Summary
Burada, metastaz biyolojisinin preklinik araştırılması ve yeni terapötiklerin gelişimi için kullanılabilecek spontan pulmoner metastaz ile osteosarkomun amputasyon prosedürünün ardından singeneik ortotopik implantasyon tanımlanmıştır.
Abstract
Osteosarkom (OS) tedavisinde en son ilerleme, 1980'lerde multi-ajan kemoterapinin sadece cerrahiye kıyasla genel sağkalımını iyileştirdiği gösterildiğinde gerçekleşti. Bu sorunu gidermek için çalışmanın amacı, sıçanlarda daha az bilinen bir işletim sistemi modelini, sağkalım süresini uzatan kapsamlı bir histolojik, görüntüleme, biyolojik, implantasyon ve amputasyon cerrahi yaklaşımı ile iyileştirmektir. Pediatrik işletim sistemini modellemek için 3 haftalık erkek ve dişi sıçanlara ortotopik tibial tümör implantları ile implante UMR106 OS hücre hattı (SD sıçanından kaynaklanan) ile singeneik bir sıçan modeli olan immün yetmetik, dışlanmış bir Sprague-Dawley (SD) kullandık. Sıçanlarda tekrarlanabilir primer ve metastatik pulmoner tümörler geliştiğini ve implantasyon sonrası 3 haftalık uzuv amputasyonlarının pulmoner metastaz insidansını önemli ölçüde azalttığını ve beklenmedik ölümleri önlüyor olduğunu gördük. Histolojik olarak, sıçanlardaki birincil ve metastatik işletim sistemi insan işletim sistemine çok benziyordu. OS hücrelerinin protein ekspresyon araştırması, bu tümörlerin ErbB ailesi kinazlarını ifade ettiğini ortaya koymaktadır. Bu kinazlar çoğu insan işletim sisteminde de yüksek oranda ifade edildiğinden, bu sıçan modeli tedavi için ErbB yol inhibitörlerini test etmek için kullanılabilir.
Introduction
Osteosarkom (OS) çocuklarda, ergenlerde ve genç erişkinlerde en sık görülen primer kemik tümörüdür. OS tedavisindeki en son ilerleme, 1980'lerde çok ajanlı kemoterapinin sadece cerrahiye kıyasla genel sağkalımını iyileştirdiği gösterildiğinde meydana geldi1. İşletim sistemi hızlı kemik büyümesi sırasında gelişir, tipik olarak femur, kaval kemiği ve humerus gibi uzun tübüler kemiklerde meydana gelir. Osteolitik, osteoblastik veya belirgin periosteal reaksiyonlu karışık görünüm ile karakterizeedilirler 2. Kemoterapi ve cerrahi rezeksiyon, hastaların % 65'i için 5 yıllık sağkalımlı hastalar için sonucu iyileştirebilir2,3. Ne yazık ki, metastatik hastalığı olan yüksek dereceli işletim sistemi hastaları% 20 sağkalıma sahiptir. İşletim sistemi bölgesel olarak istila eder ve öncelikle akciğerlere veya diğer kemiklere metastaz eder ve erkeklerde daha yaygındır. Bu genç hastalar için en zorlayıcı ihtiyaç, uzak metastazların canlılığını önleyen ve ortadan kaldıran yeni bir tedavidir.
OS klinik öncesi modeller gözden geçirilmiştir4,5,6,7 ve ortotopik işletim sisteminin amputasyonu kullanılarak mevcut birkaç immün yetmetik model geliştirilmiştir. 2000 yılında, ortotopik singeneik işletim sistemi ve amputasyon8ile BALB / c fareler kullanılarak önemli bir model geliştirilmiştir. Bu fare modeline kıyasla, sıçan modeli genetik olarak yetiştirilmiş ve bazı avantajlara yol açan 10 kat daha büyük hayvanlara dayanmaktadır. Sıçan UMR106 modeli, bir hücre hattı9'atüretilen bir Sprague Dawley (SD) sıçanında 32P kaynaklı bir işletim sistemi tarafından geliştirilmiştir. 2001 yılında UMR106-01 ortotopik implantasyonu ilk olarak athimik farelerin implante tibialarında hızlı, tutarlı primer tümör gelişimi ve insanlarda işletim sistemi ile ortak radyolojik, histolojik özelliklerle tanımlanmıştır. Pulmoner metastazlar gelişti ve UMR106'nın kemik mikroçevresine ortotopik yerleşimine bağlıydı10. 2009 yılında Yu ve arkadaşları11, daha büyük erkek SD sıçanlarda UMR106 hücrelerini kullanarak tekrarlanabilir bir ortotopik femur OS sıçan modeli kurdu. Amputasyon yapılmamış sıçanlarda başarılı tümör implantasyonları ve akciğer metastaz oranı burada sunulan verilere benzerdi. Bu çalışmada, özellikle metastatik ilerleme ile ilgili olarak, primer tümör çıkarma zamanlamasının modelleme işletim sisteminde çok önemli olduğunu öne süren genç sıçanlar kullanılarak modele ek bir amputasyon yapıldı. Bu arıtma ile amputasyon ve in vivo görüntüleme, işletim sistemi için yeni ilaç değerlendirmesi için klinik öncesi çalışmalar için bu modeli geliştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sıçanları içeren tüm prosedürler ve deneyler Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirildi.
1. SD rat OS hücre hattı UMR-106 hücre kültürü protokolü
- DMEM'de% 10 (v/ v) FBS, penisilin (10 U / mL)- streptomisinin (10 U / mL) nemli% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de ( 10 U / mL) ile desteklenmiş hücreleri büyütün. 2-812pasajlı hücreleri kullanarak deneyler gerçekleştirin.
2. İşletim sistemi hücreleri protokolünün intratibiyal enjeksiyonu
NOT: Zaman çiftleşmiş hamile SD sıçanları hayvan tesisinde doğum yapmakta ve 3 haftalıkken çöpler kullanılmaktadır (UMR 106 hücre hattı SD sıçanlar için singeneik olduğundan, ışınlama gerekmez).
