Summary
Aquí, se describe un implante ortotópico singénico seguido de un procedimiento de amputación del osteosarcoma con metástasis pulmonar espontánea que se puede utilizar para la investigación preclínica de la biología de la metástasis y el desarrollo de nuevas terapias.
Abstract
El avance más reciente en el tratamiento del osteosarcoma (SG) ocurrió en la década de 1980, cuando se demostró que la quimioterapia multiagente mejora la supervivencia general en comparación con la cirugía sola. Para abordar este problema, el objetivo del estudio es refinar un modelo menos conocido de SG en ratas con un enfoque quirúrgico histológico, de imágenes, biológico, de implantación y amputación integral que prolongue la supervivencia. Utilizamos un modelo de rata singénica inmunocompetente y desanguínea de Sprague-Dawley (SD) con línea celular de SG UMR106 implantada (originada en una rata SD) con implantes de tumores tibiales ortotópicos en ratas macho y hembra de 3 semanas de edad para modelar la SG pediátrica. Encontramos que las ratas desarrollan tumores pulmonares primarios y metastásicos reproducibles, y que las amputaciones de extremidades a las 3 semanas después de la implantación reducen significativamente la incidencia de metástasis pulmonares y previenen muertes inesperadas. Histológicamente, los SG primarios y metastásicos en ratas fueron muy similares a los OS humanos. Utilizando métodos de inmunohistoquímica, el estudio muestra que los SG de rata están infiltrados con macrófagos y células T. Un estudio de expresión de proteínas de las células de la SG revela que estos tumores expresan quinasas de la familia ErbB. Dado que estas quinasas también están altamente expresadas en la mayoría de los SG humanos, este modelo de rata podría usarse para probar los inhibidores de la vía ErbB para la terapia.
Introduction
El osteosarcoma (SG) es el tumor óseo primario más común en niños, adolescentes y adultos jóvenes. El avance más reciente en el tratamiento de la SG ocurrió en la década de 1980 cuando se demostró que la quimioterapia multiagente mejora la supervivencia general en comparación con la cirugía sola1. La SG se desarrolla durante el crecimiento óseo rápido, que generalmente ocurre en huesos tubulares largos como el fémur, la tibia y el húmero. Se caracterizan por una apariencia osteolítica, osteoblástica o mixta con notable reacción perióstica2. La quimioterapia y la resección quirúrgica pueden mejorar el resultado para los pacientes con una supervivencia a 5 años para el 65% de los pacientes2,3. Desafortunadamente, los pacientes con SG de alto grado con enfermedad metastásica tienen una supervivencia del 20%. La SG invade regionalmente y hace metástasis principalmente a los pulmones u otros huesos y es más frecuente en los hombres. La necesidad más apremiante para estos pacientes jóvenes es una terapia novedosa que prevenga y elimine la viabilidad de las metástasis a distancia.
Se han revisado modelos preclínicos de SG4,5,6,7 y se han desarrollado pocos modelos inmunocompetentes disponibles que utilizan la amputación de SG ortotópica. En el año 2000, se desarrolló un modelo importante utilizando ratones BALB/c con SG singénica ortotópica y amputación8. En comparación con este modelo de ratón, el modelo de rata se basa en animales genéticamente desanguíneos y 10 veces más grandes, lo que lleva a algunas ventajas. El modelo UMR106 de rata se desarrolló a partir de una SG inducida por 32P en una rata Sprague Dawley (SD), que se derivó en una línea celular9. En 2001, la implantación ortotópica de UMR106-01 se describió por primera vez en tibias implantadas de ratones atímicos con desarrollo rápido y consistente de tumores primarios y características radiológicas e histológicas en común con la SG en humanos. Las metástasis pulmonares se desarrollaron y dependieron de la colocación ortotópica de UMR106 en el microambiente óseo10. En 2009, Yu et al.11 establecieron un modelo de rata ortotópica de rata OS ortotópica reproducible utilizando células UMR106 en ratas SD macho más grandes. Los implantes tumorales exitosos y la tasa de metástasis pulmonar en ratas sin amputación fueron similares a los datos presentados aquí. En este estudio, se realizó una amputación adicional al modelo utilizando ratas jóvenes, lo que sugirió que el momento de la extirpación del tumor primario es crucial en el modelado de la SG, especialmente en relación con la progresión metastásica. Con este refinamiento, la amputación y las imágenes in vivo mejoran este modelo para estudios preclínicos para la evaluación de nuevos fármacos para la SG.
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Protocol
Todos los procedimientos y experimentos con ratas se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins.
1. El protocolo de cultivo celular UMR-106 de la línea celular SD rata OS
- Células de cultivo en DMEM, suplementadas con 10% (v/v) FBS, penicilina (10 U/mL)-estreptomicina (10 U/mL) a 37 °C en atmósfera humidificada de 5% de CO2. Realizar experimentos utilizando células con pasajes de 2-812.
2. Protocolo de inyección intratibial de células de LA SG
NOTA: Las ratas SD preñadas apareadas en el tiempo dan a luz en el animal y a las 3 semanas de edad, se utilizan camadas (dado que la línea celular UMR 106 es singénica a las ratas SD, no se necesita irradiación).
