Summary
Her beskrives en syngeneisk ortotopisk implantasjon etterfulgt av en amputasjonsprosedyre av osteosarkom med spontan lungemetastase som kan brukes til preklinisk undersøkelse av metastasebiologi og utvikling av nye terapeutiske stoffer.
Abstract
Det siste fremskrittet i behandlingen av osteosarkom (OS) skjedde på 1980-tallet da multi-agent kjemoterapi ble vist å forbedre total overlevelse sammenlignet med kirurgi alene. For å løse dette problemet er målet med studien å avgrense en mindre kjent modell av OS hos rotter med en omfattende histologisk, avbildning, biologisk, implantasjon og amputasjonskirurgisk tilnærming som forlenger overlevelsen. Vi brukte en immunotokmpetent, utbrent Sprague-Dawley (SD), syngeneisk rottemodell med implantert UMR106 OS-cellelinje (som stammer fra en SD-rotte) med ortotopiske tibiale tumorimplantater i 3 uker gamle mannlige og kvinnelige rotter for å modellere pediatrisk OS. Vi fant at rotter utvikler reproduserbare primære og metastatiske lungetumorer, og at lemamputasjoner ved 3 uker etter implantasjon reduserer forekomsten av lungemetastase betydelig og forhindrer uventede dødsfall. Histologisk var de primære og metastatiske OSene hos rotter svært lik humane OS. Ved hjelp av immunhiistokjemimetoder viser studien at rotte os er infiltrert med makrofager og T-celler. En proteinuttrykksundersøkelse av OS-celler avslører at disse svulstene uttrykker ErbB-familiens kinaser. Siden disse kinasene også er sterkt uttrykt i de fleste menneskelige operativsystemer, kan denne rottemodellen brukes til å teste ErbB-banehemmere for terapi.
Introduction
Osteosarkom (OS) er den vanligste primære bensvulsten hos barn, ungdom og unge voksne. Det siste fremskrittet i behandlingen av OS skjedde på 1980-tallet da multi-agent kjemoterapi ble vist å forbedre total overlevelse sammenlignet med kirurgi alene1. OS utvikler seg under rask beinvekst, vanligvis forekommer i lange rørformede bein som lårben, tibia og humerus. De er preget av en osteolytisk, osteoblastisk eller blandet utseende med bemerkelsesverdig periosteal reaksjon2. Kjemoterapi og kirurgisk reseksjon kan forbedre utfallet for pasienter med 5 års overlevelse for 65% av pasientene2,3. Dessverre har høyverdige OS-pasienter med metastatisk sykdom 20% overlevelse. OS invaderer regionalt og metastaserer hovedsakelig til lungene eller andre bein og er mer utbredt hos menn. Det mest overbevisende behovet for disse unge pasientene er en ny terapi som forhindrer og eliminerer levedyktighet av fjerne metastaser.
OS prekliniske modeller har blitt gjennomgått4,5,6,7 og få tilgjengelige immunotokmpente modeller ved hjelp av amputasjon av ortotopisk OS er utviklet. I 2000 ble en viktig modell utviklet ved hjelp av BALB/c mus med ortotopisk syngeneisk OS og amputasjon8. Sammenlignet med denne musemodellen er rottemodellen basert på genetisk utavlet og 10 ganger større dyr som fører til noen fordeler. Rotten UMR106-modellen ble utviklet fra et 32P indusert OS i en Sprague Dawley (SD) rotte, som ble avledet til en cellelinje9. I 2001 ble ortotopisk implantasjon av UMR106-01 først beskrevet i implanterte tibias av athymiske mus med rask, konsistent primær tumorutvikling og radiologiske, histologiske trekk til felles med OS hos mennesker. Lungemetastaser utviklet seg og var avhengige av ortotopisk plassering av UMR106 i beinmikromiljøet10. I 2009 etablerte Yu et al.11 en reproduserbar ortotopisk femur OS-rottemodell ved hjelp av UMR106-celler i større mannlige SD-rotter. De vellykkede tumorimplantasjonene og lungemetastaseraten hos rotter uten amputasjon var lik dataene som presenteres her. I denne studien ble det utført en ekstra amputasjon til modellen ved hjelp av unge rotter, noe som antydet at tidspunktet for primær tumorfjerning er avgjørende for modellering av OS, spesielt relatert til metastatisk progresjon. Med denne raffinement, amputasjon og in vivo imaging forbedre denne modellen for pre-kliniske studier for nye narkotika vurdering for OS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer og eksperimenter som involverer rotter ble utført i henhold til protokoller godkjent av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. SD rotte OS celle linje UMR-106 cellekultur protokoll
- Vokse celler i DMEM, supplert med 10% (v / v) FBS, penicillin (10 U / ml) -streptomycin (10 U / ml) ved 37 ° C i fuktet 5% CO2 atmosfære. Utfør eksperimenter ved hjelp av celler med passasjer på 2-812.