- Indüksiyon
- Sıçanı orta büyüklükte bir indüksiyon odasına yerleştirin ve% 2-3 izofluran ile anesteziye neden edin. Parmağı kıstırmak için refleks, solunum hızı ve karakter ile anestezi derinliği için hayvanı sürekli izleyin.
- Burnu burun kemiğine sokun. Gerekirse bantla sabitleyin.
- Sağ bacakta bulunan saçları ventral ve sırt alt karın bölgesine kadar makasla çıkarın veya tüy döken madde kullanın. Sıçanı bir supine pozisyonuna getirin.
- Cerrahi bölgeyi %70 etanol kullanarak aseptik olarak ovalayın ve klorheksidin asetat veya seyreltilmiş betadin seyreltin. Diz bölgesinin etrafından başlayın ve hem proksimal hem de distal olarak dairesel bir hareketle ovalayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın. Tümör implantasyonunda perde kullanılmaz.
- Anestezinin neden olduğu kornea tahliyesini önlemek için sıçanın her iki gözüne de göz yağı uygulayın. Sıçanı düşük ısı ayarlı bir ısıtma yastığına yerleştirin. Sıçanın normal vücut sıcaklığına (37 °C) ve normal solunum hızına sahip olduğundan emin olun.
- Ameliyat
- isoflurane'yi ~%1,5-%2 oranında açın (bakım için). Hayvanın bir parmak sıkışma refleksi eksikliği ile yeterli bir anestezi düzlemsinde olduğundan emin olun. Değilse, izofluran yüzdesini% 2,5'e çıkarın.
- Derinliğe yerleştirmek için uçtan 10 mm'de steril bir iğneyi (yaklaşık 22 G) işaretleyin.
- Tibial platonun ortasında bükülmüş dizine girerek, bir açıklık yapmak için hafif matkap benzeri bir hareket kullanarak iğneyi metafizden diafiz içine uzatarak iğneyi kaval kemiğinin diyafizine 10 mm aşağı yerleştirin. İğneyi çıkar.
- Kaval kemiğine enjeksiyondan önce hücre süspansiyonu doğrudan Hamilton şırındıcına yükleyin. Bunu yapmak için, yerçekimi hücrelerin tüpün dibine yerleşmesini sağlarken şırınd içine çekmeden önce hücreleri hafifçe karıştırın.
NOT: Hücreler, dikkatli bir karıştırmadan sonra Hamilton şırıncısına (100 μL) çekmeden önce 1,5 ila 2 mL'lik bir tüpte (oda sıcaklığında) saklanabilir. Hücreler implantasyon işlemi sırasında oda sıcaklığında 2-3 saat bekletilebilir. İmplantasyon seansından önce ve sonra tüpteki hücrelerin hücre canlılığını her zaman kontrol edin. Trypan mavi dışlama hücre canlılığı değerlendirmesi için en kolay yöntemdir. - Kemik ilk iğne ile geçirildikten sonra, hücrelerle dolu 100 μL Hamilton şırıngasına bağlı ikinci bir (10 mm'de işaretlenmiş daha küçük çaplı iğne) iğne yerleştirin. İğneyi 10 mm'lik işarete kadar diyafiz içine uzanan aynı deliğe soktuğundan emin olun.
- PBS'deki 75.000 işletim sistemi hücresi süspansiyonunun 20 μL'lik kısmını diafiz ve ilik boşluğuna hafifçe boşaltın.
NOT: İğne kemikte sallanmamalı ve kendini güvende hissetmelidir. İğne kolayca hareket ederse, korteks diyofizden geçilmiş olabilir. Hücrelerin enjeksiyonundan önce daha sıkı bir yerleşim elde etmek için ekleme işlemini tekrarlayın. - Hamilton iğnesini kemikten çıkar.
NOT: Küçük bir kan damlası oluşursa, hafif basınç uygulayın. Delinme bölgesinde berrak sıvı damlası oluşursa, iğne kemikte yeterince uzatılmamış olabilir ve tümör hücresi süspansiyonu delikten geri sızmış olabilir. Bunu notlara kaydedin, ancak genellikle tümör implantasyonu başarılı olacaktır. Deneyimle, tümör implantasyon prosedürü sıçan başına 5 dakika sürmelidir. Deneyimle, kemikteki hücrelerin tümör implantasyonu kolaylaşacaktır. Kemiğin etrafındaki kastaki hücrelerin yanlışlıkla enjekte edilmesi, pulmoner metastaz için gerekli tümör mikroçevresine yol açmayabilir.
- Kurtarma
- Sıçanın normotermik olduğundan emin olun. Sıçanı iyileşme için kafesin altına yerleştirilmiş bir ısıtma yastığı ile bir kafese yerleştirin.
- Tamamen uyanık, hareketli ve iyi nefes aldıktan sonra, sıçanlara Buprenorfin (1.0-1.2 mg / kg SC) enjekte edin.
NOT: Buprenorfin'e erişmek için, siparişi vermek için veteriner personeli aracılığıyla onay seçeneklerini görmek için kuruma danışın. - Fareleri temiz kafeslere geri taşıyın ve her hafta günde bir kez izleyin.
3. Ölçüm ve izleme
- Büyüme hızını belirlemek için implantasyon sonrası 9-10 gün ve implantasyon sonrası 3 haftaya kadar her 2 günde bir tümör boyutunu ölçün. Elektronik veya manuel kaliper kullanarak kaval kemiğinin maksimum çapını ölçün. Tümör hacmini hesaplamak için verileri bir formülle elektronik tabloda depolayın. Kontralateral (implante tibia değil) taban çizgisi olarak ölçün.
