Summary
כאן, פרוטוקול מוצג עבור תיוג מטבולי של שמרים עם 14C-חומצה אצטית, אשר יחד עם כרומטוגרפיה שכבה דקה להפרדה של שומנים ניטרליים.
Abstract
שומנים ניטרליים (NLs) הם סוג של ביומולקולים הידרופוביים ללא תשלום הממלאים תפקידי מפתח באנרגיה והומאוסטזיס שומנים בדם. NLs הם מסונתז דה נובו מאצטיל-CoA והם נוכחים בעיקר אאוקריוטים בצורה של טריגליצרידים (TGs) ו אסטרים סטרול (SEs). האנזימים האחראים על הסינתזה של NLs נשמרים מאוד מ Saccharomyces cerevisiae (שמרים) לבני אדם, מה שהופך שמרים אורגניזם מודל שימושי לנתח את הפונקציה ואת הרגולציה של אנזימי חילוף החומרים NL. בעוד הרבה ידוע על איך אצטיל-CoA מומר קבוצה מגוונת של מינים NL, מנגנונים לוויסות אנזימי חילוף החומרים NL, וכיצד ויסות שגוי יכול לתרום פתולוגיות הסלולר, עדיין מתגלים. שיטות רבות לבידוד ואפיון של מינים NL פותחו ושימשו במשך עשרות שנים של מחקר; עם זאת, פרוטוקול כמותי ופשוט לאפיון מקיף של מינים NL גדולים לא נדון. כאן, שיטה פשוטה ומסתגלת לכמת את סינתזת דה נובו של מינים NL גדולים בשמרים מוצגת. אנו מיישמים 14C-חומצה אצטית תיוג מטבולי בשילוב עם כרומטוגרפיה שכבה דקה כדי להפריד ולכומת מגוון רחב של NLs חשוב מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, שיטה זו ניתן ליישם בקלות ללמוד בשיעורי התגובה vivo של אנזימי NL או השפלה של מינים NL לאורך זמן.
Introduction
אצטיל-CoA הוא אבן הבניין הבסיסית של ביומולקולות מגוונות כולל שומנים ניטרליים (NLs), המשמשים מטבע ביומולקולרי רב-תכליתי לבניית ממברנות, יצירת ATP, ויסות איתות תאים1,2. הזמינות של NLs להיות מנודה לתוך כל אחד מהמסלולים האלה בהתאמה הוא, בחלקו, מוסדר על ידי האחסון שלהם. טיפות שומנים בדם (LDs), אברונים ציטופלסמיים המורכבים מלטיבות הידרופוביות של טריגליצרידים (TGs) ואסטרים סטרול (SEs), הם תאי האחסון העיקריים של רוב ה- NLs הסלולריים. ככזה, LDs לבודד ולווסת NLs, אשר ניתן להשפיל ולאחר מכן מנוצל לתהליכים ביוכימיים ומטבוליים3,4. זה ידוע כי הרגולציה השגויה של חלבונים הקשורים NL ו- LD מתואמת עם תחילת פתולוגיות כולל lipodystrophy ותסמונות מטבוליות5,6. בגלל זה, מחקר LD הנוכחי מתמקד מאוד על איך סינתזה NL מוסדר מרחבי, זמני, ועל פני רקמות נפרדות של אורגניזמים רב תאיים. בשל התפקידים התאיים בכל מקום עבור NLs, אנזימים רבים האחראים על סינתזה ורגולציה של NLs נשמרים ברחבי eukaryotes7. ואכן, אפילו כמה פרוקריוטים מאחסנים NLs ב- LDs8. לכן, אורגניזמים מודל מתיחה גנטית כגון Saccharomyces cerevisiae (שמרים ניצנים) היו שימושיים לחקר סינתזה ורגולציה NL.
