Summary
Här presenteras ett protokoll för metabolisk märkning av jäst med 14C-ättiksyra, som är i kombination med tunn lagerkromatografi för separation av neutrala lipider.
Abstract
Neutrala lipider (NLs) är en klass hydrofoba, laddningsfria biomolekyler som spelar nyckelroller i energi och lipidhomeostas. NLs är syntetiserade de novo från acetyl-CoA och finns främst i eukaryoter i form av triglycerider (TGs) och sterol-estrar (SEs). Enzymerna som ansvarar för syntesen av NLs är mycket bevarade från Saccharomyces cerevisiae (jäst) till människor, vilket gör jäst till en användbar modellorganism för att dissekera funktionen och regleringen av NL metabolism enzymer. Medan mycket är känt om hur acetyl-CoA omvandlas till en mångfald av NL arter, mekanismer för reglering NL metabolism enzymer, och hur felreglering kan bidra till cellulära patologier, fortfarande upptäcks. Många metoder för isolering och karakterisering av NL-arter har utvecklats och använts under årtionden av forskning. Ett kvantitativt och enkelt protokoll för omfattande karakterisering av större NL-arter har dock inte diskuterats. Här presenteras en enkel och anpassningsbar metod för att kvantifiera de novo-syntesen av större NL-arter i jäst. Vi tillämpar 14C-ättiksyra metabolisk märkning i kombination med tunn lagerkromatografi för att separera och kvantifiera ett varierat utbud av fysiologiskt viktiga NLs. Dessutom kan denna metod enkelt tillämpas för att studera in vivo reaktionshastigheter av NL enzymer eller nedbrytning av NL arter över tid.
Introduction
Acetyl-CoA är den grundläggande byggstenen i olika biomolekyler inklusive neutrala lipider (NLs), som fungerar som en mångsidig biomolekylär valuta för att bygga membran, generera ATP och reglera cellsignalering1,2. Tillgången till NLs som ska shuntas in i någon av dessa respektive vägar regleras delvis av deras lagring. Lipiddroppar (LD), cytoplasmiska organeller bestående av hydrofoba kärnor av triglycerider (TGs) och sterolestrar (SEs), är de viktigaste förvaringsfacken för de flesta cellulära NLs. Som sådan spärrar och reglerar LDs NLs, som kan försämras och därefter användas för biokemiska och metaboliska processer3,4. Det är känt att felreglering av NL och LD-associerade proteiner är korrelerad med uppkomsten av patologier inklusive lipodystrofi och metabola syndrom5,6. På grund av detta är nuvarande LD-forskning intensivt inriktad på hur NL-syntesen regleras rumsligt, tidsmässigt och över distinkta vävnader av multicellulära organismer. På grund av de allestädes närvarande cellulära rollerna för NLs, många enzymer som ansvarar för syntes och reglering av NLs bevaras i hela eukaryoter7. Faktum är att även vissa prokaryoter lagrar NLs i LDs8. Därför har genetiskt kanterbara modellorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirande jäst) varit användbara för studier av NL-syntes och reglering.