NOT: İmplant edilen hindlimb çapları tümör büyüklüğü için taşıyıcı olarak kullanılır. Arka uzuvlar, uzuv üzerinde ventral/dorsal ve media/lateral olmak üzere iki ölçüm için en büyük çapta kaval kemiği uzun eksenine dik olarak ölçülür. Tahmini tümör hacmi11: Tümör hacmi (mm3)= en büyük çap (mm) x en küçük çap (mm)2 /2formülü ile hesaplanır. - Tümörler en büyük boyutta 15 mm'ye yaklaştığında veya tümör implantasyonundan 3 hafta sonra sağkalım amputasyonu veya kemoterapi tedavisi için sıçanları düşünün. Kontrallateral uzuv, bu yaşta çoğu sıçanda yaklaşık 7-9 mm'dir.
4. Doxorubicin intravenöz uygulama
- Sıçanları% 2 izofluran ile uyuşturun. Açıklanan gibi betadin ve alkol kullanarak üç cerrahi yıkama ile cildi şahdamarı üzerinde hazırlayın13.
- Dikkatli diseksiyon altında, sağ veya sol şahdamarını görselleştirin. İğneyi aşırı kas içine yerleştirin ve daha sonra pektoralis kasına şahdamar ön kısmında görselleştirildiği için sıçanın kafasına doğru şahdamarına doğru yönlendirin.
- İğne şahdamarına yerleştirildiğinde, uygun yerleştirmeyi sağlamak için şırıngaya hafifçe kan çekin. İğnenin damardan geçtiğine inanmak mümkündür, ancak iğne damarın altındadır ve lümende değildir. Şahdamarını ortaya çıkarmak için künt diseksiyon yaparken şahdamarı enjeksiyonlar için çok küçük hale gelirse, enjeksiyon için diğer şahdamarını kullanın.
- Doksrubicin (2 mg/ kg) 100-150 μL hacimde 1 dakika boyunca yavaşça enjekte edin. Çözelti doğum sırasında şahdamarında intravenöz olarak görselleştirilebilir.
- Kontrol sıçanlarına benzer miktarlarda normal salin enjekte edin.
- İğneyi çıkarın ve steril bir gazlı bezle damara hafif bir basınç uygulayın.
- 3-4 yara klipsi kullanarak cilt kesisini kapatın. Enjeksiyondan 7-10 gün sonra klipsleri çıkarın.
NOT: Sıçanlar genellikle metal klipsleri çıkarmaya çalışmazlar, ancak dikişleri ısırır ve çıkarırlar. Damar dışına sızan herhangi bir ilaç kuyruk amputasyon gerektirebilecek kuyruk nekrozuna neden olduğundan, doksofobisin için kuyruk damarı enjeksiyonlarına şah damarı enjeksiyonları tercih edilir.
5. Hind uzuv amputasyon protokolü
- Indüksiyon
- Sıçanı orta büyüklükte bir indüksiyon odasına yerleştirin ve% 2-4 izofluran ile anesteziye neden edin. Anestezinin derinliği için sıçanı sürekli izleyin.
NOT: İndüksiyon odası kömür kutusuna atlanır ve diğer gazlar ameliyat için kullanılan aşağı taslak bir masa ile çıkarılır. - Burnu burun askumu içine sokun. Gerekirse bantla sabitleyin.
NOT: Bu prosedür, fazla uçucu gazları (yani izoflurane) çöpe atmak için aşağı taslak bir masada yapılır. - Sağ bacakta bulunan saçları ventral ve sırt alt karın bölgesine kadar makasla çıkarın veya tüy döken madde kullanın. Sıçanı bir supine pozisyonuna getirin.
- Cerrahi bölgeyi %70 etanol kullanarak aseptik olarak ovalayın ve klorheksidin asetat veya seyreltilmiş betadin seyreltin. Cildi baldırın ortasından sağ alt karın kalça ekleminin hemen üstündeki cilt bölgesine kadar ameliyata hazırlayın. Bacak proksimalini ve distal bölgeyi çevresel olarak ovalayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Göz yağlayıcıyı sıçanın her iki gözüne de uygulayın. Sıçanın normal vücut sıcaklığına (37 °C) ve normal yaşamsal işaretlere sahip olduğundan emin olun. Rektal sıcaklık probu monitörüne bağlı bir ısıtma yastığı kullanarak vücut sıcaklığını izleyin ve düzenleyin.
- Sıçanı orta büyüklükte bir indüksiyon odasına yerleştirin ve% 2-4 izofluran ile anesteziye neden edin. Anestezinin derinliği için sıçanı sürekli izleyin.
- Ameliyat
- Izoflurane'yi %1,5-%3 oranında açın (bakım). Parmak sıkışmasına, solunum hızına ve karaktere reaksiyon da dahil olmak üzere anestezik derinliği izleyin. Uygun bir anestezi düzlemini korumak için izoofluran oranını gerektiği gibi ayarlayın.
NOT: Anestezi altındayken solunum hızı dakikada 50-100 nefes arasında olmalıdır. Derin, seyrek nefesler sıçanın çok derin uyuşturuldığının bir göstergesidir. - Steril alet paketlerini ve perdeleri açın ve steril eldivenler takın. İşlem süresince steriliteyi korumaya özenin. Gerekli temel steril cerrahi aletler arasında neşter bıçağı tutucu, forseps, hemostatlar, iğne tutucu, makas ve yara klipsi uygulanıcı bulunur.
- Sıçanın bacağını steril cerrahi örtünün havalandırmasına çekin. Hayvanın parmak sıkışma refleksi ile yeterli bir anestezi düzlemsinde olduğundan emin olun.
- Neşter bıçağı veya cerrahi makas kullanarak, boğmacaya (diz eklemi) sadece proksimal olan çevresel, kütenöz bir kesi yapın.
- Arka uzvun ventral-medial yüzeyindeki femoral arteri ve damarı açığa çıkarmak için gazlı bez veya künt diseksiyon kullanarak arka uzvu deglove edin.