ההפרדה וכימות של NLs מתמציות תאים ניתן לבצע במספר עצום של דרכים, כולל ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה גז (GC-MS), כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC), וספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC-MS)9,10,11. אולי השיטה הפשוטה ביותר להפרדת NLs היא באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC), המאפשרת כימות צפיפות לאחר מכן מעקומה סטנדרטית12,13. למרות TLC מספק רק הפרדה מגורענת כמובן של NLs, זה נשאר טכניקה חזקה כי זה זול, וזה מאפשר הפרדה מהירה של NLs מכמה דגימות בו זמנית. שניים מהאתגרים הבולטים ביותר העומדים בפני המחקר של NLs באמצעות TLC הם: 1) המגוון הרחב של שפע תאי של מינים NL והמתווכים שלהם, ו -2) מגוון ההידרופיליות / הידרופוביה של מתווכים שומנים בתוך מסלולי סינתזה NL. כתוצאה מכך, הכימות של מינים NL באמצעות TLC מוגבל בדרך כלל למינים הנפוצים ביותר; עם זאת, הקדמה של 14C-חומצה אצטית radiolabel יכול לשפר באופן משמעותי את הזיהוי של מתווכים שפע נמוך בתוך מסלולי NL. חומצה אצטית מומרת במהירות לאצטיל-CoA על ידי אצטיל-CoA סינתטאז ACS214, מה שהופך 14חומצה C-אצטית מצע רדיובליבלי מתאים בשמרים15. בנוסף, הפרדה של NLs הידרופובית ומתווכים הידרופיליים של NLs ניתן להשיג על ידי TLC באמצעות מערכות ממס מרובות16. כאן, שיטה מוצגת להפרדה של NLs באמצעות 14C-חומצה אצטית תיוג מטבולי בשמרים. שומנים המסומנים במהלך תקופת הדופק מבודדים לאחר מכן על ידי פרוטוקול בידוד שומנים מוחלט מבוסס היטב17, ואחריו ההפרדה של מינים NL על ידי TLC. פיתוח לוחות TLC על ידי אוטורדיוגרפיה כדי לדמיין שומנים מסומנים, ותרסיס כימי כדי לדמיין שומנים מוחלטים, מאפשר שיטות מרובות של כימות. רצועות שומנים בודדות ניתן גם לחלץ בקלות מצלחת TLC באמצעות סכין גילוח, וספירת נוצץ יכול לשמש כדי לכמת את כמות החומר radiolabeled בתוך הלהקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמיחה ותיוג של תאי שמרים עם 14חומצה אצטית C
- לחסן תרבות שמרים על ידי בחירת מושבה מצלחת וחלוקתה לתוך 20 מ"ל של מדיה סינתטית מלאה (SC) המכילה 2% דקסטרוז (ראה קובץ משלים למתכון של מדיה SC). דגירה ב 30 °C (50 °F) ללילה עם רועד ב 200 סל"ד.
הערה: מצב הצמיחה, נפח המדגם והטיפול יהיו שונים בהתבסס על השומנים של עניין. לפני ביצוע ניסויים מלאים, תנאי צמיחה אופטימליים ונפחי תרבות צריכים להיקבע אמפירית. פרוטוקול זה דן radiolabeling של תרביות שמרים גדל לשלב נייח, שלב צמיחה כאשר ביו-ממברנה וצמיחת התא מאט, וסינתזה NL פעיל מאוד. - למדוד את OD600 של תרבות הלילה באמצעות ספקטרופוטומטר לדלל את תרבית תאי שמרים כדי ODסופי 600 של 0.2 ב 50 מ"ל של מדיה SC טרי המכיל 2% דקסטרוז. לגדל את התאים במשך 24 שעות, או עד שהם הגיעו לשלב הנייח (אשר מוגדר בדרך כלל על ידי בטנה שטוחה של התא הכפלת OD600 מדידה).
- לפני איסוף התאים, בצע את מאגר ההרוואות (ראה קובץ משלים לקבלת פרטים). הפוך שני aliquots 20 מ"ל של מאגר מרווה עבור כל מדגם (כלומר, 40 מ"ל מרווה חוצץ עבור כל מדגם) ולפצל באופן שווה לשני צינורות חרוט 50 מ"ל). אחסן את עליכות המאגר המרוותות ב- -80 °C (80 °F) לשימוש עתידי.
- לאחר שהתרביות הגיעו לשלב OD או הצמיחה הרצוי, לאסוף את התאים על ידי centrifuging ב 4,100 x g במשך 10 דקות. בעוד דגימות נמצאות בצנטריפוגה, להכין מדיה radiolabeling על ידי הוספת [1-14C] מלח נתרן חומצה אצטית לתקשורת SC ללא דקסטרוז בריכוז סופי של 10 μCi / mL.