- Inducción
- Coloque la rata en una cámara de inducción de tamaño mediano e induzca la anestesia con isoflurano al 2%-3%. Monitoree al animal continuamente para determinar la profundidad de la anestesia por reflejo a pellizco del dedo del pie, frecuencia respiratoria y carácter.
- Inserte la nariz en la nosecone. Asegure con cinta adhesiva, si es necesario.
- Retire el vello de la pierna derecha hasta el abdomen ventral y dorsal inferior con cortapelos o use agente depilatorio. Coloque la rata en posición supina.
- Frote el área quirúrgica asépticamente con etanol al 70% y diluya el acetato de clorhexidina o la betadina diluida. Comience alrededor del área de la rodilla y frote en un movimiento circular tanto proximal como distalmente. Repita este paso tres veces. No se utiliza ninguna cortina para la implantación de tumores.
- Aplique lubricante para los ojos en ambos ojos de la rata para evitar la desecación corneal causada por la anestesia. Coloque la rata en una almohadilla térmica de ajuste a fuego lento. Asegúrese de que la rata tenga una temperatura corporal normal (37 °C) y una frecuencia respiratoria normal.
- Cirugía
- Encienda el isoflurano a ~ 1.5% -2% (para mantenimiento). Asegúrese de que el animal esté en un plano adecuado de anestesia a través de la falta de un reflejo de pellizco en el dedo del pie. De lo contrario, aumente el porcentaje de isoflurano al 2,5%.
- Marque una aguja estéril (aproximadamente 22 G) a 10 mm de la punta para guiar la profundidad a insertar.
- Inserte la aguja 10 mm hacia abajo en la diáfisis de la tibia entrando en la rodilla doblada en el medio de la meseta tibial, extendiendo la aguja a través de la metáfisis hacia la diáfisis utilizando un movimiento ligero similar a un taladro para hacer una abertura. Retire la aguja.
- Cargue la suspensión celular en la jeringa Hamilton directamente antes de la inyección en la tibia. Para hacer esto, mezcle suavemente las células antes de extraerlas en la jeringa, ya que la gravedad hace que las células se asienten en el fondo del tubo.
NOTA: Las células se pueden almacenar en un tubo de 1,5 a 2 ml (a temperatura ambiente) antes de extraerlas en la jeringa Hamilton (100 μL) después de una mezcla cuidadosa. Las células se pueden mantener a temperatura ambiente durante 2-3 h durante el procedimiento de implantación. Compruebe siempre la viabilidad celular de las células en el tubo antes y después de la sesión de implantación. La exclusión del azul de tripano es el método más fácil para la evaluación de la viabilidad celular. - Una vez que el hueso se atraviesa con la primera aguja, inserte una segunda aguja (aguja de diámetro más pequeño también marcada en 10 mm) unida a la jeringa Hamilton de 100 μL cargada con células. Asegúrese de insertar la aguja hasta la marca de 10 mm en el mismo orificio que se extiende hacia la diáfisis.
- Descargue suavemente 20 μL de suspensión de 75,000 células de SG en PBS en la diáfisis y la cavidad de la médula.
NOTA: La aguja no debe tambalearse en el hueso y debe sentirse segura. Si la aguja se mueve fácilmente, la corteza puede haber sido atravesada en la diáfisis. Repita la inserción nuevamente para obtener una colocación más firme antes de la inyección de células. - Retire la aguja de Hamilton del hueso.
NOTA: Si se forma una pequeña gota de sangre, aplique una ligera presión. Si se forma una gota de líquido transparente en el sitio de la punción, es posible que la aguja no se haya extendido lo suficiente en el hueso y que la suspensión de células tumorales se haya filtrado a través del orificio. Registre esto en las notas, pero en general, la implantación del tumor será exitosa. Con experiencia, el procedimiento de implantación del tumor debe tomar 5 minutos por rata. Con la experiencia, la implantación tumoral de células en el hueso será más fácil. La inyección accidental de células en el músculo alrededor del hueso, puede no conducir al microambiente tumoral necesario para la metástasis pulmonar.
- Recuperación
- Asegúrese de que la rata sea normotérmica. Coloque a la rata en una jaula con una almohadilla térmica colocada debajo de la jaula para su recuperación.
- Después de estar completamente despierto, móvil y respirar bien, inyecte a las ratas con buprenorfina (1.0-1.2 mg / kg SC).
NOTA: Para obtener acceso a la buprenorfina, consulte con la institución para ver las opciones de aprobación a través del personal veterinario para realizar el pedido. - Mueva a las ratas de regreso a jaulas limpias y monitoree una vez al día, cada semana.
3. Medición y monitoreo
- Mida el tamaño del tumor 9-10 días después de la implantación y luego cada 2 días hasta 3 semanas después de la implantación para establecer una tasa de crecimiento. Mide el diámetro máximo de la tibia con una pinza electrónica o manual. Almacene los datos en una hoja de cálculo con una fórmula para calcular el volumen del tumor. Mida la tibia contralateral (no implantada) como línea de base.