- Damarları orta uyluk kemiği seviyesinde 4-0 emilebilir dikiş kullanarak lige edin ve distal olarak transect.
- Kas diseksiyonu sırasında sızıntıyı azaltmak için damarı distal olarak kenetleyin.
NOT: Çevresel kas yapısı femoral arter damarı ligasyonu seviyesine ve uyluk kemiğinden coxofemoral eklem seviyesine yükselen kaslara kadar distal olarak transekte edilecektir. - Künt diseksiyon kullanarak kalça eklemini yanal dışa doğru dönme ile kaçırın.
- Uyluk kemiğinin başını bulun ve asetatülden sökün. Bacağı vücuda bağlı tutarak kalan tüm dokuları kesin.
- Yaklaşık 6 mg/kg Ropivacaine ile asetabulum ve siyatik sinire sıçrama bloğu verin.
- Basit bir kesintiye uğramış dikiş (4-0, emilebilir dikiş) kullanarak asetatülün üzerindeki kasları kapatın.
NOT: Kapalı kas tabakası (lokal infiltrasyon/sıçrama bloğu) boyunca çeşitli bölgelere ek %0,5 bupivakain veya lidolin (toplam 0,15-0,2 mg) enjekte edilebilir. - Her 5-10 mm'de bir ayrı yerleştirilmiş yara klipslerini kullanarak cildin kenarlarına karşı çıkın ve kapatın.
- Izoflurane'yi %1,5-%3 oranında açın (bakım). Parmak sıkışmasına, solunum hızına ve karaktere reaksiyon da dahil olmak üzere anestezik derinliği izleyin. Uygun bir anestezi düzlemini korumak için izoofluran oranını gerektiği gibi ayarlayın.
- Kurtarma
- Sıçanı, kafesin altına yerleştirilen bir ısıtma yastığı kullanarak ısı desteği ile temiz bir geri kazanım kafesine yerleştirin.
NOT: Hipertermiyi önlemek için, ısıtma yastığı hayvanla doğrudan temas etmemelidir ve 40 ° C'yi geçmemelidir. - Hayvanı tamamen iyileşene ve normotermik (37,5-39 °C) olana kadar izleyin.
NOT: Hayvan, tamamen bilinçli ve sert bir şekilde recumbent ve kafes etrafında kolayca hareket edene kadar başıboş bırakılmamalıdır. - Tamamen uyanık, hareketli ve iyi nefes aldıktan sonra, sıçanlara Buprenorfin (1.0-1.2 mg / kg SC) enjekte edin.
NOT: Anesteziye uğramış bir sıçanda Buprenorfin verilmesi iyileşmeyi bozabilir. - Omuz bıçakları arasında 10 mL ılık laktlı Ringer çözeltisini deri altından tutun.
- Sıçanları temiz kafese geri taşıyın ve conspecifics ile tekrar bir araya geliyor.
- Piloerection, kambur duruş veya eritem, pürülan akıntı veya yara dehiscence de dahil olmak üzere kesi bölgesi enfeksiyonu belirtileri veya inme belirtileri de dahil olmak üzere tüm hayvanları bir sonraki ay boyunca günde iki kez izleyin.
NOT: Bugüne kadar hayvanların hiçbirinde ameliyat sonrası iyileşmeyi takiben klinik belirtiler (enfeksiyonlar gibi) gözlemlemedik. Sadece bir sıçan dikişlerle dehiscence vardı, daha sonra yara klipsleri daha fazla sorun olmadan yaraları kapatmak için kullanıldı. - Bir laboratuvar hayvan veterinerine danışarak yayınlanan dozlarda klinik ağrı belirtileri gösteren hayvanlara buprenorfin veya meloksikam sürün.
- Bir laboratuvar hayvan veterinerine danışarak yayınlanan dozlarda klinik ağrı belirtileri gösteren hayvanlara antibiyotik (yani sefalosporin) sürün.
NOT: Analjeziklerle iyileşmeyen uzun süreli ağrı veya sıkıntı belirtileri gösteren hayvanların veya antibiyotiklere yanıt vermeyen enfeksiyon belirtileri gösteren hayvanların insanca ötenazi yapılması gerekir.
- Sıçanı, kafesin altına yerleştirilen bir ısıtma yastığı kullanarak ısı desteği ile temiz bir geri kazanım kafesine yerleştirin.
6. X-ışını ile görüntüleme
- Tümör implantasyonundan sonra, kemirgenler için tasarlanmış bir makine ile X-ışını kullanarak tümör büyümesini tespit etmek için kaval kemiğini ve akciğerleri invaziv olmayan bir şekilde görüntüleyin.
- Fareleri daha önce yapıldığı gibi uyuşturun.
- 25 kV'da 6 s için 3x büyütmede görüntü alın.
- X-ray işlemcisini kullanarak filmi işleyin. Radyografiler dijital olarak da taranabilir.
7. Nekropsi prosedürü
- Sıçanları CO2ile ötenazi. Kalp atışı eksikliği ile ölümü onaylayın ve serum veya plazma örnekleri için kalpten hemen 3 mL kan çekin.
- Toraks ve karnı muayene için açın.
- Trakeayı izole edin ve (18 G) kateterle adanın. Kateteri nefes borusuna sabitlemek için, her iki nefes borusunun etrafına kateterle ipek bir dikiş bağlayın.
- İnfüzyon kateterini 3 veya 5 mL şırınna bağlayın. Daha iyi histoloji örnekleri için akciğer loblarını hafifçe şişirmek için formalin veya salin demleyin. infüzyonda akciğerler kabarır ve pulmoner metastazların daha iyi bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
- Seçilen tüm torasik ve abdominal organları (karaciğer, böbrekler gibi) inceleyin, inceleyin ve tartın.
- Organları histopatoloji için formalin olarak sabitlayın veya kuru buz, 2-metilbütan veya sıvı nitrojen üzerinde dondurun.
