Summary
Systematisk scoring af tarmbetændelse ved hjælp af et gratis computerassisteret system er et kraftfuldt værktøj til kvantitativt at sammenligne histopatologiske ændringer i colitismodeller karakteriseret ved tilstedeværelsen af sår og inflammatoriske ændringer. Evaluering af histologisk colitisscore styrker kliniske observationer og letter datafortolkning.
Abstract
Murine colitis modeller er værktøjer, der er flittigt ansat i undersøgelser med fokus på at forstå patobiologi af inflammatoriske tarmsygdomme. Der mangler dog stadig at blive fastlagt solide standarder for objektiv og reproducerbar kvantificering af sygdoms sværhedsgraden. De fleste colitis analysemetoder er afhængige af begrænset histologisk scoring af små segmenter af tarmen, hvilket fører til delvise eller partiske analyser. Her kombinerer vi billedopsamling i høj opløsning og langsgående analyse af hele tyktarmen for at kvantificere tarmskade og sårdannelse i dextrannatriumsulfat (DSS) induceret model af murin colitis. Denne protokol giver mulighed for generering af objektive og reproducerbare resultater uden omfattende brugeruddannelse. Her giver vi omfattende detaljer om prøveforberedelse og billedanalyse ved hjælp af eksempler på data fra DSS-induceret colitis. Denne metode kan let tilpasses andre modeller af murin colitis, der har betydelig betændelse forbundet med slimhindeskade. Vi viser, at den brøkdel af betændte / tilskadekomne og eroderet / sår slimhinden i forhold til den komplette længde af tyktarmen nøje paralleller kliniske fund såsom vægttab midt DSS-induceret sygdomsprogression. Denne histologiske protokol giver en pålidelig tid og omkostningseffektiv støtte til at standardisere analyser af sygdomsaktivitet på en upartisk måde i DSS colitis eksperimenter.
Introduction
Den gastrointestinale epitelbarriere spiller en central rolle i adskillelsen af luminale antigener og patogener fra underliggende vævsrum1. Epitelskade og slimhindesår set i patologiske tilstande som inflammatorisk tarmsygdom (IBD), iskæmi eller kirurgisk skade er forbundet med kliniske symptomer, der omfatter diarré, vægttab, blod i afføringen og mavesmerter. Som reaktion på skader migrerer og formerer epitelceller sig for at re-epithelialisere og reparere slimhindebarrierefejl. Opløsning af inflammation og tilbagelevering af slimhindeintegritet er afgørende for at genetablere tarmslimkosale homøostase og funktion2,3,4.
Forskellige dyremodeller er blevet anvendt til at studere de underliggende molekylære mekanismer, der er forbundet med skaderne på tarmepitelebarrieren. Veletablerede og let anvendelige modeller af kemisk induceret colitis anvendes i vid udstrækning, især i undersøgelser relateret til inflammatorisk skade som IBD. En fælles, reproducerbar, og pålidelig murine colitis model beskæftiger dextran natrium sulfat (DSS) medieret colon skade og betændelse. Sværhedsgraden af sygdommen varierer afhængigt af musestammen, dosis af DSS, længden af DSS-administrationen og den molekylære vægt af DSS5,6,7.
Tarmslimhindeskader under DSS-colitis evalueres normalt ved hjælp af Disease Activity Index (DAI), en sammensat score bestemt af vægttab, fækalt blodindhold og afføringskonsistens. Fækalt blodindhold kan være mikroskopisk (detekteret ved hjælp af en afføring guaiac syre test) eller makroskopisk; fækal konsistens er klassificeret som hård, blød eller flydende (dvs. diarré)5,8. Scoring af disse kliniske parametre kan være subjektiv og kan variere afhængigt af brugerens erfaring og bias, selv om dataene samlet set giver pålidelige oplysninger og derfor i vid udstrækning anvendes af IBD-forskere. I modsætning hertil er der ingen generelt accepteret metode til histologisk vurdering af slimhindeskader. Oftest inspiceres udvalgte områder af tyktarmen af en uddannet patolog og scores baseret på flere parametre, der normalt omfatter kryptskade og leukocyt infiltration9,10,11. Men da antallet af undersøgte parametre og mængden af analyseret væv varierer betydeligt mellem de enkelte rapporter, er sammenligneligheden af mange offentliggjorte undersøgelser begrænset. For at reducere observatør bias og forbedre inter-study konkordans, en ideel histologisk scoring protokol bør: 1) omfatte hele længden af tyktarmen, som tarm slimhindebetændelse er oftest variabel og springe læsioner er fælles, 2) begrænse analyse til specifikke centrale og let fortolkelige parametre for at reducere subjektivitet, 3) lette hurtig, konsekvent behandling af et stort antal prøver, og 4) bruge bredt tilgængelige og overkommelige værktøjer til dataindsamling, analyse og præsentation.
