm hayvan deneyleri için, sertifikalı bir inceleme kurulu tarafından hayvan elleçleme için Ulusal ve Kurumsal yönergelere uygun olarak onay alındı.
- Fareyi bir diseksiyon pedi üzerine supine pozisyonunda yerleştirin. 20 G x 1 1/2 inç G iğneler kullanarak fare ekstremitelerini hareketsiz hale getir.
- Perten ve makas kullanarak, karın derisinde küçük bir kesi yapın ve peritonun ortaya çıkması için yana doğru çekin.
- Kasık kemiğinden karın kenarlarına kadar peritonda orta çizgi kesi ile karın boşluğunu açın.
- Kalın bağırsak görselleşene kadar dokuları ve organları dikkatlice çıkarın. Organı tamamen görselleştirmek için kolonun her iki tarafındaki pelvik kemiği kesin, anüsten cecum'a doğru uzanın.
- Kolona bağlı yağ, küçük damarlar ve arterleri yavaşça çıkarın, organı dikkatlice parçalara ayırın, anüse sadece proksimal kesin ve sadece obtal.
NOT: Parçalanmış kolon, İsviçre rulo prosedürünü tamamlarken oda sıcaklığında kalmalıdır. - Dışkı içeriğini çıkarmak için anüsten yerleştirilmiş esnek bir plastik gavage iğnesi kullanarak kolonu 1x PBS ile dikkatlice yıkayın.
- Kolonu düz bir çizgiye yerleştirin ve mezenterik arter boyunca uzunlamasına açın. Kolonu distalden proksimal uca boyuna ikiye ayırın (Şekil 1A). Dokunun bir yarısı histolojik analiz için kullanılabilirken, diğeri batı lekesi, PCR için işlenebilir veya taze dondurulmuş immünofolüoresans mikroskopisi için ikinci bir İsviçre rulosuna yuvarlanabilir12.
2. İsviçre rulolarının hazırlanması
- Tüm kolonun uzunluğu boyunca yaklaşık aynı genişlik elde edilene kadar bir jilet kullanarak proksimal kolondan ekstra doku kırpın.
- Lümeni yukarı bakacak şekilde hizalayın ve esnek bir gavage iğnesi kullanarak dokuyu tamamen düzleştirin. İşlem boyunca dokuyu nemli tutmak için gerekirse daha fazla PBS ekleyin.
- Kağıt mendil kullanarak PBS'nin fazlalığını çıkarın. Bir şırınga ve gavage iğnesi ile, dokuyu düzeltmek ve düzlemek için 2-3 dakika boyunca doku üzerine% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi ekleyin.
- Distal kolonun ucunun ucunun kavraçlarını almak ve kolonu distalden proksimal uca eşmerkezli daireler halinde bükmek için düz tokmaklar kullanın (Şekil 1B).
NOT: Dokunun rulonun içinde olduğundan emin olmak için delme kullanarak yuvarlanırken İsviçre rulosunun içini geri itmek mümkündür. - İsviçre rulo şeklini tutmak için kolonu ortaya sabitlemek için 27 G'lik bir iğne yerleştirin (Şekil 1C).
- İğne ile İsviçre rulosunu histolojik bir numune kabının içine gömme bir kasete yerleştirin.
NOT: Doku, sabitlemeden önce kasete paralel olarak yönlendirilmelidir (Şekil 1D). - Dokuyu 4 °C 13'te bir gecede %10nötr tamponlu formalin çözeltisinde sabitle.
- Gece sabitlemeden sonra, dokuyu PBS ile 3x yıkayın.
- Parafin gömme işlemi öncesinde dokuya %70 etanol ekleyin. Devam etmeden önce iğneyi İsviçre rulosundan çıkarın. Doku, parafin gömme13'ekadar oda sıcaklığında etanolde saklanabilir.
- Örnekleri doku işlemcisine yerleştirin, parafin içine gömün ve pozitif yüklü mikroskopi slaytlarına monte edilmiş 4 μm bölüm hazırlayın (Şekil 1E). Bu isteğe bağlı bir durma noktası olabilir.
