Summary
Her beskrives en syngeneisk ortotopisk implantation efterfulgt af en amputationsprocedure af osteosarcoma med spontan lungemetomatase, der kan bruges til præklinisk undersøgelse af metastasebiologi og udvikling af nye terapier.
Abstract
Det seneste fremskridt i behandlingen af osteosarcoma (OS) fandt sted i 1980'erne, hvor multi-agent kemoterapi viste sig at forbedre den samlede overlevelse i forhold til kirurgi alene. For at løse dette problem, formålet med undersøgelsen er at forfine en mindre kendt model af OS i rotter med en omfattende histologi, billeddannelse, biologisk, implantation, og amputation kirurgisk tilgang, der forlænger overlevelse. Vi brugte en immunkompetent, udkonkurreret Sprague-Dawley (SD), syngeneic rotte model med implanteret UMR106 OS celle linje (stammer fra en SD rotte) med ortotopiske tibiale tumor implantater i 3-uger gamle mandlige og kvindelige rotter til model pædiatrisk OS. Vi fandt, at rotter udvikler reproducerbare primære og metastatiske lungetumorer, og at lemmer amputationer på 3 uger efter implantation reducere forekomsten af lungemetaser og forhindre uventede dødsfald. Histologisk, den primære og metastatiske OSs hos rotter var meget lig human OS. Ved hjælp af immunohistochemistry metoder, undersøgelsen viser, at rotte OS er infiltreret med makrofager og T-celler. En proteinekspression undersøgelse af OS celler afslører, at disse tumorer udtrykke ErbB familie kinases. Da disse kinaser også er stærkt udtrykt i de fleste menneskelige OS'er, kan denne rottemodel bruges til at teste ErbB-stihæmmere til terapi.
Introduction
Osteosarcoma (OS) er den mest almindelige primære knogletumor hos børn, unge og unge voksne. Det seneste fremskridt i behandlingen af OS fandt sted i 1980'erne, hvor kemoterapi med flere agenter viste sig at forbedre den samlede overlevelse sammenlignet med kirurgi alene1. OS udvikler sig under hurtig knoglevækst, typisk forekommer i lange rørformede knogler såsom lårben, skinneben, og humerus. De er karakteriseret ved en osteolytisk, osteoblastisk eller blandet udseende med bemærkelsesværdig periosteal reaktion2. Kemoterapi og kirurgisk resektion kan forbedre resultatet for patienter med en 5-årig overlevelse for 65% af patienterne2,3. Desværre, høj kvalitet OS patienter med metastatisk sygdom har 20% overlevelse. OS invaderer regionalt og metastaserer primært til lungerne eller andre knogler og er mere udbredt hos mænd. Det mest overbevisende behov for disse unge patienter er en ny terapi, der forhindrer og eliminerer levedygtigheden af fjerne metastaser.
OS prækliniske modeller er blevet gennemgået4,5,6,7 og få tilgængelige immunkompetente modeller ved hjælp af amputation af orthotopic OS er blevet udviklet. I 2000 blev der udviklet en vigtig model ved hjælp af BALB/c mus med ortotopisk syngeneic OS og amputation8. Sammenlignet med denne musemodel er rottemodellen baseret på genetisk udavlede og 10 gange større dyr, hvilket fører til nogle fordele. Rotten UMR106 model blev udviklet fra en 32P induceret OS i en Sprague Dawley (SD) rotte, som blev afledt i en celle linje9. I 2001 blev ortotopisk implantation af UMR106-01 først beskrevet i implanterede skinneben af athymiske mus med hurtig, konsekvent primær tumorudvikling og radiologiske, histologiske træk til fælles med OS hos mennesker. Lungemetastaser udviklet og var afhængige af ortotopisk placering af UMR106 i knoglen mikromiljø10. I 2009 etablerede Yu et al.11 en reproducerbar ortotopisk lårben OS rotte model ved hjælp af UMR106 celler i større mandlige SD rotter. Den vellykkede tumorimplantatationer og lungemetastaserate hos rotter uden amputation lignede de data, der præsenteres her. I denne undersøgelse, en ekstra amputation til modellen ved hjælp af unge rotter blev udført, hvilket tydede på, at timingen af primære tumor fjernelse er afgørende for modellering OS, især relateret til metastatisk progression. Med denne raffinement forbedrer amputation og in vivo imaging denne model for prækliniske undersøgelser til ny lægemiddelvurdering for OS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer og forsøg med rotter blev udført i henhold til protokoller godkendt af Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. SD rotte OS celle linje UMR-106 celle kultur protokol
- Vokse celler i DMEM, suppleret med 10% (v/v) FBS, penicillin (10 U/mL)-streptomycin (10 U/mL) ved 37 °C i befugtet 5% CO2 atmosfære. Udføre eksperimenter ved hjælp af celler med passager på 2-812.
2. Intratibial injektion af OS celler protokol
BEMÆRK: Tidsparrede gravide SD-rotter føder i dyreanlægget, og ved 3 uger anvendes kuld (da UMR 106 cellelinje er syngeneisk for SD-rotter, er der ikke behov for bestråling).
- Induktion
- Placer rotten i et mellemstort induktionskammer og fremkalde anæstesi med 2%-3% isoflurane. Overvåg dyret kontinuerligt for dybden af anæstesi ved refleks til tå knivspids, åndedrætsfrekvens, og karakter.