NOTA: Los diámetros de las extremidades posteriores implantadas se utilizan como sustituto del tamaño del tumor. Las extremidades posteriores se miden perpendicularmente al eje largo de la tibia en el diámetro más grande para dos mediciones, ventral / dorsal y media / lateral en la extremidad. El volumen tumoral estimado se calcula mediante la fórmula11:Volumen tumoral (mm3) = diámetro mayor (mm) x diámetro más pequeño (mm)2/2. - Considere las ratas para la amputación de supervivencia o el tratamiento de quimioterapia cuando los tumores se acercan a 15 mm en la dimensión más grande o 3 semanas después de la implantación del tumor. La extremidad contralateral mide alrededor de 7-9 mm en la mayoría de las ratas a esta edad.
4. Administración intravenosa de doxorrubicina
- Anestesiar a las ratas con 2% de isoflurano. Preparar la piel sobre la vena yugular con tres lavados quirúrgicos con betadina y alcohol como se describe13.
- Bajo una disección cuidadosa, visualice la vena yugular derecha o izquierda. Inserte la aguja en el músculo suprayacente y luego diríjase hacia la cabeza de la rata en la luz de la vena yugular a medida que se visualiza en la vena yugular anterior al músculo pectoral.
- Cuando se inserte la aguja en la vena yugular, extraiga suavemente sangre en la jeringa para garantizar la inserción adecuada. Es posible creer que la aguja está a través de la vena, pero la aguja está debajo de la vena y no en la luz. Si la vena yugular se vuelve demasiado pequeña para las inyecciones cuando se disecciona con romo para exponer la vena yugular, use la otra vena yugular para la inyección.
- Inyecte doxorrubicina (2 mg/kg) lentamente durante 1 min en un volumen de 100-150 μL. La solución se puede visualizar por vía intravenosa en la vena yugular durante el parto.
- Inyectar volúmenes similares de solución salina normal en ratas de control.
- Retire la aguja y aplique una presión suave sobre la vena con una gasa estéril.
- Cierre la incisión en la piel con 3-4 clips de herida. Retire los clips a los 7-10 días después de la inyección.
NOTA: Las ratas generalmente no intentan quitar los clips de metal, pero muerden y eliminan las suturas. El método de inyección yugular es preferible a las inyecciones de la vena de la cola para la doxorrubicina, ya que cualquier medicamento que se filtra fuera del vaso causa necrosis de la cola que puede requerir la amputación de la cola.
5. Protocolo de amputación de extremidades posteriores
- Inducción
- Coloque la rata en una cámara de inducción de tamaño mediano e induzca anestesia con isoflurano al 2% -4%. Monitoree a la rata continuamente para determinar la profundidad de la anestesia.
NOTA: La cámara de inducción se recoge en un recipiente de carbón y cualquier otro gas se elimina mediante una mesa de tiro hacia abajo utilizada para la cirugía. - Inserte la nariz en una nosecone. Asegure con cinta adhesiva, si es necesario.
NOTA: Este procedimiento se realiza en una tabla de borrador descendente para eliminar el exceso de gases volátiles (es decir, isoflurano). - Retire el vello de la pierna derecha hasta el abdomen ventral y dorsal inferior con cortapelos o use agente depilatorio. Coloque la rata en posición supina.
- Frote el área quirúrgica asépticamente con etanol al 70% y diluya el acetato de clorhexidina o la betadina diluida. Prepare la piel para la cirugía desde la mitad de la pantorrilla hasta el área de la piel justo por encima de la articulación de la cadera de la parte inferior derecha del abdomen. Frote la pierna proximal y el área distal circunferencialmente. Repita este paso tres veces.
- Aplique el lubricante para los ojos en ambos ojos de la rata. Asegúrese de que la rata tenga una temperatura corporal normal (37 ° C) y signos vitales normales. Controle y regule la temperatura corporal utilizando una almohadilla térmica que está conectada a un monitor de sonda de temperatura rectal.
- Coloque la rata en una cámara de inducción de tamaño mediano e induzca anestesia con isoflurano al 2% -4%. Monitoree a la rata continuamente para determinar la profundidad de la anestesia.
- Cirugía
- Encienda el isoflurano al 1,5%-3% (mantenimiento). Monitoree la profundidad anestésica, incluida la reacción al pellizco del dedo del pie, la frecuencia respiratoria y el carácter. Ajuste la velocidad de isoflurano según sea necesario para mantener un plano apropiado de anestesia.
NOTA: La frecuencia respiratoria bajo anestesia debe estar entre 50-100 respiraciones por minuto. Las respiraciones profundas e infrecuentes son una indicación de que la rata está demasiado anestesiada. - Abra los paquetes de instrumentos estériles y las cortinas y póngase guantes estériles. Tenga cuidado de mantener la esterilidad durante la duración del procedimiento. Los instrumentos quirúrgicos estériles básicos necesarios incluyen, soporte de cuchilla de bisturí, fórceps, hemostáticos, soporte de agujas, tijeras y aplicador de clip para heridas.
- Tire de la pata de la rata a través del respiradero de la cortina quirúrgica estéril. Asegúrese de que el animal esté en un plano adecuado de anestesia a través del reflejo de pellizco del dedo del pie.