Her beskriver vi en teknik til at behandle hele tyktarmen eller lange segmenter af tyndtarmen i en "schweizisk roll" konfiguration sammen med brugen af en gratis computer-assisteret scoring system til at analysere tarm slimhindebetændelse og skader på grund af DSS-induceret colitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de beskrevne dyreforsøg blev godkendt af University of Michigan's Komité for Brug og Pasning af Dyr.
1. Vævshøst
- Aflive mus humant ved hjælp af isofluran anæstesi efterfulgt af livmoderhalskræft dislokation, i overensstemmelse med godkendte protokoller. For alle dyreforsøg blev godkendelse opnået af et certificeret bedømmelsesudvalg i overensstemmelse med de nationale og institutionelle retningslinjer for håndtering af dyr.
- Placer musen på en dissekerende pude i en liggende stilling. Immobilisere mus ekstremiteter ved hjælp af 20 G x 1 1/2-tommer G nåle.
- Brug pincet og saks, lav et lille snit på mavehuden og træk det til siden for at udsætte bughinden.
- Åbn bukhulen med et midterlinjeindsnit i bughinden fra skambenet til siderne af maven.
- Fjern forsigtigt væv og organer, indtil tyktarmen er visualiseret. Skær bækkenbenet på begge sider af tyktarmen for fuldt ud at visualisere organet, der strækker sig fra anus mod cecum.
- Fjern forsigtigt fedt, små vener og arterier fastgjort til tyktarmen, mens du forsigtigt dissekerer orglet og skærer bare proksimalt til anus og bare distal til cecum.
BEMÆRK: Det dissekerede kolon skal forblive ved stuetemperatur, mens den schweiziske rulleprocedure afsluttes. - Skyl forsigtigt tyktarmen med 1x PBS ved hjælp af en fleksibel plastpiskel indsat gennem anus for at fjerne fækalt indhold.
- Placer tyktarmen i en lige linje, og åbn longitudinally langs mesenteric arterie. Kolon gennemskærer i længderetningen fra distal til proksimal ende (Figur 1A). Den ene halvdel af vævet kan anvendes til histologiske analyser, mens den anden kan forarbejdes til vestlig skamplet, PCR eller rulles ind i en anden schweizisk rulle til frisk frossen immunfluorescensmikroskopi12.
2. Fremstilling af schweiziske ruller
- Trim ekstra væv fra det proksimale kolon ved hjælp af et barberblad, indtil omtrent samme bredde langs længden af hele tyktarmen er opnået.
- Juster tyktarmen for at udsætte lumen vender op, og flade vævet helt ved hjælp af en fleksibel sonde nål. Tilsæt mere PBS, hvis det er nødvendigt, for at holde vævet fugtigt under hele proceduren.
- Fjern overskuddet af PBS ved hjælp af en papirservietter. Med en sprøjte og sonde nål, tilsæt 10% neutral buffer formalin opløsning over vævet i 2-3 min at fastsætte og flade vævet.
- Brug lige pincet til at gribe fat i enden af distal kolon og vride tyktarmen i koncentriske cirkler fra distal til proksimal ende(Figur 1B).
BEMÆRK: Det er muligt at skubbe indersiden af den schweiziske rulle tilbage, mens du ruller ved hjælp af pegefingeren for at sikre, at vævet er inde i rullen. - Indsæt en 27 G nål for at fastgøre tyktarmen i midten for at holde den schweiziske rulleform(Figur 1C).
- Placer den schweiziske rulle med nålen i en indlejring kassette inde i en histologic prøve beholder.
BEMÆRK: Vævet skal være orienteret parallelt med kassetten før fiksering (Figur 1D). - Vævet fastgørs i 10% neutral bufferforminopløsning natten over ved 4 °C13.
- Efter natten fiksering, vask vævet 3x med PBS.