אזהרה: יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) בכל עת בעת עבודה עם חומרים רדיואקטיביים. פעל תמיד על פי הנחיות מקומיות לאחסון, שימוש וסילוק נאותים של חומרים רדיואקטיביים.
הערה: הן הריכוז של 14C-חומצה אצטית במדיה תיוג ואת זמן הדגירה radiolabeling צריך להיות מותאם על פי מטבוליטים(ים) של עניין. כאן, 20 דקות דגירה דופק radiolabeling משמש, אשר מספיק כדי לתייג מינים NL עם מגוון של שפע. - הסר את supernatant מן התאים כדורי, לשטוף את גלולה התא פעם אחת עם 20 מ"ל של מדיה SC ללא דקסטרוז על ידי שימוש חוזר את הכדור עם pipette. לאסוף את התאים שוב על ידי centrifuging ב 4,100 x g במשך 5 דקות.
- resuspend התאים ב 1 מ"ל של תקשורת SC ללא דקסטרוז, ולהעביר את התאים לצינור microcentrifuge 2 מ"ל שכותרתו. לאסוף את התאים שוב על ידי centrifuging ב 4,100 x g במשך 2 דקות.
- resuspend התאים שוב ב 500 μL של מדיה SC ללא דקסטרוז. מצנטריפוגה מצנטריפוגה המצוידת בצינורות חרוטים של 50 מ"ל עד -10 מעלות צלזיוס או על הגדרת הטמפרטורה הנמוכה ביותר.
- התחל את תקופת ההשעיה של רדיולייבל על ידי הוספת 500 μL במהירות של מדיה radiolabeling לכל 500 μL של השעיית תא (ריכוז חומצה אצטית 14C הסופי = 5 μCi / mL). לדגור על הצינורות באינקובטור מסתובב ב 30 °C (50 °F) במשך 20 °C 2 דקות לפני סוף תקופת התיוג, להעביר אחד 20 מ"ל aliquot של חיץ מרווה עבור כל דגימה מהמקפיא -80 °C לדלי קרח
- לאחר שתקופת ההבלים הסתיימה, השתמש בצינור כדי לצלול את כל דגימת 1 מ"ל לתוך 20 מ"ל של חוצץ מרווה קר. מערבולת הצינורות החרוטים עבור 5-10 s כדי להבטיח כי המדגם כבר מעורבב ביסודיות עם חוצץ מרווה. לדגור את הדגימות במאגר מרווה במשך 2 דקות על קרח.
- לאסוף את גלולה התא על ידי ספינינג בצנטריפוגה ב 5,000 x g במשך 3 דקות להגדיר -10 °C (50 °F) או על הגדרת הטמפרטורה הנמוכה ביותר. בזמן שצינורות מדגם מסתובבים, העבר קבוצה נוספת של עליקוט מאגר מרווה מהמקפיא של 80 מעלות צלזיוס לדלי מלא בקרח (כלומר, צינור אחד של 20 מ"ל של חיץ מרווה לכל דגימה).
- הסר את חיץ מרווה supernatant מכדורי התא ולהחליף אותו עם 20 מ"ל רענן, קר, מרווה חוצץ. מערבולת ומנערים את הדגימות עד שהכדור התנתק מתחתית הצינור החרוט והוצמד מחדש במלואו במאגר מרווה. צנטריפוגות הדגימות שוב ב 5,000 x g במשך 3 דקות ב -10 °C (50 °F) כדי לאסוף את התאים.
- לאחר שהתאים הם גלולה, ביסודיות להסיר את כל חוצץ מרווה מן הדגימות על ידי שפיכת supernatant והסרת עודף עם pipette. לאחסן צינורות ב -80 °C (70 °F) לעיבוד נוסף.
2. בידוד של שומנים מוחלטים מן שמרים
הערה: הפרוטוקול הבא לבידוד שומנים מבוסס על שיטה מבוססת היטב בשימוש תכוף כי ביעילות מחלץ את רוב מיני השומניםנייטרלי 17,18.
אזהרה: בעת שימוש בממס אורגני, תמיד ללבוש PPE מתאים ולעבוד בתוך מכסה המנוע אדים במידת האפשר. במהלך מיצוי שומנים בדם, להימנע משימוש בפלסטיק שאינם תואמים ממסים אורגניים. צינורות פוליפרופילן מתאימים לפרוטוקול הבא.