Separation och kvantifiering av NLs från cell extrakt kan åstadkommas på en mängd olika sätt, inklusive gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), högpresterande flytande kromatografi (HPLC) och ultra-prestanda flytande kromatografi-masspektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Kanske är den enklaste metoden för att separera NLs via tunn lagerkromatografi (TLC), vilket möjliggör efterföljande densitometrisk kvantifiering från enstandardkurva 12,13. Även om TLC endast ger en kurskornig separation av NLs, är det fortfarande en kraftfull teknik eftersom det är billigt, och det möjliggör snabb separation av NLs från flera prover samtidigt. Två av de viktigaste utmaningarna som studien av NLs via TLC står inför är: 1) det breda utbudet av cellulära överflöd av NL-arter och deras intermediärer, och 2) utbudet av hydrofilicitet/hydrofobi för lipid intermediärer inom NL syntesvägar. Kvantifieringen av NL-arter via TLC är därför vanligtvis begränsad till de vanligaste arterna. Införandet av en 14C-ättiksyra radiolabel kan dock avsevärt förbättra upptäckten av låg överflöd intermediärer inom NL vägar. Ättiksyra omvandlas snabbt till acetyl-coa av acetyl-CoA-syntas ACS214, vilket gör 14C-ättiksyra till ett lämpligt radiomärkningssubstrat i jäst15. Dessutom kan separation av både hydrofoba NLs och hydrofila intermediärer av NLs uppnås genom TLC genom användning av flera lösningsmedelssystem16. Här presenteras en metod för separation av NLs med 14C-ättiksyra metabolisk märkning i jäst. Lipider märkta under pulsperioden isoleras därefter av ett väletablerat totalt lipidisoleringsprotokoll17, följt av separation av NL-arter med TLC. Utveckling av TLC-plattor genom både autoradiografi för att visualisera märkta lipider och en kemisk spray för att visualisera totala lipider, tillåter flera kvantifieringsmetoder. Enskilda lipidband kan också enkelt extraheras från TLC-plattan med hjälp av ett rakblad, och scintillationsräkning kan användas för att kvantifiera mängden radiomärkt material i bandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillväxt och märkning av jästceller med 14C-ättiksyra
- Inokulera en jästkultur genom att välja en koloni från en tallrik och dela ut den i 20 ml syntetiskt komplett (SC) medium som innehåller 2% dextros (se Kompletterande fil för receptet på SC-media). Inkubera vid 30 °C för natten med skakningar vid 200 varv/min.
OBS: Tillväxttillstånd, provvolym och behandling kommer att skilja sig åt beroende på lipider av intresse. Innan fullständiga experiment körs bör optimala tillväxtförhållanden och odlingsvolymer bestämmas empiriskt. Detta protokoll diskuterar radiomärkning av jästkulturer som vuxit till stationär fas, en tillväxtfas när biomembran- och celltillväxten saktar in och NL-syntesen är mycket aktiv. - Mät OD600 i nattkulturen med hjälp av en spektrofotometer och späd jästcellskulturen till en slutlig OD600 på 0,2 i 50 ml färska SC-medier som innehåller 2% dextros. Odla cellerna i 24 timmar, eller tills de har nått den stationära fasen (som vanligtvis definieras av ett platt foder i cellen som fördubblar OD600-mätningen).
- Innan du samlar in cellerna, gör släckningsbufferten (se Kompletterande fil för mer information). Gör två 20 ml alikvoter av släckbuffert för varje prov (dvs. 40 ml släckbuffert för varje prov) och dela jämnt i två koniska rör på 50 ml). Förvara släckbufferten vid -80 °C för framtida användning.
- När kulturerna har nått önskad OD- eller tillväxtfas samlar du in cellerna genom att centrifugera vid 4 100 x g i 10 minuter. Medan proverna finns i centrifugen bereder du radiomärkningsmedier genom att tillsätta [1-14C] ättiksyranatriumsalt till dextrosfria SC-medier vid en slutlig koncentration på 10 μCi/ml.
VARNING: Korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) ska bäras alla gånger vid arbete med radioaktiva material. Följ alltid lokala riktlinjer för korrekt lagring, användning och bortskaffande av radioaktiva material.
OBS: Både koncentrationen av 14C-ättiksyra i märkningsmedierna och inkubationstiden för radiomärkning bör justeras i enlighet med den eller de metaboliter som är av intresse. Här används en 20 min radiomärkningspulsinkubation, vilket är tillräckligt för att märka NL-arter med en rad överflöd. - Ta bort supernatanten från de pelleterade cellerna och tvätta cellpelleten en gång med 20 ml dextrosfria SC-medier genom att återanvända pelleten med en pipett. Samla cellerna igen genom att centrifugera vid 4 100 x g i 5 min.
- Återanvänd cellerna i 1 ml dextrosfria SC-medier och överför cellerna till ett märkt 2 ml mikrocentrifugrör. Samla cellerna igen genom att centrifugera vid 4 100 x g i 2 minuter.
- Återanvänd cellerna en gång i 500 μL dextrosfria SC-medier. Förkyl en centrifuge utrustad för 50 ml koniska rör till -10 °C eller på lägsta temperaturinställning.
