Summary
We beschrijven een snel en robuust protocol om invariante natural killer T (iNKT) cellen uit muizen milt te verrijken en in vitro uit te breiden tot geschikte aantallen voor in vitro en in vivo studies.
Abstract
Invariante Natural Killer T (iNKT) cellen zijn aangeboren T-lymfocyten die een geconserveerde semi-invariante T-celreceptor (TCR) tot expressie brengen die specifiek is voor zelf- of microbiële lipide-antigenen gepresenteerd door het niet-polymorfe MHC klasse I-gerelateerde molecuul CD1d. Preklinische en klinische studies ondersteunen een rol voor iNKT-cellen bij kanker, auto-immuniteit en infectieziekten. iNKT-cellen zijn zeer geconserveerd in alle soorten en hun onderzoek is vergemakkelijkt door muismodellen, waaronder CD1d-deficiënte of iNKT-deficiënte muizen, en de mogelijkheid om ze ondubbelzinnig te detecteren bij muizen en mannen met CD1d-tetrameren of mAbs specifiek voor de semi-invariante TCR. iNKT-cellen zijn echter zeldzaam en ze moeten worden uitgebreid om beheersbare aantallen te bereiken voor elke studie. Omdat het genereren van primaire muis iNKT-cellijn in vitro moeilijk is gebleken, hebben we een robuust protocol opgezet om milt iNKT-cellen van de iVα14-Jα18 transgene muizen (iVα14Tg) te zuiveren en uit te breiden, waarbij iNKT-cellen 30 keer vaker voorkomen. We laten hier zien dat primaire milt iVα14Tg iNKT-cellen kunnen worden verrijkt door middel van een immunomagnetisch scheidingsproces, wat ongeveer 95-98% pure iNKT-cellen oplevert. De gezuiverde iNKT-cellen worden gestimuleerd door anti-CD3/CD28 kralen plus IL-2 en IL-7, wat resulteert in een 30-voudige expansie op dag +14 van de cultuur met een zuiverheid van 85-99%. De uitgebreide iNKT-cellen kunnen gemakkelijk genetisch worden gemanipuleerd, wat een waardevol hulpmiddel is om mechanismen van activering te ontleden en in vitro te functioneren en, nog belangrijker, ook bij adoptieve overdracht in vivo.
Introduction
Invariante Natural killer T-cellen (iNKT-cellen) zijn aangeboren T-lymfocyten die een semi-invariante αβ T-celreceptor (TCR) tot expressie brengen, gevormd in muizen door een invariante Vα14-Jα18-keten in combinatie met een beperkte set van diverse Vβ-ketens1, die specifiek is voor lipide-antigenen gepresenteerd door het MHC klasse I-gerelateerde molecuul CD1d2. iNKT-cellen ondergaan een agonistselectieprogramma dat resulteert in de verwerving van een geactiveerd / aangeboren effectorfenotype al in de thymus, dat optreedt door verschillende rijpingsstadia3,4, waardoor een CD4+ en een CD4- subset ontstaat. Via dit programma verwerven iNKT-cellen verschillende T-helper (TH)effectorfenotypen, namelijk TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) en TH17 (iNKT17), identificeerbaar door de expressie van de transcriptiefactoren T-bet, GATA3, PLZF en RORγt, respectievelijk5. iNKT-cellen herkennen een reeks microbiële lipiden, maar zijn ook zelfreactief tegen endogene lipiden die worden opgereguleerd in de context van pathologische situaties van celstress en weefselschade, zoals kanker en auto-immuniteit2. Na activering moduleren iNKT-cellen de functies van andere aangeboren en adaptieve immuuneffectorcellen via direct contact en cytokineproductie2.