- Usando una cuchilla de bisturí o tijeras quirúrgicas, haga una incisión cutánea circunferencial justo proximal a la asfixia (articulación de la rodilla).
- Desenganche la extremidad posterior usando una gasa o disección roma para exponer la arteria femoral y la vena en la superficie ventral-medial de la extremidad posterior.
- Ligar los vasos usando suturas absorbibles 4-0 a nivel del fémur medio y transecto distalmente.
- Sujete la vena distalmente para reducir las fugas durante la disección muscular.
NOTA: La musculatura circunferencial se transectará distal al nivel de ligadura de los vasos de la arteria femoral y los músculos elevados desde el fémur hasta el nivel de la articulación coxofemoral. - Usando disección contundente, abducir la articulación de la cadera con rotación lateral hacia afuera.
- Encuentra la cabeza del fémur y desarticula del acetábulo. Corte cualquier tejido restante manteniendo la pierna unida al cuerpo.
- Dé un bloqueo de salpicaduras al acetábulo y al nervio ciático con aproximadamente 6 mg/kg de ropivacaína.
- Cierre la musculatura sobre el acetábulo con una sutura simple interrumpida (4-0, sutura absorbible).
NOTA: Se puede inyectar bupivacaína o lidocaína al 0,5% adicional (0,15-0,2 mg en total) en varios sitios a lo largo de la capa muscular cerrada (infiltración local / bloqueo de salpicaduras). - Oponer y cerrar los bordes de la piel con clips de herida colocados cada 5-10 mm.
- Encienda el isoflurano al 1,5%-3% (mantenimiento). Monitoree la profundidad anestésica, incluida la reacción al pellizco del dedo del pie, la frecuencia respiratoria y el carácter. Ajuste la velocidad de isoflurano según sea necesario para mantener un plano apropiado de anestesia.
- Recuperación
- Coloque a la rata en una jaula de recuperación limpia con soporte térmico usando una almohadilla térmica colocada debajo de la jaula.
NOTA: Para prevenir la hipertermia, la almohadilla térmica no debe estar en contacto directo con el animal y no debe exceder los 40 °C. - Monitoree al animal hasta que se recupere completamente y sea normotérmico (37.5-39 ° C).
NOTA: El animal no debe dejarse desatendido hasta que esté completamente consciente y severamente recostado y moviéndose fácilmente alrededor de la jaula. - Después de estar completamente despierto, móvil y respirar bien, inyecte a las ratas con buprenorfina (1.0-1.2 mg / kg SC).
NOTA: La administración de buprenorfina en una rata anestesiada puede afectar la recuperación. - Administrar 10 ml de solución de Ringer lactada caliente por vía subcutánea entre los omóplatos.
- Mueva a las ratas de regreso a la jaula limpia y reúnase con congéneres.
- Monitoree a todos los animales dos veces al día durante el próximo mes para detectar signos de dolor y angustia, incluyendo piloerección, postura encorvada o inapetencia o signos de infección en el sitio de la incisión, incluyendo eritema, secreción purulenta o dehiscencia de la herida.
NOTA: Hasta la fecha no hemos observado signos clínicos (como infecciones) después de la recuperación postoperatoria en ninguno de los animales. Solo una rata tenía una dehiscencia con suturas, después de lo cual se usaron clips de heridas para cerrar heridas sin más problemas. - Administrar buprenorfina o meloxicam a animales que presenten signos clínicos de dolor a dosis publicadas en consulta con un veterinario de animales de laboratorio.
- Administrar antibióticos (es decir, cefalosporina) a animales que presenten signos clínicos de dolor a dosis publicadas en consulta con un veterinario de animales de laboratorio.
NOTA: Cualquier animal que muestre signos prolongados de dolor o angustia que no mejoren con analgésicos o animales que muestren signos de infección que no respondan a los antibióticos deben ser sacrificados humanamente.
- Coloque a la rata en una jaula de recuperación limpia con soporte térmico usando una almohadilla térmica colocada debajo de la jaula.
6. Imágenes con rayos X
- Después de la implantación del tumor, tome imágenes de las tibias y los pulmones de forma no invasiva para detectar el crecimiento del tumor mediante rayos X con una máquina diseñada para roedores.
- Anestesiar a las ratas como se hizo anteriormente.
- Tome imágenes a un aumento de 3x durante 6 s a 25 kV.
- Procese la película utilizando el procesador de rayos X. Las radiografías también se pueden escanear digitalmente.
7. Procedimiento de necropsia
- Sacrificar a las ratas con CO2. Confirme la muerte por falta de latidos cardíacos e inmediatamente extraiga 3 ml de sangre del corazón para muestras de suero o plasma.
- Abra el tórax y el abdomen para su examen.
- Aislar la tráquea y cannularse con un catéter (18 G). Para asegurar el catéter en la tráquea, ate una sutura de seda alrededor de la tráquea con el catéter.
- Conecte el catéter de infusión a una jeringa de 3 o 5 ml. Infundir formalina o solución salina para inflar suavemente los lóbulos pulmonares para obtener mejores muestras de histología. En la infusión, los pulmones se hincharán y permitirán una mejor visualización de las metástasis pulmonares.