NOT: Görüntü analizine uygun bölümlere ulaşmak için uygun doku yönlendirmesi kritik öneme sahiptir. Parafin kasetine paralel İsviçre rulosu gömmesi, görüntü analizi için uygun tam bölümlere neden olacaktır (Şekil 1F-1H). Eksik bölümleri önlemek için eğik bölümlerden kaçınılmalıdır (Şekil 1I-1K). Daha fazla ayrıntı için Tartışma bölümüne bakın. - Hematoksilin ve eozin (H&E)13ile leke bölümleri.
3. Dijital tarama ve analiz
NOT: Mukozal değişikliklerin doğru değerlendirilmesi için, yalnızca toplam kolon uzunluğunun en az% 90'ını içeren bölümleri seçin.
- Lekeli bölümleri slayt tarayıcısı veya görüntüleyicı kullanarak tarayın (bkz. Malzeme Tablosu). Üretilen görüntüler, 40x amaç ve 40x büyütme ile piksel başına 0,25 mikron çözünürlüğe ihtiyaç duyar.
- Taranan slaytların dijital analizi için uygun bir yazılım yükleyin ve indirin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Taranan görüntüleri görüntü işleme yazılımında açın (Şekil 2A). İki nokta üst üste işaretinin tamamının görünür olduğunu ve örneğin eksik alanlarının olmadığını doğrulayın.
- Etiket görüntüleyicısı(Şekil 2A)öğesini tıklatarak taranan slaytları doğru şekilde tanımlamak için etiket görüntüleyicİsini ve ölçek çubuğu araçlarını etkinleştirin.
- Ek Açıklamalar aracını Ek Açıklamalar 'ı(Şekil 2A) tıklatarak açın ve İsviçre rulosuna, iltihaplanmaya/yaralanmaya ve erozyona/ülserasyona ilişkin toplam uzunluğu ölçmek için Yeni katmana ( Şekil2B) tıklayarak 3 farklı katman oluşturun. Katman rengi (Şekil 2B) öğesini tıklatarak her katman için farklı bir renk seçin.
- Referans olarak muscularis mukozasını kullanarak Kalem aracını (Şekil 2A) tıklatarak her katmanın/kategorinin uzunluğunu ölçün:
- Muscularis mukozasının yeterli görselleştirilmesini kolaylaştırmak için görüntüyü 400 μm yakınlaştırmada (veya daha fazla) görüntüleyin.
NOT: Büyütme, fare kaydırma tekerleği kullanılarak kolayca kontrol edilir ve tüm çizgileri çizmek için bölüm boyunca hareket ederken gerektiği gibi ayarlanması gerekir. - Muscularis mukozasını takiben bir çizgi çizmek için Kalem aracına tıklayın (Şekil 2A). Çözümleme için bitişik alanı görselleştirmek için işaretçiyi gerektiği gibi hareket ettirın.
NOT: Kalem her durdurulduğunda, küçük bir yeni katman bölgesi oluşturulur. Katman bölgeleri sekmesiyle görselleştirilebilir ve düzenlenebilir (istediğiniz segmenti seçin ve hata veya düzeltme durumunda Katmanı Sil'i tıklatın, Şekil 2B).
- Muscularis mukozasının yeterli görselleştirilmesini kolaylaştırmak için görüntüyü 400 μm yakınlaştırmada (veya daha fazla) görüntüleyin.
- Tüm katmanlar (Şekil 2C) tanımlandıktan sonra, katman bölgeleri seçeneklerinin içindeki Izgarayı Metin Dosyasına Aktar düğmesini kullanarak verileri dışa aktarın (Şekil 2B).
NOT: Verilerin düzgün depolandığından emin olmak için katmanları oluştururken dosyaları sık sık kaydedin. - Metin dosyalarını açın ve verileri bir elektronik tablo yazılımıyla kopyalayın. Her bölgedeki tüm segmentleri toplayın ve toplam uzunluğa göre yaralanma ve ülserasyon yüzdesini hesaplayın.
