Summary
我们描述了一种快速而强大的方案,以从小鼠脾脏中富集不变的自然杀伤T(iNKT)细胞,并在体外将其扩增至适合体外和体内研究的数量。
Abstract
不变的自然杀伤性T(iNKT)细胞是先天性样T淋巴细胞,表达保守的半不变T细胞受体(TCR),该受体对非多态性MHC I类相关分子CD1d呈递的自身或微生物脂质抗原具有特异性。iNKT细胞在整个物种中都非常保守,小鼠模型(包括CD1d缺陷或iNKT缺陷小鼠)促进了它们的研究,并且有可能在小鼠和男性中明确检测到它们,CD1d四聚体或mAbs特异性为半不变TCR。然而,iNKT细胞是罕见的,它们需要扩增以达到任何研究的可管理数量。由于原代小鼠iNKT细胞系的体外生成已被证明是困难的,因此我们已经建立了一个强大的方案来纯化和扩增来自iVα14-Jα18转基因小鼠(iVα14Tg)的脾iNKT细胞,其中iNKT细胞的频率是其30倍。我们在这里表明,原代脾iVα14Tg iNKT细胞可以通过免疫磁性分离过程富集,产生约95-98%纯iNKT细胞。纯化的iNKT细胞受到抗CD3 / CD28微球加IL-2和IL-7的刺激,导致培养物的天+14的30倍扩增,纯度为85-99%。扩增的iNKT细胞可以很容易地进行遗传操纵,为在体外解剖激活和功能机制提供了宝贵的工具,更重要的是,在体内过继转移时也是如此。
Introduction
不变的自然杀伤性T细胞(iNKT细胞)是先天性T淋巴细胞,表达半不变的αβ T细胞受体(TCR),由不变的Vα14-Jα18链与一组有限的不同Vβ链1配对,其特异性地存在于小鼠中,该链特异性于MHC I类相关分子CD1d2呈递的脂质抗原。iNKT细胞经历激动剂选择程序,导致获得已经在胸腺中的活化/先天效应表型,这发生在几个成熟阶段3,4,产生CD4+和CD4-亚群。通过该程序,iNKT细胞获得不同的T辅助(TH)效应子表型,即TH1(iNKT1),TH2(iNKT2)和TH17(iNKT17),可通过转录因子T-bet,GATA3,PLZF和RORγt的表达来识别,分别为5。iNKT细胞识别一系列微生物脂质,但对内源性脂质也具有自我反应性,内源性脂质在细胞应激和组织损伤的病理情况下上调,例如癌症和自身免疫2。激活后,iNKT细胞通过直接接触和细胞因子产生调节其他先天性和适应性免疫效应细胞的功能2。
小鼠模型(包括CD1d缺陷小鼠或Jα18缺陷小鼠)以及抗原负载CD1d四聚体的产生以及人为半不变TCR特异性单克隆抗体(mAbs)的产生促进了iNKT细胞的研究。然而,原代小鼠iNKT细胞系的产生已被证明是困难的。为了更好地表征iNKT细胞的抗肿瘤功能并将其用于过继细胞治疗,我们建立了一个方案来纯化和扩增iVα14-Jα18转基因小鼠(iVα14Tg)6的脾iNKT细胞,其中iNKT细胞的频率是野生型小鼠的30倍。
扩增的iNKT细胞可用于体外测定,并在体内转移回小鼠体内。例如,在这种情况下,我们已经展示了它们有效的抗肿瘤作用7。此外,体外扩增的iNKT细胞在体内注射8之前可以通过基因转移或编辑进行功能修饰,从而可以对分子途径进行有见地的功能分析,并为先进的细胞疗法铺平道路。
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Protocol
这里描述的程序由圣拉斐尔科学研究所的机构动物护理和使用委员会(IACUC)(第1048号)审查和批准。
注意:所有程序必须在无菌条件下进行。所有使用的试剂都列在 材料表。
1. 脾脏加工
- 根据机构政策,通过吸入CO2 对iVα14-Jα18小鼠实施安乐死。
注意:iVα14-Jα18小鼠必须8周大或以上。为了避免从细胞的体内转移中排斥细胞,请考虑从雌性小鼠中分离的细胞可以在雄性和雌性受体中过继转移,而从雄性小鼠中分离的细胞只能在雄性受体中转移。对于体外实验,必须不考虑性别偏见。可以汇集更多的小鼠以获得更多的细胞。 - 解剖小鼠脾脏并通过70nm细胞过滤器粉碎,以获得10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)和2%胎牛血清(FBS)中的单细胞悬浮液。
- 以300×g离心5分钟。
- 通过倒置并用红细胞裂解缓冲液处理去除上清液。用1mL无菌ACK(铵 - 氯化铵 - 钾)裂解缓冲液重悬细胞沉淀,在室温下孵育3分钟,并用5mLPBS和2%FBS阻断。以300×g离心5分钟。