2. Intratibial injeksjon av OS-celler protokoll
MERK: Tidsmatte gravide SD-rotter fødes i dyreavdelingen, og ved 3 ukers alder brukes kull (siden UMR 106 cellelinje er syngeneisk for SD-rotter, er det ikke nødvendig med bestråling).
- Induksjon
- Plasser rotten i et mellomstort induksjonskammer og induser anestesi med 2% -3% isofluran. Overvåk dyret kontinuerlig for dybden av anestesi ved refleks til tåklemme, åndedrettsfrekvens og karakter.
- Sett nesen inn i nosecone. Sikre om nødvendig med tape.
- Fjern håret på høyre ben opp til ventral og dorsal underliv med clippers eller bruk depilatorisk middel. Plasser rotten i en liggende stilling.
- Skrubb det kirurgiske området aseptisk ved hjelp av 70% etanol og fortynn klorhexidinacetat eller fortynn betadin. Begynn rundt kneområdet og skrubb i en sirkulær bevegelse både proksimalt og distalt. Gjenta dette trinnet tre ganger. Ingen drapering brukes til tumorimplantasjon.
- Påfør øyesmøremiddel i begge rottens øyne for å forhindre hornhinnens uttørking forårsaket av anestesi. Plasser rotten på en varmebestandig varmepute med lav varmeinnstilling. Pass på at rotten har normal kroppstemperatur (37 °C) og normal respirasjonsfrekvens.
- Kirurgi
- Slå på isofluran ved ~1,5%-2% (for vedlikehold). Forsikre deg om at dyret er på et tilstrekkelig plan av anestesi via mangel på tå-klemme refleks. Hvis ikke, øk isofluranprosenten til 2,5%.
- Merk en steril nål (ca. 22 G) ved 10 mm fra spissen for å få veiledning om dybde til å sette inn.
- Sett nålen 10 mm ned i tibiaens diafyse ved å gå inn i det bøyde kneet midt på tibialplatået, og utvid nålen gjennom metafysen inn i diafysen ved hjelp av en lett borelignende bevegelse for å lage en åpning. Fjern kanylen.
- Last celleopphenget inn i Hamilton-sprøyten rett før injeksjon i tibia. For å gjøre dette, bland cellene forsiktig før du trekker inn i sprøyten, da tyngdekraften får cellene til å bosette seg i bunnen av røret.
MERK: Celler kan oppbevares i et rør på 1,5 til 2 ml (ved romtemperatur) før de trekkes inn i Hamilton-sprøyten (100 μL) etter forsiktig blanding. Celler kan holdes ved romtemperatur i 2-3 timer under implantasjonsprosedyren. Kontroller alltid cellens levedyktighet i røret før og deretter etter implantasjonsøkten. Trypan blå ekskludering er den enkleste metoden for vurdering av celle levedyktighet. - Når beinet er krysset med den første nålen, sett inn en andre (mindre diameter nål også merket med 10 mm) nål festet til 100 μL Hamilton sprøyte lastet med celler. Pass på å sette nålen opp til 10 mm merket i samme hull som strekker seg inn i diafysen.
- Utladning forsiktig 20 μL av 75 000 OS-celler suspensjon i PBS i diafysen og marghulen.
MERK: Nålen skal ikke slingre i beinet og skal føles sikker. Hvis nålen lett beveger seg, kan cortex ha blitt traversert ved diafysen. Gjenta innsettingen på nytt for å få en fastere plassering før celleinjeksjonen. - Fjern Hamilton nålen fra beinet.
MERK: Hvis en liten dråpe blod dannes, bruk lett trykk. Hvis det dannes klare væskedråper på punkteringsstedet, kan nålen ikke ha blitt utvidet langt nok i beinet, og tumorcelleopphenget kan ha lekket tilbake gjennom hullet. Registrer dette i notatene, men generelt vil tumorimplantasjon lykkes. Med erfaring bør tumorimplantasjonsprosedyren ta 5 min per rotte. Med erfaring vil tumorimplantasjonen av celler i beinet bli lettere. Utilsiktet injeksjon av celler i muskelen rundt beinet, kan ikke føre til tumormikromiljøet som trengs for lungemetastase.
- Bedring
- Forsikre deg om at rotten er normotermisk. Plasser rotten i et bur med en varmepute plassert under buret for utvinning.
- Etter å ha vært helt våken, mobil og pustet godt, injiser rottene med Buprenorfin (1,0-1,2 mg/kg SC).
MERK: For å få tilgang til Buprenorfin, sjekk med institusjonen for å se alternativer for godkjenning gjennom veterinærpersonalet for å legge inn bestillingen. - Flytt rottene tilbake for å rengjøre bur og overvåke en gang om dagen, hver uke.
3. Måling og overvåking
- Mål tumorstørrelsen 9-10 dager etter implantasjon og deretter hver annen dag til 3 uker etter implantasjon for å etablere en vekstrate. Mål den maksimale diameteren på tibia ved hjelp av en elektronisk eller manuell kaliper. Lagre dataene i et regneark med en formel for å beregne tumorvolum. Mål den kontralaterale (ikke implanterte tibia) som baseline.
