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Cancer Research

मेटास्टेसिस दर को नियंत्रित करने के लिए विच्छेदन के साथ एक सिंजेनिक ऑर्थोटोपिक ऑस्टियोसारकोमा स्प्राग डावले चूहा मॉडल

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62139
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1, 6, 7, 8, 9, 10, 4, 1,2
1Department of Molecular and Comparative Pathobiology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University, 3Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Coloproctological Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine, 5Program for Comparative Medicine, Gene Therapy Program, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 6Tuskegee College of Veterinary Medicine, 7Department of Human Pathology, Juntendo University Faculty of Medicine, 8Department of Surgery, Juntendo University Shizuoka Hospital, Juntendo University School of Medicine, 9Department of Urology, The Johns Hopkins School of Medicine, 10Department of Gastroenterology and Minimally Invasive Surgery, Juntendo University Faculty of Medicine

Summary

यहां, एक सिंजेनिक ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण जिसके बाद एनस्टियोसारकोमा की एक विच्छेदन प्रक्रिया के बाद सहज फेफड़े के मेटास्टेसिस के साथ इसका उपयोग मेटास्टेसिस जीव विज्ञान की पूर्व नैदानिक जांच और उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए किया जा सकता है।

Abstract

ऑस्टियोसारकोमा (ओएस) के उपचार में सबसे हालिया अग्रिम 1 9 80 के दशक में हुआ जब बहु-एजेंट कीमोथेरेपी अकेले सर्जरी की तुलना में समग्र अस्तित्व में सुधार करने के लिए दिखाई गई थी। इस समस्या का समाधान करने के लिए, अध्ययन का उद्देश्य चूहों में ओएस के एक कम ज्ञात मॉडल को एक व्यापक हिस्टोलॉजिक, इमेजिंग, जीवविज्ञान, प्रत्यारोपण और विच्छेदन शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण के साथ परिष्कृत करना है जो अस्तित्व को बढ़ाता है। हमने बाल चिकित्सा ओएस के लिए 3 सप्ताह पुराने पुरुष और महिला चूहों में ऑर्थोटोपिक टिबियल ट्यूमर प्रत्यारोपण के साथ प्रत्यारोपित UMR106 ओएस सेल लाइन (एसडी चूहे से उत्पन्न) के साथ एक इम्यूनोसकम्पेंट, आउटब्रीड स्प्राग-डाले (एसडी), सिंजेनिक चूहा मॉडल का उपयोग किया। हमने पाया कि चूहों प्रजनन प्राथमिक और मेटास्टैटिक फेफड़े के ट्यूमर का विकास, और 3 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण में अंग विच्छेदन काफी फेफड़े के मेटास्टेसिस की घटनाओं को कम करने और अप्रत्याशित मौतों को रोकने के लिए । हिस्टोलॉजिकल रूप से चूहों में प्राइमरी और मेटास्टैटिक ओएस मानव ओएस के समान थे । इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के तरीकों का इस्तेमाल करते हुए अध्ययन से पता चलता है कि चूहे के ओएस मैक्रोफेज और टी सेल्स के साथ घुसपैठ कर रहे हैं । ओएस कोशिकाओं के एक प्रोटीन अभिव्यक्ति सर्वेक्षण से पता चलता है कि इन ट्यूमर ErbB परिवार kinases व्यक्त करते हैं । चूंकि ये किनेस भी अधिकांश मानव ॉस में अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं, इसलिए इस चूहे के मॉडल का उपयोग चिकित्सा के लिए एर्बीबी मार्ग अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

ऑस्टियोसारकोमा (ओएस) बच्चों, किशोरों और युवा वयस्कों में सबसे आम प्राथमिक अस्थि ट्यूमर है। ओएस के उपचार में सबसे हालिया अग्रिम 1 9 80 के दशक में हुआ जब मल्टी-एजेंट कीमोथेरेपी को अकेले सर्जरी की तुलना में समग्र अस्तित्व में सुधार करने के लिए दिखाया गया था1। ओएस तेजी से हड्डी के विकास के दौरान विकसित होता है, आमतौर पर फीमर, टिबिया और ह्यूमरस जैसे लंबे ट्यूबलर हड्डियों में होता है। वे एक ऑस्टियोलिटिक, ऑस्टियोब्लास्टिक, या मिश्रित उपस्थिति की विशेषता है, जो उल्लेखनीय पेरिओस्टियल प्रतिक्रिया2के साथ है। कीमोथेरेपी और सर्जिकल रिसेक्शन2,3रोगियों के 65% के लिए 5 साल के अस्तित्व वाले रोगियों के लिए परिणाम में सुधार कर सकते हैं। दुर्भाग्य से, मेटास्टैटिक रोग के साथ उच्च ग्रेड ओएस रोगियों में 20% जीवित है। ओएस क्षेत्रीय रूप से आक्रमण करता है और मुख्य रूप से फेफड़ों या अन्य हड्डियों के लिए मेटास्टेसाइज करता है और पुरुषों में अधिक प्रचलित है। इन युवा रोगियों के लिए सबसे सम्मोहक आवश्यकता एक उपन्यास चिकित्सा है जो दूर के मेटास्टेस की व्यवहार्यता को रोकती है और समाप्त करती है।

ओएस प्री-क्लीनिकल मॉडल की समीक्षा की गई है4,5,6,7 और ऑर्थोटोपिक ओएस के विच्छेदन का उपयोग करके कुछ उपलब्ध इम्यूनोसंपिटर मॉडल विकसित किए गए हैं। 2000 में, ऑर्थोटोपिक सिंजेनिक ओएस और विच्छेदन8के साथ बाल्ब/सी चूहों का उपयोग करके एक महत्वपूर्ण मॉडल विकसित किया गया था। इस माउस मॉडल की तुलना में, चूहा मॉडल आनुवंशिक रूप से outbred और 10 गुना बड़े जानवरों पर आधारित है जिससे कुछ फायदे होते हैं। चूहा UMR106 मॉडल एक स्प्राग डावले (एसडी) चूहे में एक 32पी प्रेरित ओएस से विकसित किया गया था, जिसे सेल लाइन9में प्राप्त किया गया था। 2001 में, UMR106-01 के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण को पहली बार मनुष्यों में ओएस के साथ आम में तेजी से, लगातार प्राथमिक ट्यूमर विकास और रेडियोलॉजिकल, हिस्टोलॉजिक सुविधाओं के साथ एथेमिक चूहों के प्रत्यारोपित टिबिया में वर्णित किया गया था। पल्मोनरी मेटास्टेस विकसित हुए और बोन माइक्रोएनवायरमेंट10में UMR106 के ऑर्थोटोपिक प्लेसमेंट पर निर्भर थे । 2009 में, यू एट अल11 ने बड़े पुरुष एसडी चूहों में UMR106 कोशिकाओं का उपयोग करके एक प्रजनन ऑर्थोटोपिक ओएस चूहा मॉडल की स्थापना की। विच्छेदन के बिना चूहों में सफल ट्यूमर प्रत्यारोपण और फेफड़ों के मेटास्टेसिस दर यहां प्रस्तुत आंकड़ों के समान थे । इस अध्ययन में, युवा चूहों का उपयोग कर मॉडल के लिए एक जोड़ा विच्छेदन किया गया था, जो सुझाव दिया है कि प्राथमिक ट्यूमर हटाने के समय ओएस मॉडलिंग में महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से मेटास्टैटिक प्रगति से संबंधित है । इस शोधन के साथ, विच्छेदन और वीवो इमेजिंग में ओएस के लिए उपन्यास दवा मूल्यांकन के लिए पूर्व-नैदानिक अध्ययन के लिए इस मॉडल में सुधार होता है।

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Protocol

चूहों से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं और प्रयोग जॉन्स हॉपकिंस एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे ।