注意:ACK是市售的;它由0.15 M NH4 Cl,10mM KHCO3和0.1mM Na2EDTA(乙二胺四乙酸)的溶液组成,溶解在双搅拌H2O,pH 7.2-7.4中。如果是自制的,请用0.22μm过滤器过滤灭菌。 - 通过反转除去上清液。将细胞沉淀重悬于3mLPBS中,含2%FBS,并通过移液去除脂肪残留物。如果需要,池化来自不同小鼠的细胞。
- 计数细胞并保持50μL用于FACS分析。
2. T细胞富集
注意:对于富集步骤,快速工作,保持细胞冷,并使用在4°C下预冷过夜的溶液,然后保持在冰上
- 以300×g离心5分钟。
- 将所有细胞重悬于适量的PBS中,具有2%FBS(500μL用于107 个细胞)和Fc阻断剂(2.5μL×107 个细胞);在室温(RT)下孵育15分钟。
- 每10个7 个细胞用1-2mL MACS分离缓冲液(MB)洗涤,并以300×g离心10分钟。
注:MACS 缓冲器已市售。它由PBS pH 7.2,0.5%牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA组成。如果是自制的,请用0.22μm过滤器过滤灭菌。 - 通过倒置除去上清液,并用CD19-FITC和H2(IA b)-FITC染色细胞(使用5μL×107个细胞在100μLMB中)。充分混合,在4-8°C的黑暗中孵育15分钟。
- 通过每10个7 个细胞加入1-2mL MB来洗涤细胞,并以300×g离心10分钟。
- 完全移液上清液,并将细胞沉淀重悬于每10个7 个细胞的90μL MB中。每10个7 个细胞加入10μL抗FITC微珠。充分混合,在4-8°C的黑暗中孵育15分钟。
- 通过每10个7 个细胞加入1-2mL MB来洗涤细胞,并以300×g离心10分钟。
- 完全移液上清液,并在500μL MB中重悬至1.25×108 个细胞。
- 在MACS分离器的磁场中放置一个LD柱以继续进行耗尽。为避免堵塞,请在LD柱上应用预分离过滤器,并用2 mL MB冲洗。
- 当柱储液器为空时,将细胞悬浮液施加到过滤器上。收集通过列的未标记单元格。
- 仅当色谱柱储液器为空时,用 1 mL MB 洗涤 3 次。收集总流出物,这些流出物将在T细胞中富集,并计数细胞。始终保持50μL用于FACS分析。
3. iNKT细胞富集
- 以300×g离心5分钟,并通过倒置除去上清液。
- 根据抗体滴定法,用CD1d-四聚体-PE(小鼠PBS57-CD1d-四聚体)染色细胞,每10个6 个细胞中50μL MB。搅拌均匀,在黑暗中在冰上孵育30分钟。
注:该程序也可以使用APC标记的mCD1d四聚体和抗APC珠进行;相应地调整用于以下染色的荧光染料。在本实验方案中,我们使用NIH提供的小鼠PBS-57-CD1d-四聚体。α半乳糖基神经酰胺(αGal-Cer)是iNKT细胞识别的原型抗原;PBS-57是αGal-Cer的类似物,溶解度提高9;NIH四聚体设施提供与CD1d四聚体复合的PBS-57配体。然而,其他CD1d二聚体/四聚体/解构体是市售的,并且可以装载脂质抗原作为αGal-Cer。我们设想了调整协议以供其使用的可能性。 - 通过每10个7 个细胞加入1-2mL MB来洗涤细胞,并以300×g离心10分钟。
- 完全移液上清液,并将细胞沉淀重悬于每10个7 个细胞的80μL MB中。每10个7 个细胞加入20μL抗PE微珠。充分混合,在4-8°C的黑暗中孵育15分钟。
- 通过每10个7 个细胞加入1-2mL MB来洗涤细胞,并以300×g离心10分钟。
- 完全移液上清液,并在500μL MB中重悬多达108 个细胞。否则,如果细胞超过108,请相应地调节音量。
- 根据细胞计数,在MACS分离器的磁场中放置LS(最多108)或MS(最多107)柱。用MB冲洗色谱柱(LS为3 mL,MS为500μL)。
- 将细胞悬浮液施加到色谱柱上。
- 收集通过的未标记的细胞。仅当色谱柱储液器为空时,通过加入适量的MB(LS柱为3 x 3 mL,MS柱为3 x 500μL)洗涤色谱柱3次。总出水量是 负分数。
- 将色谱柱从磁场中取出,并将其放在新的收集管上。
- 将MB移液到色谱柱上(LS色谱柱为5 mL,MS色谱柱为1 mL);将提供的柱塞推入柱中并冲洗出 阳性部分 (在iNKT细胞中富集)。
- 为了进一步提高iNKT细胞回收率,将阴性部分以300×g离心10分钟,并用新的LS或MS柱重复步骤3.6-3.7。汇集阳性组分并确定细胞计数。保留50μL的阳性和阴性馏分用于FACS分析。