- Batı lekesi kullanılarak protein ekspresyonunun değerlendirilmesi için donmuş dokuların lysates yapın. Sıçan dokuları ile reaksiyona gelen antikorlar ayrıntılıolarak 13.
8. İmmünohistokinoloji
- Birincil işletim sistemi dokusunu işleyin, parafin içine gömün ve immünohistokimyasal lekeleme için bölümleyin.
- Deparaffinizasyondan sonra antijeni sitrat tamponu (pH 6.0) kullanarak alın. Endojen peroksidazları söndürmek için 30 dakika boyunca metanolde% 0.3H2 O2'de kuluçkaya yatırın.
- Normal serum kullanarak 5 μm kalınlığındaki parafin bölümlerini engelleyin.
- Primer anti-CD68 ve CD3 antikorları ile kuluçkaya yatırın (tabloya bakınız) gece boyunca 4 °C'de.
- Bölümleri PBS'de durulayın ve bir algılama kiti kullanarak HRP polimerinde kuluçkaya yatırın.
NOT: İmmünostaining, kromojen olarak diaminobenzidin ile geliştirilmiştir.
9. Batı şişkinliği
- Standart jel elektroforez ve batı şişkinliği gerçekleştirmek için UMR-106 hücrelerini 200-300 μL lizistamponu 14'te lyse.
- %4 ila %12 Bis-Tris jelleri kullanın.
- Anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actin veya anti-fare β2-AR primer antikor (tabloya bakınız) ve yaban turpu peroksidaz bağlantılı ikincil antikorda kuluçkaya yatırın.
- Chemiluminescent substratını ekleyin. Membranları X-ray filme maruz bırak.
NOT: yükleme kontrolleri olarak β-actin düzeyleri kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bağışıklık sistemi bozulmamış bir bağışıklık sistemine sahip bir hayvan modeli sunan bu işletim sistemi çalışmaları için bağışıklık sistemi yetersiz SD dışlanmış sıçanlar kullanılmaktadır. ATCC'den UMR106 hücre hattını kullandık, başlangıçta bir SD sıçanından işletim sistemi izole edilmiş hücrelerden geliştirildi. Hücreleri SD sıçanlara yerleştirdik, böylece işletim sistemi için singeneik bir model sağladık. Ayrıca UMR106 hücrelerinin doğrudan kaval kemiği metafizi/diafiz içine ortotopik implantasyonu ilgili bir tümör mikroçevrimini verir.
Tümör hücrelerini implante ederken, iğne ucu kemiğin orta boşluğuna yaklaşık 10 mm uzatılan doğru açıda (kemik şaftına paralel) tibial platodan (Şekil 1) doğru bir iğne sokulmalıdır. Bu işlemle sıçanların %95'inde (52/55) dizde kaval kemiği distalinde tümörler gelişti. Tibial enjeksiyon deneyimi ile sıçanların% 100'lerinde tümör gelişti. Kesilmeyen bir grup sıçanda, erkeklerde ortalama tümör hacimleri implantasyon sonrası 3 haftada 504 mm3 ve 5 haftada 1195 mm3 idi. Kadınlarda tümör hacimleri ortalama 3 haftada 285 mm3, implantasyon sonrası 5 haftada 495 mm3'tedir.
Amputasyonlu olanlar (23 sıçan) ( Şekil 2 ) ve amputasyon olmayanlar (29sıçan) dahil olmak üzere iki sıçan kohortları karşılaştırıldı. Her iki kohort da akciğerlerdeki tümör metastazını incelemek için implantasyondan 7 hafta sonra ötenaziye tabi edildi. Amputasyon grubunda (3/23) sıçanlarda pulmoner metastazlar gelişti. Bu üç sıçan ameliyat sonrası komplikasyonlar nedeniyle ameliyattan 24 saat içinde öldü veya ötenaziye tabi tökezlendi. Cerrah yöntemi öğrenirken iki sıçan uzun süreli anesteziden öldü. Bir sıçan bir dehiscence geliştirdi ve ertesi gün ötenaziye tabi edildi. Bu üç sıçanın akciğerleri değerlendirildi ve histolojik olarak üç küçük metastaz (>1 mm) bulundu. Hayatta kalan 20 sıçanın implantasyondan 7 hafta sonra akciğer metastazları yoktu. Bu, implantasyon sonrası 3 haftalık amputasyonların pulmoner metastazlı sıçan sayısını azaltmak için yeterli olduğunu gösterdi. Amputasyon prosedürüne sahip olmayan 29 sıçandan oluşan ikinci bir grupta, 26/29 sıçanın daha önce yayınlanan verilerle tutarlı akciğer metastazları vardı11. Bu sıçanlarda metastaz boyutunda veya sayısında bir desen görmedik. Çoğu sıçan, nekropsi sırasında kolayca örneklenebilen 10'dan fazla brüt görünür 2-7 mm çapında metastazlara sahiptir. Bazen, sıçanların çapı 10 mm'ye kadar daha büyük metastazlar vardı. 10 veya daha yüksek pasaj sayısına sahip hücrelerin implantasyon sonrası 2-3 hafta kadar erken agresifleştiğini ve metastaz yaptığını gösterdiğinden, UMR106 hücrelerinin düşük pasaj sayısına sahip implante edilmesi önemlidir. Doğanın nedeni bilinmemekle birlikte, spekülasyon, kültürdeki hücrelerin metastazdan yana mutasyonlar geliştirebileceğidir.
