Summary
Her præsenteres en protokol for metabolisk mærkning af gær med 14C-eddikesyre, som er kombineret med tyndlagskromatografi til adskillelse af neutrale lipider.
Abstract
Neutrale lipider (NLs) er en klasse af hydrofobe, afgiftsfri biomolekyler, der spiller nøgleroller i energi og lipidhomøostase. NLs syntetiseres de novo fra acetyl-CoA og er primært til stede i eukaryoter i form af triglycerider (TGs) og sterol-estere (SE). De enzymer, der er ansvarlige for syntesen af NLs er stærkt bevaret fra Saccharomyces cerevisiae (gær) til mennesker, hvilket gør gær en nyttig model organisme til at dissekere funktion og regulering af NL metabolisme enzymer. Mens meget er kendt om, hvordan acetyl-CoA omdannes til et mangfoldigt sæt af NL arter, mekanismer til regulering af NL metabolisme enzymer, og hvordan mis-regulering kan bidrage til cellulære patologier, er stadig ved at blive opdaget. Talrige metoder til isolering og karakterisering af NL arter er blevet udviklet og anvendt gennem årtiers forskning; der er imidlertid ikke blevet drøftet en kvantitativ og enkel protokol for en omfattende karakterisering af større NL-arter. Her præsenteres en enkel og fleksibel metode til at kvantificere de novosyntesen af større NL-arter i gær. Vi anvender 14C-eddikesyre metaboliske mærkning kombineret med tyndt lag kromatografi til at adskille og kvantificere en bred vifte af fysiologisk vigtige NLs. Derudover kan denne metode let anvendes til at studere in vivo reaktionshastigheder af NL enzymer eller nedbrydning af NL arter over tid.
Introduction
Acetyle-CoA er den grundlæggende byggesten i forskellige biomolekyler, herunder neutrale lipider (NLs), der tjener som en alsidig biomolekylær valuta til opbygning af membraner, generering af ATP og regulering af cellesignalering1,2. Tilgængeligheden af NLs, der skal shunted i nogen af disse respektive veje er til dels reguleret af deres opbevaring. Lipiddråber (LD'er), cytoplasmiske organeller bestående af hydrofobe kerner af triglycerider (TGs) og sterolestere (SE'er) er de vigtigste opbevaringsrum i de fleste cellulære NLs. Som sådan, LDs sequester og regulere NLs, som kan nedbrydes og efterfølgende anvendes til biokemiske og metaboliske processer3,4. Det er kendt, at misreguleringen af NL og LD-associerede proteiner er korreleret med starten af patologier, herunder lipodystrofi og metaboliske syndromer5,6. På grund af dette, nuværende LD forskning er intenst fokuseret på, hvordan NL syntese er reguleret rumligt, tidsmæssigt, og på tværs af forskellige væv af multi-cellulære organismer. På grund af de allestedsnærværende cellulære roller for NLs bevares mange enzymer, der er ansvarlige for syntese og regulering af NLs, i hele eukaryoter7. Faktisk, selv nogle prokaryoter gemme NLs i LDs8. Derfor har genetisk tractable modelorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirende gær) været nyttige til undersøgelse af NL syntese og regulering.