- Histolojik Kolit Skorunu (HCS) hesaplamak ve hastalığın şiddetini değerlendirmek için, üç ana özelliği aşağıda ayrıntılı olarak düşünün.
- Kripto-luminal eksende organize epitel hücreleri, az sayıda bağışıklık hücresine sahip lamina propria ve mukoza ve submucosa'yı arayüzleyen subjacent muscularis mukozası ile karakterize edilen sağlıklı bağırsak mukozasını kontrol edin (Şekil 3A).
- Zayıflatılmış veya kısmen eksik epitel hücreleri ve kriptolara nötrofil infiltrasyonlu mukozal inflamasyon ile karakterize olan iltihap/yaralanma olup olmadığını kontrol edin (Şekil 3B).
- Yüzey epitelden yoksun alanlar veya ilişkili lökositli veya ilişkili lökositsiz epitel mahzenlerinden tamamen yoksun alanlarla karakterize edilen erozyon / ülserasyon varlığını kontrol edin (Şekil 3C).
- Aşağıdaki formülde toplam uzunluğun yüzdesi olarak ifade edilen yaralı ve ülserli bölgelerin HCS'sini hesaplayın:
NOT: HCS, epitelin tamamen kaybedilmesinin maksimum bariyer bütünlüğü kaybına ve dolayısıyla daha kötü hastalığa neden olduğu makul bir varsayıma dayanarak, iltihaplanma / yaralanma ve erozyon / ülserasyon yüzdesini ikincisine iki faktör ekleyerek birleştirir. HCS, DSS indüklenmiş deneysel kolitin neden olduğu morfolojik değişiklikleri sürekli olarak temsil eder. İlginçtir ki, DSS kolitinde kolonik lenfoid agrega veya folikül sayısı ile klinik hastalık şiddeti arasında net bir korelasyon görmedik ve bu nedenle bu analize niceliği dahil etmedik. - Temsili görüntülerin anlık görüntüsünü alın (Anlık Görüntü, Şekil 2A'yı tıklatın) ve kaydedin. Ölçek Çubuğunu Göster/Gizle 'ye tıklayarak gerekirse ölçek çubuklarını dahil edin (Şekil 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu Histolojik Kolit Skor Analizinin güvenilirliğini DSS meydan okuması ve daha sonra kolitten iyileşmeden sonra mukozal hasar bağlamında göstermek için, 5 gün boyunca sekiz 10 haftalık erkek C57BL6 vahşi tip farelerin içme suyunda% 2.5 DSS uyguladık ve ardından 5 gün boyunca düzenli su ile bir geri kazanım süresi uyguladık. DSS'nin akut yönetimi sırasında vücut ağırlığında 0'dan 5'e kadar bir değişiklik olmadı (Şekil 4A). Vücut ağırlığı, farelerin düzenli musluk suyu içmeye başladığı 5 günden sonra önemli ölçüde azaldı. Kan ve yumuşak dışkı 3 günlük DSS yönetiminden sonra ortaya çıktı ve deneyin 8. gününe kadar su üzerinde sonraki 3 gün boyunca devam etti (Şekil 4B). Bu gözlemler, DSS'ye maruz kalmanın en zararlı etkilerinin 5 ila 8 gün arasındaki iyileşme döneminde gözlendiğini ileri sürmektedir. 10. günde kolon uzunluğunun ölçümü, deneyin sonunda önemli bir kısalma olduğunu doğruladı (Şekil 4C). Kolonlar parafin İsviçre ruloları yapmak için 0, 2, 5, 7, 8 ve 10 günlerinde hasat edildi. Doku H&E ile boyanmış ve Histolojik Kolit Skoru (Şekil 4E) ve yaralanma ve ülserasyon yüzdesini hesaplamak için yüksek çözünürlüklü taramalar (Şekil 4D) analiz edilmiştir (Şekil 4F).