- Börja radiomärkningsperioden genom att snabbt tillsätta 500 μL radiomärkningsmedier till varje 500 μL cellfjädring (slutlig koncentration av 14C-ättiksyra = 5 μCi/ml). Inkubera rören i en roterande inkubator vid 30 °C i 20 min. 2 min före märkningsperiodens slut, överför en 20 ml alikvot av släckbuffert för varje prov från frysen -80 °C till en hink is
- När radiomärkningsperioden är slut, använd en pipett för att doppa hela 1 ml-provet i 20 ml kallsläckningsbuffert. Virvel de koniska rören i 5-10 s för att säkerställa att provet har blandats noggrant med släckbufferten. Inkubera proverna i släckbuffert i 2 minuter på is.
- Samla cellpelleten genom att snurra i en centrifuge vid 5 000 x g i 3 min inställd på -10 °C eller på lägsta temperaturinställning. Medan provrören snurrar överför du en annan uppsättning släckbuffert alikvot från frysen -80 °C till en hink fylld med is (dvs. ett 20 ml-rör med släckbuffert per prov).
- Ta bort släckningsbuffertens supernatant från cellpellets och ersätt den med 20 ml färsk, kall, släckbuffert. Virvel och skaka proverna tills pelleten har lossnat från botten av det koniska röret och återanvänds helt i släckningsbufferten. Centrifugera proverna igen vid 5 000 x g i 3 min vid -10 °C för att samla in cellerna.
- När cellerna har pellets, ta noggrant bort all släckningsbuffert från proverna genom att hälla av supernaten och ta bort överskottet med en pipett. Förvara rör vid -80 °C för vidare bearbetning.
2. Isolering av totala lipider från jäst
OBS: Följande protokoll för lipidisolering är baserat på en väletablerad och ofta använd metod som effektivt extraherar de flesta neutrala lipidarter17,18.
VARNING: Använd alltid lämplig personlig skyddsutrustning när det används och arbeta inuti en rökhuv när det är möjligt. Under lipidextraktion, undvik att använda plast som är oförenlig med organiska lösningsmedel. Polypropylenrör är lämpliga för följande protokoll.
- Väg 0,3 g syratvättade glaspärlor för varje prov och förvara dem i 2 ml mikrocentrifugrör på is. Ta bort cellpelletsen från frysen -80 °C och håll dem på is. Tillsätt 350 μL metanol och 700 μL kloroform till varje prov, återanvänd och överför till mikrocentrifugrör som innehåller förvägda glaspärlor.
- Lyse celler genom att agitera rör på en virvel 3x i 1 min, med 30 s inkubationer på is mellan agitationer. Alternativt kan celler lysas med en mini pärl-visp i tre 1-minuters cykler. Spara 25-30 μL helcellslyat i ett separat rör för scintillationsräkning.
OBS: Det sparade lysatet kommer att användas för att bestämma den relativa mängden radioisotoper som tas upp av varje prov under pulsperioden, vilket kommer att påverka mängden av varje prov som laddas på TLC-plattan. Detta diskuteras ytterligare i steg 3.2. - Häll hela innehållet i 2 ml mikrocentrifugrör på 2 ml i ett 15 ml glascentrifugrör [Rör A]. Tvätta de 2 ml mikrocentrifugrören genom att tillsätta 1 ml metanol och virvel i 10-15 s. Överför 1 ml metanoltvätt till rör A och tillsätt 2 ml kloroform till rör A följt av 400 μL vatten för en slutlig provvolym på 4,45 ml.
- Virvelprover i 1 min följt av en 5 min centrifugering vid 1 000 x g. Efter centrifugation bör de vattenhaltiga (övre) och organiska (nedre) faserna tydligt separeras visuellt med cellskräp som ligger vid gränssnittet.
- Använd en pastörpipett i glas, samla den organiska fasen från rör A och flytta till ett nytt 15 ml glascentrifugrör (rör B). Tillsätt 1 ml 1M KCl till rör B. Tillsätt 1 ml metanol och 2 ml kloroform och 200 μL MiliQ-vatten till rör A. Upprepa virvel- och centrifugeringsstegen på rör A.