- Sæt næsen ind i næsesn. Fastgør med tape, hvis det er nødvendigt.
- Fjern håret på højre ben op til ventral og ryg underlivet med klippere eller brug depilatory agent. Placer rotten i en liggende position.
- Skrub det kirurgiske område aseptisk ved hjælp af 70% ethanol og fortynd chlorhexidinacetat eller fortyndet betadin. Begynd omkring knæområdet og skrub i en cirkulær bevægelse både proximally og distally. Gentag dette trin tre gange. Ingen drapering anvendes til tumor implantation.
- Påfør øjensmøremiddel i begge rottens øjne for at forhindre hornhindetørring forårsaget af anæstesi. Placer rotten på en lav varme indstilling varmepude. Sørg for, at rotten har normal kropstemperatur (37 °C) og normal åndedrætsfrekvens.
- Kirurgi
- Tænd isoflurane ved ~1,5%-2% (til vedligeholdelse). Sørg for, at dyret er på et passende anæstesi på grund af mangel på en tåspidsrefleks. Hvis ikke, skal isofluraneprocenten øges til 2,5 %.
- Marker en steril nål (ca. 22 G) ved 10 mm fra spidsen for at få vejledning af dybde til at indsætte.
- Sæt nålen 10 mm ned i skinnebenets diafyse ved at indtaste det bøjede knæ midt på det tibiale plateau, der strækker nålen gennem metafysen ind i diafysen ved hjælp af en let borelignende bevægelse for at lave en åbning. Tag nålen af.
- Læg celleaffjedringen i Hamilton-sprøjten umiddelbart før injektion i skinnebenet. For at gøre dette blandes cellerne forsigtigt, før du trækker ind i sprøjten, da tyngdekraften får cellerne til at bosætte sig i bunden af røret.
BEMÆRK: Celler kan opbevares i et 1,5 til 2 mL rør (ved stuetemperatur), før de trækkes ind i Hamilton-sprøjten (100 μL) efter omhyggelig blanding. Celler kan opbevares ved stuetemperatur i 2-3 timer under implantationsproceduren. Kontroller altid cellernes celle levedygtighed i røret før og derefter efter implantationssessionen. Trypan blå udelukkelse er den nemmeste metode til celle levedygtighed vurdering. - Når knoglen er krydset med den første nål, skal du indsætte en anden kanyle med mindre diameter, der også er markeret ved 10 mm) nål fastgjort til 100 μL Hamilton-sprøjten fyldt med celler. Sørg for at sætte nålen op til 10 mm mærket i det samme hul, der strækker sig ind i diafysen.
- Udled forsigtigt 20 μL af 75.000 OS-celler suspension i PBS i diaphysis og marv hulrum.
BEMÆRK: Nålen må ikke slingre i knoglen og skal føles sikker. Hvis nålen let bevæger sig, kan cortex have været krydset ved diafysen. Gentag indsættelsen igen for at få en fastere placering før injektion af celler. - Fjern Hamilton nålen fra knoglen.
BEMÆRK: Hvis der dannes en lille dråbe blod, skal du anvende let tryk. Hvis klar væske dråbe former på punkteringsstedet, nålen kan ikke have været udvidet langt nok i knoglen og tumor celle suspension kan have lækket tilbage gennem hullet. Optag dette i noterne, men generelt, tumor implantation vil blive en succes. Med erfaring, tumor implantation procedure bør tage 5 min pr rotte. Med erfaring, tumor implantation af celler i knoglen vil blive lettere. Utilsigtet injektion af celler i musklen omkring knoglen, kan ikke føre til tumor mikromiljø er nødvendig for lungemetassis.
- Opsving
- Sørg for, at rotten er normtermisk. Placer rotten i et bur med en varmepude placeret under buret til genopretning.
- Efter at være helt vågen, mobil og vejrtrækning godt, injicere rotterne med Buprenorphin (1,0-1,2 mg /kg SC).
BEMÆRK: For at få adgang til Buprenorphine skal du kontakte institutionen for at se muligheder for godkendelse gennem veterinærpersonalet for at afgive ordren. - Flyt rotterne tilbage for at rense bure og overvåge en gang om dagen, hver uge.
3. Måling og overvågning
- Mål tumorstørrelsen 9-10 dage efter implantation og derefter hver 2. dag indtil 3 uger efter implantation for at etablere en vækstrate. Mål den maksimale diameter af skinnebenet ved hjælp af en elektronisk eller manuel kaliber. Gem dataene i et regneark med en formel til beregning af tumorvolumen. Mål det kontralaterale (ikke implanterede skinneben) som baseline.
BEMÆRK: De implanterede hindlimb diametre bruges som surrogat for tumor størrelse. Bagbenene måles vinkelret på skinnebenets lange akse ved den største diameter til to målinger, ventral/dorsal og medier/laterale på lemmerne. Den anslåede tumorvolumen beregnes ved formel11: Tumorvolumen (mm3) = største diameter (mm) x mindste diameter (mm)2/2. - Overvej rotter for overlevelse amputation eller kemoterapi behandling, når tumorer tilgang 15 mm i den største dimension eller 3 uger efter tumor implantation. Den kontralaterale lemmer måler ca. 7-9 mm hos de fleste rotter i denne alder.