Şekil 4D, tedavi edilmemiş C576BL6 farelerde normal mahzen mimarisini gösterir, kas mukozasına yüzeyseldir ve lamina propria (gün 0, ok) tarafından desteklenir. 2 günlük DSS yönetiminden sonra immün hücre alımı gözlendi (2. gün ok). 5. günde, epitel hücreleri hasarlı göründü ve epitel yaralanması (5. gün, ok) ile ilişkili epitel (kriptit) boyunca nötrofillerin sızması vardı. 5 ila 8. günden itibaren iltihaplanma ve ülserasyon ile epitel kaybı bölgeleri kaydedildi (7. ve 8. gün, oklar). İkincisi, fareler geri kazanım aşamasında düzenli musluk suyu içerken yaygın olarak gözlenir. Son olarak, epitel hücreleri ülserli bölgeleri yenilemeye ve yeniden doldurmaya başlar ve 10. günde (ok) kolonik mukozayı yavaşça geri yükler.
HCS, inflamasyon / yaralanma ve erozyon / ülserasyon yüzdesinin basit bir değerlendirmesini yakından yansıtır ve her ikisi de 5 ila 10. HCS tarafından sağlanan veriler, epitel yaralanması ile ilişkili inflamasyon ile erozyon/ülserasyon açısından hastalığın şiddetini ayırt eder.
Bu gözlemler, bu protokolde önerilen HCS'nin sistematik puanlama sisteminin mukozal hasarı ölçmek için güvenilir bir araç oluşturduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Numune hazırlama, doğru veri analizi için çok önemlidir. (A) Distal kolon tamamen uzatılmış ve mezenterik arter boyunca açılmıştır. (B) İsviçre haddeleme işlemi. (C) İsviçre rulo şeklini tutmak için iğne yerleştirme (D) parafin gömme kaseti. (E) Parafin bloğu. (F) Kısmi bölümleri önlemek için İsviçre rulo paralel yönü. (G) Komple İsviçre rulosu, ölçek çubuğu: 2 mm. (Y) Kolonik mahzenlerin ideal bölümü, ölçek çubuğu: 80 μm. (I) Eğik İsviçre rulo yönü. (J) Tamamlanmamış İsviçre rulosu, ölçek çubuğu: 2mm. (K) Kolonik mahzenlerin eğik bölümü, ölçek çubuğu: 80 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mukozal hasarın nicel değerlendirmesi. (A) Anlık Görüntü içeren temel araç çubuğu, yakınlaştırma kaydırıcısı, ölçek çubuğunu/eksenleri/ızgarayı göster/gizle, etiket görüntüleyici, ek açıklamalar ve kalem aracı özellikleri, diğerleri arasında. (B) Katman rengini, yeni katmanı, katmanı silmeyi, katmanı göstermeyi/gizlemeyi, bölgeyi silmeyi ve kılavuzu metin dosyası düğmelerine dışa aktarmayı görüntüleyen ek açıklamalar menüsü. (C) Toplam uzunluğa, yaralı ve ülserli katmanlara genel bakış, ölçek çubuğu: 3 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Akut DSS-deneysel kolit sonrası hematoksilin ve eozin ile lekelenmiş fare bağırsak mukozasının morfolojisi ve ardından iyileşme. (A) Lamina propria ile çevrili kolonik mahzenlerde organize edilen ve submuucosa'dan kas mukozası, ölçek çubuğu ile ayrılan sağlıklı bağırsak hücreleri: 200 μm. (B) Nötrofillerin mukozaya ve şifreli epitellere sızmasıyla akut mukozal inflamasyon veya yaralanma, kript epitel distorsiyon / kaybı ve epitel attenuasyonu ile ilişkili, ölçek çubuğu: 200 μm. (C) Tam epitel kaybı ve ilişkili iltihaplanma ile ülserli veya aşınmış alanlar., ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Histolojik Kolit Skoru ve DSS deneysel kolit sırasında yaralanma ve ülserasyon yüzdesi vücut ağırlığı ve dışkı indeksi ile ilişkilidir: (A) Vücut ağırlığı ve (B) dışkı indeksleri, 5 