Amputasyon ameliyatına ek olarak, yöntemlerin bir başka inceltilmesi tümör gözetimi veya nekropsi için X-ışını görüntülemesini içeriyordu. Bu yöntem, araştırmacının anestezi altındaki sıçanlarda kemik tümörü invazyonını doğrulamasını sağlar. Düzlemsel radyografi yöntemi yakın zamanda kesilmiş uzuvlarda veya sabit uzuvlarda formalin olarak da kullanılabilir. Yöntem, Bilgisayarlı Tomografiye (BT) kıyasla hızlı (sıçan başına 5 dk) ve ucuzdur ($2-5/rat). In vivo izleme için, görüntüleme sırasında sıçanların uyuşturulmasını gerektirir. Şekil 3, daha önce kesilmiş iki uzvun röntgen görüntülemesi ile görülen ayrıntılı morfolojiyi göstermektedir. Bu yöntem bu tümörlerin osteolitik ve osteoblastik doğasını aydınlatır. Her iki örnekte de kaval kemiği ve fibulanın normal kemik kortikal mimarisinin bozulmasına dikkat edin (beyaz oklar). Şekil 4, metastazlı ve metastazsız akciğerlerin radyografik morfolojisini göstermektedir. X-ışını ile görüntüleme, gereksiz spontan ölümleri önlemek için ötanazi ihtiyacını laboratuvara hızlı bir şekilde ortaya getirebilir.
Akciğerdeki primer ve metastatik tümörler histolojik olarak hem osteolitik hem de osteoblastik tümör morfolojisi sergileyen insan işletim sistemine benzer. Sıçan işletim sistemi, hem osteolitik hem de osteoblastik tümör morfolojisi Şekil 5 ve Şekil 6'dakesilmiş uzuv histopatolojisi ile doğrulanır. Kortikal kemiğin bu örnekte bulunmadığını ve bitişik kemiğin korteksin mevcut şaftına dik olarak yönlendirilen yeni dokuma kemik (eksostozlar) ile değiştirildiğini veya güçlendirildiğini unutmayın. Olgunlaşmamış osteoid (amorf hücre dışı materyal) adaları tümör örneğinde gösterilmiştir. Ek olarak, akciğer metastazlarının mikroskobik morfolojisi, bazıları mineralize kemik ve tümör vasküler emboli şekil 7'degösterilmiştir.
OS ile uzuv amputasyonu sıçanlarda sağkalımı arttırır. Sıçanlar implantasyondan sonra 7 haftadan daha uzun süre evde bulunan pulmoner metastaz nedeniyle kendiliğinden ölebilir. Amputasyon kullanımı, bu modelde standart veya hedefe hedefli kanser tedavisinin daha fazla araştırılmasına izin verebilir. Tümör implantasyonu ile amputasyon arasındaki sürenin uzaması metastaz insidansını artıracaktır.
Doxorubicin, insanlarda işletim sistemi tedavisinde kullanılan kemoterapötik bir ajandır. Sıçanlarda, doxorubicin burada açıklandığı gibi juguler enjeksiyonlar13 veya kateter15 ile verilebilir. Şahdamar enjeksiyonu sıçan başına 5-10 dakika gerektirir, ancak açıkta kalan damarda dozun verilmesini sağlar. Genel olarak, juguler enjeksiyonlar sıçan kuyruk damarı enjeksiyonlarına kıyasla çok daha tekrarlanabilir. Kuyruk damarı enjeksiyonları sırasında dermise doksrofosin sızarsa, kuyruğun nekrozu oluşabilir ve daha fazla tedaviyi önleyebilir. Bu çalışmada beş sıçan 2 mg/kg dozda doksrubisin ile tedavi edilmiş ve Şekil 5A,B'de gösterildiği gibi tümörlerde hücre ölümünü araştırmak için 48 saat post enjeksiyon ötanaziye tabi tedavüle edilmiştir.
Salin ile tedavi edilen beş kontrol sıçanı da sıçan işletim sistemindeki bağışıklık hücrelerini immünostain etmek için kullanılabilecek antikorları seçmek için değerlendirildi. Burada iki antikor immün reaktivite için test edildi. İmmünohistokimya çalışmaları için tümörler formalinde 48-72 saat sabitlendi ve daha sonra formalinde meydana gelen protein çapraz bağını azaltmak için% 70 etanol'e taşındı. Primer işletim sistemi tümörlerinde immün hücre infiltratları için immünizokimya, makrofajlarda (CD68) ve T hücrelerinde (CD3) immünositasyon yapıldı. Şekil 8, tümör mikroçevrimi içindeki immün hücre infiltratlarının immünostainlerinin iki örneğini göstermektedir.
Terapötik müdahale için potansiyel hedefler de araştırıldı. Tümörlü uzuvların kesilmesinden sonra, sıçan işletim sistemi örnekleri gelecekteki protein izolasyonu için donduruldu. Bu çalışmada UMR106 hücrelerinin ErbB ailesi yol proteinlerini ifade ettiğini keşfettik. UMR106 hücre protein lysates üzerinde gerçekleştirilen Batı lekeleri ErbB2, EGFR, ErbB4 ve bu yollar ile etkileşime giren diğer proteinlerin ekspresyonunu göstermektedir (Şekil 9).