- Samla återigen upp den organiska fasen från rör A och tillsätt den i rör B. Kassera rör A i en lämplig behållare. Virvelrör B i 1 min följt av en 5 min centrifugering vid 1 000 x g.
- Ta bort det övre vattenskiktet från rör B och kassera det. Tillsätt 1 ml färsk 1 M KCl tillbaka till rör B och upprepa virvel-/centrifugeringssteget. När lagren har separerats samlar du försiktigt hela det nedre organiska skiktet i en märkt 4 ml glasflaska.
OBS: I detta steg kan lipidextrakt lagras vid -80 °C, eller protokollet kan fortsätta för TLC-separation av lipider.
3. Separation och kvantifiering av radioisotopemärkta NLs med tunn skiktkromatografi
- Om lipidextrakt placerades vid -80 °C, för långsamt till rumstemperatur genom att inkubera på is och därefter på en bänkskiva. Avdunsta lösningsmedel helt från lipidextrakt genom att dammsuga eller använda en skonsam ström av inert gas (t.ex. argon eller kväve). Värm under tiden en ugn till 145 °C för uppvärmning av TLC-plattan.
- Innan proverna kan laddas på TLC-plattan, bestäm relativa mängder radiomärke som tas upp av cellerna. Pipett 10 μL av hela cellen lyserar från steg 2,2 till en 6 ml glasscintillationsflaska, tillsätt 6 ml scintillationsvätska och placera injektionsflaskor i ett rack. Använd en scintillationsräknare för att mäta cpm eller dpm för varje prov med alternativet räkna ett rack inställt på en 1 min inventeringstid. Mät varje cell lysat i duplicerat för att få ett genomsnitt för varje prov. Justera lastmängden enligt ett vildtyps- eller referensprov
OBS: Mängden av varje prov som ska belastningas på TLC-plattan kan bestämmas med hjälp av följande ekvation: (genomsnittligt antal prov)/(genomsnittligt referensantal) x önskad belastningsvolym. Om till exempel 20 μL av referensprovet ska lastas på TLC-plattan och har ett genomsnittligt antal på 1 000, kommer ett experimentellt prov med ett genomsnittligt antal på 2 000 att ha 10 μL laddat på TLC-plattan. - Rekonstruera provets lipider i 40-50 μL 1:1 (v/v%) kloroform:metanol genom virvel i 5 min. Förbered 101 ml av det mobila faslösningsmedlet i en glasklassad cylinder (se avsnittet Representativa resultat för ett exempel på större NL-artseparation med en 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Petroleumeter:Dietyleter:Ättiksyralösningsmedel).
- Häll lösningsmedlet i en TLC-kammare i glas som innehåller en 20 x 20 TLC mättnadsdyna och ett tätt passande lock. Förbered en kanaliserad 20 x 20 kiselgel 60 G-platta genom att försiktigt markera en linje 1,5 cm över botten av plattan med en penna. Linjen anger ursprunget och var lipiderna ska laddas. Under linjen, märk försiktigt provet som ska lastas i varje körfält. När TLC-plattan har förberetts, inkubera plattan i en 145 °C ugn i minst 30 minuter för att förvärma plattan och avlägsna eventuell överskott av fukt.
- När plattan har värmts upp tillräckligt och TLC-mättnadsdynan är mättad med lösningsmedel, ta bort TLC-plattan från ugnen och fortsätt omedelbart att ladda TLC-plattan. Lastning av plattan medan den är varm säkerställer snabb lösningsmedelsavdunstning. För varje lipidart av intresse bör du lasta 5–20 μg av en renad lipidstandard på ett körfält på TLC-plattan för att spåra separation och förväntad migrationssträcka. Använd en pipett och placera 5 μL prov på varje körfälts ursprung som ligger 1,5 cm ovanför botten av TLC-plattan. Upprepad belastning på 5 μL-fläckar tills 20-40 μL prov har lastats i varje körfält.