Adskillelsen og kvantificeringen af NLs fra celleekstrakter kan opnås på et utal af måder, herunder gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), højtydende væskekromatografi (HPLC) og ultraperformet væskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Måske er den enkleste metode til adskillelse af NLs via tyndlagskromatografi (TLC), som giver mulighed for efterfølgende densitometrisk kvantificering fra en standardkurve12,13. Selvom TLC kun giver en kursuskornet adskillelse af NLs, forbliver det en kraftfuld teknik, fordi den er billig, og den giver mulighed for hurtig adskillelse af NLs fra flere prøver samtidigt. To af de største udfordringer, som undersøgelsen af NLs via TLC står over for, er: 1) den brede vifte af cellulære overfloder af NL-arter og deres mellemprodukter og 2) rækken af hydrofilicitet/hydrofobitet af lipidmellemprodukter inden for NL-synteseveje. Derfor er kvantificeringen af NL-arter via TLC typisk begrænset til de mest udbredte arter; indførelse af et 14C-eddikesyreradiolabel kan imidlertid i væsentlig grad øge påvisningen af mellemprodukter med lav forekomst inden for NL-veje. Eddikesyre omdannes hurtigt til acetyls-coA af acetyl-CoA-synthetase ACS214, hvilket gør 14 C-eddikesyretil et egnet radiolabelingssubstrat i gær15. Derudover kan TLC opnå adskillelse af både hydrofobe NLs og hydrofile mellemprodukter af NLs ved hjælp af flere opløsningsmiddelsystemer16. Her præsenteres en metode til adskillelse af NLs ved hjælp af 14C-eddikesyre metabolisk mærkning i gær. Lipider mærket i løbet af pulsperioden isoleres efterfølgende af en veletableret total lipidisolationsprotokol17, efterfulgt af adskillelsen af NL-arter med TLC. Udvikling af TLC plader af både autoradiografi at visualisere mærket lipider, og en kemisk spray til at visualisere samlede lipider, giver mulighed for flere metoder til kvantificering. Individuelle lipidbånd kan også let udtrækkes fra TLC-pladen ved hjælp af et barberblad, og scintillationstælling kan bruges til at kvantificere mængden af radiolabeleret materiale i båndet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vækst og mærkning af gærceller med 14C-eddikesyre
- Pod en gærkultur ved at plukke en koloni fra en plade og dispensere den til 20 mL syntetisk komplet (SC) medier, der indeholder 2% dextrose (se supplerende fil til opskriften på SC medier). Inkuber ved 30 °C for natten over med omrystning ved 200 omdrejninger i minuttet.
BEMÆRK: Væksttilstand, prøvevolumen og behandling vil variere afhængigt af lipid(er) af interesse. Før der udføres fuldstændige eksperimenter, bør optimale vækstbetingelser og kulturmængder bestemmes empirisk. Denne protokol diskuterer radiomærkning af gærkulturer dyrket til stationær fase, en vækstfase, hvor biomembran og cellevækst bremser, og NL-syntese er meget aktiv. - Od600 af natten kultur ved hjælp af et spektrofotometer og fortynd gær celle kultur til en endelig OD600 af 0,2 i 50 mL friske SC medier, der indeholder 2% dextrose. Cellerne vokses i 24 timer, eller indtil de har nået den stationære fase (som almindeligvis defineres ved en flad foring af cellen, der fordobler OD600-målingen).
- Før du indsamler cellerne, skal du oprette slukningsbufferen (se Supplerende fil for at få flere oplysninger). Der fremstilles to 20 mL prøvestødpude for hver prøve (dvs. 40 mL slukningsbuffer for hver prøve) og deles jævnt i to koniske rør på 50 mL). Slukningsbufferen opbevares ved -80 °C til fremtidig brug.
- Når kulturerne har nået den ønskede OD eller vækstfase, indsamle cellerne ved centrifugering på 4.100 x g i 10 min. Mens prøverne befinder sig i centrifuge, skal der fremstilles radiomærkningsmedier ved at tilsætte [1-14C] eddikesyrenatriumsalt til dextrosefri SC-medier ved en endelig koncentration på 10 μCi/mL.
ADVARSEL: Der skal altid bæres korrekt personlige værnemidler, når der arbejdes med radioaktive materialer. Følg altid lokale retningslinjer for korrekt opbevaring, brug og bortskaffelse af radioaktive materialer.
BEMÆRK: Både koncentrationen af 14C-eddikesyre i mærkningsmediet og inkubationstiden for radiomærkningen bør justeres i overensstemmelse med den eller de metabolitter, der er af interesse. Her anvendes en 20 min radiolabeling puls inkubation, hvilket er tilstrækkeligt til at mærke NL arter med en række overflod. - Fjern supernatanten fra pelletcellerne, og vask cellepillen én gang med 20 mL dextrose-fri SC-medier ved at genbruge pelleten med en pipette. Opsamle cellerne igen ved centrifugering ved 4.100 x g i 5 min.
- Resuspend cellerne i 1 mL af dextrose-fri SC medier, og overføre cellerne til en mærket 2 mL mikrocentrifuge rør. Opsamle cellerne igen ved centrifugering ved 4.100 x g i 2 min.
- Resuspend cellerne igen i 500 μL af dextrose-fri SC medier. Forkøle en centrifuge, der er udstyret til 50 mL koniske rør til -10 °C eller ved den laveste temperaturindstilling.