- Tilsæt 70% ethanol til vævet før paraffinindlejringsprocessen. Fjern nålen fra den schweiziske rulle, før du fortsætter. Væv kan opbevares i ethanol ved stuetemperatur indtil paraffinindlejring13.
- Prøverne anbringes i vævsprocessoren, indlejringen i paraffinen, og der fremstilles 4 μm sektioner monteret på positivt ladede mikroskopidias (Figur 1E). Dette kan være et valgfrit stoppunkt.
BEMÆRK: Korrekt vævsorientering er afgørende for at opnå sektioner, der er egnede til billedanalyse. Parallel schweizisk rulleintegrering i paraffinkassetten vil resultere i hele sektioner, der er afsat til billedanalyse (Figur 1F-1H). Skrå sektioner skal undgås for at forhindre ufuldstændige sektioner (Figur 1I-1K). Yderligere oplysninger finder du i afsnittet Diskussion. - Pletsektioner med hematoxylin og eosin (H&E)13.
3. Digital scanning og analyse
BEMÆRK: For nøjagtig vurdering af slimhindeændringer skal du kun markere sektioner, der indeholder mindst 90% af den samlede kolonlængde.
- Scan farvede sektioner ved hjælp af en slidescanner eller billedafbildning (se Materialeoversigt). Producerede billeder har brug for en opløsning på 0,25 mikron pr. pixel med 40x mål og 40x forstørrelse.
- Installer og download en passende software til digital analyse af scannede dias (se Materialeoversigt).
- Åbn scannede billeder i billedbehandlingssoftwaren (Figur 2A). Kontroller, at hele kolonet er synligt, og at der ikke mangler områder i prøven.
- Aktiver værktøjerne til etiketbilled- og skaleringslinje for at identificere scannede dias korrekt ved at klikke på Etiketbillede (Figur 2A).
- Åbn anmærkningsværktøjet ved at klikke på Anmærkninger(Figur 2A) og oprette 3 forskellige lag ved at klikke på Nyt lag (Figur 2B) for at kvantificere den samlede længde af den schweiziske rulle, betændelse/skade og erosion/sårdannelse. Vælg en anden farve for hvert lag ved at klikke på Lagfarve (Figur 2B).
- Mål længden af hvert lag/kategori ved at klikke på penværktøjet (Figur 2A) ved hjælp af muskulær slimhinde som reference:
- Se billedet ved 400 μm zoom (eller mere) for at lette tilstrækkelig visualisering af muscularis slimhinden.
BEMÆRK: Forstørrelsen styres let ved hjælp af musens rullehjul og skal justeres efter behov, mens du bevæger dig hen over sektionen for at tegne alle linjerne. - Klik på penværktøjet for at tegne en streg efter muskulær slimhinden (Figur 2A). Flyt markøren efter behov for at visualisere det tilstødende analyseområde.
BEMÆRK: Hver gang pennen stoppes, genereres et lille nyt lagområde. Den kan visualiseres og redigeres med fanen Lagområder (vælg det ønskede segment, og klik på Slet lag i tilfælde af fejl eller rettelser, Figur 2B).
- Se billedet ved 400 μm zoom (eller mere) for at lette tilstrækkelig visualisering af muscularis slimhinden.
- Når alle lag (Figur 2C) er defineret, skal du eksportere dataene ved hjælp af knappen Eksporter gitter til tekstfil i indstillingerne for lagområder (Figur 2B).
BEMÆRK: Gem filer ofte, mens du opretter lagene for at sikre, at dataene gemmes korrekt. - Åbn tekstfilerne, og kopier dataene med en regnearkssoftware. I alt alle segmenter fra hver region og beregn procentdelen af skader og sårdannelse i forhold til den samlede længde.
- For at beregne histologiske colitis score (HCS) og for at evaluere sværhedsgraden af sygdommen, overveje tre vigtigste egenskaber som beskrevet nedenfor.
- Kontroller for sund tarmslimhinde, som er karakteriseret ved organiserede epitelceller i krypt-luminal aksen, lamina propria med få immunceller og subjacent muscularis slimhinde, der grænseflader slimhinden og submucosa (Figur 3A).
- Kontroller for betændelse/skade, som er karakteriseret ved epitelkrypter, der er svækkede eller delvist manglende epitelceller og slimhindebetændelse med neutrofil infiltration i krypter (Figur 3B).