MERK: De implanterte bakimplantatdiametrene brukes som surrogat for tumorstørrelse. Bakre lemmer måles vinkelrett på tibia langaksen med størst diameter for to målinger, ventral / dorsal og media / lateral på lemmen. Det estimerte tumorvolumet beregnes ved formelen11: Tumorvolum (mm3) = største diameter (mm) x minste diameter (mm)2/2. - Vurder rotter for overlevelse amputasjon eller kjemoterapi behandling når svulster nærmer seg 15 mm i den største dimensjonen eller 3 uker etter tumor implantasjon. Den kontralaterale lemmen måler ca 7-9 mm hos de fleste rotter i denne alderen.
4. Doxorubicin intravenøs administrering
- Bedøv rottene med 2% isofluran. Forbered huden over jugularvenen med tre kirurgiske vasker ved hjelp av betadin og alkohol som beskrevet13.
- Under forsiktig disseksjon, visualiser høyre eller venstre jugular vene. Sett nålen inn i den overliggende muskelen og rett deretter mot rottens hode inn i jugularvenen lumen som det visualiseres i jugularvenen fremre til pectoralis muskelen.
- Når kanylen settes inn i jugularvenen, trekker du forsiktig blod inn i sprøyten for å sikre riktig innsetting. Det er mulig å tro at nålen er gjennom venen, men nålen er under venen og ikke i lumen. Hvis jugularvenen blir for liten til injeksjonsvæsker når du dissekerer for å eksponere jugularvenen, bruk den andre jugulære venen til injeksjonen.
- Injiser doksorubicin (2 mg/kg) langsomt over 1 min i et volum på 100-150 μL. Løsningen kan visualiseres intravenøst i jugularvenen under levering.
- Injiser lignende mengder normal saltvann i kontrollrotter.
- Fjern nålen og påfør forsiktig trykk på venen med en steril gasbind.
- Lukk hudsnittet med 3-4 sårklemmer. Fjern klipsene etter 7-10 dager etter injeksjon.
MERK: Rotter prøver vanligvis ikke å fjerne metallklips, men vil bite og fjerne suturer. Jugular injeksjon metoden er å foretrekke å hale vene injeksjoner for doxorubicin siden ethvert stoff som lekker utenfor fartøyet forårsaker nekrose av halen som kan kreve hale amputasjon.
5. Hind lem amputasjonsprotokoll
- Induksjon
- Plasser rotten i et mellomstort induksjonskammer og induser anestesi med 2% -4% isofluran. Overvåk rotten kontinuerlig for dybden av anestesi.
MERK: Induksjonskammeret er scavenged til en kullbeholder og andre gasser fjernes av et down-draft bord som brukes til kirurgi. - Sett nesen inn i en nosecone. Sikre om nødvendig med tape.
MERK: Denne prosedyren gjøres på et nedtrekksbord for å samle overflødige flyktige gasser (dvs. isofluran). - Fjern håret på høyre ben opp til ventral og dorsal underliv med clippers eller bruk depilatorisk middel. Plasser rotten i en liggende stilling.
- Skrubb det kirurgiske området aseptisk ved hjelp av 70% etanol og fortynn klorhexidinacetat eller fortynn betadin. Forbered huden på kirurgi fra midten av kalven til hudområdet like over hofteleddet i høyre underliv. Skrubb benet proksimalt og det distale området omkrets. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Påfør øyesmøremiddelet i begge rottens øyne. Pass på at rotten har normal kroppstemperatur (37 °C) og normale vitale tegn. Overvåk og reguler kroppstemperaturen ved hjelp av en varmepute som er koblet til en rektal temperatursondemonitor.
- Plasser rotten i et mellomstort induksjonskammer og induser anestesi med 2% -4% isofluran. Overvåk rotten kontinuerlig for dybden av anestesi.
- Kirurgi
- Slå på isofluran ved 1,5%-3% (vedlikehold). Overvåk for bedøvelsesdybde, inkludert reaksjon på tåklemme, åndedrettsfrekvens og karakter. Juster isofluranhastigheten etter behov for å opprettholde et passende anestesiplan.
MERK: Åndedrettsfrekvensen under anestesi bør være mellom 50-100 pust per minutt. Dype, sjeldne åndedrag er en indikasjon på at rotten er for dypt bedøvet. - Åpne sterile instrumentpakker og gardiner og ikke sterile hansker. Pass på å opprettholde steriliteten gjennom prosedyrens varighet. Grunnleggende sterile kirurgiske instrumenter som trengs inkluderer, skalpellbladholder, tang, hemostater, nåleholder, saks og sårklipsapplier.
- Trekk rottens ben gjennom ventilen til den sterile kirurgiske gardinen. Forsikre deg om at dyret er på et tilstrekkelig plan av anestesi via tå-klemme refleks.