- Radiolabelingsperioden påbegyndes ved hurtigt at tilsætte 500 μL radiolabelingsmedier til hver 500 μL celleaffjedring (endelig koncentration af C-eddikesyre= 5 μCi/ml). Rørene inkuberes i en roterende inkubator ved 30 °C i 20 min. 2 min inden udgangen af mærkningsperioden, og der overføres en 20 mL prøve for hver prøve fra fryseren på -80 °C til en spand is
- Når radiolabelingsperioden er afsluttet, skal du bruge en pipette til at kaste hele 1 mL prøven i 20 mL koldslukningsbuffer. Hvirvel de koniske rør i 5-10 s for at sikre, at prøven er blevet grundigt blandet med slukningsbufferen. Inkuber prøverne i slukningsbuffer i 2 minutter på is.
- Cellepillen opsamles ved at dreje i en centrifuge ved 5.000 x g i 3 min. indstillet til -10 °C eller ved den laveste temperaturindstilling. Mens prøverørene drejer rundt, overføres et andet sæt slukningsbuffer aliquot fra fryseren -80 °C til en spand fyldt med is (dvs. et 20 mL rør med slukningsbuffer pr. prøve).
- Fjern slukningsbufferen fra cellepiller, og udskift den med 20 mL frisk, kold, slukkende buffer. Vortex og ryst prøverne, indtil pellet er blevet løsnet fra bunden af koniske rør og genbruges fuldt ud i slukning buffer. Prøverne centrifuges igen ved 5.000 x g i 3 min ved -10 °C for at opsamle cellerne.
- Når cellerne er pelleted, grundigt fjerne alle slukning buffer fra prøverne ved at hælde ud supernatant og fjerne det overskydende med en pipette. Rør opbevares ved -80 °C til videreforarbejdning.
2. Isolering af total lipider fra gær
BEMÆRK: Følgende protokol for lipidisolation er baseret på en veletableret og hyppigt anvendt metode, der effektivt udvinder de fleste neutrale lipidarter17,18.
ADVARSEL: Når du bruger organisk opløsningsmiddel, skal du altid bære passende PERSONLIGE VÆRNEmidler og arbejde inde i en røghætte, når det er muligt. Under lipidekstraktion skal du undgå at bruge plast, der er uforenelig med organiske opløsningsmidler. Polypropylenrør er velegnede til følgende protokol.
- Der afvejes 0,3 g syrevaskede glasperler til hver prøve, og de opbevares i 2 mL mikrocentrifugerør på is. Fjern cellepillerne fra fryseren -80 °C og hold dem på is. Der tilsættes 350 μL methanol og 700 μL chloroform til hver prøve, opsuges og overføres til mikrocentrifugerør, der indeholder forvejte glasperler.
- Lyse celler ved agiterende rør på en hvirvel 3x i 1 min, med 30 s inkubationer på is mellem omrøring. Alternativt kan celler lysed ved hjælp af en mini perle-tæppebanker i tre 1-min cyklusser. Gem 25-30 μL helcelle lysat i et separat rør til scintillationstælling.
BEMÆRK: Det gemte lysat vil blive brugt til at bestemme den relative mængde radioisotop, som hver prøve har taget op i løbet af pulsperioden, hvilket vil påvirke mængden af hver prøve, der er lagt på TLC-pladen. Dette behandles yderligere i trin 3.2. - Hele indholdet af 2 mL mikrocentrifugerøret hældes i et centrifugerør på 15 mL glas [Tube A]. De 2 mL mikrocentrifugerør vaskes ved at tilsætte 1 mL methanol og hvirvler i 10-15 s. 1 ml methanolvask overføres til rør A, og der tilsættes 2 ml kloroform til rør A efterfulgt af 400 μL vand for et slutprøvevolumen på 4,45 ml.
- Vortex prøver i 1 min efterfulgt af en 5 min centrifugering ved 1.000 x g. Efter centrifugering skal de vandige (øvre) og organiske (nedre) faser være tydeligt visuelt adskilt med cellerester liggende ved grænsefladen.
- Brug en glas Pasteur pipette, indsamle den organiske fase fra rør A og flytte til en ny 15 mL glas centrifuge rør (Tube B). Der tilsættes 1 mL 1M KCl til rør B. Til rør A tilsættes 1 ml methanol og 2 ml kloroform og 200 μL MiliQ vand. Gentag hvirvle- og centrifugeringstrinnene på rør A.