1. एसडी चूहा ओएस सेल लाइन UMR-106 सेल संस्कृति प्रोटोकॉल

  1. डीएमईएम में कोशिकाओं को उगाएं, 10% (v/v) एफबीएस, पेनिसिलिन (10 यू/एमएल) के साथ पूरक-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10 यू/एमएल) आर्द्र 5% सीओ2 वायुमंडल में ३७ डिग्री सेल्सियस पर । 2-812के मार्ग के साथ कोशिकाओं का उपयोग कर प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं ।

2. ओएस कोशिकाओं प्रोटोकॉल के इंट्राटिबियल इंजेक्शन

नोट: समय-संभोग गर्भवती एसडी चूहे जानवरों की सुविधा में जन्म देते हैं और 3 सप्ताह की उम्र में, कूड़े का उपयोग किया जाता है (चूंकि UMR 106 सेल लाइन एसडी चूहों के लिए सिनेजेनिक है, इसलिए कोई विकिरण की आवश्यकता नहीं है)।

  1. प्रवेश
    1. चूहे को मध्यम आकार के इंडक्शन कक्ष में रखें और 2%-3% आइसोफ्लुन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें। जानवरों की गहराई के लिए लगातार जानवर की निगरानी करें, जो पिस् ट चुटकी, श्वसन दर और चरित्र पर पलटा जाता है।
    2. नाक को नाक में डालें। यदि आवश्यक हो तो टेप के साथ सुरक्षित करें।
    3. कतरनी के साथ वेंट्रल और पृष्ठीय निचले पेट तक दाहिने पैर पर बाल निकालें या डिपिलेटरी एजेंट का उपयोग करें। चूहे को रीढ़ की स्थिति में रखें।
    4. 70% इथेनॉल और पतला क्लोरहेक्सीडीन एसीटेट या पतला बीटाडीन का उपयोग करके सर्जिकल क्षेत्र को उपयुक्त रूप से साफ़ करें। घुटने के क्षेत्र के आसपास शुरू करें और एक गोलाकार गति में साफ़ करें दोनों समीपस्थ और डिस्टल। इस स्टेप को तीन बार दोहराएं। ट्यूमर प्रत्यारोपण के लिए कोई कपड़ा का उपयोग नहीं किया जाता है।
    5. संज्ञाहरण के कारण कॉर्नियल डेसीफिकेशन को रोकने के लिए चूहे की दोनों आंखों में आंख स्नेहक लगाएं। चूहे को कम गर्मी सेटिंग हीटिंग पैड पर रखें। सुनिश्चित करें कि चूहे के शरीर का सामान्य तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और सामान्य श्वसन दर है।
  2. शल्यचिकित्सा
    1. ~1.5%-2% (रखरखाव के लिए) पर आइसोफ्लुनाणे चालू करें। सुनिश्चित करें कि जानवर एक अंगुली चुटकी पलटा की कमी के माध्यम से संज्ञाहरण के एक पर्याप्त विमान में है। यदि नहीं, तो आइसोफ्ल्रैन प्रतिशत को बढ़ाकर 2.5% करें।
    2. डालने के लिए गहराई के मार्गदर्शन के लिए टिप से 10 मिमी पर एक बाँझ सुई (लगभग 22 ग्राम) चिह्नित करें।
    3. सुई 10 मिमी नीचे टिबिया के डायफिसिस में टिबियल पठार के बीच में तुला घुटने में प्रवेश करके डालें, एक खोलने के लिए एक प्रकाश ड्रिल की तरह गति का उपयोग कर डायफिसिस में मेटाफिसिस के माध्यम से सुई का विस्तार । सुई निकालें।
    4. टिबिया में इंजेक्शन से पहले सीधे हैमिल्टन सिरिंज में सेल निलंबन लोड करें। ऐसा करने के लिए, धीरे से सिरिंज में ड्राइंग से पहले कोशिकाओं को मिश्रण के रूप में गुरुत्वाकर्षण कोशिकाओं ट्यूब के नीचे में व्यवस्थित करता है ।
      नोट: कोशिकाओं को सावधान मिश्रण के बाद हैमिल्टन सिरिंज (१०० μL) में ड्राइंग से पहले एक १.५ से 2 मिलीएल ट्यूब (कमरे के तापमान पर) में संग्रहीत किया जा सकता है । प्रत्यारोपण प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को 2-3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है। प्रत्यारोपण सत्र से पहले और फिर ट्यूब में कोशिकाओं की कोशिका व्यवहार्यता की हमेशा जांच करें। ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन सेल व्यवहार्यता मूल्यांकन के लिए सबसे आसान तरीका है।
    5. एक बार हड्डी पहली सुई के साथ तय हो जाती है, तो कोशिकाओं से भरी 100 माइक्रोन हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ी एक दूसरी (छोटी व्यास सुई भी 10 मिमी) सुई पर चिह्नित डालें। डायफिसिस में विस्तारित एक ही छेद में 10 मिमी निशान तक सुई डालने के लिए सुनिश्चित करें।
    6. धीरे से डायफिसिस और मज्जा गुहा में पीबीएस में 75,000 ओएस कोशिकाओं निलंबन के 20 μL निर्वहन।
      नोट: सुई हड्डी में लड़खड़ा नहीं होना चाहिए और सुरक्षित महसूस करना चाहिए । यदि सुई आसानी से चलती है, तो हो सकता है कि कॉर्टेक्स डायफिसिस पर पार हो गया हो। कोशिकाओं के इंजेक्शन से पहले एक मजबूत प्लेसमेंट प्राप्त करने के लिए प्रविष्टि को फिर से दोहराएं।
    7. हड्डी से हैमिल्टन सुई निकालें।
      नोट: यदि रक्त रूपों की एक छोटी सी बूंद, प्रकाश दबाव लागू होते हैं । यदि पंचर साइट पर स्पष्ट तरल पदार्थ ड्रॉप रूपों, सुई अभी तक हड्डी में पर्याप्त नहीं बढ़ाया गया है और ट्यूमर सेल निलंबन छेद के माध्यम से वापस लीक हो सकता है । नोटों में यह रिकॉर्ड लेकिन आम तौर पर, ट्यूमर प्रत्यारोपण सफल हो जाएगा। अनुभव के साथ, ट्यूमर प्रत्यारोपण प्रक्रिया चूहे प्रति 5 मिनट लेना चाहिए। अनुभव के साथ, हड्डी में कोशिकाओं का ट्यूमर प्रत्यारोपण आसान हो जाएगा। हड्डी के चारों ओर मांसपेशियों में कोशिकाओं के आकस्मिक इंजेक्शन, फेफड़े के मेटास्टेसिस के लिए आवश्यक ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट का कारण नहीं बन सकते हैं।
  3. वसूली
    1. सुनिश्चित करें कि चूहा आदर्श है। वसूली के लिए पिंजरे के नीचे रखे हीटिंग पैड के साथ चूहे को पिंजरे में रखें।
    2. पूरी तरह से जागने के बाद, मोबाइल, और अच्छी तरह से सांस लेने के बाद, चूहों को बुप्रेनोरफिन (1.0-1.2 मिलीग्राम/किलो अनुसूचित जाति) के साथ इंजेक्ट करें।
      नोट: Buprenorphine तक पहुंच प्राप्त करने के लिए, आदेश देने के लिए पशु चिकित्सा कर्मचारियों के माध्यम से अनुमोदन के लिए विकल्प देखने के लिए संस्था के साथ जांच करें।
    3. चूहों को पिंजरों को साफ करने के लिए वापस ले जाएं और प्रत्येक सप्ताह दिन में एक बार निगरानी करें।