OBS: 5-20 μg omärkta renade lipider kan läggas till varje provkörfält som spårämnen som kan färgas och visualiseras efter TLC-separation av lipider. Förekomsten av en färgad standard möjliggör enkel spårning och excision av radiomärkta lipidband för efterföljande scintillationsräkning. Vilka renade standarder som laddas på plattan kommer att bestämmas av NL-arterna av intresse. Se avsnittet Representativt resultat för exempel på separation av oljesyra (FFA), 1,2 dioleoyl-glycerol (DG), triolein (TG), kolesterol (Chol), kolesteryllinoleat (SE) och squalene i körfält intill provbanorna. - När standarden och de experimentella proverna har laddats placerar du plattan i utvecklingskammaren och väntar tills lösningsmedlet har nått toppen av plattan (40-60 min). När plattan är fullt utvecklad, ta bort den från kammaren och låt den torka i rökhuven i 20 minuter.
- När plattan har torkats, täck den med plastfilm och placera den i en utvecklande kassett med en autoradiografiskärm. Låt plattan utvecklas med skärmen i 24-48 h.
4. Visualisering och kvantifiering av TLC-separerade lipider
- Ta bort skärmen från den utvecklande kassetten och placera inuti en fosforbildare. Välj alternativet Fosforavbildning och utvecklas vid 800-1000 V.
OBS: Fosforavbildning ger en kvalitativ bild av radiomärkta lipider på TLC-plattan. Kvantifiering av radiomärkta lipider uppnås dock bäst genom scintillationsräkning, som beskrivs senare. - Blanda 100 ml p-anisaldehydreagens (se kompletterande fil)och deponera i en glassprayflaska. Spraya TLC-plattan med p-anisaldehydreagens tills kiseldioxiden är mättad. Grädda tallriken i en ugn på 145 °C i 5 minuter, eller tills band har dykt upp.
- För att kvantifiera enskilda lipidarter med hjälp av radiolabelscintillationsräkning, använd ett rakblad för att skrapa kiselgelen från glas TLC-plattan. Överför varje kiselgelband som motsvarar en enda etikettslipidart med radiolabelt glas till en glasscintillationsflaska och tillsätt 6 ml scintillationsvätska. Virvel kraftigt tills kiseldioxidbandet har reducerats till små bitar.
- Alternativt kan lipider extraheras från kiselgelbandet med lipidextraktionsprotokollet i avsnitt 3. Om lipider extraheras från kiselgelen, avdunsta lösningsmedlet helt enligt steg 3.1 och tillsätt 6 ml scintillationsvätska till de torkade lipiderna. Placera hyllan som innehåller scintillationsflaskan i en scintillationsräknare. Välj alternativet Räkna enstaka rack och justera räknetiden till 2 minuter per flaska. Resultat från scintillationsräknaren skrivs ut och kan visualiseras som ett stapeldiagram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll har vi visat att märkning, detektion och kvantifiering av NL-arter kan åstadkommas genom 14C-ättiksyra metabolisk märkning. Större NL-arter kan separeras i ett lösningsmedelssystem på 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexane:Petroleumeter:Dietyleter:Ättiksyra (Figur 1A, B). Fosforavbildning möjliggör visualisering av märkt fri fettsyra (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) och squalene (SQ) (Figur 1A). Även om SEs kan separeras från andra NL arter i detta lösningsmedel, ingen detekteras i autoradiogram efter en 20-minuters puls. Detta kan hänföras till långsam SE-syntes under den stationära fasen av tillväxt i jäst. Det kan också påvisas att renade lipidarter kan separeras i denna metod och därefter visualiseras genom sprutning av TLC-plattan med p-anisaldehydreagens (figur 1B). Medan NL-arter är väl åtskilda i detta lösningsmedel, stannar polära arter som fosfatidylkolin (PC) vid ursprunget (Figur 1B). Genom att tillämpa en jaktperiod i radiolabelfria medier efter pulsen kan relativa flödet genom NL-vägar mätas (figur 1C). Efter en 10-minuters jakt har den stora poolen av SQ försvunnit, och totalt Chol är förhöjd. På samma sätt korrelerar utseendet på GD under jaktperioden med en minskning av FFA-signalen.