- Opsamles igen den organiske fase fra rør A, og den tilsættes til rør B. Rør A skal bortskaffes i en passende beholder. Vortex rør B i 1 min efterfulgt af en 5 min centrifugering ved 1.000 x g.
- Fjern det øverste vandige lag fra rør B og kassér. Tilsæt 1 mL frisk 1 M KCl tilbage til rør B og gentag vortexing/centrifugeringstrinnet. Når lagene er adskilt, skal hele det organiske bundlag forsigtigt samles i et mærket 4 mL glasglas.
BEMÆRK: På dette trin kan lipidekstrakter opbevares ved -80 °C, eller protokollen kan fortsættes for TLC-adskillelse af lipider.
3. Adskillelse og kvantificering af radioisotopmærkede NLs ved tyndlagskromatografi
- Hvis lipidekstrakter blev placeret ved -80 °C, skal du langsomt bringe til stuetemperatur ved at inkubere på is og derefter på en bordplade. Opløsningsmiddel fordampes fuldstændigt fra lipidekstrakter ved vakuumtørring eller ved hjælp af en blid strøm af inert gas (f.eks. argon eller nitrogen). I mellemtiden opvarmes en ovn til 145 °C til opvarmning af TLC-pladen.
- Før prøver kan indlæses på TLC-pladen, bestemme relative mængder af radiolabel taget op af cellerne. Der pipettes 10 μL af hele cellelysat fra trin 2.2 til et 6 ml glasscintillationsglas, tilsættes 6 ml scintillationsvæske og anbringes hætteglas i et stativ. Brug en scintillation tæller til at måle cpm eller dpm for hver prøve ved hjælp af tælle enkelt rack indstilling indstillet til en 1 min tælletid. Mål hver hel celle lysat i dublet for at opnå et gennemsnit for hver prøve. Justere lastemængden efter en vild type eller referenceprøve
BEMÆRK: Mængden af hver prøve, der skal indlæses på TLC-pladen, kan bestemmes ved hjælp af følgende ligning: (gennemsnitlige prøvetal)/(gennemsnitlige referencetal) x ønsket belastningsvolumen. Hvis f.eks. 20 μL af referenceprøven skal læsses på TLC-pladen og har et gennemsnitligt antal på 1.000, vil en forsøgsprøve med et gennemsnitligt antal på 2.000 have 10 μL lastet på TLC-pladen. - Prøvelæbepigerne rekonstrueres i 40-50 μL på 1:1 (v/v%) chloroform:methanol ved hvirvelstrømning i 5 min. Forbered 101 ml af det mobile faseopløsningsmiddel i en glas gradueret cylinder (se afsnittet Repræsentative resultater for et eksempel på større NL-artsadskillelse med en 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Petroleum ether:Diethyl ether:Eddikesyreopløsningsmiddel).
- Hæld opløsningsmidlet i et TLC-glaskammer, der indeholder en TLC-mætningspude på 20 x 20 og et tætsluttende låg. Forbered en kanaliseret 20 x 20 silica gel 60 G plade ved forsigtigt at markere en linje 1,5 cm over bunden af pladen ved hjælp af en blyant. Linjen angiver oprindelsen, og hvor lipiderne vil blive indlæst. Under linjen skal du forsigtigt mærke den prøve, der vil blive indlæst i hver vognbane. Når TLC-pladen er klargjort, inkuberes pladen i en ovn på 145 °C i mindst 30 minutter for at forvarme pladen og fjerne overskydende fugt.
- Når pladen er tilstrækkeligt opvarmet, og TLC-mætningspuden er mættet med opløsningsmiddel, skal du fjerne TLC-pladen fra ovnen og straks fortsætte med at indlæse TLC-pladen. Ved at læsse pladen, mens den er varm, sikrer du hurtig fordampning af opløsningsmidler. For hver lipidart af interesse skal der på en renset lipidstandard på en bane på TLC-pladen belastes 5-20 μg for at spore adskillelsen og den forventede migrationsafstand. Ved hjælp af en pipette punkt 5μL prøve på oprindelsen af hver vognbane placeret 1,5 cm over bunden af TLC plade. Der er lastet 5 μL pletter igen, indtil der er lastet 20-40 μL prøve i hver vognbane.