3. माप और निगरानी

  1. ट्यूमर के आकार को मापने के बाद 9-10 दिन प्रत्यारोपण और फिर हर 2 दिन जब तक 3 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण के लिए एक विकास दर स्थापित करने के लिए । इलेक्ट्रॉनिक या मैनुअल कैलिपर का उपयोग करके टिबिया के अधिकतम व्यास को मापें। ट्यूमर की मात्रा की गणना करने के लिए एक सूत्र के साथ एक स्प्रेडशीट में डेटा स्टोर करें। बेसलाइन के रूप में कॉन्ट्रालेट्रल (प्रत्यारोपित टिबिया नहीं) को मापें।
    नोट: प्रत्यारोपित हिंडलिब व्यास ट्यूमर के आकार के लिए एक किराए के रूप में उपयोग किया जाता है । अंगों को दो मापों, वेंट्रल/पृष्ठीय और मीडिया/पार्श्व अंग के लिए सबसे बड़े व्यास पर टिबिया लंबी धुरी के लंबवत मापा जाता है । अनुमानित ट्यूमर की मात्रा की गणना फॉर्मूला11:ट्यूमर की मात्रा(एमएम 3)= सबसे बड़ा व्यास (मिमी) एक्स सबसे छोटा व्यास(मिमी) 2 /2द्वारा किया जाता है।
  2. जीवित रहने विच्छेदन या कीमोथेरेपी उपचार के लिए चूहों पर विचार करें जब ट्यूमर सबसे बड़े आयाम में 15 मिमी या ट्यूमर प्रत्यारोपण के बाद 3 सप्ताह तक पहुंचते हैं। कॉन्ट्रालेट्रल अंग इस उम्र में अधिकांश चूहों में लगभग 7-9 मिमी का उपाय करता है।

4. डॉक्सोरुबिकिन नसों में प्रशासन

  1. चूहों को 2% आइसोफ्लुनाणे के साथ एनेस्थेटाइज करें। त्वचा को जुगुलर नस पर तैयार करें , जिसमें बीटाडीन और अल्कोहल का उपयोग करके तीन सर्जिकल वॉश13बताए गए हैं ।
  2. सावधानीपूर्वक विच्छेदन के तहत, दाईं या बाईं जुगलबंदी नस की कल्पना करें। सुई को ओवरलाइंग मांसपेशी में डालें और फिर चूहे के सिर की ओर जुगुलर नस ल्यूमेन में सीधे करें क्योंकि यह छाती की मांसपेशियों के लिए जुगुलर नस पूर्वकाल में कल्पना की जाती है।
    1. जब सुई को जुगुलर नस में डाला जाता है, तो उचित प्रविष्टि सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे सिरिंज में रक्त खींचें। यह विश्वास करना संभव है कि सुई नस के माध्यम से होती है, लेकिन सुई नस के नीचे होती है न कि ल्यूमेन में। यदि जुगुलर नस को बेनकाब करने के लिए कुंद विच्छेदन करते समय इंजेक्शन के लिए बहुत छोटी हो जाती है, तो इंजेक्शन के लिए अन्य जुगुलर नस का उपयोग करें।
  3. 100-150 माइक्रोन की मात्रा में 1 मिनट से अधिक धीरे-धीरे डॉक्सोरुबिकिन (2 मिलीग्राम/किलो) इंजेक्ट करें। समाधान को डिलीवरी के दौरान जुगुलर नस में नसों के द्वारा कल्पना किया जा सकता है।
  4. नियंत्रण चूहों में सामान्य नमकीन की समान मात्रा इंजेक्ट करें।
  5. सुई निकालें और एक बाँझ धुंध के साथ नस पर कोमल दबाव लागू होते हैं।
  6. 3-4 घाव क्लिप का उपयोग कर त्वचा चीरा बंद करें। 7-10 दिनों के बाद इंजेक्शन पर क्लिप निकालें।
    नोट: चूहे आमतौर पर धातु क्लिप हटाने की कोशिश नहीं करते हैं, लेकिन टांके काटेंगे और हटा देंगे। जुगुलर इंजेक्शन विधि डॉक्सोरुबिसिन के लिए पूंछ नस इंजेक्शन के लिए बेहतर है क्योंकि पोत के बाहर लीक होने वाली किसी भी दवा से पूंछ के परिगलन का कारण बनता है जिसके लिए पूंछ विच्छेदन की आवश्यकता हो सकती है।