- Bruk et skalpellblad eller kirurgisk saks, lag et omkretselt, kutan snitt bare proksimalt til stifle (kneledd).
- Deglove bakre lem ved hjelp av gasbind eller stump disseksjon for å eksponere lårarterien og venen på den ventral-mediale overflaten av bakre lem.
- Ligate fartøyene ved hjelp av 4-0 absorberbare suturer på nivået av midt-lårbenet og transekt distally.
- Klem venen distalt for å redusere lekkasje under muskel disseksjon.
MERK: Omkretsmuskulaturen vil bli transektert distal til nivået av lårarteriekarligasjon og muskler forhøyet fra lårbenet til nivået av coxofemoral leddet. - Bruk stump disseksjon, bortføre hofteleddet med lateral utover rotasjon.
- Finn hodet på lårbenet og disarticulate det fra acetabulum. Klipp eventuelt gjenværende vev som holder benet festet til kroppen.
- Gi en sprutblokk til acetabulum og isjiasnerven med ca. 6 mg/kg Ropivacaine.
- Lukk muskulaturen over acetabulum ved hjelp av en enkel avbrutt sutur (4-0, absorberbar sutur).
MERK: Ytterligere 0,5 % bupivakain eller lidokain (totalt 0,15–0,2 mg) kan injiseres på flere steder langs det lukkede muskellaget (lokal infiltrasjons-/splash-blokk). - Mot og lukk kantene på huden ved hjelp av sårklemmer plassert fra hverandre hver 5-10 mm.
- Slå på isofluran ved 1,5%-3% (vedlikehold). Overvåk for bedøvelsesdybde, inkludert reaksjon på tåklemme, åndedrettsfrekvens og karakter. Juster isofluranhastigheten etter behov for å opprettholde et passende anestesiplan.
- Bedring
- Plasser rotten i et rent gjenopprettingsbur med varmestøtte ved hjelp av en varmepute plassert under buret.
MERK: For å forhindre hypertermi, bør varmeputen ikke være i direkte kontakt med dyret og bør ikke overstige 40 °C. - Overvåk dyret til det er helt restituert og er normotermisk (37,5-39 °C).
MERK: Dyret bør ikke etterlates uten tilsyn før det er fullt bevisst og strengt liggende og beveger seg lett rundt buret. - Etter å ha vært helt våken, mobil og pustet godt, injiser rottene med Buprenorfin (1,0-1,2 mg/kg SC).
MERK: Å gi Buprenorfin i en bedøvet rotte kan svekke utvinningen. - Administrer 10 ml varm laktert Ringers oppløsning subkutant mellom skulderbladene.
- Flytt rottene tilbake til det rene buret og gjenforenes med konsifiser.
- Overvåk alle dyrene to ganger daglig i neste måned for tegn på smerte og nød, inkludert piloereksjon, hunched holdning eller inappetens eller tegn på snittstedsinfeksjon, inkludert erytem, purulent utslipp eller sårdehiscence.
MERK: Til dags dato har vi ikke observert kliniske tegn (som infeksjoner) etter postoperativ utvinning hos noen av dyrene. Bare en rotte hadde en dehiscence med suturer, hvorpå sårklemmer ble brukt til å lukke sår uten ytterligere problemer. - Administrer buprenorfin eller meloksikam til dyr som presenterer kliniske tegn på smerte ved publiserte doser i samråd med en veterinær av forsøksdyr.
- Administrer antibiotika (dvs. cephalosporin) til dyr som presenterer kliniske tegn på smerte ved publiserte doser i samråd med en dyreveterinær.
MERK: Dyr som utviser langvarige tegn på smerte eller nød som ikke forbedres med smertestillende midler eller dyr som viser tegn på infeksjon som ikke reagerer på antibiotika, må avlives humant.
- Plasser rotten i et rent gjenopprettingsbur med varmestøtte ved hjelp av en varmepute plassert under buret.
6. Bildebehandling med røntgen
- Etter tumorimplantasjon, bilde tibias og lunger ikke-invasivt for å oppdage tumorvekst ved hjelp av røntgen med en maskin designet for gnagere.
- Bedøv rottene som tidligere gjort.
- Ta bilder med 3x forstørrelse for 6 s ved 25 kV.
- Behandle filmen ved hjelp av røntgenprosessoren. Radiografer kan også skannes digitalt.
7. Nekropsi prosedyre
- Avlive rotter med CO2. Bekreft død via mangel på hjerterytme og trekk umiddelbart 3 ml blod fra hjertet for serum- eller plasmaprøver.
- Åpne thorax og mage for undersøkelse.
- Isoler luftrøret og kanyler med et (18 G) kateter. For å feste kateteret i luftrøret, bind en silke sutur rundt både luftrøret med kateteret.
- Koble infusjonskateteret til en 3 eller 5 ml sprøyte. Tilsett formalin eller saltvann for forsiktig å blåse opp lungelobene for bedre histologiprøver. Ved infusjon vil lungene blåse opp og muliggjøre en bedre visualisering av lungemetastaser.