BEMÆRK: 5-20 μg umærkede rensede lipider kan tilsættes til hver prøvebane som sporstoffer, der kan farves og visualiseres efter TLC-adskillelse af lipider. Tilstedeværelsen af en farvet standard giver mulighed for nem sporing og udskæring af radiolabeled lipidbånd til efterfølgende scintillationtælling. Hvilke rensede standarder der indlæses på pladen, bestemmes af nl-arten af interesse. Se afsnittet Repræsentativt resultat for at få eksempler på adskillelse af oliesyre (FFA), 1,2 dioleoyl-glycerol (DG), triolein (TG), kolesterol (Chol), cholesteryl-linoleat (SE) og squalen i baner ved siden af prøvebanerne. - Når standarden og forsøgsprøverne er indlæst, skal pladen placeres i udviklingskammeret og ventes, indtil opløsningsmidlet har nået toppen af pladen (40-60 min). Når pladen er fuldt udviklet, skal du fjerne den fra kammeret og lade den tørre i røghætten i 20 minutter.
- Når pladen er tørret, skal du dække den med plastfolie og placere den i en kassette under udvikling med en autoradiografiskærm. Lad pladen udvikle sig med skærmen i 24-48 timer.
4. Visualisering og kvantificering af TLC-adskilte lipider
- Fjern skærmen fra den udviklende kassette og sted inde i en fosfor billedsprog. Vælg indstillingen Fosforbilleddannelse, og udvikl ved 800-1000 V.
BEMÆRK: Fosforbilleddannelse giver et kvalitativt billede af radiomærkede lipider på TLC-pladen. Men kvantificering af radiolabeled lipider er bedst opnås ved scintillation tælle, som er beskrevet efterfølgende. - Der blandes 100 mL p-anisaldehydreagens (se supplerende fil)og deponeres i en glassprayflaske. Sprøjt TLC-pladen med p-anisaldehydrenseagens, indtil silicaen er mættet. Pladen bages i en ovn på 145 °C i 5 min., eller indtil der er opstået bånd.
- For at kvantificere individuelle lipidarter ved hjælp af radiolabelscintillationstælling skal du bruge et barberblad til at skrabe silicagelen fra glas-TLC-pladen. Hvert silicagelbånd, der svarer til en enkelt radiolabeled lipidart, overføres til et glasscintillationsglas, og der tilsættes 6 ml scintillationsvæske. Vortex kraftigt, indtil silicabåndet er blevet reduceret til små stykker.
- Alternativt kan lipider udvindes fra silicagelbåndet ved hjælp af lipidudsugningsprotokollen i afsnit 3. Hvis lipider ekstraheres fra silicagelen, fordampes opløsningsmidlet helt som i trin 3.1, og der tilsættes 6 ml scintillationsvæske til de tørrede lipider. Placer stativet med scintillationsglas i en scintillationstæller. Vælg indstillingen Tæl enkelt rack, og juster optællingstiden til 2 min pr. hætteglas. Resultater fra scintillation tælleren vil blive udskrevet og kan visualiseres som en søjlediagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol har vi vist, at mærkning, påvisning og kvantificering af NL-arter kan opnås ved 14C-eddikesyre metabolisk mærkning. Større NL-arter kan adskilles i et opløsningsmiddelsystem på 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexin:Petroleum ether:Diethyl ether:Eddikesyre(figur 1A, B). Fosforbilleddannelse gør det muligt at visualiseringere fri fedtsyre (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) og squalen (SQ) (Figur 1A). Selvom SE'er kan adskilles fra andre NL-arter i dette opløsningsmiddel, opdages ingen i autoradiogrammet efter en 20-minutters puls. Dette kan tilskrives langsom SE syntese i den stationære fase af væksten i gær. Det påvises også, at rensede lipidarter kan adskilles ved denne metode og efterfølgende visualiseres ved sprøjtning af TLC-pladen med p-anisaldehydreagens (figur 1B). Mens NL-arter er godt adskilt i dette opløsningsmiddel, forbliver polære arter som fosfatidylcholin (PC) ved oprindelsen (Figur 1B). Ved at anvende en jagtperiode i radiolabelfrie medier efter pulsen kan relativ flux gennem NL-veje måles (Figur 1C). Efter en 10-minutters jagt, er den store pulje af SQ forsvundet, og den samlede Chol er forhøjet. På samme måde korrelerer GD's udseende i jagtperioden med et fald i FFA-signalet.