- Examinar, diseccionar y pesar todos los órganos torácicos y abdominales seleccionados (como el hígado, los riñones).
- Fije los órganos en formalina para histopatología o congele en hielo seco, 2-metilbutano o nitrógeno líquido.
- Para la evaluación de la expresión de proteínas utilizando western blot, haga lisados de tejidos congelados. Se detallan los anticuerpos que reaccionan con los tejidos derata 13.
8. Inmunohistoquímica
- Procese el tejido primario del sistema operativo, intégrelo en parafina y seccionarlo para la tinción inmunohistoquímica.
- Recuperar el antígeno después de la desparafinización utilizando tampón de citrato (pH 6.0). Incubar en 0,3% H2O2 en metanol durante 30 min para apagar la peroxidasa endógena.
- Bloquee las secciones de parafina de 5 μm de espesor con suero normal.
- Incubar con anticuerpos primarios anti-CD68 y CD3 (ver tabla) durante la noche a 4 °C.
- Enjuague las secciones en PBS e incube en polímero HRP utilizando un kit de detección.
NOTA: La inmunotinción se desarrolló con diaminobenzidina como cromógeno.
9. Western blotting
- Lisar las células UMR-106 en 200-300 μL de tampón de lisis14 para realizar electroforesis en gel estándar y western blotting.
- Use de 4% a 12% de geles Bis-Tris.
- Incubar en anticuerpos primarios anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actina o anti-ratón β2-AR (ver tabla) y anticuerpo secundario ligado a la peroxidasa de rábano picante.
- Añadir el sustrato quimioluminiscente. Exponga las membranas a una película de rayos X.
NOTA: los niveles de β-actina se utilizan como controles de carga.
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Representative Results
Las ratas inmunocompetentes SD de raza se utilizan para estos estudios de SG, que ofrece un modelo animal con un sistema inmunológico intacto. Hemos utilizado la línea celular UMR106 de ATCC, desarrollada a partir de células que inicialmente se aislaron de un sistema operativo de una rata SD. Implantamos las células en ratas SD, proporcionando así un modelo singénico para la SG. Las células UMR106 se implantan en la tibia de ratas SD macho y hembra de 3 semanas de edad, simulando un modelo de SG pediátrica. Además, la implantación ortotópica de células UMR106 directamente en la metáfisis/diáfisis tibia proporciona un microambiente tumoral relevante.
Al implantar células tumorales, se debe insertar una aguja correctamente a través de la meseta tibial (Figura 1) en el ángulo correcto (paralelo al eje óseo) extendiendo la punta de la aguja aproximadamente 10 mm en la cavidad central del hueso. Con este procedimiento, el 95% (52/55) de las ratas desarrollaron tumores en las tibias distales a la rodilla. Con la experiencia en inyección tibial, el 100% de las ratas desarrollaron tumores. En un grupo de ratas que no fueron amputadas, los volúmenes tumorales promedio en los machos fueron de 504 mm3 a las 3 semanas y 1195 mm3 a las 5 semanas después de la implantación. En las mujeres, los volúmenes tumorales promedian 285 mm3 a las 3 semanas y 495 mm3 a las 5 semanas después de la implantación.
Se compararon dos cohortes de ratas, incluidas las que tenían amputación (23 ratas) (Figura 2) y las que no tenían amputación (29 ratas). Ambas cohortes fueron sacrificadas a las 7 semanas después de la implantación para examinar la metástasis tumoral en los pulmones. En el grupo de amputación (3/23) las ratas desarrollaron metástasis pulmonares. Estas tres ratas murieron o fueron sacrificadas dentro de las 24 horas de la cirugía debido a complicaciones posteriores a la cirugía. Dos ratas murieron por anestesia prolongada mientras el cirujano estaba aprendiendo el método. Una rata desarrolló una dehiscencia y fue sacrificada al día siguiente. Se evaluaron los pulmones de estas tres ratas y se encontraron histológicamente tres pequeñas metástasis (>1 mm). Las 20 ratas sobrevivientes no tuvieron metástasis pulmonares 7 semanas después de la implantación. Esto indicó que las amputaciones posteriores a la implantación de 3 semanas son adecuadas para disminuir el número de ratas con metástasis pulmonar. En un segundo grupo de 29 ratas que no se sometieron al procedimiento de amputación, 26/29 ratas tuvieron metástasis pulmonares consistentes con los datos publicados anteriormente11. No vimos ningún patrón en el tamaño o número de metástasis en estas ratas. La mayoría de las ratas tienen más de 10 metástasis de 2-7 mm de diámetro groseramente visibles que se muestrearon fácilmente durante la necropsia. Ocasionalmente, las ratas tenían metástasis aún más grandes de hasta 10 mm de diámetro. Es importante implantar células UMR106 con un número de pasaje bajo, ya que los estudios demostraron que las células con un número de paso de 10 o más se vuelven más agresivas y hacen metástasis tan pronto como 2-3 semanas después de la implantación. La razón de la naturaleza no se conoce, pero la especulación es que las células en cultivo podrían desarrollar mutaciones que favorezcan la metástasis.