5. हिंद अंग विच्छेदन प्रोटोकॉल

  1. प्रवेश
    1. चूहे को मध्यम आकार के इंडक्शन कक्ष में रखें और 2%-4% आइसोफ्लुन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें। संज्ञाहरण की गहराई के लिए लगातार चूहे की निगरानी करें।
      नोट: इंडक्शन चैंबर एक लकड़ी का कोयला कनस्तर के लिए मैला है और किसी भी अंय गैसों सर्जरी के लिए इस्तेमाल किया एक नीचे मसौदा मेज से हटा रहे हैं ।
    2. नाक को नाक में डालें। यदि आवश्यक हो तो टेप के साथ सुरक्षित करें।
      नोट: यह प्रक्रिया अतिरिक्त अस्थिर गैसों (यानी आइसोफ्लाणे) को मैला करने के लिए डाउन-ड्राफ्ट टेबल पर की जाती है।
    3. कतरनी के साथ वेंट्रल और पृष्ठीय निचले पेट तक दाहिने पैर पर बाल निकालें या डिपिलेटरी एजेंट का उपयोग करें। चूहे को रीढ़ की स्थिति में रखें।
    4. 70% इथेनॉल और पतला क्लोरहेक्सीडीन एसीटेट या पतला बीटाडीन का उपयोग करके सर्जिकल क्षेत्र को उपयुक्त रूप से साफ़ करें। सही निचले पेट के कूल्हे के जोड़ के ठीक ऊपर बछड़े के बीच से त्वचा क्षेत्र के लिए सर्जरी के लिए त्वचा तैयार करें। पैर के समीपस्थ और डिस्टल क्षेत्र को परिरस रूप से साफ़ करें। इस स्टेप को तीन बार दोहराएं।
    5. चूहे की दोनों आंखों में आंखों के स्नेहक लगाएं। सुनिश्चित करें कि चूहे के शरीर का सामान्य तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और सामान्य महत्वपूर्ण संकेत हैं। एक हीटिंग पैड का उपयोग करके शरीर के तापमान की निगरानी और नियमन करें जो गुदा तापमान जांच मॉनिटर से जुड़ा हुआ है।
  2. शल्यचिकित्सा
    1. 1.5%-3% (रखरखाव) पर आइसोफ्लुनाणे चालू करें। संवेदनाहारी गहराई के लिए मॉनिटर, जिसमें अंगुली की चुटकी, श्वसन दर और चरित्र की प्रतिक्रिया शामिल है। संज्ञाहरण के एक उपयुक्त विमान को बनाए रखने के लिए जरूरत के रूप में आइसोफ्लुएरेन की दर को समायोजित करें।
      नोट: संज्ञाहरण के तहत श्वसन दर प्रति मिनट 50-100 सांस के बीच होनी चाहिए। गहरी, निराला साँस एक संकेत है कि चूहा बहुत गहराई से एनेस्थेटाइज्ड है।
    2. खुले बाँझ साधन पैक और पर्दे और डॉन बाँझ दस्ताने। प्रक्रिया की अवधि के माध्यम से बंध्यता बनाए रखने के लिए ध्यान रखना। बुनियादी बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों की जरूरत में शामिल हैं, स्केलपेल ब्लेड धारक, संदंश, हीमोस्त, सुई धारक, कैंची, और घाव क्लिप लागू होता है।
    3. बाँझ सर्जिकल ड्रेप के वेंट के माध्यम से चूहे के पैर खींचो। सुनिश्चित करें कि जानवर मधुमक्खी-चुटकी पलटा के माध्यम से संज्ञाहरण के एक पर्याप्त विमान में है।
    4. एक स्केलपेल ब्लेड या सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, दबाना (घुटने के जोड़) के लिए एक परिस्थितिजन्य, cutaneous चीरा सिर्फ समीपस्थ बनाते हैं।
    5. हिंद अंग के वेंट्रल-मध्य सतह पर फीमोरल धमनी और नस को बेनकाब करने के लिए धुंध या कुंद विच्छेदन का उपयोग करके हिंद अंग को छोड़ देता है।
    6. मध्य-फीमर के स्तर पर 4-0 अवशोषित टांके का उपयोग करके जहाजों को लिगेट करें और distally से पार करें।
    7. मांसपेशियों के विच्छेदन के दौरान रिसाव को कम करने के लिए नस को अलग से दबाना।
      नोट: परिधीय मांसपेशी फेमोरल धमनी पोत लिगेशन और मांसपेशियों को फीमर से कोक्सोफेमोरल संयुक्त के स्तर तक ऊंचा करने के स्तर तक डिस्टल ट्रांसटेक्टेड होगी।
    8. कुंद विच्छेदन का उपयोग करना, पार्श्व जावक रोटेशन के साथ कूल्हे के संयुक्त का अपहरण करें।
    9. फीमर का सिर ढूंढें और उसे एसिटाबुलम से डिस्टर्ब करें। शरीर से जुड़े पैर को रखते हुए किसी भी बचे हुए टिश्यू को काट लें।
    10. लगभग 6 मिलीग्राम/किलो रोपिवकेन के साथ एसिटाबुलम और सियाटिक तंत्रिका को एक स्पलैश ब्लॉक दें।
    11. एक साधारण बाधित सीवन (4-0, अवशोषित सीवन) का उपयोग करके एसिटाबुलम पर मांसपेशी बंद करें।
      नोट: अतिरिक्त 0.5% bupivacaine या lidocaine (0.15-0.2 मिलीग्राम कुल) बंद मांसपेशी परत (स्थानीय घुसपैठ/
    12. हर 5-10 मिमी के अलावा रखे गए घाव क्लिप का उपयोग करके त्वचा के किनारों का विरोध और बंद करें।
  3. वसूली
    1. पिंजरे के नीचे रखे हीटिंग पैड का उपयोग करके गर्म समर्थन के साथ चूहे को एक साफ वसूली पिंजरे में रखें।
      नोट: हाइपरथर्मिया को रोकने के लिए, हीटिंग पैड जानवर के सीधे संपर्क में नहीं होना चाहिए और 40 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं होना चाहिए।
    2. जानवर की निगरानी तब तक करें जब तक कि यह पूरी तरह से ठीक न हो जाए और नॉर्मथथिक (37.5-39 डिग्री सेल्सियस) हो।
      नोट: जानवर को पूरी तरह से सचेत और सख्ती से भारित और पिंजरे के चारों ओर आसानी से जाने तक उपेक्षित नहीं छोड़ा जाना चाहिए।
    3. पूरी तरह से जागने के बाद, मोबाइल, और अच्छी तरह से सांस लेने के बाद, चूहों को बुप्रेनोरफिन (1.0-1.2 मिलीग्राम/किलो अनुसूचित जाति) के साथ इंजेक्ट करें।
      नोट: एक एनेस्थेटाइज्ड चूहे में बुप्रेनोरफिन देने से रिकवरी ख़राब हो सकती है।
    4. कंधे के ब्लेड के बीच गर्म स्तनपान कराने वाले रिंगर के समाधान के 10 एमएल को कम से कम प्रशासित करें।
    5. चूहों को साफ पिंजरे में वापस ले जाएं और विशिष्टताओं के साथ पुनर्मिलन करें।
    6. दर्द और संकट के लक्षणों के लिए अगले महीने के लिए दैनिक रूप से सभी जानवरों की निगरानी करें, जिसमें पिलोरेक्शन, कूबड़ मुद्रा, या चीरा साइट संक्रमण के संकेत शामिल हैं, जिनमें एरिथेमा, शुद्ध निर्वहन या घाव का उपहास शामिल है।
      नोट: आज तक हमने किसी भी जानवर में पोस्ट-ऑपरेटिव रिकवरी के बाद नैदानिक संकेत (जैसे संक्रमण) नहीं देखा है। केवल एक चूहे में टांके के साथ एक अपमान था, जिसके बाद घाव क्लिप का उपयोग घावों को बंद करने के लिए किया जाता था जिसमें आगे की कोई समस्या नहीं होती थी।
    7. प्रयोगशाला पशु पशुचिकित्सा के परामर्श से प्रकाशित खुराक पर दर्द के नैदानिक लक्षण पेश करने वाले जानवरों को बुप्रेनोरफिन या मेलोक्सिकम प्रशासित करें।
    8. एक प्रयोगशाला पशु पशुचिकित्सा के परामर्श से प्रकाशित खुराक पर दर्द के नैदानिक लक्षण पेश जानवरों के लिए एंटीबायोटिक दवाओं (यानी, cephalosporin) प्रशासन ।
      नोट: कोई भी जानवर दर्द या संकट के लंबे संकेतों का प्रदर्शन करता है जो एनाल्जेसिक या जानवरों के साथ संक्रमण के लक्षणों का प्रदर्शन नहीं करते हैं जो एंटीबायोटिक दवाओं का जवाब नहीं देते हैं, मानवीय रूप से इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है।

6. एक्स-रे के साथ इमेजिंग

  1. ट्यूमर प्रत्यारोपण के बाद, कृंतक के लिए डिज़ाइन की गई मशीन के साथ एक्स-रे का उपयोग करके ट्यूमर के विकास का पता लगाने के लिए टिबियस और फेफड़ों को गैर-आक्रामक रूप से छवि दें।
  2. चूहों को पहले किया गया था।
  3. 25 केवी पर 6 एस के लिए 3x आवर्धन पर छवियां लें।
  4. एक्स-रे प्रोसेसर का उपयोग कर फिल्म की प्रक्रिया। रेडियोग्राफ को डिजिटल रूप से स्कैन भी किया जा सकता है।

7. नेक्रॉप्सी प्रक्रिया

  1. सीओ2के साथ चूहों को इच्छामृत्यु । दिल की धड़कन की कमी के माध्यम से मौत की पुष्टि करें और तुरंत सीरम या प्लाज्मा नमूनों के लिए दिल से 3 एमएल रक्त आकर्षित करें।
  2. जांच के लिए छाती और पेट खोलें।
  3. श्वासनली को अलग करें और एक (18 जी) कैथेटर के साथ कैनुलेट करें। श्वासनली में कैथेटर को सुरक्षित करने के लिए, कैथेटर के साथ दोनों श्वासनली के चारों ओर एक रेशम सीवन बांधें।
  4. जलसेक कैथेटर को 3 या 5 एमएल सिरिंज से कनेक्ट करें। बेहतर हिटोलॉजी नमूनों के लिए फेफड़ों के पालियों को धीरे-धीरे फुलाने के लिए फॉर्मेलिन या नमकीन का संचार करें। जलसेक पर, फेफड़े कश और फेफड़े के मेटास्टेस के एक बेहतर दृश्य सक्षम हो जाएगा ।
  5. सभी चयनित छाती और पेट के अंगों (जैसे यकृत, गुर्दे) की जांच, विच्छेदन और वजन करें।
  6. हिस्टोपैथोलॉजी के लिए फॉर्मेलिन में अंगों को ठीक करें या सूखी बर्फ, 2-मिथाइलबुटेन, या तरल नाइट्रोजन पर फ्रीज करें।
  7. पश्चिमी दाग का उपयोग कर प्रोटीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए, जमे हुए ऊतकों की lysates बनाते हैं। चूहे के ऊतकों के साथ प्रतिक्रिया करने वाले एंटीबॉडी विस्तृत हैं13.

8. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. प्राथमिक ओएस ऊतक को संसाधित करें, पैराफिन में एम्बेड करें, और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला करने के लिए इसे अनुभाग करें।
  2. साइट्रेट बफर (पीएच 6.0) का उपयोग करके डेपैराफिनाइजेशन के बाद एंटीजन को पुनः प्राप्त करें। 0.3% एच2O2 मेथनॉल में 30 मिनट के लिए एंडोजेनस पेरोक्सिडेस को बुझाने के लिए।
  3. सामान्य सीरम का उपयोग करके 5 माइक्रोन मोटी पैराफिन सेक्शन को ब्लॉक करें।
  4. प्राथमिक एंटी-सीडी 68 और सीडी 3 एंटीबॉडी (टेबल देखें) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  5. पीबीएस में अनुभागों कुल्ला और एक पता लगाने किट का उपयोग कर एचआरपी बहुलक में उन्हें इनक्यूबेट।
    नोट: इम्यूनोस्टेटिंग को क्रोमोजन के रूप में डायामिनोबेन्जिडीन के साथ विकसित किया गया था।

9. पश्चिमी धब्बा

  1. Lyse 200-300 में UMR-106 कोशिकाओं lysis बफर14 के μL मानक जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस और पश्चिमी दाग प्रदर्शन करने के लिए।
  2. 4% से 12% बीआईएस-ट्रिस जैल का उपयोग करें।
  3. एंटी-एर्बबी2, एंटी-एर्बीबी 4, एंटी-ईजीएफआर, एंटी-ईईएफआर, β-ऐक्टिन या एंटी-माउस 2-एआर प्राइमरी एंटीबॉडी (टेबल देखें) और सहिजन पेरोक्सिडासे से जुड़े सेकेंडरी एंटीबॉडी में इनक्यूबेट।
  4. केमिल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट डालें। एक्स-रे फिल्म के लिए झिल्ली का पर्दाफाश करें।
    नोट: β-ऐक्टिन स्तरों का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता है।

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Representative Results

इम्यूनोडंपेंट एसडी आउटब्रीड चूहों का उपयोग इन ओएस अध्ययनों के लिए किया जाता है, जो एक अक्षुण्ण प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ एक पशु मॉडल प्रदान करता है। हमने एटीसीसी से UMR106 सेल लाइन का उपयोग किया है, जो उन कोशिकाओं से विकसित किया गया है जो शुरू में एसडी चूहे से एक ओएस से अलग थे। हम एसडी चूहों में कोशिकाओं प्रत्यारोपित, इस प्रकार ओएस के लिए एक सिंजेनिक मॉडल प्रदान करते हैं । UMR106 कोशिकाओं को 3 सप्ताह पुराने पुरुष और महिला एसडी चूहों के टिबिया में प्रत्यारोपित किया जाता है, एक बाल चिकित्सा ओएस मॉडल अनुकरण । इसके अलावा, UMR106 कोशिकाओं के आर्थोटोपिक प्रत्यारोपण सीधे टिबिया मेटाफिसिस/डायफिसिस में एक प्रासंगिक ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट देता है ।

ट्यूमर कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करते समय, एक सुई को सही कोण (हड्डी शाफ्ट के समानांतर) पर टिबियल पठार (चित्रा 1) के माध्यम से सही ढंग से डाला जाना चाहिए, जो सुई की हड्डी की केंद्रीय गुहा में लगभग 10 मिमी का विस्तार करता है। इस प्रक्रिया के साथ, चूहों के 95% (52/55) ने घुटने तक टिबियस डिस्टल में ट्यूमर विकसित किया। टिबियल इंजेक्शन अनुभव के साथ, 100% चूहों ने ट्यूमर विकसित किया। चूहों के एक समूह में जो काट नहीं रहे थे, पुरुषों में औसत ट्यूमर की मात्रा 3 सप्ताह में 504मिमी 3 और 5 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण में 1195 मिमी3 थी। महिलाओं में, ट्यूमर की मात्रा 3 सप्ताह में 285मिमी 3 और 5 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण पर 495 मिमी3 पर औसत है।

चूहों के दो साथियों की तुलना की गई, जिनमें विच्छेदन (23 चूहे) (चित्रा 2) और विच्छेदन के बिना (29 चूहे) शामिल हैं। दोनों साथियों को फेफड़ों के लिए ट्यूमर मेटास्टेसिस की जांच करने के लिए 7 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण पर इच्छामृत्यु दी गई थी । विच्छेदन समूह (3/23) चूहों में फेफड़े के मेटास्टेस विकसित हुए। इन तीन चूहों की मृत्यु हो गई या सर्जरी के 24 घंटे के भीतर इच्छामृत्यु के बाद सर्जरी जटिलताओं के कारण थे । सर्जन विधि सीख रहा था के रूप में लंबे समय तक संज्ञाहरण से दो चूहों की मृत्यु हो गई । एक चूहे ने एक अपवित्रता विकसित की और अगले दिन इच्छामृत्यु दी गई। इन तीन चूहों के फेफड़ों का मूल्यांकन किया गया और तीन छोटे मेटास्टेस (>1 मिमी) हिस्टोलॉजिकल रूप से पाए गए। जीवित 20 चूहों में प्रत्यारोपण के बाद फेफड़ों के मेटास्टेस 7 सप्ताह नहीं थे। यह संकेत दिया है कि 3 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण विच्छेदन फेफड़े के मेटास्टेसिस के साथ चूहों की संख्या को कम करने के लिए पर्याप्त हैं । 29 चूहों के एक दूसरे समूह में, जिसमें विच्छेदन प्रक्रिया नहीं थी, 26/29 चूहों में पहले प्रकाशित डेटा11के अनुरूप फेफड़े के मेटास्टेस थे। हमने इन चूहों में मेटास्टेस के आकार या संख्या में कोई पैटर्न नहीं देखा। अधिकांश चूहों में 10 से अधिक दिखाई देने वाले 2-7 मिमी व्यास मेटास्टेस होते हैं जिन्हें नेक्रॉप्सी के दौरान आसानी से नमूना लिया जाता था। कभी-कभी, चूहों के व्यास में 10 मिमी तक के बड़े मेटास्टेस थे। कम मार्ग संख्या के साथ UMR106 कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि अध्ययनों से पता चला है कि 10 या उससे अधिक मार्ग संख्या वाली कोशिकाएं अधिक आक्रामक हो जाती हैं और 2-3 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण के रूप में जल्दी मेटास्टेसाइज हो जाती हैं। प्रकृति का कारण ज्ञात नहीं है लेकिन अटकलें यह है कि संस्कृति में कोशिकाएं उत्परिवर्तन विकसित कर सकती हैं जो मेटास्टेसिस का पक्ष लेते हैं।

विच्छेदन सर्जरी के अलावा, तरीकों के एक और शोधन ट्यूमर निगरानी के लिए एक्स-रे इमेजिंग या necropsy में शामिल थे । यह विधि शोधकर्ता संज्ञाहरण के तहत चूहों में हड्डी ट्यूमर आक्रमण की पुष्टि करने के लिए अनुमति देता है। प्लानर रेडियोग्राफी विधि का उपयोग हाल ही में विच्छेदित अंगों या फॉर्मेलिन फिक्स्ड अंगों पर भी किया जा सकता है। विधि तेजी से है (चूहा प्रति 5 मिनट) और सस्ती ($2-5/चूहा) गणना टोमोग्राफी (सीटी) की तुलना में । वीवो मॉनिटरिंग के लिए इमेजिंग के दौरान चूहों को एनेस्थेटाइज्ड करने की जरूरत होती है । चित्रा 3 दो पहले से विच्छेदित अंगों के एक्स-रे इमेजिंग द्वारा देखी गई विस्तृत आकृति विज्ञान को दर्शाता है। यह विधि इन ट्यूमर की ऑस्टियोलिटिक और ऑस्टियोब्लास्टिक प्रकृति को रोशन करती है। दोनों उदाहरणों (सफेद तीर) में टिबिया और फिबुला की सामान्य हड्डी कॉर्टिकल वास्तुकला के व्यवधान पर ध्यान दें। चित्रा 4 मेटास्टेस के साथ और बिना फेफड़ों की रेडियोग्राफिक आकृति विज्ञान दिखाता है। एक्स-रे द्वारा इमेजिंग जल्दी से प्रयोगशाला को प्रकट कर सकते हैं, अनावश्यक सहज मौतों को रोकने के लिए इच्छामृत्यु की आवश्यकता।