- Undersøk, disseker og vei alle valgte thorax- og bukorganer (som lever, nyrer).
- Fest organene i formalin for histopatologi eller frys på tørris, 2-metylbutan eller flytende nitrogen.
- For evaluering av proteinuttrykk ved hjelp av vestlig blot, gjør lysater av frosne vev. Antistoffer som reagerer med rottevev er detaljert13.
8. Immunohistokjemi
- Behandle det primære OS-vevet, legg inn i paraffin, og del det for immunhiistokjemisk farging.
- Hent antigenet etter deparaffinering ved hjelp av sitratbuffer (pH 6.0). Inkuber i 0,3% H2O2 i metanol i 30 min for å slukke endogen peroksidase.
- Blokker de 5 μm tykke parafindelene ved hjelp av normalt serum.
- Inkuber med primære anti-CD68- og CD3-antistoffer (se tabell) over natten ved 4 °C.
- Skyll seksjonene i PBS og inkuber dem i HRP-polymer ved hjelp av et deteksjonssett.
MERK: Immunostaining ble utviklet med diaminobenzidin som kromatogen.
9. Vestlig blotting
- Lyse UMR-106 cellene i 200-300 μL lysis buffer14 for å utføre standard gel elektroforese og vestlig blotting.
- Bruk 4% til 12% Bis-Tris geler.
- Inkuber i anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-aktin eller antimus β2-AR primær antistoff (se tabell) og pepperrot peroksidase-koblet sekundært antistoff.
- Tilsett chemiluminescent substratet. Utsett membranene for røntgenfilm.
MERK: β-aktinnivåer brukes som lastekontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunocompetente SD-utrangerte rotter brukes til disse OS-studiene, som tilbyr en dyremodell med et intakt immunsystem. Vi har brukt UMR106-cellelinjen fra ATCC, utviklet fra celler som opprinnelig var isolert fra et OPERATIVSYSTEM fra en SD-rotte. Vi implanterte cellene i SD-rotter, og ga dermed en ny modell for OS. UMR106-celler implanteres i tibia av 3 uker gamle mannlige og kvinnelige SD-rotter, og simulerer en pediatrisk OS-modell. Videre gir den ortotopiske implantasjonen av UMR106-celler direkte inn i tibiametastifysen / diafysen et relevant tumormikromiljø.
Ved implantering av tumorceller må en nål settes riktig inn gjennom det tibiale platået (figur 1) i riktig vinkel (parallelt med beinakselen) som forlenger nålespissen ca. 10 mm inn i benets sentrale hulrom. Med denne prosedyren utviklet 95% (52/55) rotter svulster i tibias distal til kneet. Med tibial injeksjonserfaring utviklet 100% av rotter svulster. I en gruppe rotter som ikke ble amputert, var gjennomsnittlig tumorvolum hos menn 504 mm3 ved 3 uker og 1195 mm3 ved 5 uker etter implantasjon. Hos kvinner er tumorvolumene gjennomsnittlig ved 285 mm3 ved 3 uker og 495 mm3 ved 5 uker etter implantasjon.
To kohorter av rotter ble sammenlignet, inkludert de med amputasjon (23 rotter) (figur 2) og de uten amputasjon (29 rotter). Begge kohortene ble euthanized ved 7 uker etter implantasjon for å undersøke tumormetastase til lungene. I amputasjonsgruppen (3/23) utviklet rotter lungemetastaser. Disse tre rottene døde eller ble euthanized innen 24 timers kirurgi på grunn av post kirurgi komplikasjoner. To rotter døde av langvarig anestesi da kirurgen lærte metoden. En rotte utviklet en dehiscence og ble euthanized neste dag. Lungene til disse tre rottene ble evaluert og tre små metastaser (>1 mm) ble funnet histologisk. De overlevende 20 rottene hadde ikke lungemetastaser 7 uker etter implantasjon. Dette indikerte at 3 uker etter implantasjon amputasjoner er tilstrekkelig til å redusere antall rotter med lungemetastase. I en annen gruppe på 29 rotter som ikke hadde amputasjonsprosedyren, hadde 26/29 rotter lungemetastaser i samsvar med de tidligere publiserte dataene11. Vi så ikke noe mønster i størrelsen eller antall metastaser i disse rottene. De fleste rotter har mer enn 10 grovt synlige metastaser med 2-7 mm diameter som lett ble samplet under nekropsi. Av og til hadde rotter enda større metastaser på opptil 10 mm i diameter. Det er viktig å implantere UMR106-celler med lavt passasjenummer, da studiene viste at cellene med 10 eller høyere passasjenummer blir mer aggressive og metastaser så tidlig som 2-3 uker etter implantasjon. Årsaken til naturen er ikke kjent, men spekulasjonene er at cellene i kulturen kan utvikle mutasjoner som favoriserer metastase.