4. Doxorubicin intravenøs administration
- Bedøve rotterne med 2% isoflurane. Forbered huden over halsvenen med tre kirurgiske vasker ved hjælp af betadin og alkohol som beskrevet13.
- Under omhyggelig dissektion visualisere højre eller venstre halspulsåre. Indsæt nålen i den overlying muskel og derefter direkte mod rottens hoved i halsvenen lumen som det visualiseres i halspulsåren forreste til pectoralis muskel.
- Når nålen er indsat i halsvenen, skal du forsigtigt trække blod ind i sprøjten for at sikre korrekt indsættelse. Det er muligt at tro, at nålen er gennem venen, men nålen er under venen og ikke i lumen. Hvis halsvenen bliver for lille til injektioner, når stump dissekering til at udsætte halsvenen, skal du bruge den anden halsvene til injektionen.
- Indsprøjt doxorubicin (2 mg/kg) langsomt over 1 min i et volumen på 100-150 μL. Opløsningen kan visualiseres intravenøst i halsvenen under fødslen.
- Indsprøjt lignende mængder af normal saltvand i kontrolrotter.
- Fjern nålen og tryk forsigtigt på venen med en steril gaze.
- Luk hudsnittet ved hjælp af 3-4 sårklip. Fjern clipsene ved 7-10 dage efter injektionen.
BEMÆRK: Rotter forsøger normalt ikke at fjerne metalclips, men vil bide og fjerne suturer. Den halspulsåre injektionsmetode er at foretrække frem for hale vene injektioner for doxorubicin da ethvert lægemiddel, der lækker uden for fartøjet forårsager nekrose i halen, der kan kræve hale amputation.
5. Hind lemmer amputation protokol
- Induktion
- Placer rotten i et mellemstort induktionskammer og fremkalde anæstesi med 2%-4% isoflurane. Overvåg rotten kontinuerligt for dybden af anæstesi.
BEMÆRK: Induktionskammeret skylles til en kulbeholder, og alle andre gasser fjernes af et nedtræksbord, der bruges til kirurgi. - Sæt næsen i en næsekone. Fastgør med tape, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Denne procedure udføres på et bord med nedtræk for at skylle overskydende flygtige gasser (dvs. isofluran). - Fjern håret på højre ben op til ventral og ryg underlivet med klippere eller brug depilatory agent. Placer rotten i en liggende position.
- Skrub det kirurgiske område aseptisk ved hjælp af 70% ethanol og fortynd chlorhexidinacetat eller fortyndet betadin. Forbered huden til kirurgi fra midten af kalven til hudområdet lige over hofteleddet i højre underliv. Skrub benet proksimalt og det distale område omkredsligt. Gentag dette trin tre gange.
- Påfør øjensmøremidlet i begge rottens øjne. Sørg for, at rotten har normal kropstemperatur (37 °C) og normale vitale tegn. Overvåg og regulere kropstemperaturen ved hjælp af en varmepude, der er tilsluttet en rektal temperatursondemonitor.
- Placer rotten i et mellemstort induktionskammer og fremkalde anæstesi med 2%-4% isoflurane. Overvåg rotten kontinuerligt for dybden af anæstesi.
- Kirurgi
- Tænd isoflurane ved 1,5%-3% (vedligeholdelse). Monitor for bedøvelse dybde, herunder reaktion på tå knivspids, åndedrætsfrekvens, og karakter. Juster isofluraen efter behov for at opretholde et passende anæstesiplan.
BEMÆRK: Åndedrætsfrekvensen under bedøvelse bør være mellem 50-100 vejrtrækninger i minuttet. Dybe, sjældne vejrtrækninger er et tegn på, at rotten er for dybt bedøvet. - Åbn sterile instrumentpakker og gardiner og don sterile handsker. Sørg for at opretholde sterilitet gennem procedurens varighed. Grundlæggende sterile kirurgiske instrumenter er nødvendige omfatter, skalpel blade indehaveren, sammenkædninger, hæmostats, nål indehaveren, saks, og sår klip applier.
- Træk rottens ben gennem udluftningen af den sterile kirurgiske drapering. Sørg for, at dyret er på et passende anæstesi via tå-knivspids refleks.
- Brug en skalpelblad eller kirurgisk saks, lav et omskåret, kutant snit bare proksimale til kvæle (knæleddet).
- Deglove bagbenet ved hjælp af gaze eller stump dissektion til at udsætte lårpulsåren og venen på den ventrale-mediale overflade af bagbenet.
- Ligate fartøjerne ved hjælp af 4-0 absorberbare suturer på niveau med midten af lårbenet og transect distally.
- Fastgør venen distally for at reducere lækage under muskel dissektion.
BEMÆRK: Circumferential muskulatur vil blive transected distal til niveauet af lårpulsåren kar ligation og muskler forhøjet fra lårbenet til niveauet af coxofemoral fælles. - Ved hjælp af stump dissektion bortføre hofteleddet med lateral udadgående rotation.
- Find lårbenets hoved og disarticulate det fra acetabulum. Skær eventuelle resterende væv holde benet fastgjort til kroppen.
- Giv en stænkblok til acetabulum og iskiasnerven med ca. 6 mg/kg Ropivacain.
- Luk muskulaturen over acetabulum ved hjælp af en simpel afbrudt sutur (4-0, absorberelig sutur).