Además de la cirugía de amputación, otro refinamiento de los métodos incluyó las imágenes de rayos X para la vigilancia del tumor o en la necropsia. Este método permite al investigador confirmar la invasión de tumores óseos en ratas bajo anestesia. El método de radiografía plana también se puede utilizar en extremidades recientemente amputadas o miembros fijos de formalina. El método es rápido (5 minutos por rata) y económico ($ 2-5 / rata) en comparación con la tomografía computarizada (TC). Para el monitoreo in vivo, requiere que las ratas sean anestesiadas durante la toma de imágenes. La Figura 3 demuestra la morfología detallada observada por las imágenes de rayos X de dos extremidades previamente amputadas. Este método ilumina la naturaleza osteolítica y osteoblástica de estos tumores. Tenga en cuenta la interrupción de la arquitectura cortical ósea normal de la tibia y el peroné en ambos ejemplos (flechas blancas). La Figura 4 ilustra la morfología radiográfica de los pulmones con y sin metástasis. Las imágenes por rayos X pueden revelar rápidamente al laboratorio la necesidad de la eutanasia para evitar muertes espontáneas innecesarias.
Los tumores primarios y metastásicos en el pulmón son histológicamente similares a la SG humana que exhiben morfología tumoral osteolítica y osteoblástica. En la SG de rata, tanto la morfología tumoral osteolítica como la osteoblástica se confirma por histopatología de la extremidad amputada en la Figura 5 y figura 6. Tenga en cuenta que el hueso cortical está ausente en este ejemplo y el hueso adyacente también es reemplazado o fortificado por hueso tejido nuevo (exostosis) que está orientado perpendicularmente al eje existente de la corteza. Las islas de osteoide inmaduro (material extracelular amorfo) se muestran dentro del ejemplo del tumor. Adicionalmente, la morfología microscópica de las metástasis pulmonares, algunas con hueso mineralizado, y los émbolos vasculares tumorales se muestran en la Figura 7.
La amputación de extremidades con SG aumenta la supervivencia en ratas. Las ratas pueden morir espontáneamente debido a la metástasis pulmonar alojada durante más de 7 semanas después de la implantación. El uso de la amputación puede permitir una mayor investigación de la terapia estándar o dirigida contra el cáncer en este modelo. Alargar el tiempo entre la implantación del tumor y la amputación aumentará la incidencia de metástasis.
La doxorrubicina es un agente quimioterapéutico utilizado para tratar la SG en humanos. En ratas, la doxorrubicina se puede administrar a través de inyecciones yugulares13 o un catéter15 como se describe aquí. La inyección yugular requiere 5-10 minutos por rata, pero asegura la administración de la dosis en la vena expuesta. En general, las inyecciones yugulares son mucho más reproducibles en comparación con las inyecciones de venas de la cola de rata. Si la doxorrubicina se filtra en la dermis durante las inyecciones de la vena de la cola, puede ocurrir necrosis de la cola e impedir tratamientos adicionales. En este estudio, cinco ratas fueron tratadas con una dosis de 2 mg/kg de doxorrubicina y sacrificadas 48 h después de la inyección para investigar la muerte celular en los tumores como se muestra en la Figura 5A,B.
También se evaluaron cinco ratas de control tratadas con solución salina para seleccionar anticuerpos que se pueden usar para inmunotintar las células inmunes en el sistema operativo de rata. Aquí, se probaron dos anticuerpos para la reactividad inmune. Para los estudios de inmunohistoquímica, los tumores se fijaron en formalina durante 48-72 h y luego se movieron al etanol al 70% para reducir la reticulación de proteínas que se produce en la formalina. La inmunohistoquímica se realizó para infiltrados de células inmunes en tumores primarios de SG e inmunoteñida para macrófagos (CD68) y células T (CD3). La Figura 8 muestra dos ejemplos de inmunotinciones de infiltrados de células inmunes dentro del microambiente tumoral.
También se exploraron las posibles dianas para la intervención terapéutica. Después de la amputación de extremidades con tumores, las muestras de SG de rata se congelaron para el aislamiento futuro de proteínas. En este estudio, descubrimos que las células UMR106 expresan las proteínas de la vía de la familia ErbB. Los Western blots realizados en lisados de proteínas celulares UMR106 demuestran la expresión de ErbB2, EGFR, ErbB4 y otras proteínas que interactúan con estas vías(Figura 9).