Het onderzoek van iNKT-cellen is vergemakkelijkt door muismodellen, waaronder CD1d-deficiënte of Jα18-deficiënte muizen, en door de productie van antigeen-geladen CD1d-tetrameren plus de generatie van monoklonale antilichamen (mAbs) specifiek voor de menselijke semi-invariante TCR. Het genereren van primaire muis iNKT-cellijn is echter moeilijk gebleken. Om de antitumorfuncties van iNKT-cellen beter te karakteriseren en te gebruiken voor adoptieve celtherapie, hebben we een protocol opgezet om milt iNKT-cellen van iVα14-Jα18 transgene muizen (iVα14Tg)6te zuiveren en uit te breiden , waarbij iNKT-cellen 30 keer vaker voorkomen dan bij muizen van het wilde type.
Geëxpandeerde iNKT-cellen kunnen worden gebruikt voor in vitro testen en in vivo bij overdracht terug naar muizen. In deze setting hebben we bijvoorbeeld hun krachtige anti-tumor effecten aangetoond7. Bovendien zijn in vitro geëxpandeerde iNKT-cellen vatbaar voor functionele modificatie via genoverdracht of bewerking voorafgaand aan hun injectie in vivo8, waardoor inzichtelijke functionele analyse van moleculaire routes mogelijk is en de weg wordt vrijgemaakt voor geavanceerde celtherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hier beschreven procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (nr. 1048) van het San Raffaele Scientific Institute.
OPMERKING: Alle procedures moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Alle gebruikte reagentia zijn opgenomen in de tabel met materialen.
1. Miltverwerking
- Euthanaseer iVα14-Jα18 muizen door inademing van CO2 volgens het institutionele beleid.
OPMERKING: iVα14-Jα18-muizen moeten 8 weken oud of ouder zijn. Om afstoting van de cellen door de in vivo overdracht van de cellen te voorkomen, moet u bedenken dat cellen geïsoleerd uit vrouwelijke muizen adoptief kunnen worden overgedragen, zowel bij mannelijke als vrouwelijke ontvangers, terwijl cellen geïsoleerd van mannelijke muizen alleen kunnen worden overgedragen bij mannelijke ontvangers. Voor in vitro experimenten moet geen rekening worden gehouden met genderbias. Meer muizen kunnen worden samengevoegd om meer cellen te verkrijgen. - Ontleed de milt van de muis en sla deze door een 70 nm celzeef om een eencellige suspensie te verkrijgen in 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% foetaal runderserum (FBS).
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant door inversie en proces met erytrocytenlysisbuffer. Resuspend de celkorrel met 1 ml steriele ACK (ammoniumchloride-kalium) ligbuffer, incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en blok met 5 ml PBS met 2% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
OPMERKING: ACK is in de handel verkrijgbaar; het bestaat uit een oplossing van 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3en 0,1 mM Na2 EDTA(ethyleendiaminetetra-azijnzuur) opgelost in gebidistilleerd H2O, pH 7,2-7,4. Indien zelfgemaakt, steriliseer door filtratie met een filter van 0,22 μm. - Verwijder het supernatant door inversie. Resuspend de celkorrel in 3 ml PBS met 2% FBS en verwijder vetresten door pipetteren. Bundel indien nodig de cellen afkomstig van verschillende muizen.
- Tel de cellen en houd 50 μL voor FACS-analyse.
2. T-celverrijking
OPMERKING: Voor de verrijkingsstappen, werk snel, houd de cellen koud en gebruik oplossingen die 's nachts voorgekoeld zijn bij 4 °C en vervolgens op ijs worden bewaard
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Resuspend alle cellen in de juiste hoeveelheid PBS met 2% FBS (500 μL voor 107 cellen) en Fc-blokker (2,5 μL x 107 cellen); incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Was met 1-2 ml MACS-scheidingsbuffer (MB) per 107 cellen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g.
OPMERKING: MACS-buffer is in de handel verkrijgbaar. Het bestaat uit PBS pH 7,2, 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA. Indien zelfgemaakt, steriliseer door filtratie met een filter van 0,22 μm. - Verwijder het supernatant door inversie en kleur de cellen met CD19-FITC en H2(IA b)-FITC (gebruik 5 μL x 107 cellen in 100 μL MB). Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4-8 °C.