I tillegg til amputasjonsoperasjonen inkluderte en annen raffinement av metodene røntgenavbildning for tumorovervåking eller ved nekropsi. Denne metoden gjør det mulig for forskeren å bekrefte beinsvulstinvasjon hos rotter under anestesi. Planarradiografimetoden kan også brukes på nylig amputerte lemmer eller formalin faste lemmer. Metoden er rask (5 min per rotte) og billig ($ 2-5 / rotte) sammenlignet med beregnet tomografi (CT). For in vivo-overvåking krever det at rottene blir bedøvet under avbildning. Figur 3 viser den detaljerte morfologien sett ved røntgenavbildning av to tidligere amputerte lemmer. Denne metoden belyser den osteolytiske og osteoblastiske naturen til disse svulstene. Legg merke til forstyrrelsen av normal ben kortikal arkitektur av tibia og fibula i begge eksemplene (hvite piler). Figur 4 illustrerer den radiografiske morfologien til lunger med og uten metastaser. Avbildning ved røntgen kan raskt avsløre for laboratoriet, behovet for eutanasi for å forhindre unødvendige spontane dødsfall.
Primære og metastatiske svulster til lungen er histologisk lik menneskelig OS som viser både osteolytisk og osteoblastisk tumormorfologi. I rotteoperativsystemet er både osteolytisk og osteoblastisk tumormorfologi bekreftet av histopatologi av amputert lem i figur 5 og figur 6. Legg merke til at det kortikale beinet er fraværende i dette eksemplet, og det tilstøtende beinet erstattes eller forsterkes også av nytt vevd bein (eksostoser) som er orientert vinkelrett på den eksisterende akselen av cortex. Øyer med umoden osteoid (amorf ekstracellulært materiale) er vist i tumoreksemplet. I tillegg er den mikroskopiske morfologien til lungemetastasene, noen med mineralisert bein og tumorvaskulære emboli vist i figur 7.
Lem amputasjon med OS øker overlevelsen hos rotter. Rotter kan dø spontant på grunn av lungemetastase som er plassert i mer enn 7 uker etter implantasjon. Bruk av amputasjon kan tillate videre undersøkelse av standard eller målrettet kreftbehandling i denne modellen. Forlenge tiden mellom tumorimplantasjon og amputasjon vil øke forekomsten av metastase.
Doxorubicin er et kjemoterapeutisk middel som brukes til å behandle OS hos mennesker. Hos rotter kan doksorubicin gis via jugulære injeksjoner13 eller et kateter15 som beskrevet her. Jugularinjeksjonen krever 5-10 min per rotte, men sikrer levering av dosen i den eksponerte venen. Totalt sett er jugulære injeksjoner mye mer reproduserbare sammenlignet med rottehaleveneinjeksjoner. Hvis doksorubicin lekker inn i dermis under hale vene injeksjoner, nekrose i halen kan oppstå og forhindre ytterligere behandlinger. I denne studien ble fem rotter behandlet med 2 mg/kg dose doksorubicin og euthanized 48 h postinjeksjon for å undersøke celledød i svulstene som vist i figur 5A,B.
Fem kontrollrotter behandlet med saltvann ble også evaluert for å velge antistoffer som kan brukes til å immunoppnå immunceller i rotte-OSer. Her ble to antistoffer testet for immunreaktivitet. For immunhiistokjemistudier ble svulster festet i formalin i 48-72 timer og deretter flyttet til 70% etanol for å redusere protein krysskobling som forekommer i formalin. Immunhiistokjemi ble utført for immuncelleinfiltraringer i primære OS-svulster og immunostert for makrofager (CD68) og T-celler (CD3). Figur 8 viser to eksempler på immunflekker av immuncelleinfiltrerer i tumormikromiljøet.
De potensielle målene for terapeutisk intervensjon ble også utforsket. Etter amputasjon av lemmer med svulster ble rotte OS-prøver frosset for fremtidig proteinisolasjon. I denne studien oppdaget vi at UMR106-celler uttrykker ErbB-familiens veiproteiner. Vestlige flekker utført på UMR106 celleproteinlysater demonstrerer uttrykket av ErbB2, EGFR, ErbB4 og andre proteiner som samhandler med disse banene (Figur 9).