- שקול 0.3 גרם של חרוזי זכוכית שטף חומצה עבור כל מדגם ולאחסן אותם 2 mL צינורות microcentrifuge על קרח. הסר את כדורי התא מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס ולשמור אותם על קרח. הוסף 350 מתנול μL ו 700 μL כלורופורם לכל דגימה, resuspend, ולהעביר צינורות microcentrifuge המכיל חרוזי זכוכית שקל מראש.
- תאי ליזה על ידי צינורות מתסיסים על מערבולת 3x במשך 1 דקות, עם 30 של דגירה על קרח בין תסיסה. לחלופין, תאים יכולים להיות lysed באמצעות מקצף חרוזים מיני במשך שלושה מחזורים 1 דקות. שמור 25-30 μL של כל תא lysate בצינור נפרד לספירת נוצצים.
הערה: הליזט שנשמר ישמש לקביעת הכמות היחסית של רדיואיזוטופ שנלקח על ידי כל דגימה במהלך תקופת הדופק, אשר ישפיע על כמות כל דגימה שנטענה על צלחת TLC. זה נדון בהמשך בשלב 3.2. - יוצקים את כל התוכן של צינור המיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה זכוכית 15 מ"ל [Tube A]. לשטוף את צינורות microcentrifuge 2 מ"ל על ידי הוספת 1 מ"ל של מתנול מערבולת עבור 10-15 s. העבר את שטיפת מתנול 1 מ"ל לצינור A ולהוסיף 2 מ"ל של כלורופורם לצינור A ואחריו 400 μL של מים עבור נפח מדגם סופי של 4.45 מ"ל.
- דגימות מערבולת במשך דקה אחת ואחריהן צנטריפוגה של 5 דקות ב-1,000 x גרם. לאחר צנטריפוגה, השלבים מימיים (עליונים) ואורגניים (נמוכים) צריכים להיות מופרדים חזותית בבירור עם פסולת תאים שוכבת בממשק.
- באמצעות פיפטת פסטר זכוכית, לאסוף את השלב האורגני מצינור A ולעבור צינור צנטריפוגה זכוכית 15 מ"ל חדש (Tube B). הוסף 1 מ"ל של 1M KCl לצינור B. כדי צינור A, להוסיף 1 מ"ל של מתנול ו 2 מ"ל של כלורופורם, ו 200 μL MiliQ מים. חזור על מדרגות המערבולת והמרכז בצינור A.
- שוב לאסוף את השלב האורגני מצינור A ולהוסיף אותו צינור B. להיפטר צינור A במיכל מתאים. צינור מערבולת B למשך דקה אחת ואחריו צנטריפוגה של 5 דקות ב 1,000 x g.
- הסר את השכבה מימית העליונה מצינור B ולהיפטר. הוסף 1 מ"ל של 1 M KCl טרי בחזרה לצינור B ולחזור על שלב המערבולת / צנטריפוגה. לאחר הפרדת השכבות, אסוף בזהירות את כל השכבה האורגנית התחתונה לתוך בקבוקון זכוכית 4 מ"ל שכותרתו.
הערה: בשלב זה, תמציות שומנים ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F), או הפרוטוקול ניתן להמשיך עבור הפרדת TLC של שומנים.
3. הפרדה וכימות של NLs עם תווית רדיואיזוטופ על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה
- אם תמציות שומנים הונחו ב -80 מעלות צלזיוס, לאט להביא לטמפרטורת החדר על ידי דגירה על קרח ולאחר מכן על ספסל. לאדות לחלוטין ממס מתמציות שומנים על ידי ייבוש ואקום או באמצעות זרם עדין של גז אינרטי (למשל, ארגון או חנקן). בינתיים, מחממים תנור ל-145 מעלות צלזיוס לחימום צלחת TLC.