BEMÆRK: Yderligere 0,5% bupivacain eller lidokain (0,15-0,2 mg i alt) kan injiceres flere steder langs det lukkede muskellag (lokal infiltration /splash block). - Mod og luk kanterne af huden ved hjælp af sår klip placeret fra hinanden hver 5-10 mm.
- Tænd isoflurane ved 1,5%-3% (vedligeholdelse). Monitor for bedøvelse dybde, herunder reaktion på tå knivspids, åndedrætsfrekvens, og karakter. Juster isofluraen efter behov for at opretholde et passende anæstesiplan.
- Opsving
- Placer rotten i et rent genopretningsbur med varmestøtte ved hjælp af en varmepude placeret under buret.
BEMÆRK: For at undgå hypertermi må varmepuden ikke være i direkte kontakt med dyret og må ikke overstige 40 °C. - Overvåg dyret, indtil det er helt genoprettet og er normtermisk (37,5-39 °C).
BEMÆRK: Dyret må ikke efterlades uden opsyn, før det er fuldt bevidst og strengt liggende og bevæger sig let rundt i buret. - Efter at være helt vågen, mobil og vejrtrækning godt, injicere rotterne med Buprenorphin (1,0-1,2 mg /kg SC).
BEMÆRK: At give Buprenorphin i en bedøvet rotte kan forringe genopretningen. - Giv 10 mL varm lakteret Ringers opløsning subkutant mellem skulderbladene.
- Flyt rotterne tilbage til det rene bur og genforenes med medspecificer.
- Overvåg alle dyrene to gange dagligt i den næste måned for tegn på smerte og angst, herunder piloerection, bøjet kropsholdning, eller utilsigtede eller tegn på snit site infektion, herunder erytem, purulent udledning, eller sår dehiscence.
BEMÆRK: Til dato har vi ikke observeret kliniske tegn (såsom infektioner) efter postoperativ genopretning hos nogen af dyrene. Kun en rotte havde en dehiscence med suturer, hvorefter sår klip blev brugt til at lukke sår uden yderligere problemer. - Administrere buprenorphin eller meloxicam til dyr, der præsenterer kliniske tegn på smerte ved offentliggjorte doser i samråd med en laboratoriedyre dyrlæge.
- Administrere antibiotika (dvs. cephalosporin) til dyr, der præsenterer kliniske tegn på smerte ved offentliggjorte doser i samråd med en laboratoriedyre dyrlæge.
BEMÆRK: Alle dyr, der udviser langvarige tegn på smerte eller angst, og som ikke forbedres med smertestillende midler eller dyr, der udviser tegn på infektion, der ikke reagerer på antibiotika, skal aflives humant.
- Placer rotten i et rent genopretningsbur med varmestøtte ved hjælp af en varmepude placeret under buret.
6. Billedbehandling med røntgen
- Efter tumorimplantation, billede skinnebenet og lungerne ikke-invasivt at opdage tumorvækst ved hjælp af X-ray med en maskine designet til gnavere.
- Bedøve rotterne som tidligere gjort.
- Tag billeder ved 3x forstørrelse for 6 s ved 25 kV.
- Behandl filmen ved hjælp af røntgenprocessoren. Røntgenbilleder kan også scannes digitalt.
7. Obduktionsprocedure
- Afliv rotterne med CO2. Bekræft døden på grund af manglende hjerteslag, og træk straks 3 ML-blod ud af hjertet til serum- eller plasmaprøver.
- Åbn brystkassen og maven til undersøgelse.
- Isoler luftrøret og kanyt med et (18 G) kateter. For at sikre kateteret i luftrøret skal du binde en silke sutur omkring både luftrøret med kateteret.
- Tilslut infusionkatetret til en 3 eller 5 mL sprøjte. Indgyde formalin eller saltvand til forsigtigt at puste lungelapperne for bedre histologiprøver. Ved infusion vil lungerne puste op og muliggøre en bedre visualisering af lungemetastaser.
- Undersøge, dissekere, og veje alle de udvalgte bryst-og maveorganer (såsom lever, nyrer).
- Fix organerne i formalin for histopatologi eller fryse på tøris, 2-methylbutan, eller flydende nitrogen.
- Til evaluering af proteinudtryk ved hjælp af western blot, lav lysater af frosset væv. Antistoffer, der reagerer med rottevæv, er detaljerede13.
8. Immunohistochemistry
- Behandl det primære OS-væv, indlejr i paraffin, og afsnit det for immunohistokemisk farvning.
- Hent antigen efter deparaffinering ved hjælp af citratbuffer (pH 6.0). Inkuberes i 0,3% H2O2 i methanol i 30 min for at slukke endogen peroxidase.
- Bloker de 5 μm tykke paraffin sektioner ved hjælp af normal serum.
- Inkuberes med primære anti-CD68- og CD3-antistoffer (se tabellen) natten over ved 4 °C.
- Skyl sektionerne i PBS og inkuber dem i HRP polymer ved hjælp af et detektionssæt.
BEMÆRK: Immunstainning blev udviklet med diaminobenzidin som kromoogen.
9. Vestlige blotting
- Lyse UMR-106 cellerne i 200-300 μL lysis buffer14 til at udføre standard gel elektroforese og vestlige blotting.