- Kontroller, om der er erosion/sårdannelse, som er karakteriseret ved områder uden overfladeepitelet eller områder, der helt mangler epitelkrypter med eller uden tilhørende leukocytter (Figur 3C).
- HCS for skadede og ulcererede områder beregnes udtrykt i procent af den samlede længde i følgende formel:
BEMÆRK: HCS kombinerer procentdelen af inflammation/skade og erosion/sårdannelse, der tilføjer en faktor på to til sidstnævnte, baseret på en rimelig antagelse om, at fuldstændigt tab af epitel resulterer i maksimalt tab af barriereintegritet og dermed værre sygdom. HCS repræsenterer konsekvent de morfologiske ændringer forårsaget af DSS induceret eksperimentel colitis. Interessant nok har vi ikke set en klar sammenhæng mellem antallet af colon lymfoid aggregater eller follikler og klinisk sygdom sværhedsgrad i DSS colitis, og derfor har vi ikke medtaget kvantificeringen i denne analyse. - Tag et øjebliksbillede af de repræsentative billeder (klik på Snapshot, Figur 2A), og gem. Medtag skalalinjer, hvis det er nødvendigt, ved at klikke på Vis/skjul skalalinje (Figur 2A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere pålideligheden af denne Histological Colitis Score Analysis i forbindelse med slimhindeskader efter DSS-udfordring og efterfølgende genopretning fra colitis administrerede vi 2,5% DSS i drikkevandet på otte 10 uger gamle mandlige C57BL6 vilde type mus i 5 dage efterfulgt af en genopretningsperiode med regelmæssigt vand i 5 dage. Der var ingen ændring i kropsvægten under akut indgift af DSS fra dag 0 til 5 (Figur 4A). Kropsvægten faldt dramatisk efter dag 5, da mus begyndte at drikke almindeligt vand fra hanen. Blod og blød afføring dukkede op efter 3 dages DSS-administration og fortsatte i de efterfølgende 3 dage på vand indtil dag 8 af eksperimentet (Figur 4B). Disse observationer tydede på, at de mest skadelige virkninger af eksponering for DSS blev observeret i genopretningsperioden mellem dag 5 og 8. Måling af tyktarmens længde på dag 10 bekræftede en betydelig afkortning ved forsøgets afslutning (figur 4C). Koloner blev høstet på dag 0, 2, 5, 7, 8 og 10 for at gøre paraffin schweiziske ruller. Væv blev plettet med H &E og high-definition scanninger (Figur 4D) blev analyseret for at beregne Histological Colitis Score(Figur 4E) og procentdel af skader og sårdannelse (Figur 4F).
Figur 4D viser normal kryptarkitektur i ubehandlede C576BL6-mus, overfladisk til muscularis slimhinden og understøttet af lamina propria (dag 0, pil). Efter 2 dages DSS-administration blev immuncellerekruttering observeret (dag 2, pil). På dag 5 syntes epitelceller beskadiget, og der var en infiltration af neutrofiler over epitel (kryptoitis) forbundet med epitelskade (dag 5, pil). Fra dag 5 til 8 blev der bemærket områder med epiteltab med betændelse og sårdannelse (dag 7 og 8, pile). Sidstnævnte er almindeligt observeret som musene drikker regelmæssig postevand i genopretningsfasen. Endelig begynder epitelceller at regenerere og genbefolke sårområder og langsomt genoprette colon slimhinde på dag 10 (pil).
HCS afspejler nøje en simpel vurdering af procentdelen af inflammation/skade og erosion/sårdannelse, og begge kvantitativt viser, at der er betydelig skade på tyktarmen af mus under genopretning fra DSS på dag 5 til 10, som korrelerer med epitel erosioner og leukocyt infiltration vist i figur 4D. Data fra HCS skelner mellem sygdommens sværhedsgrad med hensyn til betændelse i forbindelse med epitelskade versus erosion/sårdannelse.
Disse observationer viser, at det systematiske pointsystem for HCS, der foreslås i denne protokol, udgør et pålideligt redskab til at kvantificere skader på slimhinder.