- לפני שניתן לטעון דגימות על צלחת TLC, לקבוע כמויות יחסיות של radiolabel נלקח על ידי התאים. Pipette 10 μL של התא כולו ליסייט מן שלב 2.2 לתוך בקבוקון נצנצים זכוכית 6 מ"ל, להוסיף 6 מ"ל של נוזל נוצץ ולהניח בקבוקונים בארון תקשורת. השתמש במונה נוצץ כדי למדוד את עלות לאלף חשיפות או dpm של כל דגימה באמצעות האפשרות ספירת ארון תקשורת יחיד המוגדרת לזמן ספירה של דקה אחת. מדוד כל תא שלם lysate בכפילות כדי לקבל ממוצע עבור כל מדגם. התאמת כמות הטעינה בהתאם לסוג פראי או לדגימת הפניה
הערה: ניתן לקבוע את כמות כל דגימה לטעינה על לוח TLC באמצעות המשוואה הבאה: (ממוצע ספירות מדגם)/(ממוצע ספירות הפניות) x נפח הטעינה הרצוי. לדוגמה, אם 20 μL של מדגם הייחוס הוא להיות טעון על צלחת TLC, ויש לו ספירה ממוצעת של 1,000, אז מדגם ניסיוני עם ספירה ממוצעת של 2,000 יהיה 10 μL טעון על צלחת TLC. - ליישב מחדש את השומנים מדגם ב 40-50 μL של 1:1 (v/v%) כלורופורם:מתנול על ידי מערבולת במשך 5 דקות. הכן 101 מ"ל של ממס פאזה ניידת בגליל בוגר זכוכית (ראה סעיף תוצאות מייצגות לדוגמה של הפרדת מינים NL גדול על ידי 50:40:10:1 (v / v / v / v%) Hexane:אתר נפט:אתר דיאתיל:ממס חומצה אצטית).
- יוצקים את הממס לתא TLC מזכוכית המכיל כרית רוויה של 20 x 20 TLC ומכסה צמוד. הכן ג'ל סיליקה 20 x 20 סיליקה 60 G על ידי סימון בעדינות קו 1.5 ס"מ מעל החלק התחתון של הצלחת באמצעות עיפרון. הקו קובע את המקור ואת המקום שבו השומנים ייטענו. מתחת לקו, סמן בעדינות את המדגם שייטען בכל נתיב. לאחר צלחת TLC כבר מוכן, לדגור על הצלחת בתנור 145 °C לפחות 30 דקות כדי לחמם מראש את הצלחת ולהסיר כל לחות עודפת.
- לאחר הצלחת כבר מחומם מספיק, ואת כרית רווי TLC רווי ממס, להסיר את צלחת TLC מהתנור מיד להמשיך לטעון את צלחת TLC. טעינת הצלחת בזמן שהיא חמה מבטיחה אידוי ממס מהיר. עבור כל מינים שומנים של עניין, לטעון 5-20 מיקרוגרם של תקן שומנים מטוהרים על נתיב של צלחת TLC כדי לעקוב אחר הפרדה ומרחק הגירה צפוי. באמצעות פיפטה, לזהות 5μL של מדגם על המקור של כל נתיב הממוקם 1.5 ס"מ מעל החלק התחתון של צלחת TLC. טעינה חוזרת של 5 נקודות μL עד 20-40 μL של מדגם כבר טעון לתוך כל נתיב.
הערה: 5-20 מיקרוגרם של שומנים מטוהרים ללא תווית ניתן להוסיף לכל נתיב מדגם כמו עקבות שניתן להכתים ודמיינו לאחר הפרדת TLC של שומנים. נוכחותו של תקן מוכתם מאפשרת מעקב קל ו excision של רצועות שומנים radiolabeled לספירת הניקוד הבאים. אילו סטנדרטים מטוהרים נטענים על הצלחת ייקבעו על ידי מינים מעניינים NL. עיין בסעיף התוצאה הייצוגית לדוגמה של הפרדת חומצה אולאית (FFA), 1,2 דיאולאויל-גליצל (DG), טריולין (TG), כולסטרול (כול), כולסטריל-לינולאט (SE) וסקוואלן בנתיבים הסמוכים לנתיבי המדגם. - לאחר הטעינת התקן והדגימות הניסיוניות, מניחים את הצלחת בתא המתפתח וממתינים עד שהממס יגיע לראש הצלחת (40-60 דקות). לאחר הצלחת מפותחת במלואה, להסיר אותו מהתא ולאפשר לו להתייבש במכסה המנוע אדים במשך 20 דקות.
- לאחר הצלחת מיובשת, לכסות אותו עם סרט פלסטיק ומניחים אותו בקלטת מתפתחת עם מסך אוטוקרדיוגרפיה. אפשר לצלחת להתפתח עם המסך במשך 24-48 שעות.
4. הדמיה וכימות של שומנים מופרדים TLC
- הסר את המסך מהקלטת המתפתחת והצב בתוך צלם זרחן. בחר באפשרות הדמיית זרחן ופתח ב- V 800-1000.