- Brug 4% til 12% Bis-Tris geler.
- Inkuberes i anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actin eller anti-mouse β2-AR primært antistof (se tabel) og peberrod peroxidase-forbundet sekundært antistof.
- Tilsæt det chemiluminescerende substrat. Udsæt membranerne for røntgenfilm.
BEMÆRK: β-actin niveauer bruges som lastning kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunkompetente SD-udavlede rotter anvendes til disse OS-undersøgelser, som tilbyder en dyremodel med et intakt immunsystem. Vi har brugt UMR106 cellelinjen fra ATCC, udviklet fra celler, der oprindeligt blev isoleret fra et OPERATIVSYSTEM fra en SD rotte. Vi implanterede cellerne i SD-rotter og giver dermed en syngeneisk model til OS. UMR106-celler implanteres i skinnebenet hos 3 uger gamle han- og hun-SD-rotter, der simulerer en pædiatrisk OS-model. Desuden giver den ortotopiske implantation af UMR106-celler direkte i skinnebenets metafyse/diafyse et relevant tumormikromiljø.
Ved implantering af tumorceller skal en nål indsættes korrekt gennem tibialplateauet (Figur 1) i den korrekte vinkel (parallelt med knogleakslen), der strækker nålespidsen ca. 10 mm ind i knoglens centrale hulrum. Med denne procedure udviklede 95% (52/55) af rotter tumorer i skinneben distale til knæet. Med tibiel injektion erfaring, 100% af rotter udviklet tumorer. I en gruppe rotter, der ikke blev amputeret, var de gennemsnitlige tumormængder hos mænd 504 mm3 ved 3 uger og 1195 mm3 ved 5 uger efter implantation. Hos kvinder, tumor mængder gennemsnit på 285 mm3 på 3 uger og 495 mm3 på 5 uger efter implantation.
To kohorter af rotter blev sammenlignet, herunder rotter med amputation (23 rotter) (figur 2) og rotter uden amputation (29 rotter). Begge kohorter blev aflivet på 7 uger efter implantation til at undersøge tumor metastaser til lungerne. I amputationsgruppen (3/23) udviklede rotter lungemetastaser. Disse tre rotter døde eller blev aflivet inden for 24 timer efter operationen på grund af post kirurgi komplikationer. To rotter døde af langvarig anæstesi, da kirurgen var ved at lære metoden. En rotte udviklede en dehiscence og blev aflivet den følgende dag. Lunger af disse tre rotter blev evalueret og tre små metastaser (>1 mm) blev fundet histologisk. De overlevende 20 rotter havde ikke lungemetastaser 7 uger efter implantation. Dette indikerede, at 3 uger efter implantation amputationer er tilstrækkelige til at reducere antallet af rotter med lungemetaser. I en anden gruppe på 29 rotter, der ikke havde amputationsproceduren, havde 26/29 rotter lungemetastaser i overensstemmelse med de tidligere offentliggjorte data11. Vi så intet mønster i størrelsen eller antallet af metastaser i disse rotter. De fleste rotter har mere end 10 groft synlige 2-7 mm diameter metastaser, der let blev udtaget under obduktion. Lejlighedsvis havde rotter endnu større metastaser på op til 10 mm i diameter. Det er vigtigt at implantere UMR106-celler med et lavt passagetal, da undersøgelserne viste, at cellerne med 10 eller højere passagetal bliver mere aggressive og metastaserer så tidligt som 2-3 uger efter implantation. Årsagen til naturen er ikke kendt, men spekulationerne er, at cellerne i kulturen kunne udvikle mutationer, der favoriserer metastaser.
Ud over amputation kirurgi, en anden raffinement af metoderne omfattede X-ray imaging for tumor overvågning eller ved obduktion. Denne metode gør det muligt for forskeren at bekræfte knogletumor invasion hos rotter under anæstesi. Planar radiografimetoden kan også bruges på nyligt amputerede lemmer eller formalin faste lemmer. Metoden er hurtig (5 min pr. Rotte) og billig ($ 2-5 / rotte) sammenlignet med computertomografi (CT). Til in vivo-overvågning kræver det, at rotterne bedøves under billeddannelse. Figur 3 viser den detaljerede morfologi set ved røntgenbilleder af to tidligere amputerede lemmer. Denne metode belyser osteolytisk og osteoblastisk karakter af disse tumorer. Bemærk afbrydelsen af normal knogle kortikal arkitektur af skinnebenet og fibula i begge eksempler (hvide pile). Figur 4 illustrerer lungernes radiografiske morfologi med og uden metastaser. Imaging af X-ray kan hurtigt afsløre for laboratoriet, behovet for aktiv dødshjælp for at forhindre unødvendige spontane dødsfald.
Primære og metastatiske tumorer til lungen er histologisk ligner human OS udviser både osteolytisk og osteoblastisk tumor morfologi. I rotte OS, både osteolytisk og osteoblastisk tumor morfologi er bekræftet af histopatologi af amputeret lemmer i figur 5 og figur 6. Bemærk, at kortikalebenet er fraværende i dette eksempel, og den tilstødende knogle erstattes eller befæstes også af nye vævede knogler (exostoses), der er orienteret vinkelret på cortexens eksisterende aksel. Øer af umodne osteoid (amorfe ekstracellulært materiale) er vist inden for tumoreksempel. Derudover er den mikroskopiske morfologi af lungemetasserne, nogle med mineraliseret knogle og tumor vaskulær emboli vist i figur 7.