gün boyunca % 2,5 DSS ile tedavi edilen vahşi tip farelerde günlük olarak değerlendirilir (kırmızı çizgi), ardından su üzerinde 5 günlük geri kazanım (siyah çizgi). Veriler, grup başına en az 4 fare içeren iki bağımsız deneyi temsil eder ve SEM ± ortalama olarak ifade edilir<<<. (C) Farelerin kolon uzunluğu 10. Veriler, grup başına en az 3 fare ile yapılan iki bağımsız deneyi temsil eder ve ortalama olarak ifade edilir ± SEM. Önemi iki kuyruklu Öğrencinin t testi ile belirlenir, ***p<0.001. (D) Kolonik mukozanın hematoksilin ve eozin (H&E)lekeli doku bölümleri, ölçek çubukları: 60 μm. (E) Histolojik Kolit Skoru (HCS) ve kolonun uzunluğuna göre yaralanma/ülserasyon yüzdesi için analiz edildi. Veriler grup başına 2 fare ile yapılan iki deneyi temsil eder ve ortalama ± SEM olarak ifade<<< edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histolojik Kolit Skor sistemimiz doku iltihabını ve bağırsaktaki hasarı ölçmek için güvenilir bir araçtır. Bu yaklaşım, küçük alanlar veya eksik bölümler seçme önyargısı olmadan tüm organın histopatolojik durumunun daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu protokolü başarıyla yürütmek için kritik adımlar arasında, kolon uzunluğunun en az% 90'ının analizine izin veren İsviçre rulolarının uygun şekilde hazırlanması vardır; epitel mahzenlerinin boyuna görünümlerine sahip düz ve düzgün doku bölümlerini sağlamak için parafin gömme ve bölümleme sırasında paralel yönlendirme; kursiyerlerin akut inflamasyon, epitel yaralanması ve erozyon/ ülserasyon arasındaki farkları tespit ettiğini doğrulamak için deneyimli bir patologun gözetimi ile uygulama ve eğitim; ve yüksek çözünürlüklü dijital tarayıcıya erişim.
Dokunun parafin kasetine ve bıçağına göre paralel olarak yönlendirilmesini sağlamak için parafin gömme sırasında ve bölümleme sırasında İsviçre rulosunu uygun şekilde yönlendirmek için küçük ayarlamalar ve sorun giderme gereklidir (Şekil 1E-F). Bu uzamsal yönlendirmeye bağlı kalmak, tamamlanmamış bölümlerin sayısını azaltacaktır. Kolon kendi üzerine mükemmel bir şekilde yuvarlanırsa, doku uzunluğunun çoğunu içeren en iyi bölümler İsviçre rulosunun ortasına yakın olacaktır (Şekil 1F). Birkaç bölüm toplamak, mahzenlerin tüm uzunluğunun görülebildiği iyi yönelimli bölümler elde etme şansını büyük ölçüde artırır (Şekil 1G-H). Dairesel şekilli mahzenler veya mahzen donutları (Şekil 1K) ile karakterize eğik İsviçre rulolarını (Şekil 1I-J) bölümlemekten kaçının. Genellikle mikroskop altında toplanan bölümlerin görselleştirilmesi, uygun tekniği sağlamak için şiddetle tavsiye edilir. İyi bir bölüm iki nokta üst üste tüm uzunluğu yakalar.
İsviçre rulosunun tüm uzunluğunu yakalamayı sağlayan ve mahzen mimarisini görselleştirmek için dokuyu büyütmek için gereken çözünürlüğü sağlayan herhangi bir cihaz HCS'nin değerlendirilmesi için yeterlidir. Bazı mikroskoplar küçük görüntülerin çakışmasına izin verir ve tüm doku bölümlerini yeniden yapılandırır. Ancak, bu görüntülerin çözünürlüğü, dokuyu puanlamak için büyütmeyi artırdıktan sonra zayıf olabilir. Ek olarak, bölümlerin çakışması mükemmel olmayabilir, bu da doku alanlarını iyi tanımlanmamış ve doğru puanlamayı imkansız bırakır.