Figur 1:Prøveforberedelse er afgørende for en nøjagtig dataanalyse. b)Schweizisk valseproces. (C) Nåleindføring for at holde schweizisk rulleform (D) paraffinintegreringskassette. (E)Paraffin blok. f) Schweizisk rulle parallel orientering for at undgå delvise sektioner. (G) Komplet schweizisk rulle, skalastang: 2 mm. (H) Ideel del af colon krypter, skalastang: 80 μm. (I) Skrå schweizisk rulleorientering. (J) Ufuldstændig schweizisk rulle, skala bar: 2mm. (K) Skrå del af colon krypter, skala bar: 80 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvantitativ vurdering af skader på slimhindeskader. (A) Grundlæggende værktøjslinje med snapshot, zoomskyder, vis/skjul skalalinje/akser/gitter, etiketbillede, anmærkninger og penneværktøjsfunktioner, blandt andre. (B) Menuen Anmærkninger, der viser lagfarve, nyt lag, slettelag, vise/skjule lag, slette område og eksportere gitter til tekstfilknapper. (C) Oversigt over den samlede længde, tilskadekomne og ulcerated lag, skala bar: 3 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Morfologi af mus tarmslimhinde farvet med hematoxylin &eosin efter akut DSS-eksperimentel colitis efterfulgt af genopretning. (A) Sunde tarmceller organiseret i colon krypter omgivet af lamina propria og adskilt fra submucosa af muscularis slimhinden, skala bar: 200 μm. (B) Akut slimhindebetændelse eller skade med infiltration af neutrofiler i slimhinden og krypt epitel, forbundet med kryptisk epitelforvrængning / tab og epitel dæmpning, skala bar: 200 μm. (C) Såede eller eroderede områder med fuldstændig epitel tab og tilhørende inflammation., skala bar: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Histologisk colitisScore og procentdel af skader og sårdannelse korrelerer med kropsvægt og afføringsindeks under DSS eksperimentel colitis: (A) Kropsvægt og (B) afføringsindeks evalueres dagligt i mus af vild type behandlet med 2,5% DSS i 5 dage (rød linje) efterfulgt af 5 dages restitution på vand (sort linje). Data er repræsentative for to uafhængige forsøg med mindst 4 mus pr. gruppe og udtrykkes som middel ± SEM. Betydningen bestemmes af tovejs ANOVA og Sidak multi sammenligning, *p<0.033, **p<0.002 og ***p<0.001. (C) Musens tyktarmslængde blev målt på dag 10. Data er repræsentative for to uafhængige forsøg med mindst 3 mus pr. gruppe og udtrykkes som middel ± SEM. Betydningen bestemmes af tosidet Student's t-test, ***p<0.001. (D) Hematoxylin og eosin (H&E)-farvede vævssektioner af colon slimhinde blev analyseret for at beregne, skalere stænger: 60 μm. (E) Histologisk Colitis Score (HCS) og procentdel af skade / sårdannelse i forhold til tyktarmens længde. Data er repræsentative for to forsøg med 2 mus pr. gruppe og udtrykkes som middelværdi ± SEM. Betydningen bestemmes af envejs-ANOVA- og Tukey-multisammenligning, *p<0,033, **p<0,002 og ***p<0.001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores Histological Colitis Score system udgør et pålideligt værktøj til at kvantificere vævsbetændelse og skader i tarmen. Denne tilgang giver en bedre forståelse af hele organets histopatologiske tilstand uden bias ved at vælge små områder eller ufuldstændige sektioner. Blandt de kritiske skridt til at gennemføre denne protokol med succes er korrekt forberedelse af schweiziske ruller, der giver mulighed for analyse af mindst 90% af tyktarmens længde; parallel orientering under paraffinindlejring og sektionsindretning for at sikre lige og ensartede vævssektioner med langsgående udsigt over epitelkrypter praksis og uddannelse med tilsyn fra en erfaren patolog for at bekræfte, at praktikanter identificerer forskellene mellem akut inflammation, epitelskade og erosion/sårdannelse adgang til en digital scanner med høj opløsning.
Små justeringer og fejlfinding er nødvendige for korrekt at orientere den schweiziske rulle under paraffinindlejring samt under sektionsinddemring for at sikre, at vævet er parallelt orienteret i forhold til paraffinkassetten og klingen (Figur 1E-F). Hvis du overholder denne rumlige retning, reduceres antallet af ufuldstændige sektioner. Hvis tyktarmen er perfekt rullet på sig selv, vil de bedste sektioner, herunder det meste af vævslængden, være placeret nær midten af den schweiziske rulle(Figur 1F). Indsamling af flere sektioner øger i høj grad chancen for at opnå velorienterede sektioner, hvor hele krypternes længde er synlig (Figur 1G-H). Undgå at sektionsopdelte skrå schweiziske ruller (Figur 1I-J), karakteriseret ved cirkulære krypter eller krypt donuts (Figur 1K). Ofte anbefales visualisering af de sektioner, der er indsamlet under mikroskopet, stærkt for at sikre korrekt teknik. En god sektion fanger hele længden af tyktarmen.