फेफड़ों के लिए प्राथमिक और मेटास्टैटिक ट्यूमर हिस्टोलॉजिकल रूप से मानव ओएस के समान होते हैं जो ऑस्टियोलिटिक और ऑस्टियोब्लास्टिक ट्यूमर आकृति विज्ञान दोनों का प्रदर्शन करते हैं। चूहा ओएस में, ऑस्टियोलिटिक और ऑस्टियोब्लास्टिक ट्यूमर आकृति विज्ञान दोनों की पुष्टि चित्रा 5 और चित्रा 6में विच्छेदित अंग के हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा की जाती है। ध्यान दें कि कॉर्टिकल हड्डी इस उदाहरण में अनुपस्थित है और आसन्न हड्डी को नई बुने हुए हड्डी (एक्सोस्टोज़) द्वारा भी प्रतिस्थापित या मजबूत किया जाता है जो कॉर्टेक्स के मौजूदा शाफ्ट के लंबवत है। अपरिपक्व ऑस्टियोइड (असंगत बाहेल सामग्री) के द्वीप ट्यूमर उदाहरण के भीतर दिखाए गए हैं। इसके अतिरिक्त, फेफड़ों के मेटास्टेस की सूक्ष्म आकृति विज्ञान, कुछ खनिज हड्डी के साथ, और ट्यूमर संवहनी एम्बोली चित्रा 7में दिखाए गए हैं।

ओएस के साथ अंग विच्छेदन चूहों में अस्तित्व को बढ़ाता है। प्रत्यारोपण के बाद 7 सप्ताह से अधिक समय तक रखे पल्मोनरी मेटास्टेसिस के कारण चूहे अनायास मर सकते हैं। विच्छेदन का उपयोग इस मॉडल में मानक या लक्षित कैंसर चिकित्सा की आगे की जांच की अनुमति दे सकता है। ट्यूमर प्रत्यारोपण और विच्छेदन के बीच समय को लंबा करने से मेटास्टेसिस की घटनाओं में वृद्धि होगी।

डॉक्सोरुबिसिन एक कीमोथैरेप्टिक एजेंट है जिसका उपयोग मनुष्यों में ओएस के इलाज के लिए किया जाता है। चूहों में, डॉक्सोरुबिकिन को यहां वर्णित जुगुलर इंजेक्शन13 या कैथेटर15 के माध्यम से दिया जा सकता है। जुगुलर इंजेक्शन चूहे प्रति 5-10 मिनट की आवश्यकता होती है, लेकिन उजागर नस में खुराक के वितरण का आश्वासन देता है। कुल मिलाकर, चूहे की पूंछ नस इंजेक्शन की तुलना में जुगुलर इंजेक्शन बहुत अधिक प्रजनन योग्य हैं। यदि डॉक्सोरुबिसिन पूंछ नस इंजेक्शन के दौरान डर्मिस में लीक हो जाता है, तो पूंछ का परिगलन हो सकता है और आगे के उपचार को रोक सकता है। इस अध्ययन में, पांच चूहों का इलाज डॉक्सोरुबिकिन की 2 मिलीग्राम/किलो खुराक के साथ किया गया और ट्यूमर में सेल मौत की जांच करने के लिए 48 घंटे पोस्ट इंजेक्शन के साथ इलाज किया गया जैसा कि चित्रा 5A,बीमें दिखाया गया है।

नमकीन के साथ इलाज किए गए पांच नियंत्रण चूहों का भी मूल्यांकन एंटीबॉडी का चयन करने के लिए किया गया था जिसका उपयोग चूहे के एसएस में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इम्यूनोदाता करने के लिए किया जा सकता है। यहां, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाशीलता के लिए दो एंटीबॉडी का परीक्षण किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन के लिए, ट्यूमर को फॉर्मेलिन में 48-72 घंटे के लिए तय किया गया था और फिर फॉर्मेलिन में होने वाले प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग को कम करने के लिए 70% इथेनॉल में स्थानांतरित कर दिया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्राथमिक ओएस ट्यूमर में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ और मैक्रोफेज (सीडी 68) और टी कोशिकाओं (सीडी 3) के लिए इम्यूनोटांग के लिए किया गया था। चित्रा 8 ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ के इम्यूनोदात के दो उदाहरण दिखाता है।

चिकित्सीय हस्तक्षेप के संभावित लक्ष्यों का भी पता लगाया गया । ट्यूमर के साथ अंगों के विच्छेदन के बाद, चूहा ओएस नमूने भविष्य प्रोटीन अलगाव के लिए जमे हुए थे । इस अध्ययन में, हमें पता चला कि UMR106 कोशिकाएं एर्बीबी परिवार मार्ग प्रोटीन व्यक्त करती हैं। UMR106 सेल प्रोटीन lysates पर प्रदर्शन पश्चिमी दाग Erb2, EGFR, ErbB4, और अन्य प्रोटीन है कि इन रास्तों(चित्रा 9)के साथ बातचीत की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन ।