Figur 1: 14C-eddikesyreradiomærkning gør det muligt at påvise flere NL-arter. (A) Autoradiogram af lipider adskilt af TLC isoleret fra gærradiolabeled med 14C-eddikesyre i stationær fase. Klart påviselige arter omfatter frie fedtsyrer (FFA), triglycedide (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) og squalen (SQ). Umærkede bands er uidentificerede NL arter. (B) Rensede lipidarter, der er adskilt af TLC og visualiseret ved p-anisaldehydpletter. Visualiserede arter omfatter alle lipider, der er nævnt i (A) ud over sterolestere (SE) og phosphatidylcholine (PC). (C) Autoradiogram af lipider adskilt af TLC isoleret fra gær pulserede med 14-eddikesyrei stationær fase efterfulgt af en 10 min chase periode i radiolabel-fri medier. Forsvinden af SQ er mødt med stigning i Chol. Stigningen i GENERALDIREKTORATET i jagtperioden ledsages af et fald i FFA-arter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil: Opskrifter på buffere, medier og løsninger. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenteres en alsidig radiolabelingsprotokol til kvantitativ overvågning af syntesen af NL-arter i gær. Denne protokol er meget modulopbygget, hvilket gør det muligt at afslutte proceduren inden for 3-6 dage. Derudover findes der et væld af litteratur om brugen af TLC til at adskille lipidarter og metabolitter, som skulle gøre det muligt for brugeren at opdage flere lipidarter af interesse med en simpel ændring af TLC-opløsningsmiddelsystemer16,19. Denne protokol er befordrende for adskillelse, detektion og kvantificering af radiolabeled lipider. Det kan også kombineres med en jagtperiode i umærkede medier for at opdage omsætningstiden for mærkede NLs. Kollektivt giver denne procedure en nyttig struktur til at begynde at udforske radiomærkningen af NL-arter.
Andre metoder, såsom HPLC, GC-MS og UPLC-MS giver højere opløsning af lipidadskillelse og kvantificering; Det er dog typisk ikke optimalt at køre radiomærkede prøver gennem MS, selv om dette kan overvindes ved hjælp af stabile isotoper. Ikke desto mindre giver denne radiolabelmetode høj detektionsfølsomhed og alsidighed for mange lipidarter. En anden fordel ved denne protokol sammenlignet med MS er dens overkommelighed. TLC adskillelse af lipider er relativt enkel, kræver ingen ekstravagant udstyr, og er afhængig af fælles laboratoriematerialer. Med hensyn til begrænsninger: Visse arter med lav forekomst, f.eks. lyso-lipider, kan muligvis ikke påvises, selv efter at der er indarbejdet en etiket på 14C. Derudover er de fleste TLC-tilgange ikke egnede til 'lipidomiske' karakteriseringer på grund af den kursuskornede adskillelse af lipidarter inden for et givet opløsningsmiddel.
Gær tilbyder et praktisk, genetisk tractable modelsystem til undersøgelse af lipider via radiolabel biokemiske tilgange. Det skal dog bemærkes, at i specifikke genetiske baggrunde eller under særlige metaboliske vækstbetingelser kan den cellulære optagelse af radiolabeleret eddikesyre eller andre radiolabeller reduceres. Mærkning af celler med 14C-eddikesyre i mangel af glukose øger kraftigt optagelsen af radiolabelen. Lange inkubationer uden glukose vil forholdsmæssigt øge optagelsen af radiolabel; Dette kan dog også påvirke de pågældende veje. Der bør derfor fastsættes en mærkningseffektivitet for en bestemt væksttilstand, inden protokollen om 14C-eddikesyreradiolabeling følges fuldt ud. Vær især opmærksom på længden af radiomærkningsperioden. Mærkningstiden bør holdes så kort som muligt for at detektere de lipidarter, der er af interesse. Alt i alt giver denne procedure mulighed for at undersøge vigtige lipidsyntesereaktioner og bør gøre det muligt at undersøge NL-regulering i intakte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen konkurrerende interesser i udarbejdelsen af dette manuskript.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Henne lab for hjælp og konceptuel rådgivning i afslutningen af denne undersøgelse. W.M.H. støttes af midler fra Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund og UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R er blevet understøttet af et T32-programtilskud (5T32GM008297).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V.
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P.
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