Limb amputation med OS øger overlevelsen hos rotter. Rotter kan dø spontant på grund af lungemetastase, der er anbragt i mere end 7 uger efter implantation. Brugen af amputation kan gøre det muligt yderligere undersøgelse af standard eller målrettet kræftbehandling i denne model. Forlængelse af tiden mellem tumor implantation og amputation vil øge forekomsten af metastaser.
Doxorubicin er et kemoterapimiddel, der anvendes til behandling af OS hos mennesker. Hos rotter kan doxorubicin gives via halspulsåreninjektioner 13 eller et kateter15 som beskrevet her. Halspulsåren injektion kræver 5-10 min pr rotte, men sikrer levering af dosis i den eksponerede vene. Samlet set kan jugular injektioner er langt mere reproducerbare i forhold til rotte hale vene injektioner. Hvis doxorubicin lækker ind i dermis under hale vene injektioner, nekrose i halen kan forekomme og forhindre yderligere behandlinger. I denne undersøgelse blev fem rotter behandlet med 2 mg/kg dosis doxorubicin og aflivede 48 timer efter injektion for at undersøge celledøden i tumorerne som vist i figur 5A,B.
Fem kontrolrotter behandlet med saltvand blev også evalueret for at vælge antistoffer, der kan bruges til at immunstæmme immunceller i rotte-hormonforstyrrende stoffer. Her blev to antistoffer testet for immunreaktivitet. For immunohistochemistry undersøgelser, tumorer blev fastsat i formalin for 48-72 h og derefter flyttet til 70% ethanol for at reducere protein krydsbinding, der opstår i formalin. Immunohistochemistry blev udført for immuncelleinfiltrerer i primære OS tumorer og immun farves til makrofager (CD68) og T-celler (CD3). Figur 8 viser to eksempler på immunstain af immuncelleinfiltrerer i tumormikromiljøet.
De potentielle mål for terapeutisk intervention blev også undersøgt. Efter amputation af lemmer med tumorer blev rotte OS-prøver frosset til fremtidig proteinisolation. I denne undersøgelse opdagede vi, at UMR106-celler udtrykker ErbB-familievejsproteinerne. Vestlige pletter udført på UMR106 celleproteinlyater demonstrerer udtrykket af ErbB2, EGFR, ErbB4 og andre proteiner, der interagerer med disse veje (Figur 9).
Figur 1: Skinneben med tumor implantation nål indsat.
Figur 2: Skinneben under amputationsprocedure med huden fjernet (A), eksponeret lårpulsåre og vene (B), med muskler forhøjet fra lårbenet (C) og i en rotte 3 uger efter amputationsoperation (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Røntgen røntgen røntgenbillede af højre ben efter amputation (ex vivo) fra to rotter med OS. Bemærk tumorens osteolytiske og osteoblastiske karakter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Røntgenbilleder af rotte lunger. (A) uden lungemetastaser. (B) med OS lungemetaser. (C) korrelation med bruttopatologi af metastaser i en oppustet lunge. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: (A) Histopatologi af OS med 90% af cellerne, der viser celledød i skinnebenet tumor 48 timer efter en dosis på 2 mg/kg doxorubicin. (B) Tumorcelledød (pil) i tibial primær OS ved 48 timer efter en dosis på 2 mg/kg doxorubicin. Bemærk, at øverste højre og venstre hjørne har levedygtige celler. (C) OS invasion i kortikale knogler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: (A) Histopatologi af OS, der har erstattet knoglemarvscellerne og infiltreret i skinnebenets cortices. Bemærk den ledsagede reaktive nye knoglevækst, da den er lagdelt udenfor og vinkelret på den allerede eksisterende cortex. (B) Højere effekt undersøgelse af OS tumorceller støder op til en ø af knogle. (C) Højere effektundersøgelse af OS-celler indlejret i pink til blå ekstracellulær matrix (osteoid). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: (A) Flere lungemetastaser hos rotter med skinnebenstumorimplantatering. (B) Tumor OS celler i en embolus i små lungearterie gren fartøj støder op til en bronkier under fartøjet. (C) Nogle lungemetatastaser indeholder øer af knogler, mens andre metastaser er mere cellulære. (D) Højere effekt af metastaser med OS-celler blandet med øer af mineraliseret knogle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Immunohistochemistry af (A) CD68 immunstaining makrofager og (B) immunstaining T-celler, der viser CD3 positive celler i OS i skinnebenet.