- Was de cellen door 1−2 ml MB per 107 cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
- Pipetteer het supernatant volledig en resuspend de celkorrel in 90 μL MB per 107 totale cellen. Voeg 10 μL Anti-FITC MicroBeads toe per 107 cellen in totaal. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4-8 °C.
- Was de cellen door 1−2 ml MB per 107 cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
- Pipetteer het supernatant volledig en resuspend tot 1,25 x 108 cel in 500 μL MB.
- Plaats een LD-kolom in het magnetisch veld van de MACS-separator om door te gaan naar de uitputting. Om verstopping te voorkomen, brengt u een voorscheidingsfilter aan op de LD-kolom en spoelt u af met 2 ml MB.
- Wanneer het kolomreservoir leeg is, brengt u de celsuspensie aan op het filter. Verzamel de niet-gelabelde cellen die door de kolom gaan.
- Was 3 keer met 1 ml MB, alleen als het kolomreservoir leeg is. Verzamel het totale effluent, dat wordt verrijkt in T-cellen, en tel de cellen. Houd altijd 50 μL voor FACS-analyse.
3. iNKT celverrijking
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant door inversie.
- Kleur de cellen met CD1d-tetrameer-PE (muis PBS57-CD1d-tetrameer), volgens de antilichaamtitratie in 50 μL MB per 106 cellen. Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten in het donker op ijs.
OPMERKING: De procedure kan ook worden uitgevoerd met APC-gelabelde mCD1d-tetrameren en anti-APC-kralen; het dienovereenkomstig aanpassen van de fluorchromen die in de volgende kleuring worden gebruikt. In het huidige protocol gebruikten we muis PBS-57-CD1d-tetrameren geleverd door NIH. αgalactosylceramide (αGal-Cer) is het prototypische antigeen dat wordt herkend door iNKT-cellen; PBS-57 is een analoog van αGal-Cer met verbeterde oplosbaarheid9; de NIH Tetramer Facility levert PBS-57 ligand gecomplexeerd tot CD1d tetrameren. Andere CD1d-dimeren/tetrameren/dextrameren zijn echter in de handel verkrijgbaar en kunnen worden geladen met een lipidisch antigeen als αGal-Cer. We voorzien de mogelijkheid om het protocol aan te passen voor het gebruik ervan. - Was de cellen door 1−2 ml MB per 107 cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
- Pipetteer het supernatant volledig en resuspend de celkorrel in 80 μL MB per 107 totale cellen. Voeg 20 μL Anti-PE MicroBeads toe per 107 totale cellen. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4-8 °C.
- Was de cellen door 1−2 ml MB per 107 cellen toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g.
- Pipetteer het supernatant volledig en resuspend tot 108 cellen in 500 μL MB. Anders, als cellen groter zijn dan 108,past u het volume dienovereenkomstig aan.
- Plaats volgens het celgetal een LS (tot 108) of MS (tot 107) kolom in het magnetisch veld van de MACS-separator. Spoel de kolom af met MB (3 ml voor LS, 500 μL voor MS).
- Breng de celsuspensie aan op de kolom.
- Verzamel ongelabelde cellen die passeren. Was de kolom 3 keer door de juiste hoeveelheid MB toe te voegen (3 x 3 ml voor LS-kolom, 3 x 500 μL voor MS-kolom) alleen als het kolomreservoir leeg is. Het totale effluent is de negatieve fractie.
- Verwijder de kolom uit het magnetisch veld en plaats deze op een nieuwe opvangbuis.
- Pipetteer MB op de kolom (5 ml voor LS-kolom of 1 ml voor MS-kolom); duw de meegeleverde zuiger in de kolom en spoel de positieve fractie (verrijkt in iNKT-cellen) weg.
- Om de iNKT-celterugwinning verder te verhogen, centrifugeert u de negatieve fractie gedurende 10 minuten bij 300 x g en herhaalt u stap 3.6-3.7 met een nieuwe LS- of MS-kolom. Pool de positieve fracties en bepaal het celgetal. Bewaar 50 μL van zowel positieve als negatieve fracties voor FACS-analyse.