Şekil 1: Tümör implantasyon iğnesi takılı kaval kemiği. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Deri çıkarılmış (A), maruz kalan femoral arter ve damar(B),uyluk kemiğinden(C)yükseltilmiş kaslı ve bir sıçanda 3 hafta sonra amputasyon ameliyatı(D)ile kaval kemiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OS'li iki sıçandan amputasyondan sonra sağ bacakların X-ray radyografisi (ex vivo). Tümörün osteolitik ve osteoblastik doğasına dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sıçan akciğerlerinin röntgen görüntüleri. (A) akciğer metastazları olmadan. (B) işletim sistemi pulmoner metastaz ile. (C) şişirilmiş bir akciğerdeki metastazların brüt patolojisi ile korelasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: (A) Kaval kemiği tümöründe hücre ölümünü gösteren hücrelerin %90'ı ile işletim sistemi histopatolojisi 2 mg/kg doksomatosin dozunda 48 saat. (B) Tümör hücre ölümü (ok) tibial primer işletim sistemi 2mg/kg doksrubisin doz sonra 48 saat. Sağ üst ve sol köşenin uygun hücrelere sahip olduğunu unutmayın. (C) Kortikal kemikte işletim sistemi invazyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: (A) Kemik iliği hücrelerinin yerini alan ve kaval kemiğinin kortikallerine sızan işletim sistemi histopatolojisi. Dışarıda katmanlı ve önceden var olan kortekse dik olduğu için eşlik eden reaktif yeni kemik büyümesine dikkat edin. (B) Kemik adasına bitişik işletim sistemi tümör hücrelerinin daha yüksek güç muayenesi. (C) Pembeden maviye gömülü işletim sistemi hücrelerinin daha yüksek güç incelemesi hücre dışı matris (osteoid). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: (A) Kaval kemiği tümörü implantasyonu olan sıçanda multipl pulmoner metastaz. (B) Damarın altındaki bir bronşiole bitişik küçük pulmoner arter dal damarındaki bir embolustaki tümör işletim sistemi hücreleri. (C) Bazı pulmoner metastazlar kemik adaları içerirken, diğer metastazlar daha hücreseldir. (D) Mineralize kemik adaları ile karıştırılmış işletim sistemi hücreleri ile metastazların daha yüksek gücü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: (A) CD68 immünosteining makrofajlarının immünhistokimyası ve (B) kaval kemiğinde işletim sistemindeki CD3 pozitif hücreleri gösteren immünosteining T hücrelerinin immünizasyon.
Şekil 9: Kaval tümörlerinden UMR106 OS hücrelerinde ifade edilen ERB yolu proteinleri. Primer tümörlerden elde edilen lysatlar, ErbB2, EGFR, ErbB4, AKT, ERK1/2 ve yükleme kontrolü olarak aksinli β2-adrenerjik reseptörler de dahil olmak üzere ErbB ailesi sinyal transdüksiyon yolundan protein ekspresyasyonu için incelendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OS tibial implantlı sıçanlar implantasyondan 3 hafta sonra ölçülebilir tümörler geliştirirler. Tümörlü uzuvlar implantasyondan 3 hafta sonra kesilirse akciğer metastazının görülme sıklığı önemli ölçüde azalır. OS'ler hem osteolitik hem de osteoblastiktir. Amputasyonsuz sıçanlar, implantasyondan 7 hafta sonra radyografi veya nekropsi ile gözlenen, çoklu ve değişken boyutta akciğer metastazları geliştirir. EGFR, ErbB2 ve ErbB4, insan işletim sistemi 16 ,17,18'ebenzer şekildeumr106işletim sistemi ile ifade edilir. CD3 T hücreleri ve makrofajlar oS'de immünhistokinometri yöntemleri ile kolayca tespit edilir. OS hastalarına verilen bir ilaç olan kemoterapi doksofobinin doğumu için damarı takip etmek için juguler ven enjeksiyonları tercih edilir. Burada açıklanan yöntem tam bir coxofemoral amputasyondur. Bu prosedür bir arıtmadır ve kemiğin kesildiği cerrahi yöntemi (femoral osteotomi) hasta için bir kütük bırakarak tümörün yerini alması düşünülebilir8. Çalışma, ameliyat sonrası ağrı ve komplikasyon olasılığını azaltmak için tam bir uzuv çıkarma önermektedir.
Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, tümör hücrelerinin geçişine dikkat etmek ve modeli deneyden deneye tutarlı tutmak için çalışmalar için hücrelerin daha düşük geçişini kullanmak önemlidir. Eski pasaj hücreleri kültürdeki zamanla daha agresif hale gelir. İkincisi, uygun boyutta iğne ve Hamilton şırıngası kullanmak, hücrelerin kaval kemiğindeki hücrelerin en uygun olarak belirlenen ve sızıntıya neden olmayan çok küçük bir hacim olan 20 μL'lik çok küçük bir hacimde doğru bir şekilde enjekte edilmesine yardımcı olacaktır. Üçüncü olarak, cerrahın prosedürün mekaniğini öğrenmek için benzer yaşlı sıçanlar üzerinde nekropsi yaparken başlangıçta disartikülasyon uygulaması gerekir. Dördüncüsü, amputasyon başarısı için termoregülasyonu koruyun ve ameliyat süresini sınırlayın. Deneyimli bir cerrah ampütasyonu 15 dakikada tamamlayabilir.
Kaval kemiğindeki hücrelerindikiminin, ilk açıklığı yapmak için daha büyük bir delik iğnesi kullanıldığında büyük ölçüde iyileştiği ve ardından daha küçük bir delikli Hamilton şırınga iğnesinin yerleştirildiği gözlendi. Bu, Hamilton şırındını zamanla kırılmaya ve donuklaşmaya karşı korur. Hamilton şırınnaları 10 μL kadar küçük hacimlere sahip olabilir. 1 mL tüberkülin şırınnalar 20 μL implantasyonu için yeterince doğru olmaz. Aynı Hamilton şırınd, bir günde yerleştirilen tüm sıçanlar için kullanıldı, ancak her sıçanın cerrahi prosedürleri arasında yıkandı. Kırılmaya eğilimli oldukları için Hamilton şırındını otomatik olarak kullanmaktan kaçının. İşlemin sonunda, salin (10 kez) ve ardından% 100 etanol (10 kez) ile yıkayın ve saklamak için piston çıkarılarak kurumaya bırakın.
Deri ve deri altı dikişleri başlangıçta kesiği kapatmak için kullanıldı, ancak ameliyattan bir gün sonra bir sıçan dehiscence ile bulundu. Kesiği kapatmak için yara klipsleri ve cerrahi yapıştırıcı kullanımı yöntemi geliştirdi. Bu incelikle, başka hiçbir sıçan ameliyat sonrası komplikasyona sahip değildi. Akciğerlerin radyografisinin X-ışını ile dahil edilmesi, zamanında ötanaziye izin veren ve beklenmedik ölümleri önleyen sıçanlarda akciğer metastazını göstermek için bu modeli rafine eder. X-ışını görüntüleri, insan işletim sistemine benzer şekilde bu sıçan işletim sistemilerin osteolitik ve osteoblastik doğasını belirlememizi sağlar.