Figure 1
चित्रा 1:ट्यूमर प्रत्यारोपण सुई के साथ टिबिया डाला गया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: त्वचा के साथ विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान टिबिया हटा दिया(ए),उजागर फीमोरल धमनी और नस(बी),मांसपेशी के साथ फीमर(सी)से ऊंचा, और एक चूहा 3 सप्ताह के बाद विच्छेदन सर्जरी(डी)में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: ओएसके साथ दो चूहों से विच्छेदन (पूर्व वीवो) के बाद दाहिने पैरों का एक्स-रे रेडियोग्राफ। ट्यूमर की ऑस्टियोलिटिक और ऑस्टियोब्लास्टिक प्रकृति पर ध्यान दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:चूहे के फेफड़ों की एक्स-रे छवियां। (ए)जिसमें फेफड़े के मेटास्टेस नहीं होते हैं। (ख)ओएस पल्मोनरी मेटास्टेसिस के साथ । (ग)एक फुलाया फेफड़ों में मेटास्टेस की सकल विकृति के लिए सहसंबंध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: (A)ओएस की हिस्टोपैथोलॉजी 90% कोशिकाओं के साथ टिबिया ट्यूमर 48 घंटे में 2 मिलीग्राम/किलो डॉक्सोरुबिसिन की खुराक के बाद सेल डेथ दिखाती है। (ख)ट्यूमर सेल डेथ (तीर) टिबियल प्राइमरी ओएस में 2मिलीग्राम/किलो डॉक्सोरुबिसिन की खुराक के बाद 48 घंटे में। ध्यान दें ऊपर दाएं और बाएं कोने में व्यवहार्य कोशिकाएं हैं। (ग)कॉर्टिकल बोन में ओएस आक्रमण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: (A)ओएस के हिस्टोपैथोलॉजी जिसने बोन मैरो कोशिकाओं को बदल दिया है और टिबिया के कॉर्टिस में घुसपैठ की है । प्रतिक्रियाशील नई हड्डी के विकास के साथ ध्यान दें क्योंकि यह पहले से मौजूद प्रांतस्था के लिए बाहर और लंबवत है। (ख)हड्डी के एक द्वीप से सटे ओएस ट्यूमर कोशिकाओं की उच्च शक्ति परीक्षा । (ग)गुलाबी से नीले रंग के एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ऑस्टियोइड) में एम्बेडेड ओएस कोशिकाओं की उच्च शक्ति परीक्षा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: (ए)टिबिया ट्यूमर प्रत्यारोपण के साथ चूहे में मल्टीपल पल्मोनरी मेटास्टेस। (ख)पोत के नीचे एक ब्रोंकिओल से सटे छोटे फेफड़े की धमनी शाखा पोत में एम्बोलस में ट्यूमर ओएस कोशिकाएं। (ग)कुछ फेफड़े के मेटास्टेस में हड्डी के द्वीप होते हैं जबकि अन्य मेटास्टेस अधिक सेलुलर होते हैं। (घ)खनिज हड्डी के द्वीपों के साथ ओएस कोशिकाओं के साथ मेटास्टेस की उच्च शक्ति । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8:इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (ए) सीडी68 इम्यूनोस्टेनिंग मैक्रोफेज और (बी) इम्यूनोस्टेपिंग टी कोशिकाएं टिबिया में ओएस में सीडी 3 पॉजिटिव कोशिकाएं दिखाती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9:ERB पाथवे प्रोटीन टिबिया ट्यूमर से UMR106 ओएस कोशिकाओं में व्यक्त की गई । प्राथमिक ट्यूमर से लाइसेट्स की जांच एर्बीबी 2, ईजीएफआर, एर्बीबी 4, एकेटी, ईआरके 1/2 और लोडिंग नियंत्रण के रूप में ऐक्टिन के साथ 2-एड्रेनेरिक रिसेप्टर्स सहित एर्बीबी परिवार सिग्नल ट्रांसडक्शन पाथवे से प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ओएस टिबियल प्रत्यारोपण वाले चूहे प्रत्यारोपण के बाद 3 सप्ताह तक औसत दर्जे के ट्यूमर विकसित करते हैं। यदि ट्यूमर के साथ अंगों को प्रत्यारोपण के बाद 3 सप्ताह काट दिया जाता है, तो फेफड़ों के मेटास्टेसिस की घटना काफी कम हो जाती है। ओएस ऑस्टियोलिटिक और ऑस्टियोब्लास्टिक दोनों हैं। विच्छेदन के बिना चूहे फेफड़ों के मेटास्टेस विकसित करते हैं जो कई और निरवैरूप से आकार के होते हैं, रेडियोग्राफी द्वारा या 7 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण द्वारा नेक्रॉप्सी पर मनाया जाता है। EGFR, ErbB2, और ErbB4 चूहा UMR106 ओएस में व्यक्त कर रहे हैं, मानव ओएस16,17,18के समान । इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विधियों द्वारा ओएस में सीडी 3 टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज का आसानी से पता लगाया जाता है। जुगुलर नस इंजेक्शन कीमोथेरेपी डॉक्सोरुबिसिन, ओएस रोगियों को दी जाने वाली दवा की डिलीवरी के लिए पूंछ नस को पसंद किया जाता है। यहां वर्णित विधि एक पूर्ण कॉक्सोफेमोरल विच्छेदन है। यह प्रक्रिया एक शोधन है और ट्यूमर को हटाने वाली सर्जिकल विधि (फेमोरल ऑस्टियोटॉमी) को बदलने पर विचार किया जा सकता है जहां हड्डी रोगी8के लिए एक स्टंप छोड़कर काट दी जाती है। अध्ययन के बाद सर्जिकल दर्द और जटिलताओं की संभावना को कम करने के लिए एक पूर्ण अंग हटाने का सुझाव है ।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले, यह ट्यूमर कोशिकाओं के पारित होने पर ध्यान दें और अध्ययन के लिए कोशिकाओं के निचले मार्ग का उपयोग करने के लिए प्रयोग से प्रयोग करने के लिए मॉडल लगातार रखने के लिए महत्वपूर्ण है । पुराने मार्ग कोशिकाओं संस्कृति में समय के साथ और अधिक आक्रामक हो जाते हैं । दूसरा, उचित आकार की सुई का उपयोग करना और हैमिल्टन सिरिंज सही ढंग से 20 μL की एक बहुत छोटी मात्रा में टिबिया में कोशिकाओं इंजेक्शन में मदद मिलेगी, एक इष्टतम के रूप में निर्धारित मात्रा और रिसाव का कारण नहीं था । तीसरा, सर्जन को प्रक्रिया के यांत्रिकी सीखने के लिए समान वृद्ध चूहों पर नेक्रिप्स करते समय शुरू में विच्छेदन का अभ्यास करने की आवश्यकता होती है। चौथा, विच्छेदन की सफलता के लिए, थर्मोरेगुलेशन बनाए रखें और सर्जरी के समय को सीमित करें। एक अनुभवी सर्जन 15 मिनट में विच्छेदन पूरा कर सकता है।

यह देखा गया कि मैंटिबिया में कोशिकाओं के mplantation बहुत सुधार हुआ जब एक बड़ा बोर सुई प्रारंभिक खोलने के बाद एक छोटे बोर हैमिल्टन सिरिंज सुई के सम्मिलन के बाद बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह हैमिल्टन सिरिंज को टूटने और समय के साथ सुस्त होने से बचाता है । हैमिल्टन सीरिंज 10 μL के रूप में छोटे रूप में संस्करणों हो सकता है । 1 एमएल ट्यूबरक्यूलिन सीरिंज 20 माइक्रोन के प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त सटीक नहीं होगा। एक ही हैमिल्टन सिरिंज एक दिन पर प्रत्यारोपित सभी चूहों के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन प्रत्येक चूहे की शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के बीच धोया गया । हैमिल्टन सीरिंज सीरिंज को ऑटोक्लेव करने से बचें क्योंकि उन्हें टूटने का खतरा है। प्रक्रिया के अंत में, इसे नमकीन (10 बार) के साथ धोएं और फिर 100% इथेनॉल (10 बार) के साथ और इसे स्टोर करने के लिए हटाए गए प्लंजर के साथ सूखने दें।

त्वचा और चमड़े के नीचे टांके शुरू में चीरा बंद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, अभी तक एक चूहा सर्जरी के बाद दिन dehiscence के साथ पाया गया था । चीरा बंद करने के लिए घाव क्लिप और सर्जिकल गोंद के उपयोग ने विधि में सुधार किया। इस शोधन के साथ, किसी अन्य चूहों को सर्जरी के बाद की कोई जटिलता नहीं थी। एक्स-रे द्वारा फेफड़ों की रेडियोग्राफी को शामिल करना इस मॉडल को परिष्कृत करता है ताकि चूहों में फेफड़ों के मेटास्टेसिस को प्रदर्शित किया जा सके जो समय पर हो और अप्रत्याशित मौतों को रोकता है। एक्स-रे छवियां हमें मानव ओएस के समान इन चूहे ओएस की ऑस्टियोलिटिक और ऑस्टियोब्लास्टिक प्रकृति का निर्धारण करने की अनुमति देती हैं।

विच्छेदन प्रक्रिया करने के लिए सर्जिकल विशेषज्ञता का एक मध्यम स्तर आवश्यक है। सबसे कठिन कदम कोक्सोफेमोरल संयुक्त का पता लगाने के लिए मांसल में विच्छेदन है। इस चरण के दौरान आवर्धन और अच्छी रोशनी महत्वपूर्ण है। सर्जिकल विशेषज्ञता जानवरों कि इच्छामृत्यु किया गया है पर अभ्यास के साथ प्राप्त किया जा सकता है । लगभग 10 चूहों के बाद, सर्जन को संज्ञाहरण के तहत एक जीवित चूहे से ओएस के साथ एक अंग काटना करने के लिए आश्वस्त होना चाहिए।

चूहों और चूहों में सारकोमा के साथ अंगों को हटाने के मौजूदा तरीके फीमर बोन और मांसपेशी मिड-शाफ्ट को काटकर टिबिया को हटाने और स्टंप8को छोड़ने पर आधारित हैं । हालांकि, यह कुछ जांच के लिए उपयोगी हो सकता है, इस अध्ययन में, पूरा पैर हटाने का प्रयास किया गया था । प्रक्रिया संतोषजनक पाई गई और सर्जिकल जटिलताओं के बाद कोई पेशकश नहीं की गई। एक हिंद अंग स्टंप के साथ चूहों में, अधिक सर्जिकल त्वचा, मांसपेशियों, या तंत्रिका दर्द के बाद हो सकता है। एक स्टंप छोड़कर, चूहे चारों ओर पहुंच सकते हैं और सर्जरी साइट तक पहुंच सकते हैं। चूहे बहुत अच्छी तरह से विच्छेदन के बाद करते हैं और एक हिंडलिम्ब के साथ पिंजरे में अच्छी तरह से एम्बुलेट करते हैं।