Burada önerilen puanlama protokolünün avantajları arasında dokunun sadece iki kategoride sınıflandırılması iltihaplanma/yaralanma veya erozyon/ülserasyon bulunmaktadır. Bu, doku hasarının sınıflandırılmasını basitleştirir ve hızlandırırken tekrarlanabilirliği artırır. Analiz için kullanılan yazılım erişilebilir, ücretsiz ve kullanımı kolaydır. HCS, kolonun tüm uzunluğu boyunca ülserli bölgelerin ölçülmesine izin verdiği ve iltihaplı, ülsersiz bölgeler üzerinde bu patolojiye doğru şekilde daha fazla ağırlık sağladığı için mukozal hasarı doğru bir şekilde yansıtır. Bu, HCS verileri yaralanma/ülserasyon yüzdesi ile karşılaştırıldığında açıkça yansıtılır (Şekil 4E-F). Her numunenin puanlama analizi yaklaşık 40 dakika sürer. Uygun eğitim, taranan slaytlara erişim, bir bilgisayar ve yazılımla çoğu araştırmacı analizi gerçekleştirebilir. Bununla birlikte, doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlamak için puanlama sonuçlarını bir patologla onaylamanız her zaman tavsiye edilir. Bağırsak iltihabının değerlendirilmesi, slaytların ve uzunluk ölçümlerinin yüksek çözünürlüklü büyütmesine izin veren herhangi bir yazılımla yapılabilir; ancak, basitlik için, bu protokolde malzeme tablosundalistelenen yazılıma odaklandık.
Bu puanlama sistemini çeşitli DSS kolit deneylerinde hastalığı başarıyla analiz etmek için kullanıyoruz. Örneğin, Kelm ve ark.14, epitel göçü ve çoğalmasının önemli bir düzenleyicisi olan CD44v6'nın glikosilasyonunun önemini yeni bir antikor (GM35) kullanarak araştırdı. Epitel CD44v6'da sialyl lewis A glikanlarının hedeflendikten sonra akut DSS ile meydan okuyan farelerde hastalık aktivite indeksi puanlamasının azaldığını ve iyileştirilmiş HSC'yi gösterdiler, DSS indüklenen yaralanmadan sonra CD44 varyantlarının post translational modifikasyonunun iyileşme için öneminidoğruladılar 14. Başka bir örnekte, Reed ve ark.15, enflamatuar ve onarım süreçleri için önemli bir transmembran proteini olan CD47'nin epitel özgül silinmesi ile farelerde mukozal yaralanma ve onarımı incelemek için kronik bir DSS modeli kullandı. Kolon taramaları, yukarıda açıklandığı gibi yaralanma ve ülserasyon yüzdesini hesaplamak için analiz edildi ve puanlandı, epitel CD4715'denyoksun farelerde belirgin şekilde bozulmuş mukozal onarım gösterdi. Bu rapordaki kronik kolit modeli, zaman içinde yaralanma ve onarımı analiz etmek için DSS'nin döngüsel yönetimini sınamıştır.
Grubumuzdan ve diğerlerinden gelen ek yayınlar, bu puanlama sisteminin avantajlarını ve klinik semptomlarla korelasyonunu göstermiştir6,16,17. Bu protokol, ücretsiz ve kolay erişilebilir yazılım kullanarak İsviçre rulolarının nasıl hazırlanacağını ve puanlanacağını ayrıntılı olarak açıklar. Burada önerilen puanlamanın basitliği, puanlama işlemini kolaylaştırmak ve tekrarlanabilirliği artırmak için taranan slaytlarda sadece iki kategorinin (iltihaplanma/ yaralanma veya erozyon / ülserasyon) kullanılmasına dayanmaktadır. Daha da önemlisi, burada açıklanan puanlama sistemi bağırsak iltihabının klinik parametreleriyle de ilişkilidir. Sonuç olarak, Histolojik Kolit Skoru DSS-kolit puanlamak için kullanılabilecek ve iltihaplanma ve epitel yaralanması / kaybı ile ilişkili diğer kolit modellerine uygulanabilen bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar NIH'nin DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 ve Michigan Üniversitesi Patoloji Slayt Tarama Hizmetleri'nden destek almak istemeleridir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