- 通过 FACS 分析检查纯化步骤。样品包括:脾脏离体、富含T细胞的级分、iNKT阳性级分和iNKT阴性级分。用CD19-FITC,IAb-FITC,CD1d-四聚体-PE,TCRβ-APC和DAPI染色细胞。
注意:从一个iVα14-Jα18小鼠的预期恢复是2x106 个iNKT细胞。
4. iNKT细胞活化和扩增
- 用小鼠T激活剂抗CD3 / CD28磁珠以1:1的比例激活纯化的iNKT细胞。
- 将iNKT细胞阳性级分以300×g离心5分钟。
- 同时将适量的抗CD3/CD28磁珠转移到管中,加入等体积的PBS,涡旋5秒。将管子放在磁铁上1分钟,然后丢弃上清液。
- 从磁体中取出管子,并将洗涤的磁珠重悬于适当体积的完全RPMI(RPMI 1640培养基,10%热灭活的FCS,1mM丙酮酸钠,1%非必需氨基酸,10 U / ml青霉素和链霉素,50μM β-巯基乙醇)中,在1mL中具有5×10 5 个iNKT细胞。使用该悬浮液重悬离心的iNKT阳性馏分。
- 将细胞悬浮液(5 x 105 iNKT细胞)和抗CD3 / CD28磁珠的板1mL放入具有20 U / mL IL-2的48孔板中,并在37°C下孵育。
- 5 天后,加入 10 纳克/毫升 IL-7。
- 当细胞达到80-90%汇合时,以1:2的比例分裂细胞,始终添加20U / mL IL-2和10 ng / mL IL-7。在这些条件下,iNKT细胞可以扩增长达15天。
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Representative Results
本手稿中描述的方案能够通过图1A中总结的免疫磁性分离过程从iVa14-Ja18转基因小鼠的脾脏中富集iNKT细胞。首先通过消耗B细胞和单核细胞来对总脾T细胞进行阴性选择,然后用PBS-57脂质抗原负载的CD1d四聚体进行iNKT细胞阳性免疫磁性分选,从而能够特异性地仅染色iNKT细胞。该方案从单个iVa14-Ja18 Tg小鼠的脾脏中产生约2 x 106个95-98%纯iNKT细胞。在阴性部分中没有或实际上很少的iNKT细胞可以检测到(图1B)。
富集后,iVa14 iNKT细胞可以用抗CD3 / CD28微珠加IL-2和IL-7扩增(图2A),导致平均每天+14的培养物扩增30倍 ,如图2B所示。
图3A 显示了iNKT细胞纯度以及体外扩增和CD4分子的表达。我们观察到TCRβ+ CD1d-四聚体+ 双阳性细胞的百分比减少:抗CD3 / CD28微球的强激活诱导细胞表面iNKT细胞TCR表达的下调,并且出现双阴性群体。大多数扩增的iNKT细胞是CD4-。 图3B 显示了扩增后第0天和第14天在富集的iNKT细胞上谱系特异性转录因子PLZF和RORγt的表达的表征。该染色能够鉴定NKT1(PLZF低 RORγt-),NKT2(PLZF高 RORγt-)和NKT17(PLZFint RORγt+)表型。富集的iNKT细胞主要为NKT1和NKT2,显示出TH0样效应子表型。该表型在扩增14天后是保守的,如图3C所示,在PMA / Ionomycin刺激后IFN-γ和 IL-4的分泌证实了这一点。
图1:iNKT细胞富集A)免疫磁分离方案的示意图。B)流式细胞术分析每个富集步骤。T细胞频率的百分比显示在上图中,门控在活淋巴细胞上。虽然沿每个步骤的iNKT细胞频率百分比显示在较低的图中,在活的CD19- TCRβ+淋巴细胞上门控。用未加载的CD1d四聚体在活CD19- TCRβ+淋巴细胞上染色,可以正确绘制iNKT细胞门。图中显示了一个具有代表性的实验。请点击此处查看此图的放大版本。
图2:iNKT细胞体外扩增。A)iNKT细胞计数沿iNKT细胞扩增。图中显示了三个具有代表性的独立实验。B)纯化和活化后第7天和第14天iNKT细胞数增加。显示±标清的均值。请点击此处查看此图的放大版本。
图3:扩展的iNKT细胞表征。A) 流式细胞术分析沿扩增期的iNKT细胞百分比和CD4表达。上图以活淋巴细胞为门控。下图在iNKT细胞(活CD1d-四聚体+ TCRβ+淋巴细胞)上门控。B)富集(第0天)和扩增(第14天)iNKT细胞的表型表征。将地块置于iNKT细胞(活CD1d-四聚体+ TCRβ+淋巴细胞)上。使用Foxp3转录因子染色缓冲液组对细胞进行核内转录因子染色。鉴定了NKT1(PLZF低RORγt-)、NKT2(PLZF高RORγt-)和NKT17(PLZFint RORγt+)子集,每个子集的频率以百分比显示。C)在第14天通过扩增的iNKT细胞产生细胞因子。将地块置于iNKT细胞(活CD1d-四聚体+ TCRβ+淋巴细胞)上。用PMA 25 ng / mL / Ionomycin 1μg/ mL刺激细胞4小时,在Brefeldin A 10μg/ mL存在的最后2小时中存在。然后将细胞用PFA固定2%,用Permwash渗透,然后在细胞内染色以产生细胞因子。在左侧面板上设置了未激活的控件上的门控策略。图中显示了一个具有代表性的实验。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