- Controleer de zuiveringsstappen door FACS-analyse. Monsters omvatten: milt ex-vivo, T-cel verrijkte fractie, iNKT positieve fractie en iNKT negatieve fractie. Kleur de cellen met: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC en DAPI.
OPMERKING: Het verwachte herstel van één iVα14-Jα18-muis is 2x106 iNKT-cellen .
4. iNKT cel activering en uitbreiding
- Activeer gezuiverde iNKT-cellen met muis T-activator anti-CD3/CD28 magnetische kralen in een verhouding van 1:1.
- Centrifugeer de iNKT-celpositieve fractie bij 300 x g gedurende 5 minuten.
- Breng ondertussen het juiste volume anti-CD3/CD28 magnetische kralen over naar een buis en voeg een gelijk volume PBS, vortex toe gedurende 5 seconden. Plaats de buis gedurende 1 minuut op een magneet en gooi het supernatant weg.
- Verwijder de buis van de magneet en resuspend de gewassen magnetische kralen in het juiste volume van volledige RPMI (RPMI 1640 medium, 10% warmte-geïnactiveerde FCS, 1 mM natriumpyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, 10 U / ml penicylline en streptomycine, 50 μM β-Mercaptoethanol) om 5 x 105 iNKT-cellen in 1 ml te hebben. Gebruik deze suspensie om de gecentrifugeerde iNKT-positieve fractie opnieuw te conditioneren.
- Plaat 1 ml van de celsuspensie (5 x 105 iNKT-cellen) en anti-CD3/CD28 magnetische kralen in een 48 putplaat met 20 U/ml IL-2 en incubeer bij 37 °C.
- Voeg na 5 dagen 10 ng/ml IL-7 toe.
- Splits de cellen 1:2 wanneer ze 80-90% confluentie bereiken, voeg altijd 20U / ml IL-2 en 10 ng / ml IL-7 toe. In deze omstandigheden kunnen iNKT-cellen tot 15 dagen worden uitgebreid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, maakt het mogelijk om iNKT-cellen uit de milt van iVa14-Ja18 transgene muizen te verrijken via een immunomagnetisch scheidingsproces samengevat in figuur 1A. Totale milt T-cellen worden eerst negatief geselecteerd door B-cellen en monocyten uit te putten, gevolgd door iNKT-celpositieve immunomagnetische sortering met PBS-57 lipide-antigeen geladen CD1d-tetrameren, die het mogelijk maken om specifiek alleen iNKT-cellen te kleuren. Dit protocol levert ongeveer 2 x 106 van 95-98% zuivere iNKT-cellen op uit de milt van een enkele iVa14-Ja18 Tg-muis. Er kunnen geen of zeer weinig iNKT-cellen worden gedetecteerd in de negatieve fractie(figuur 1B).
Na verrijking kunnen iVa14 iNKT-cellen worden uitgebreid met anti-CD3/CD28-kralen plus IL-2 en IL-7(figuur 2A),wat resulteert in een 30-voudige expansie gemiddeld op dag +14 van de cultuur zoals weergegeven in figuur 2B.
Figuur 3A toont de zuiverheid van de iNKT-cel, samen met de expansie in vitro en de expressie van het CD4-molecuul. We zagen een afname van het percentage TCRβ+ CD1d-tetrameer+ dubbel positieve cellen: de sterke activering met anti-CD3/CD28-kralen induceert de downregulatie van de INKT-cel TCR-expressie op het celoppervlak en er verschijnt een dubbele negatieve populatie. De meerderheid van de uitgebreide iNKT-cellen waren CD4-. Figuur 3B toont een karakterisering van de expressie van afstammingsspecifieke transcriptiefactoren PLZF en RORγt op verrijkte iNKT-cellen op dag 0 en 14 dagen na de expansie. Deze kleuring maakt het mogelijk om de NKT1 (PLZFlage RORγt-), NKT2 (PLZFhoge RORγt-) en NKT17 (PLZFint RORγt+) fenotypen te identificeren. Omdat het voornamelijk NKT1 en NKT2 is, vertonen de verrijkte iNKT-cellen een TH0-achtig effectorfenotype. Dit fenotype blijft behouden na 14 dagen expansie, zoals bevestigd door de secretie van zowel IFN-γ als IL-4 na PMA / Ionomycine-stimulatie weergegeven in figuur 3C.