Figur 9: ErbB-pathwayproteiner udtrykt i UMR106 OS-celler fra skinnebenstumorer. Lysater fra primære tumorer blev undersøgt for proteinudtryk fra ErbB-familiesignaltransduktionsvej, herunder ErbB2, EGFR, ErbB4, AKT, ERK1/2 og β2-adrenergic receptorer med actin som belastningskontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rotter med OS tibial implantater udvikle målbare tumorer ved 3 uger efter implantation. Hvis lemmer med tumorer amputeres 3 uger efter implantation, reduceres forekomsten af lungemetastase betydeligt. OS'er er både osteolytiske og osteoblastiske. Rotter uden amputation udvikler lungemetastaser, der er flere og varierende størrelse, observeret ved radiografi eller ved obduktion med 7 uger efter implantation. EGFR, ErbB2 og ErbB4 udtrykkes i rotte UMR106 OS, svarende til human OS16,17,18. CD3 T-celler og makrofager opdages let i OS ved immunhistokemi metoder. Jugular vene injektioner foretrækkes frem for hale vene til levering af kemoterapi doxorubicin, et lægemiddel givet til OS patienter. Den metode, der er beskrevet her, er en komplet coxofemoral amputation. Denne procedure er en raffinement og kunne overvejes at erstatte tumor fjerne kirurgisk metode (lårben osteotomi), hvor knoglen er skåret forlader en stub for patienten8. Undersøgelsen tyder på en fuldstændig fjernelse af lemmer for at reducere sandsynligheden for post-kirurgisk smerte og komplikationer.
Der er en række kritiske trin i denne protokol. For det første er det vigtigt at bemærke passagen af tumorceller og bruge lavere passage af celler til undersøgelserne for at holde modellen konsekvent fra eksperiment til eksperiment. De ældre passageceller bliver mere aggressive med tiden i kulturen. For det andet vil brugen af nålen af passende størrelse og Hamilton-sprøjten hjælpe med korrekt at injicere cellerne i skinnebenet ved et meget lille volumen på 20 μL, et volumen bestemt som optimalt og forårsagede ikke lækage. For det tredje skal kirurgen i første omgang praktisere disartikulation, når de laver obduktioner på lignende alderen rotter for at lære mekanikken i proceduren. For det fjerde, for succes amputation, opretholde termoregulering og begrænse kirurgi tid. En erfaren kirurg kan fuldføre amputationen i 15 min.
Det blev observeret, at implantation af celler i skinnebenet stærkt forbedret, når en større borenål blev brugt til at gøre den indledende åbning efterfulgt af indsættelsen af en mindre boring Hamilton sprøjtenål. Dette beskytter Hamilton sprøjten fra brud og sløvning over tid. Hamilton sprøjter kan have mængder så små som 10 μL. 1 mL tuberkulinsprøjterne ville ikke være nøjagtige nok til implantation af 20 μL. Den samme Hamilton sprøjte blev brugt til alle rotter implanteret på en dag, men blev vasket mellem de kirurgiske procedurer for hver rotte. Undgå autoklave Hamilton sprøjte sprøjter, da de er tilbøjelige til brud. I slutningen af proceduren vaskes det med saltvand (10 gange) og derefter med 100% ethanol (10 gange) og lad det tørre med stemplet fjernet til opbevaring.
Hud og subkutane suturer blev oprindeligt brugt til at lukke snittet, men en rotte blev fundet med dehiscence dagen efter operationen. Brugen af sår klip og kirurgisk lim til at lukke snittet forbedret metoden. Med denne raffinement havde ingen andre rotter en sådan komplikation efter operationen. Inddragelsen af lungernes radiografi ved røntgen forfiner denne model for at demonstrere lungemetastase hos rotter, der giver mulighed for aktiv dødshjælp, der er rettidig og forhindrer uventede dødsfald. Røntgenbilleder giver os mulighed for at bestemme osteolytisk og osteoblastisk karakter af disse rotte-OS'er, svarende til menneskelige OS'er.
Et moderat niveau af kirurgisk ekspertise er nødvendig for at udføre amputationsproceduren. Det sværeste skridt er dissektionen i muskulaturen for at finde coxofemoralleddet. Forstørrelse og god belysning er vigtige i løbet af dette trin. Kirurgisk ekspertise kan opnås med praksis på dyr, der er blevet aflivet. Efter ca. 10 rotter skal kirurgen være sikker på at amputere et lem med OS fra en levende rotte under anæstesi.
Eksisterende metoder til at fjerne lemmer med sarkomer hos mus og rotter er baseret på at fjerne skinnebenet ved at skære lårbenet og muskulaturen midt i akslen og forlade stub8. Selv om, Dette kan være nyttigt for nogle undersøgelser, i denne undersøgelse, den komplette ben fjernelse blev forsøgt. Proceduren viste sig at være tilfredsstillende og tilbød ingen post-kirurgiske komplikationer. Hos rotter med en bagbensstub, der kunne være mere post-kirurgisk hud, muskel, eller nervesmerter. Efter at have efterladt en stub kunne rotter nå rundt og få adgang til operationsstedet. Rotter klarer sig meget godt efter amputation og ambulate godt i buret med en hindlimb.
Fordele ved fuld lemmer amputation omfatter fjernelse af den primære tumor, før det bliver for stor og smertefuldt for rotten. Vigtigere, fjernelse af den primære tumor vil hjælpe med at kontrollere primære tumor metastaser til lungen. Rotter med amputation kan yderligere studeres for at teste effekten af nye terapeutiske på cirkulerende tumorceller i blodet eller i mikromekanik i kapillærer i lungerne eller andre knogler.