הערה: הדמיית זרחן מעניקה תצוגה איכותית של שומנים עם תווית רדיו על צלחת TLC. עם זאת, כימות של שומנים radiolabeled הוא הטוב ביותר מושגת על ידי ספירת נוצץ, אשר מתואר לאחר מכן. - מערבבים 100 מ"ל של ריאגנט p-anisaldehyde (ראה קובץ משלים)ומפקידים בבקבוק ספריי זכוכית. מרססים את צלחת TLC עם ריאגנט p-אניסלדהיד עד שהסיליקה רוויה. אופים את הצלחת בתנור 145 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, או עד להקות הופיעו.
- כדי לכמת מינים בודדים של שומנים באמצעות ספירת נוצץ radiolabel, השתמש בסכין גילוח כדי לגרד את ג'ל הסיליקה מצלחת TLC הזכוכית. מעבירים כל רצועת ג'ל סיליקה המתאימה למין שומנים עם תווית רדיו אחת ללוויה נוצצת מזכוכית ומוסיפים נוזל נוצצת של 6 מ"ל. מערבולת במרץ עד הלהקה סיליקה צומצמה לחתיכות קטנות.
- לחלופין, שומנים ניתן לחלץ מרצועת ג'ל סיליקה באמצעות פרוטוקול מיצוי השומנים בסעיף 3. אם שומנים מופקים מג'ל סיליקה, לאדות את הממס לחלוטין כמו בשלב 3.1, ולהוסיף 6 מ"ל נוזל נצנוץ שומנים מיובשים. מניחים את המדף המכיל בקבוקוני נצנצים לתוך דלפק נוצץ. בחר באפשרות ספירת ארון תקשורת יחיד והתאם את זמן הספירה ל- 2 דקות לכל מתקן. תוצאות מדלפק הניצוץ יודפסו וניתן יהיה לדמייןן כגרף עמודות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה, הוכחנו כי תיוג, זיהוי וכימות של מינים NL יכול להתבצע על ידי 14C-חומצה אצטית תיוג מטבולי. מינים NL העיקריים ניתן להפריד במערכת ממס של 50:40:10:1 (v /v/v/v%) Hexane:אתר נפט:אתר Diethyl:חומצה אצטית (איור 1A, B). הדמיית זרחן מאפשרת הדמיה חזותית של חומצת שומן חופשית מסומנת (FFA), טריאציליגליצרול (TG), דיאקיליגליצרול (DG), כולסטרול (Chol) וסקוואלן (SQ)(איור 1A). למרות SEs ניתן להפריד ממיני NL אחרים בממס זה, אף אחד לא מזוהה autoradiogram בעקבות פעימה של 20 דקות. זה עשוי להיות מיוחס סינתזה SE איטי במהלך השלב הנייח של צמיחה בשמרים. כמו כן, ניתן להפריד בין מיני שומנים מטוהרים בשיטה זו, ולאחר מכן לדמיין על ידי ריסוס של צלחת TLC עם ריאגנט p-anisaldehyde (איור 1B). בעוד שמינים של NL מופרדים היטב בממס זה, מינים קוטביים כמו פוספטידילכולין (PC) נשארים במקור(איור 1B). על ידי החלת תקופת מרדף במדיה נטולת רדיולאבל בעקבות הדופק, ניתן למדוד שטף יחסי דרך מסלולי NL (איור 1C). לאחר מרדף של 10 דקות, הבריכה הגדולה של SQ נעלמה, וסך הכל Chol הוא מוגבה. באופן דומה, המראה של DG בתקופת המרדף תואם עם ירידה באות FFA.