Figuur 1: iNKT-celverrijking. A) Schematische weergave van het immunomagnetische scheidingsprotocol. B) Flowcytometrie-analyse van elke verrijkingsstap. Percentage T-celfrequenties wordt weergegeven in de bovenste plots, gated op levensvatbare lymfocyten. Terwijl het percentage iNKT-celfrequenties langs elke stap wordt weergegeven in de onderste plots, gated op levensvatbare CD19- TCRβ+ lymfocyten. Kleuring op levensvatbare CD19- TCRβ+ lymfocyten met onbelast CD1d tetrameer maken het mogelijk om de iNKT-celpoort correct te tekenen. Er wordt één representatief experiment getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: iNKT-cel in vitro expansie. A) iNKT celtellingen langs iNKT cel expansie. Er worden drie representatieve en onafhankelijke experimenten getoond. B)Vouw toename van het iNKT-celgetal op dag 7 en 14 na zuivering en activering. Betekent ± SD worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Uitgebreide iNKT-celkarakterisering. A) Flowcytometrie-analyse van iNKT-celpercentage en CD4-expressie gedurende de expansieperiode. Bovenste percelen zijn omheind op levensvatbare lymfocyten. Lagere plots zijn gated op iNKT-cellen (levensvatbaar CD1d-tetrameer+ TCRβ+ lymfocyten). B) Fenotypische karakterisering van verrijkte (dag 0) en uitgebreide (dag 14) iNKT cellen. Percelen zijn omheind op iNKT-cellen (levensvatbaar CD1d-tetrameer+ TCRβ+ lymfocyten). Cellen werden intranucleair gekleurd voor transcriptiefactoren met de Foxp3 Transcription Factor Staining Buffer Set. NKT1 (PLZFlage RORγt-), NKT2 (PLZFhoge RORγt-), en NKT17 (PLZFint RORγt+) deelverzamelingen werden geïdentificeerd, frequenties van elke deelverzameling worden weergegeven in percentage. C) Cytokineproductie door geëxpandeerde iNKT-cellen op dag 14. Percelen zijn omheind op iNKT-cellen (levensvatbaar CD1d-tetrameer+ TCRβ+ lymfocyten). Cellen werden gedurende 4 uur gestimuleerd met PMA 25 ng / ml / ionomycine 1 μg / ml, in aanwezigheid gedurende de laatste 2 uur van Brefeldin A 10 μg / ml. Cellen werden vervolgens gefixeerd met PFA 2%, gepermeabiliseerd met Permwash en vervolgens intracellulair gekleurd voor cytokineproductie. Gating-strategie werd ingesteld op het niet-geactiveerde bedieningsorgaan, linkerpaneel. Er wordt één representatief experiment getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier tonen we een reproduceerbaar en haalbaar protocol om miljoenen kant-en-klare iNKT-cellen te verkrijgen. Vanwege het gebrek aan deze cellen in vivo, was een methode om ze uit te breiden hard nodig. Het protocol dat wij voorstellen vereist noch een bepaalde instrumentatie, noch een groot aantal muizen. We hebben iVα14-Jα18 transgene muizen met opzet gebruikt om het aantal muizen dat nodig is voor de procedure te verminderen.