Amputasyon prosedürünü gerçekleştirmek için orta düzeyde cerrahi uzmanlık gereklidir. En zor adım, coxofemoral eklemi bulmak için kas yapısına diseksiyondur. Bu adım sırasında büyütme ve iyi aydınlatma önemlidir. Ötenazi yapılan hayvanlar üzerinde pratik ile cerrahi uzmanlık sağlanabilir. Yaklaşık 10 sıçandan sonra, cerrah anestezi altında canlı bir sıçandan işletim sistemi ile bir uzuv kesmek için kendinden emin olmalıdır.
Farelerde ve sıçanlarda sarkomlarla uzuvları çıkarmak için mevcut yöntemler, uyluk kemiğini keserek ve orta şaftı kasarak ve kütüğü bırakarak kaval kemiğini çıkarmaya dayanır8. Bu, bazı araştırmalar için yararlı olsa da, bu çalışmada, tam bacak çıkarılması denendi. İşlemin tatmin edici olduğu ve ameliyat sonrası komplikasyon sunulmadı. Arka uzuv kütüğü olan sıçanlarda, ameliyat sonrası cilt, kas veya sinir ağrısı daha fazla olabilir. Bir kütük bırakarak, sıçanlar etrafa uzanabilir ve ameliyat bölgesine erişebilirler. Sıçanlar amputasyon sonrası çok iyi yaparlar ve bir arka plan ile kafeste iyi ambulat yaparlar.
Tam uzuv amputasyonunun avantajları, birincil tümörün sıçan için çok büyük ve ağrılı hale gelmeden çıkarılmasını içerir. Daha da önemlisi, primer tümörün çıkarılması akciğerdeki primer tümör metastazının kontrol etmesine yardımcı olacaktır. Amputasyonlu sıçanlar, kandaki dolaşımdaki tümör hücreleri veya akciğerlerin veya diğer kemiklerin kılcal damarlarındaki mikrometazlar üzerindeki yeni terapötiklerin etkinliğini test etmek için daha fazla incelenebilir.
İşletim sistemi ve diğer sarkomlar için yeni kanser terapötiklerinin, özellikle metastatik ilerlemeye karşı ilaç aktivitesi olan terapötiklerin geliştirilmesine önemli bir ihtiyaç vardır. Diğer kanserler için geliştirilen yeni terapötiklerle karşılaştırıldığında, işletim sistemi için terapötikler ne yazık ki uzun yıllar boyunca ilerlememiştir. Bu soruna yanıt olarak, işletim sistemi ve metastazdaki önemli liderler ve uzmanların bir toplantısı, işletim sistemi ilaç geliştirme19'un iyileştirilmesi için yönergeler geliştirmek üzere toplandı. Panelin önerilerine göre, daha az bilinen bir işletim sistemi modeli olan sıçan klinik öncesi modelini geliştirmek için çalışmalar yapıldı. Özetle, amputasyon ve görüntüleme, sarkom araştırma topluluğu tarafından daha fazla kullanılmak üzere sıçan klinik öncesi modelini rafine eder. Amputasyon prosedürü, mikrometazlar veya uykuda tümörler üzerinde yeni tedavilerin etkinliğinin değerlendirilmesini veya daha uzun ömürlü bir modelle tedavilerin toksisitesini test etmeyi sağlayan birden fazla ay boyunca hastanın hayatta kalmasını sağlayacaktır.
Özetle, bu işletim sistemi modelinin avantajını sağlıyoruz. İmmün yetmsiz SD dışkan sıçanlar, bir SD sıçan işletim sisteminden izole edilmiş implante UMR106 işletim sistemi hücre hattı ile singeneik bir model sağlamak için kullanılır. Primer ve metastatik tümör histolojik olarak insanlarda işletim sistemine benzer. Juvenil erkek ve dişi sıçanlar UMR106 tümör implantasyon çalışmaları için pediatrik sarkom modellemede kullanılır. İmplante edilen hücrelerin ortotopik yerleşimi, ilgili bir tümör mikroçevrişim için doğrudan kaval kemiğine yapılır. Primer tümör akciğere metastaz yaparak, metastazlar ise X-ray yöntemi ile in vivo görüntüleme ile izlenebilir. Sıçan işletim sistemi, ErbB2 gibi insan işletim sistemi ile ortak proteinleri ifade eder. Köpek işletim sistemi ile karşılaştırıldığında, sıçan modeli aynı anda daha fazla sayıda hayvanın kullanılmasına izin verir. Sıçanlar, tibial enjeksiyonlar, cerrahi, görüntüleme, kan alma ve biyopsi kolaylığı için farelerden 10 kat daha büyüktür. Sıçanların uzun ömürlülüğü amputasyon ile daha fazla güvence altına alınmıştır ve bu model neoadjuvan tedavi, amputasyon ve adjuvan tedaviyi birleştirerek mikrometazlar veya uykuda tümörler üzerindeki tedavilerin etkinliğinin değerlendirilmesini sağlayan daha iyi hasta sağkalımını sağlayabilir. Hedef dışı toksisite değerlendirmesi, sıçanların doxorubicin gibi kanser terapötik ile tedavi edilebildiği ve doksafosin indüklenen kardiyak toksisite veya işletim sistemi nüks için uzun süreli izlenebildiği bu modelde de değerlendirilebilir. Bu, kardiyo koruma ajanlarının işletim sistemine sahip bir modelde testine izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beyan edecek bir açıklama yok.
Acknowledgments
Ulusal Kanser Enstitüsü aracılığıyla NIH finansmanı, hibe # CA228582. Shun Ishiyama şu anda Toray Medical Co., Ltd.'den hibe alıyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
- Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B.
- Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P.
- Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271 (2012).
- Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
- Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
- Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
- Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
- Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
- Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
- Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
- Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
- Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).