Figur 1: Tibia med tumorimplantasjonsnål satt inn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tibia under amputasjonsprosedyren med huden fjernet (A), eksponert lårarterie og vene (B), med muskel forhøyet fra lårbenet (C), og hos en rotte 3 uker etter amputasjonskirurgi (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Røntgenradiograf av høyre ben etter amputasjon (ex vivo) fra to rotter med OS. Legg merke til svulstens osteolytiske og osteoblastiske natur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Røntgenbilder av rotte lungene. (A) uten lungemetastaser. (B) med OS lungemetastase. (C) korrelasjon til grov patologi av metastaser i en oppblåst lunge. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: (A) Histopatologi av OS med 90% av cellene som viser celledød i tibiasvulsten 48 timer etter en dose på 2 mg / kg doksorubicin. (B) Tumorcelledød (pil) i tibial primær os ved 48 timer etter en dose på 2mg/kg doksorubicin. Legg merke til at øverste høyre og venstre hjørne har levedyktige celler. (C) OS invasjon i kortikale bein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: (A) Histopatologi av OS som har erstattet benmargscellene og infiltrert i tibiaens kortikaler. Legg merke til den ledsagede reaktive nye beinveksten da den er lagdelt utenfor og vinkelrett på den eksisterende cortexen. (B) Høyere effektundersøkelse av OS tumorceller ved siden av en øy av bein. (C) Høyere effekt undersøkelse av OS celler innebygd i rosa til blå ekstracellulær matrise (osteoid). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: (A) Flere lungemetastaser hos rotte med tibia tumorimplantasjon. (B) Tumor OS celler i en embolus i små lungearterie gren fartøy ved siden av en bronkiol under fartøyet. (C) Noen lungemetastaser inneholder øyer med bein, mens andre metastaser er mer cellulære. (D) Høyere kraft av metastaser med OS-celler blanding med øyer av mineralisert bein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Immunhistokjemi av (A) CD68 immunstainende makrofager og (B) immunsende T-celler som viser CD3-positive celler i operativsystemet i tibia. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: ErbB-baneproteiner uttrykt i UMR106 OS-celler fra tibiatumorer. Lysater fra primære svulster ble undersøkt for proteinuttrykk fra ErbB-familiens signaltransduksjonsvei, inkludert ErbB2, EGFR, ErbB4, AKT, ERK1/2 og β2-adrenerge reseptorer med aktin som lastekontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rotter med OS-tibiale implantater utvikler målbare svulster med 3 uker etter implantasjon. Hvis lemmer med svulster amputeres 3 uker etter implantasjon, reduseres forekomsten av lungemetastase betydelig. OSer er både osteolytiske og osteoblastiske. Rotter uten amputasjon utvikler lungemetastaser som er flere og variably størrelse, observert ved radiografi eller ved nekropsi med 7 uker etter implantasjon. EGFR, ErbB2 og ErbB4 uttrykkes i rotte UMR106 OS, lik menneskelig OS16,17,18. CD3 T-celler og makrofager oppdages lett i operativsystemet ved hjelp av immunhiistokjemiske metoder. Jugular vene injeksjoner er foretrukket å hale vene for levering av kjemoterapi doxorubicin, et stoff gitt til OS-pasienter. Metoden beskrevet her er en komplett coxofemoral amputasjon. Denne prosedyren er en raffinement og kan vurderes å erstatte svulsten som fjerner kirurgisk metode (lår osteotomi) hvor beinet er kuttet og etterlater en stubbe for pasienten8. Studien antyder en fullstendig fjerning av lemmer for å redusere sannsynligheten for postkirurgiske smerter og komplikasjoner.
Det finnes en rekke kritiske trinn i denne protokollen. For det første er det viktig å merke seg passasjen av tumorceller og å bruke lavere passasje av celler for studiene for å holde modellen konsistent fra eksperiment til eksperiment. De eldre passasjecellene blir mer aggressive med tiden i kulturen. For det andre, ved hjelp av nålen av passende størrelse og Hamilton sprøyten vil bidra til å injisere cellene i tibia på et svært lite volum på 20 μL, et volum bestemt som optimalt og forårsaket ikke lekkasje. For det tredje må kirurgen i utgangspunktet praktisere disarticulation når du gjør nekropsier på lignende eldre rotter for å lære mekanikken i prosedyren. For det fjerde, for suksessen med amputasjon, opprettholde termoregulering og begrense operasjonstiden. En erfaren kirurg kan fullføre amputasjonen på 15 min.
Det ble observert at implantation av celler i tibia sterkt forbedret når en større bore nål ble brukt til å gjøre den første åpningen etterfulgt av innsetting av en mindre bore Hamilton sprøyte nål. Dette beskytter Hamilton-sprøyten mot brudd og sløving over tid. Hamilton sprøyter kan ha volumer så små som 10 μL. 1 ml tuberkulin sprøyter ville ikke være nøyaktig nok til implantasjon av 20 μL. Den samme Hamilton-sprøyten ble brukt til alle rotter implantert på en dag, men ble vasket mellom de kirurgiske prosedyrene til hver rotte. Unngå autoklavering av Hamilton sprøyte sprøyter som de er utsatt for brudd. På slutten av prosedyren, vask den med saltvann (10 ganger) og deretter med 100% etanol (10 ganger) og la den tørke med stempel fjernet for å lagre.
Hud og subkutane suturer ble opprinnelig brukt til å lukke snittet, men en rotte ble funnet med dehiscence dagen etter operasjonen. Bruken av sårklemmer og kirurgisk lim for å lukke snittet forbedret metoden. Med denne raffinementet hadde ingen andre rotter noen slik komplikasjon etter operasjonen. Inkluderingen av lungenes radiografi ved røntgen foredler denne modellen for å demonstrere lungemetastase hos rotter som tillater eutanasi som er rettidig og forhindrer uventede dødsfall. Røntgenbilder lar oss bestemme den osteolytiske og osteoblastiske naturen til disse rotte-OSene, som ligner på menneskelige operativsystemer.