在这里,我们展示了一种可重复且可行的方案,以获得数百万个即用型iNKT细胞。由于这些细胞在体内的缺乏,因此非常需要一种扩增它们的方法。我们提出的协议既不需要特定的仪器,也不需要大量的小鼠。我们故意利用iVα14-Jα18转基因小鼠来减少手术所需的小鼠数量。
来自iVα14-Jα18转基因小鼠的iNKT细胞扩增的另一种成功方案在文献10中可用。该协议涉及在iNKT细胞纯化前6天产生新鲜的骨髓来源的树突状细胞,然后加载α-半乳糖基神经酰胺并照射,加上IL-2和IL-7。我们认为减少参与该过程的小鼠数量是该协议的一大优势。这也是节省时间的,因为细胞培养的设置持续一天而不是一周。当前方案的可重复性的一个可能限制可能是iVα14-Jα18转基因小鼠的可用性,然而这些小鼠是市售的。在没有这些小鼠的情况下,我们设想使用大量WT小鼠的可能性,但由于WT小鼠中iNKT细胞的缺乏,需要相应地设置方案。
在细胞培养过程中,我们通常检查扩增的iNKT细胞的纯度和表型。TCRβ+ CD1d-四聚体+双阳性细胞百分比的降低(图3A)可以通过激活后不变的NKT细胞TCR从细胞表面的自然下调来解释。此外,大多数扩增的iNKT细胞没有表达CD4(图3A):这可能代表了过继细胞治疗背景下的一个优势,因为CD4- iNKT细胞被发现是控制肿瘤进展的最有效11。此外,观察到的TH0样效应子表型(图3C)与在体外扩增和再刺激后在人iNKT细胞中观察到的完全一致8,12,13,14,15。扩增的细胞在体内和体外具有高度反应性,因此在基于iNKT细胞的过继免疫疗法的背景下有用。未操纵或扩增的iNKT细胞的过继转移可预防或改善急性移植物抗宿主病(aGVHD),使移植物与白血病效应保持不变16,17,18,19。通过间接转移的人iNKT细胞在体外用αGal-Cer扩增,缓解异种性aGVHD,并且这种作用由CD4介导-但不是CD4+细胞20。此外,鉴于iNKT细胞不会引起aGVHD,它们构成了CAR免疫治疗的理想细胞,而无需删除其TCR,并且被证明在体内具有延长的抗肿瘤活性8,15。iNKT细胞目前正在进行和已完成的临床试验中得到利用21,22,23,24.
总之,所描述的方案快速,直接,并且允许从小鼠脾脏中恢复的iNKT细胞数量增加30倍(图3B)。这些细胞可以很容易地用于临床前研究中的体外识别测定、共培养系统或过继细胞治疗。iNKT细胞确实在肿瘤免疫监测,传染病和自身免疫中起着关键作用。在这些情况下,iNKT细胞可以代表一种强大的工具,是没有MHC限制的传统T细胞的有吸引力的替代品。大量这些细胞的快速产生以及在体外进一步操纵它们的可能性可以导致前所未有的治疗策略的发展。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Paolo Dellabona和Giulia Casorati对手稿的科学支持和批判性阅读。我们还感谢NIH Tetramer Core Facility为小鼠CD1d四聚体。该研究由Fondazione Cariplo Grant 2018-0366(至M.F.)和意大利癌症研究协会(AIRC)奖学金2019-22604(至G.D.)资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
hrIL-2 | Chiron Corp | ||
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
PFA | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
PMA | Sigma | P1585 | |
Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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