Ethvert instrument, der gør det muligt at fange hele længden af den schweiziske rulle og giver den opløsning, der er nødvendig for at forstørre vævet for at visualisere kryptarkitekturen, er tilstrækkeligt til evaluering af HCS. Nogle mikroskoper tillader overlapning af små billeder og rekonstruere hele væv sektioner. Opløsningen af disse billeder kan dog være dårlig efter stigende forstørrelse for at score vævet. Derudover er overlapningen af sektioner muligvis ikke perfekt, hvilket efterlader vævsområder, der ikke er veldefinerede og umulige at nøjagtigt score.
Blandt fordelene ved den scoringsprotokol, der foreslås her, er klassificeringen af vævet i kun to kategorier inflammation / skade eller erosion / sårdannelse. Dette forenkler og fremskynder klassificeringen af vævsskader, samtidig med at reproducerbarheden øges. Den software, der bruges til analysen, er tilgængelig, gratis og nem at bruge. HCS afspejler nøjagtigt slimhindeskader, da det giver mulighed for at kvantificere sårområder langs hele tyktarmens længde og giver passende mere vægt mod denne patologi over betændte, ikke-sårerede regioner. Dette afspejles tydeligt, når HCS-dataene sammenlignes i forhold til procentdelen af skade/sårdannelse(figur 4E-F). Scoringsanalysen af hver prøve tager ca. 40 minutter. Med den rette træning, adgang til scannede dias, en computer og softwaren kan de fleste forskere udføre analysen. Det er dog altid tilrådeligt at bekræfte scoringsresultater med en patolog for at sikre nøjagtighed og reproducerbarhed. Vurdering af tarmbetændelse kan udføres med enhver software, der tillader forstørrelse af dias med høj opløsning og længdemålinger; Men for nemheds skyld fokuserede vi i denne protokol på den software, der er anført i materialetabellen.
Vi har brugt dette scoringssystem til at analysere sygdom på tværs af forskellige DSS colitis eksperimenter. Kelm et al.14 undersøgte f.eks. betydningen af glykosylering af CD44v6, en vigtig regulator for epitelmigration og -spredning, ved hjælp af et nyt antistof (GM35). De demonstrerede reduceret sygdomsaktivitet indeks scoring og forbedret HSC hos mus udfordret med akut DSS efter målretning af sialyl lewis A glycaner på epitel CD44v6, bekræfter betydningen af post translationel ændring af CD44 varianter til nyttiggørelse efter DSS induceret skade14. I et andet eksempel brugte Reed et al.15 en kronisk DSS-model til at studere slimhindeskade og reparation hos mus med en epitelspecifik sletning af CD47, et transmembalprotein, der er vigtigt for inflammatoriske og reparationsprocesser. Kolon scanninger blev analyseret og scoret for at beregne procentdelen af skader og sår som beskrevet ovenfor, viser markant nedsat slimhinde reparation hos mus mangler epitel CD4715. Den kroniske colitis model i denne rapport ansat cyklisk administration af DSS til at analysere skader og reparation over tid.
Yderligere publikationer fra vores gruppe og andre har vist fordelene ved dette scoringssystem og dets korrelation med kliniske symptomer6,16,17. Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan man forbereder og scorer schweiziske ruller ved hjælp af gratis og let tilgængelig software. Enkelheden i den scoring, der foreslås her, er baseret på brug af kun to kategorier (betændelse / skade eller erosion / sårdannelse) i scannede dias for at lette scoringsprocessen og øge reproducerbarheden. Det er vigtigt, at det scoringssystem, der er beskrevet her, også korrelerer med kliniske parametre for tarmbetændelse. Afslutningsvis er Histological Colitis Score et værktøj, der kan bruges til kvantitativt at score DSS-colitis og kan anvendes på andre colitismodeller forbundet med betændelse og epitelskade / tab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra NIH finansiering DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 og University of Michigan Patologi Slide Scanning Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors - ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