Et moderat nivå av kirurgisk kompetanse er nødvendig for å utføre amputasjonsprosedyren. Det vanskeligste trinnet er disseksjonen i muskulaturen for å finne coxofemoralleddet. Forstørrelse og god belysning er viktig i dette trinnet. Kirurgisk kompetanse kan oppnås med praksis på dyr som har blitt euthanized. Etter ca 10 rotter bør kirurgen være trygg på å amputere en lem med OS fra en levende rotte under anestesi.
Eksisterende metoder for å fjerne lemmer med sarkomer hos mus og rotter er basert på å fjerne tibia ved å kutte lårbenet og muskulaturen midt i akselen og forlate stubben8. Selv om dette kan være nyttig for noen undersøkelser, ble fullstendig benfjerning i denne studien forsøkt. Prosedyren ble funnet å være tilfredsstillende og tilbød ingen postkirurgiske komplikasjoner. Hos rotter med bakre lemstump kan det være mer postkirurgisk hud, muskel eller nervesmerter. Etterlater en stubbe, rotter kunne nå rundt og få tilgang til operasjonsstedet. Rotter gjør det veldig bra etter amputasjon og ambulate godt i buret med ett bakben.
Fordeler med full lem amputasjon inkluderer å fjerne den primære svulsten før den blir for stor og smertefull for rotten. Viktig, fjerning av den primære svulsten vil bidra til å kontrollere primær tumormetastase til lungen. Rotter med amputasjon kan studeres videre for å teste effekten av nye terapeutiske behandlinger på sirkulerende tumorceller i blodet eller i mikrometastasene i kapillærer i lungene eller andre bein.
Det er et betydelig behov for utvikling av nye kreftterapeutiske behandlinger for OS og andre sarkomer, spesielt terapeutiske stoffer som har legemiddelaktivitet mot metastatisk progresjon. Sammenlignet med de nye terapeutiske er utviklet for andre kreftformer, har terapeutiske stoffer for OS dessverre ikke utviklet seg på mange tiår. Som svar på dette problemet innkalte et møte med sentrale ledere og eksperter i OS og metastase for å utvikle retningslinjer for forbedret OS-narkotikautvikling19. I henhold til panelets forslag ble det utarbeidet studier for å forbedre rotte preklinisk modell, en mindre kjent modell av OS. Oppsummert foredler amputasjon og avbildning rotte preklinisk modell for videre bruk av sarkomforskningssamfunnet. Amputasjonsprosedyren vil muliggjøre forbedret pasientoverlevelse i flere måneder, noe som muliggjør evaluering av effekt av nye behandlinger på mikrometastaser eller sovende svulster eller for å teste for toksisitet av behandlinger med en modell med bedre levetid.
Oppsummert gir vi fordelen av denne OS-modellen. Immunokogene SD-utrangerte rotter brukes til å gi en syngeneisk modell med implantert UMR106 OS-cellelinje isolert fra et SD-rotteoperativsystem. Den primære og metastatiske svulsten er histologisk lik OS hos mennesker. Juvenile hann- og hunnrotter brukes til UMR106 tumorimplantasjonsstudier som modellerer pediatrisk sarkom. Ortotopisk plassering av implanterte celler gjøres direkte inn i tibia for et relevant tumormikromiljø. Den primære svulsten metastaser til lungen, og metastasene kan overvåkes ved in vivo-avbildning med røntgenmetode. Rotteoperativsystemet uttrykker proteiner til felles med menneskelig OS, for eksempel ErbB2. Sammenlignet med hunden OS, tillater rottemodell at større antall dyr kan brukes samtidig. Rotter er 10 ganger større enn mus for enkel tibial injeksjoner, kirurgi, avbildning, blodtrekninger og biopsi. Levetiden til rotter er mer sikret med amputasjon, og denne modellen kan kombinere neoadjuvant terapi, amputasjon og adjuvant terapi som muliggjør forbedret pasientoverlevelse, noe som muliggjør evaluering av effekt av behandlinger på mikrometastaser eller sovende svulster. Off target toksisitetsevaluering kan også vurderes i denne modellen der rotter kan behandles med kreftterapeutisk som doksorubicin og overvåkes på lang sikt for doksorubicinindusert hjertetoksisitet eller tilbakefall av operativsystemet. Dette vil tillate testing av kardiobeskyttelsesmidler i en modell med OS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen avsløring å deklarere.
Acknowledgments
NIH-midler gjennom National Cancer Institute, stipend # CA228582. Shun Ishiyama mottar for tiden et stipend fra Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
- Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B.
- Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P.
- Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271 (2012).
- Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
- Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
- Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
- Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
- Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
- Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
- Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
- Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
- Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).