איור 1: 14חומצה C-Acetic radiolabeling מאפשר זיהוי של מינים רבים NL. (A)Autoradiogram של שומנים מופרדים על ידי TLC מבודד שמרים radiolabeled עם 14C-חומצה אצטית בשלב נייח. מינים הניתנים לזיהוי בבירור כוללים חומצת שומן חופשית (FFA), טריגליצרידים (TG), דיאקילגליצרול (DG), כולסטרול (Chol) וסקוואלן (SQ). להקות ללא תווית הן מינים לא מזוהים של NL. (B)מינים מטוהרים של שומנים מופרדים על ידי TLC ומדמיינים על ידי כתמי p-אניסלדהיד. מינים חזותיים כוללים את כל השומנים המוזכרים ב- (A) בנוסף אסטרי סטרול (SE) ופוספטידילכולין (PC). (C)Autoradiogram של שומנים מופרדים על ידי TLC מבודד שמרים פעמו עם 14-חומצה אצטית בשלב נייח ואחריו תקופת מרדף של 10 דקות במדיה ללא רדיובל. היעלמותה של SQ היא נפגשה עם עלייה Chol. עלייה ב- DG בתקופת המרדף מלווה בירידה במינים של FFA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים: מתכונים למאגרים, מדיה ופתרונות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, פרוטוקול radiolabeling תכליתי תכליתי כדי לפקח כמותית על הסינתזה של מינים NL בשמרים מוצג. פרוטוקול זה הוא מודולרי מאוד, המאפשר לסיים את ההליך בתוך 3-6 ימים. בנוסף, שפע של ספרות קיים על השימוש TLC להפריד מינים שומנים ומטבוליטים, אשר אמור לאפשר למשתמש לזהות כמה מינים שומנים של עניין עם שינוי פשוט של מערכות ממס TLC16,19. פרוטוקול זה תורם להפרדה, איתור וכימות של שומנים עם כיתוב רדיו. זה יכול גם להיות יחד עם תקופת מרדף במדיה לא מתויגת כדי לזהות את זמן המחזור של NLs שכותרתו. באופן קולקטיבי, הליך זה נותן מבנה שימושי להתחיל לחקור את radiolabeling של מינים NL.
שיטות אחרות, כגון HPLC, GC-MS ו-UPLC-MS מספקות רזולוציה גבוהה יותר של הפרדת שומנים וכימות; עם זאת, זה בדרך כלל לא אופטימלי להפעיל דגימות radiolabeled באמצעות טרבלים, אם כי זה יכול להתגבר באמצעות איזוטופים יציבים. עם זאת, שיטת radiolabel זו מספקת רגישות גבוהה לזיהוי ורב-תכליתיות עבור מינים שומנים רבים. יתרון נוסף של פרוטוקול זה בהשוואה ל- MS הוא יכולתו. הפרדת TLC של שומנים היא פשוטה יחסית, אינה דורשת ציוד ראוותני, ונשענת על חומרי מעבדה נפוצים. לגבי מגבלות: מינים מסוימים בעלי שפע נמוך, כמו ליסו-שומנים, לא ניתן לזהות גם לאחר שילוב של תווית 14C. בנוסף, רוב גישות TLC אינן מתאימות לאפיונים 'ליפידומיים', בשל ההפרדה כמובן מגורען של מינים שומנים בתוך ממס נתון.
שמרים מציעים מערכת מודל נוחה ומתיחה גנטית לחקר שומנים באמצעות גישות ביוכימיות radiolabel. עם זאת, יש לציין כי ברקע גנטי ספציפי, או במהלך תנאי גדילה מטבוליים מסוימים, ספיגת התאים של חומצה רדיולאבלית-אצטית או radiolabels אחרים עשויים להיות מופחתים. תיוג של תאים עם 14C-חומצה אצטית בהיעדר גלוקוז מגביר בחוזקה את ספיגת radiolabel. דגירה ארוכה בהיעדר גלוקוז תגדיל באופן יחסי את ספיגת הרדיבל; עם זאת, זה עשוי להשפיע גם על המסלולים המדוברים. לכן, תיוג יעילות עבור מצב צמיחה מסוים צריך להיות נקבע לפני ביצוע פרוטוקול radiolabeling חומצה C-14C במלואו. בפרט, לשים לב לאורך תקופת radiolabeling. זמן התיוג צריך להישמר קצר ככל האפשר כדי לזהות את מינים השומנים של עניין. בסך הכל, הליך זה מאפשר מחקר של תגובות סינתזה שומנים חשובות צריך לאפשר את החקירה של ויסות NL בתאים שלמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים בהכנת כתב יד זה.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לחברי מעבדת חן על עזרה וייעוץ רעיוני בסיום מחקר זה. W.M.H. נתמך על ידי כספים מקרן וולש (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), קרן המחקר הרפואי Ara Paresghian, ותוכנית המלומדים UT Southwestern ניחן. S.R נתמך על ידי מענק תוכנית T32 (5T32GM008297).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V.
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P.
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