Een ander succesvol protocol voor iNKT-celuitbreiding van iVα14-Jα18 transgene muizen is beschikbaar in de literatuur10. Dit protocol omvat de generatie, 6 dagen voorafgaand aan iNKT-celzuivering, van verse beenmerg-afgeleide dendritische cellen, vervolgens geladen met α-galactosylceramide en bestraald, plus IL-2 en IL-7. Wij beschouwen de vermindering van het aantal muizen dat betrokken is bij de procedure als een groot voordeel van het protocol. Het is ook tijdbesparend, omdat het opzetten van de celcultuur een enkele dag duurt in plaats van een week. Een mogelijke beperking van de reproduceerbaarheid van het huidige protocol zou de beschikbaarheid van iVα14-Jα18 transgene muizen kunnen zijn, die echter in de handel verkrijgbaar zijn. Bij afwezigheid van deze muizen voorzien we de mogelijkheid om een groot aantal WT-muizen te gebruiken, maar het protocol moet dienovereenkomstig worden ingesteld vanwege het gebrek aan iNKT-cellen in WT-muizen.
Tijdens de celkweek controleren we meestal de zuiverheid en het fenotype van geëxpandeerde iNKT-cellen. De afname van het percentage TCRβ+ CD1d-tetrameer+ dubbel positieve cellen (Figuur 3A) kan worden verklaard door een natuurlijke downregulatie van de invariante NKT-cel TCR van het celoppervlak na activering. Bovendien bracht de meerderheid van de geëxpandeerde iNKT-cellen geen CD4 tot expressie (figuur 3A): dit kan een voordeel zijn in de context van een adoptieve celtherapie, aangezien CD4 - iNKT-cellen het meest effectief bleken te zijn in het beheersen van tumorprogressie 11. Bovendien is het waargenomen TH0-achtige effectorfenotype (figuur 3C) volledig coherent met dat waargenomen in menselijke iNKT-cellen na in vitro expansie en restimulatie8,12,13,14,15. De geëxpandeerde cellen zijn zeer reactief in vivo en in vitro, dus nuttig in contexten van op iNKT-cellen gebaseerde adoptieve immunotherapieën. Adoptieve overdracht van ongemanipuleerde of geëxpandeerde iNKT-cellen voorkomt of verbetert acute Graft-Versus-Host Disease (aGVHD) waardoor het Graft-Versus-Leukemie-effectongewijzigd blijft 16,17,18,19. Adoptief overgedragen menselijke iNKT-cellen die in vitro zijn uitgebreid met αGal-Cer verlichten xenogene aGVHD en dit effect wordt gemedieerd door CD4- maar niet door CD4+ cellen20. Bovendien, gezien het feit dat iNKT-cellen geen aGVHD veroorzaken, vormen ze de ideale cellen voor CAR-immunotherapie zonder dat verwijdering van hun TCR nodig is en bewezen langdurige antitumoractiviteit in vivo te hebben8,15. iNKT-cellen worden momenteel geëxploiteerd in lopende en afgeronde klinische onderzoeken21,22,23,24.
Kortom, het beschreven protocol is snel, eenvoudig en maakt een 30x toename van het aantal iNKT-cellen mogelijk dat wordt hersteld uit een muizenpleet(Figuur 3B). Deze cellen kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor in vitro herkenningstests, co-kweeksystemen of adoptieve celtherapie in preklinische studies. iNKT-cellen spelen inderdaad een cruciale rol bij tumorimmuunsurveillance, infectieziekten en auto-immuniteit. In deze contexten kunnen iNKT-cellen een krachtig hulpmiddel zijn, omdat ze een aantrekkelijk alternatief zijn voor conventionele T-cellen zonder de MHC-beperking. De snelle generatie van grote hoeveelheden van deze cellen en de mogelijkheid om ze in vitro verder te manipuleren kan leiden tot de ontwikkeling van ongekende therapeutische strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Paolo Dellabona en Giulia Casorati voor de wetenschappelijke ondersteuning en kritische lezing van het manuscript. We bedanken ook de NIH Tetramer Core Facility voor muis CD1d tetrameer. De studie werd gefinancierd door Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (aan M.F.) en de Italiaanse Vereniging voor Kankeronderzoek (AIRC) fellowship 2019-22604 (aan G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
- Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
- Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
- Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
- Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
- Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
- Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
- Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
- de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
- Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
- Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
- Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
- Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
- Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
- Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
- Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
- Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
- Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
- Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
- Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
- Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).