Figura 1: Tibia con aguja de implantación tumoral insertada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tibia durante el procedimiento de amputación con piel extirpada (A), arteria y vena femoral expuesta (B), con músculo elevado del fémur (C), y en una rata 3 semanas después de la cirugía de amputación (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Radiografía de rayos X de piernas derechas después de la amputación (ex vivo) de dos ratas con SG. Tenga en cuenta la naturaleza osteolítica y osteoblástica del tumor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes de rayos X de los pulmones de la rata. (A) sin metástasis pulmonares. (B) con metástasis pulmonar de SG. (C) correlación con la patología macroscópica de metástasis en un pulmón inflado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: (A) Histopatología de la SG con un 90% de células que muestran muerte celular en el tumor de tibia 48 h después de una dosis de 2 mg/kg de doxorrubicina. (B) Muerte de células tumorales (flecha) en la SG primaria tibial a las 48 h después de una dosis de 2 mg/kg de doxorrubicina. Tenga en cuenta que la esquina superior derecha e izquierda tiene celdas viables. (C) Invasión de la SG en el hueso cortical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: (A) Histopatología de la SG que ha reemplazado las células de la médula ósea y se ha infiltrado en las cortezas de la tibia. Observe el crecimiento de hueso nuevo reactivo acompañado, ya que está en capas hacia afuera y perpendicular a la corteza preexistente. (B) Examen de mayor potencia de las células tumorales de la SG adyacentes a una isla de hueso. (C) Examen de mayor potencia de las células de la SG incrustadas en la matriz extracelular de rosa a azul (osteoide). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: (A) Metástasis pulmonares múltiples en rata con implantación de tumor de tibia. (B) Células tumorales de LA SG en un émbolo en un pequeño vaso de la rama de la arteria pulmonar adyacente a un bronquiolo debajo del vaso. (C) Algunas metástasis pulmonares contienen islas de hueso, mientras que otras metástasis son más celulares. (D) Mayor poder de metástasis con células de LA SG mezcladas con islas de hueso mineralizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Inmunohistoquímica de (A) macrófagos inmunoestángudos CD68 y (B) células T inmunodefinidas que muestran células CD3 positivas en la SG en la tibia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Proteínas de la vía ErbB expresadas en células UMR106 OS de tumores de tibia. Se examinaron los lisados de tumores primarios para la expresión de proteínas de la vía de transducción de señales de la familia ErbB, incluidos los receptores ErbB2, EGFR, ErbB4, AKT, ERK1/2 y β2-adrenérgicos con actina como control de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las ratas con implantes tibiales de SG desarrollan tumores medibles a las 3 semanas posteriores a la implantación. Si las extremidades con tumores se amputan 3 semanas después de la implantación, la incidencia de metástasis pulmonar se reduce significativamente. Los SG son tanto osteolíticos como osteoblásticos. Las ratas sin amputación desarrollan metástasis pulmonares que son múltiples y de tamaño variable, observadas por radiografía o en la necropsia a las 7 semanas después de la implantación. EGFR, ErbB2 y ErbB4 se expresan en la SG UMR106 de rata, similar a la SG humana16,17,18. Las células T CD3 y los macrófagos se detectan fácilmente en la SG por métodos de inmunohistoquímica. Las inyecciones de la vena yugular se prefieren a la vena de la cola para la administración de doxorrubicina de quimioterapia, un medicamento que se administra a los pacientes con SG. El método descrito aquí es una amputación coxofemoral completa. Este procedimiento es un refinamiento y podría considerarse para reemplazar el método quirúrgico de extirpación del tumor (osteotomía femoral) donde se corta el hueso dejando un muñón para el paciente8. El estudio sugiere una extirpación completa de las extremidades para reducir la probabilidad de dolor y complicaciones postquirúrgicas.
Hay una serie de pasos críticos en este protocolo. Primero, es importante tener en cuenta el paso de las células tumorales y usar un paso más bajo de las células para los estudios para mantener el modelo consistente de un experimento a otro. Las células de paso más viejas se vuelven más agresivas con el tiempo en cultivo. En segundo lugar, el uso de la aguja del tamaño adecuado y la jeringa hamilton ayudará a inyectar correctamente las células en la tibia a un volumen muy pequeño de 20 μL, un volumen determinado como óptimo y no causó fugas. En tercer lugar, el cirujano necesita practicar inicialmente la desarticulación al hacer necropsias en ratas de edad similar para aprender la mecánica del procedimiento. Cuarto, para el éxito de la amputación, mantener la termorregulación y limitar el tiempo de la cirugía. Un cirujano experimentado puede completar la amputación en 15 minutos.
Se observó que lamplantación de células en la tibia mejoró mucho cuando se utilizó una aguja de orificio más grande para hacer la abertura inicial seguida de la inserción de una aguja de jeringa Hamilton de diámetro más pequeño. Esto protege la jeringa Hamilton de roturas y embotamientos con el tiempo. Las jeringas Hamilton pueden tener volúmenes tan pequeños como 10 μL. Las jeringas de tuberculina de 1 ml no serían lo suficientemente precisas para la implantación de 20 μL. La misma jeringa Hamilton se utilizó para todas las ratas implantadas en un día, pero se lavaron entre los procedimientos quirúrgicos de cada rata. Evite autoclave las jeringas de jeringa Hamilton, ya que son propensas a la rotura. Al final del procedimiento, lávelo con solución salina (10 veces) y luego con etanol al 100% (10 veces) y déjelo secar con el émbolo retirado para almacenar.