Der er et betydeligt behov for udvikling af nye kræftbehandling for OS og andre sarkomer, især therapeutics, der har narkotika aktivitet mod metastatisk progression. Sammenlignet med de nye terapier udviklet til andre kræftformer, har terapi for OS desværre ikke udviklet sig i mange årtier. Som svar på dette problem, et møde mellem centrale ledere og eksperter i OS og metastaser indkaldt til at udvikle retningslinjer for forbedret OS lægemiddeludvikling19. I henhold til panelets forslag blev der sat undersøgelser for at forbedre den prækliniske rottemodel, en mindre kendt model af OS. Sammenfattende, amputation og billeddannelse forfiner rotte præklinisk model til videre brug af sarkom forskning samfund. Amputationsproceduren vil give mulighed for forbedret patientoverlevelse i flere måneder, der muliggør evaluering af effekten af nye behandlinger på mikromekanik eller sovende tumorer eller for at teste for toksicitet af behandlinger med en model med bedre levetid.
Sammenfattende giver vi fordelen ved denne OS-model. Immunkompetente SD-udavlede rotter bruges til at levere en syngeneisk model med implanteret UMR106 OS-cellelinje isoleret fra et SD-rotte-operativsystem. Den primære og metastatiske tumor er histologisk ligner OS hos mennesker. Juvenile mandlige og kvindelige rotter anvendes til UMR106 tumor implantation undersøgelser modellering pædiatriske sarkom. Ortotopisk placering af implanterede celler sker direkte i skinnebenet for en relevant tumor mikromiljø. Den primære tumor metastaserer til lungen og metastaser kan overvåges af in vivo imaging med X-ray metode. Rotte OS udtrykker proteiner til fælles med human OS, såsom ErbB2. Sammenlignet med hunden OS giver rottemodellen mulighed for, at et større antal dyr kan bruges samtidigt. Rotter er 10 gange større end mus for nem tibial injektioner, kirurgi, billeddannelse, blod trækker, og biopsi. Levetiden af rotter er mere sikret med amputation og denne model kan kombinere neoadjuvant terapi, amputation og adjuvans terapi giver mulighed for forbedret patientens overlevelse muliggør evaluering af effekten af behandlinger på mikrometastaser eller sovende tumorer. Off target toksicitet evaluering kan også vurderes i denne model, hvor rotter kan behandles med kræft terapeutisk såsom doxorubicin og overvåges på lang sigt for doxorubicin induceret hjertetoksicitet eller gentagelse af OS. Dette ville gøre det muligt at teste cardio-beskyttelsesmidler i en model med OS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen offentliggørelse at erklære.
Acknowledgments
NIH finansiering gennem National Cancer Institute, tilskud # CA228582. Shun Ishiyama modtager i øjeblikket et tilskud fra Toray Medical Co. Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
- Link, M. P., et al. The effect of adjuvant chemotherapy on relapse-free survival in patients with osteosarcoma of the extremity. New England Journal of Medicine. 314 (25), 1600-1606 (1986).
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Botter, S. M., Neri, D., Fuchs, B.
- Ek, E. T. H., Dass, C. R., Choong, P. F. M. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Guijarro, M. V., Ghivizzani, S. C., Gibbs, C. P.
- Janeway, K. A., Walkley, C. R. Modeling human osteosarcoma in the mouse: From bedside to bench. Bone. 47 (5), 859-865 (2010).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C., Cleton-Jansen, A. M. Osteosarcoma models: from cell lines to zebrafish. Sarcoma. 2012, 417271 (2012).
- Khanna, C., et al. An orthotopic model of murine osteosarcoma with clonally related variants differing in pulmonary metastatic potential. Clinical & Experimental Metastasis. 18 (3), 261-271 (2000).
- Martin, T. J., et al. Parathyroid hormone-responsive adenylate cyclase in induced transplantable osteogenic rat sarcoma. Nature. 260 (5550), 436-438 (1976).
- Fisher, J. L., Mackie, P. S., Howard, M. L., Zhou, H., Choong, P. F. The expression of the urokinase plasminogen activator system in metastatic murine osteosarcoma: an in vivo mouse model. Clinical Cancer Research. 7 (6), 1654-1660 (2001).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Zhang, P., et al. Homologous mesenchymal stem cells promote the emergence and growth of pulmonary metastases of the rat osteosarcoma cell line UMR-106. Oncology Letters. 8 (1), 127-132 (2014).
- Gabrielson, K., et al. Heat shock protein 90 and ErbB2 in the cardiac response to doxorubicin injury. Cancer Research. 67 (4), 1436-1441 (2007).
- Sysa-Shah, P., et al. Bidirectional cross-regulation between ErbB2 and β-adrenergic signalling pathways. Cardiovascular Research. 109 (3), 358-373 (2016).
- Wachtman, L. M., Browning, M. D., Bedja, D., Pin, S., Gabrielson, K. L. Validation of the use of long-term indwelling jugular catheters in a rat model of cardiotoxicity. Journal of American Association Laboratory Animal Science. 45, 55-64 (2006).
- Abdou, A. G., et al. The Prognostic role of Ezrin and HER2/neu expression in osteosarcoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 24 (5), 355-363 (2016).
- Hughes, D. P., Thomas, D. G., Giordano, T. J., McDonagh, K. T., Baker, L. H. Essential erbB family phosphorylation in osteosarcoma as a target for CI-1033 inhibition. Pediatric Blood & Cancer. 46 (5), 614-623 (2006).
- Wen, Y. H., et al. Epidermal growth factor receptor in osteosarcoma: expression and mutational analysis. Human Pathology. 38 (8), 1184-1191 (2007).
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4200-4209 (2014).