Figur 1: 14C-ättiksyraradiabelring gör det möjligt att påtäcka flera NL-arter. a)Autoradiogram av lipider åtskilda av TLC som är isolerade från jäst som är radioaktivt med 14C-ättiksyra i stationär fas. Klart detekterbara arter inkluderar fri fettsyra (FFA), triglycerid (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) och squalene (SQ). Omärkta band är oidentifierade NL-arter. B)Renade lipidarter åtskilda av TLC och visualiserade genom p-anisaldehydfärgning. Visualiserade arter inkluderar alla lipider som nämns i (A) förutom sterolestrar (SE) och fosfatidylkolin (PC). C)Autoradiogram av lipider åtskilda av TLC isolerade från jäst pulserade med 14-ättiksyrai stationär fas följt av en 10 minuters jaktperiod i radiolabelfria medier. Sqs försvinnande möts av en ökning av Chol. Ökningen av GD under jaktperioden åtföljs av minskning av FFA-arter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande fil: Recept för buffertar, media och lösningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenteras ett mångsidigt radiomärkningsprotokoll för att kvantitativt övervaka syntesen av NL-arter i jäst. Detta protokoll är mycket modulärt, vilket gör att proceduren kan avslutas inom 3-6 dagar. Dessutom finns det en mängd litteratur om användningen av TLC för att separera lipidarter och metaboliter, vilket bör göra det möjligt för användaren att upptäcka flera lipidarter av intresse med en enkel förändring av TLC-lösningsmedelssystem16,19. Detta protokoll bidrar till separation, detektion och kvantifiering av radiomärkta lipider. Det kan också kopplas till en jaktperiod i omärkta medier för att upptäcka omsättningstiden för märkta NLs. Tillsammans ger detta förfarande en användbar struktur för att börja utforska radiomärkningen av NL-arter.
Andra metoder, såsom HPLC, GC-MS och UPLC-MS ger högre upplösning av lipidseparation och kvantifiering. Det är dock vanligtvis inte optimalt att köra radiomärkta prover genom MS, även om detta kan övervinnas med hjälp av stabila isotoper. Denna radiolabelmetod ger dock hög detektionskänslighet och mångsidighet för många lipidarter. En annan fördel med detta protokoll jämfört med medlemsstaterna är dess överkomliga priser. TLC-separation av lipider är relativt enkel, kräver ingen extravagant utrustning och förlitar sig på vanliga laboratoriematerial. När det gäller begränsningar: vissa arter med låg förekomst, som lyso-lipider, kanske inte kan upptäckas ens efter införlivandet av en 14 C-etikett. Dessutom är de flesta TLC-metoder inte lämpliga för "lipidomic" karakteriseringar, på grund av den kurskorniga separationen av lipidarter inom ett givet lösningsmedel.
Jäst erbjuder ett bekvämt, genetiskt kantbart modellsystem för studier av lipider via radiolabel biokemiska metoder. Det bör dock noteras att i specifika genetiska bakgrunder, eller under särskilda metabola tillväxtförhållanden, kan det cellulära upptaget av radiomärkt ättiksyra eller andra radiolabels minskas. Märkning av celler med 14C-ättiksyra i avsaknad av glukos ökar robust upptaget av radiomärket. Långa inkubationer i avsaknad av glukos kommer proportionellt att öka radiomärkningens upptag; Detta kan dock också påverka de omst på de olika vägarna. Märkningseffektivitet för ett visst tillväxttillstånd bör därför fastställas innan 14 C-syraradiellmärkningsprotokollet följs i sin helhet. Var särskilt uppmärksam på längden på radiomärkningsperioden. Märkningstiden bör hållas så kort som möjligt för att upptäcka lipidarter av intresse. Sammantaget möjliggör detta förfarande studier av viktiga lipidsyntesreaktioner och bör möjliggöra undersökning av NL-reglering i intakta celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några konkurrerande intressen i utarbetandet av detta manuskript.
Acknowledgments
Författarna vill tacka medlemmarna i Henne-labbet för hjälp och konceptuell rådgivning i slutförandet av denna studie. W.M.H. stöds av medel från Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund och UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R har fått stöd av ett T32-programbidrag (5T32GM008297).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V.
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P.
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. "Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