पूर्ण अंग विच्छेदन के फायदे चूहे के लिए बहुत बड़े और दर्दनाक होने से पहले प्राथमिक ट्यूमर को हटाना शामिल है। महत्वपूर्ण बात, प्राथमिक ट्यूमर को हटाने से फेफड़ों को प्राथमिक ट्यूमर मेटास्टेसिस को नियंत्रित करने में मदद मिलेगी। विच्छेदन के साथ चूहों को आगे रक्त में ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचारी या फेफड़ों या अन्य हड्डियों की केशिकाओं में माइक्रोमेटास्टेस में उपन्यास चिकित्सीय की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए आगे का अध्ययन किया जा सकता है।

ओएस और अन्य सारकोमा के लिए नए कैंसर चिकित्सा विज्ञान के विकास की पर्याप्त आवश्यकता है, विशेष रूप से चिकित्सीय जो मेटास्टैटिक प्रगति के खिलाफ दवा गतिविधि है। अन्य कैंसर के लिए विकसित उपन्यास चिकित्सा विज्ञान की तुलना में, ओएस के लिए चिकित्सा विज्ञान दुर्भाग्य से कई दशकों में प्रगति नहीं की है। इस समस्या का जवाब देते हुए, बेहतर ओएस दवा विकास19के लिए दिशानिर्देश विकसित करने के लिए ओएस और मेटास्टेसिस में प्रमुख नेताओं और विशेषज्ञों की एक बैठक बुलाई गई । पैनल के सुझावों के अनुसार, चूहा प्री-क्लीनिकल मॉडल, ओएस के कम ज्ञात मॉडल में सुधार के लिए अध्ययन निर्धारित किए गए थे। संक्षेप में, विच्छेदन और इमेजिंग सारकोमा अनुसंधान समुदाय द्वारा आगे के उपयोग के लिए चूहे पूर्व-नैदानिक मॉडल को परिष्कृत करता है। विच्छेदन प्रक्रिया माइक्रोमेटास्टेस या निष्क्रिय ट्यूमर पर उपन्यास उपचार की प्रभावकारिता के मूल्यांकन को सक्षम करने या बेहतर दीर्घायु के साथ एक मॉडल के साथ उपचार की विषाक्तता के लिए परीक्षण करने के लिए कई महीनों के लिए बेहतर रोगी अस्तित्व के लिए अनुमति देगा।

संक्षेप में, हम इस ओएस मॉडल का लाभ प्रदान करते हैं। इम्यूनोडंपेटेंट एसडी आउटब्रीड चूहों का उपयोग एसडी चूहे ओएस से अलग प्रत्यारोपित UMR106 ओएस सेल लाइन के साथ एक सिनेजेनिक मॉडल प्रदान करने के लिए किया जाता है। प्राथमिक और मेटास्टैटिक ट्यूमर हिस्टोलॉजिकल रूप से मनुष्यों में ओएस के समान है। किशोर पुरुष और महिला चूहों UMR106 ट्यूमर प्रत्यारोपण अध्ययन मॉडलिंग बाल चिकित्सा सारकोमा के लिए उपयोग किया जाता है । प्रत्यारोपित कोशिकाओं का ऑर्थोटोपिक प्लेसमेंट एक प्रासंगिक ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट के लिए सीधे टिबिया में किया जाता है। प्राथमिक ट्यूमर मेटास्टेसाइज फेफड़ों के लिए और मेटास्टेस एक्स-रे विधि के साथ वीवो इमेजिंग में द्वारा निगरानी की जा सकती है। चूहा ओएस मानव ओएस के साथ आम में प्रोटीन व्यक्त करता है, जैसे ErbB2। कुत्ते ओएस की तुलना में, चूहा मॉडल जानवर की बड़ी संख्या के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है । चूहे टिबियल इंजेक्शन, सर्जरी, इमेजिंग, रक्त ड्रॉ और बायोप्सी की आसानी के लिए चूहों की तुलना में 10 गुना बड़े होते हैं। चूहों की दीर्घायु विच्छेदन के साथ अधिक आश्वस्त है और यह मॉडल नियोएडजुवेंट थेरेपी, विच्छेदन और एडजुवेंट थेरेपी को जोड़ सकता है जो बेहतर रोगी अस्तित्व के लिए अनुमति देता है जिससे माइक्रोमेटास्टेस या निष्क्रिय ट्यूमर पर उपचार की प्रभावकारिता का मूल्यांकन हो सके। लक्ष्य विषाक्तता मूल्यांकन से भी इस मॉडल में मूल्यांकन किया जा सकता है जहां चूहों को कैंसर चिकित्सकीय जैसे डॉक्सोरुबिसिन के साथ इलाज किया जा सकता है और डॉक्सोरुबिक प्रेरित कार्डियक विषाक्तता या ओएस की पुनरावृत्ति के लिए दीर्घकालिक निगरानी की जा सकती है। यह ओएस के साथ एक मॉडल में कार्डियो-प्रोटेक्शन एजेंटों के परीक्षण के लिए अनुमति देगा।

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Disclosures

घोषणा करने के लिए कोई खुलासा नहीं।

Acknowledgments

राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के माध्यम से NIH धन, अनुदान # CA228582। शगुन इशियामा को फिलहाल टोरे मेडिकल कंपनी लिमिटेड से ग्रांट मिल रही है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AKT Cell Signaling TECHNOLOGY 4685S
absorbable suture Ethicon J214H
β-actin SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY sc-47778
β2-AR antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY sc-569 replaced by β2-AR (E-3): sc-271322
Bis–Tris gels Thermo Fisher NP0321PK2
Buprenorphine SR Lab ZooPharm IZ-70000-201908
CD3 antibody Dako #A0452
CD68 antibody eBioscience #14-0688-82
Chemiluminescent substrate cytiva RPN2232
CL-Xposure film Thermo Fisher 34089
Complete Anesthesia System EVETEQUIP 922120
diaminobenzidine VECTOR LABORATORIES SK-4100
Doxorubicin Actavis NDC 45963-733-60
EGFR antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY sc-03 replaced by EGFR (A-10): sc-373746
ERBB2 antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY sc-284 replaced by Neu (3B5): sc-33684
ERBB4 antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY sc-283 replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050
ERK antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY sc-514302
eye lubricant PHARMADERM NDC 0462-0211-38
Hamilton syringe (100 µL) Hamilton Model 1710 SN SYR
horseradish peroxidase-linked secondary antibody cytiva NA934
HRP polymer detection kit VECTOR LABORATORIES MP-7401
HRP polymer detection kit VECTOR LABORATORIES MP-7402
isoflurane BUTLER SCHEIN NDC 11695-6776-2
isoflurane vaporizer EVETEQUIP 911103
UMR-106 cell ATCC CRL-1661
X-ray Faxitron UltraFocus
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References

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मेटास्टेसिस दर को नियंत्रित करने के लिए विच्छेदन के साथ एक सिंजेनिक ऑर्थोटोपिक ऑस्टियोसारकोमा स्प्राग डावले चूहा मॉडल
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Ishiyama, S., Kissel, C., Guo, X.,… More

Ishiyama, S., Kissel, C., Guo, X., Howard, A., Saeki, H., Ito, T., Sysa-Shah, P., Orita, H., Sakamoto, K., Gabrielson, K. A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate. J. Vis. Exp. (171), e62139, doi:10.3791/62139 (2021).

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