Inicialmente se utilizaron suturas cutáneas y subcutáneas para cerrar la incisión, sin embargo, se encontró una rata con dehiscencia el día después de la cirugía. El uso de clips para heridas y pegamento quirúrgico para cerrar la incisión mejoró el método. Con este refinamiento, ninguna otra rata tuvo tal complicación posterior a la cirugía. La inclusión de la radiografía de los pulmones por rayos X refina este modelo para demostrar la metástasis pulmonar en ratas, lo que permite una eutanasia que es oportuna y evita muertes inesperadas. Las imágenes de rayos X nos permiten determinar la naturaleza osteolítica y osteoblástica de estos sistemas operativos de rata, similares a los sistemas operativos humanos.
Se necesita un nivel moderado de experiencia quirúrgica para realizar el procedimiento de amputación. El paso más difícil es la disección en la musculatura para localizar la articulación coxofemoral. La ampliación y una buena iluminación son importantes durante este paso. La experiencia quirúrgica se puede lograr con la práctica en animales que han sido sacrificados. Después de aproximadamente 10 ratas, el cirujano debe estar seguro de amputar una extremidad con SG de una rata viva bajo anestesia.
Los métodos existentes para extirpar extremidades con sarcomas en ratones y ratas se basan en extirpar la tibia cortando el hueso del fémur y la musculatura a mitad del eje y dejando el muñón8. Aunque, esto puede ser útil para algunas investigaciones, en este estudio, se intentó la extirpación completa de la pierna. Se encontró que el procedimiento era satisfactorio y no ofrecía complicaciones postquirúrgicas. En ratas con un muñón de la extremidad posterior, podría haber más dolor postquirúrgico en la piel, los músculos o los nervios. Dejando un muñón, las ratas podían alcanzar y acceder al sitio de la cirugía. A las ratas les va muy bien después de la amputación y deambulan bien en la jaula con una extremidad posterior.
Las ventajas de la amputación completa de la extremidad incluyen la extirpación del tumor primario antes de que se vuelva demasiado grande y doloroso para la rata. Es importante destacar que la extirpación del tumor primario ayudará a controlar la metástasis del tumor primario en el pulmón. Las ratas con amputación se pueden estudiar más a fondo para probar la eficacia de nuevas terapias en las células tumorales circulantes en la sangre o en las micrometástasis en los capilares de los pulmones u otros huesos.
Existe una necesidad sustancial de desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer para la SG y otros sarcomas, especialmente terapias que tienen actividad farmacológica contra la progresión metastásica. En comparación con las nuevas terapias desarrolladas para otros tipos de cáncer, las terapias para la SG desafortunadamente no han progresado en muchas décadas. En respuesta a este problema, se convocó una reunión de líderes y expertos clave en SG y metástasis para desarrollar pautas para mejorar el desarrollo de fármacos para laSG 19. Según las sugerencias del panel, se establecieron estudios para mejorar el modelo preclínico de ratas, un modelo menos conocido de SG. En resumen, la amputación y las imágenes refinan el modelo preclínico de rata para su uso posterior por parte de la comunidad de investigación del sarcoma. El procedimiento de amputación permitirá mejorar la supervivencia del paciente durante varios meses, lo que permitirá evaluar la eficacia de nuevos tratamientos en micrometástasis o tumores latentes o probar la toxicidad de los tratamientos con un modelo con mejor longevidad.
En resumen, proporcionamos la ventaja de este modelo de sistema operativo. Las ratas inmunocompetentes SD de raza se utilizan para proporcionar un modelo singénico con una línea celular de SG UMR106 implantada aislada de una OS de rata SD. El tumor primario y metastásico es histológicamente similar a la SG en humanos. Las ratas macho y hembra juveniles se utilizan para los estudios de implantación de tumores UMR106 que modelan el sarcoma pediátrico. La colocación ortotópica de las células implantadas se realiza directamente en la tibia para un microambiente tumoral relevante. El tumor primario hace metástasis en el pulmón y las metástasis se pueden controlar mediante imágenes in vivo con el método de rayos X. El SG de rata expresa proteínas en común con la SG humana, como ErbB2. En comparación con el sistema operativo del perro, el modelo de rata permite que se use un mayor número de animales simultáneamente. Las ratas son 10 veces más grandes que los ratones para facilitar las inyecciones tibiales, la cirugía, las imágenes, las extracciones de sangre y la biopsia. La longevidad de las ratas está más asegurada con la amputación y este modelo puede combinar la terapia neoadyuvante, la amputación y la terapia adyuvante, lo que permite mejorar la supervivencia del paciente, lo que permite evaluar la eficacia de los tratamientos en micrometástasis o tumores latentes. La evaluación de la toxicidad fuera del objetivo también se puede evaluar en este modelo en el que las ratas pueden ser tratadas con terapias contra el cáncer, como la doxorrubicina, y monitoreadas a largo plazo para la toxicidad cardíaca inducida por doxorrubicina o la recurrencia de la SG. Esto permitiría la prueba de agentes de cardioprotección en un modelo con sistema operativo.
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Disclosures
No hay divulgación para declarar.
Acknowledgments
Financiamiento de los NIH a través del Instituto Nacional del Cáncer, subvención # CA228582. Shun Ishiyama está recibiendo actualmente una subvención de Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
- Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B.
- Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P.
- Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271 (2012).
- Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
- Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
- Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
- Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
- Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
- Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
- Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
- Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
- Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).
