Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

इन विट्रो और वीवो अध्ययन में माउस इनवेरियंट नेचुरल किलर टी सेल का शुद्धिकरण और विस्तार

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62214
Automatic Translation
1, *1,2, *1,2, 1,2
1Experimental Immunology Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University
* These authors contributed equally

Summary

हम माउस तिल्ली से अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक तेजी से और मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और उन्हें इन विट्रो और वीवो अध्ययनों के लिए उपयुक्त संख्या में इन विट्रो में विस्तारित करते हैं।

Abstract

इनवेरिएंट नेचुरल किलर टी (iNKT) कोशिकाएं जन्मजात होती हैं, जैसे टी लिम्फोसाइट्स एक संरक्षित अर्ध-इनवेरिएटेंट टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) को व्यक्त करते हैं जो गैर-बहुरूपिक एमएचसी वर्ग I-संबंधित अणु CD1d द्वारा प्रस्तुत स्वयं या माइक्रोबियल लिपिड एंटीजन के लिए विशिष्ट है। प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययन कैंसर, ऑटोआईआईयुडिजिट और संक्रामक रोगों में iNKT कोशिकाओं के लिए एक भूमिका का समर्थन करते हैं । iNKT कोशिकाओं को बहुत प्रजातियों में संरक्षित कर रहे है और उनकी जांच सीडी 1d कमी या iNKT कमी चूहों सहित माउस मॉडल द्वारा सुविधा दी गई है, और स्पष्ट रूप से उंहें चूहों और पुरुषों में CD1d tetramers या अर्द्ध अवरक्त TCR के लिए विशिष्ट mAbs के साथ पता लगाने की संभावना है । हालांकि, iNKT कोशिकाओं दुर्लभ है और वे किसी भी अध्ययन के लिए प्रबंधनीय संख्या तक पहुंचने के लिए विस्तार की जरूरत है । क्योंकि विट्रो में प्राथमिक माउस iNKT सेल लाइन की पीढ़ी मुश्किल साबित हुई है, हमने iVα14-Jα18 ट्रांसजेनिक चूहों (iVα14Tg) से प्लीहा iNKT कोशिकाओं को शुद्ध और विस्तारित करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल स्थापित किया है, जिसमें iNKT कोशिकाएं 30 गुना अधिक बार होती हैं। हम यहां दिखाते हैं कि प्राथमिक प्लीहा iVα14Tg iNKT कोशिकाओं को इम्यूनोमैग्नेटिक पृथक्करण प्रक्रिया के माध्यम से समृद्ध किया जा सकता है, जो लगभग 95-98% शुद्ध iNKT कोशिकाओं को उत्पीचक करता है। शुद्ध iNKT कोशिकाओं विरोधी CD3/CD28 मोती प्लस IL-2 और आईएल-7 से प्रेरित हैं, जिसके परिणामस्वरूप 85-99% शुद्धता के साथ संस्कृति के दिन + 14 से 30 गुना विस्तार । विस्तारित iNKT कोशिकाओं को आसानी से आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है, सक्रियण के तंत्र को विच्छेदन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करता है और विट्रो में कार्य करता है और अधिक महत्वपूर्ण बात, वीवो में दत्तक हस्तांतरण पर भी।

Introduction

इनवेरिएंट नेचुरल किलर टी सेल्स (iNKT कोशिकाएं) जन्मजात हैं-जैसे टी लिम्फोसाइट्स जो एक अर्ध-इनवेरेंट α αο T सेल रिसेप्टर (टीसीआर) को व्यक्त करते हैं, जो चूहों में एक अवरिष्क Vα14-Jα18 श्रृंखला द्वारा निर्मित विविध Vα 14-Jα18 श्रृंखला द्वारा गठित विविध Vοजंजीरों 1के एक सीमित सेट के साथ बनती है, जो MHC वर्ग I-से संबंधित अणुओं द्वारा प्रस्तुत लिपिड एंटीजन के लिए विशिष्टहै। iNKT कोशिकाओं को एक एगोनिस्ट चयन कार्यक्रम से गुजरना पड़ता है जिसके परिणामस्वरूप थाइमस में पहले से ही सक्रिय/जन्मजात प्रभावकार फेनोटाइप का अधिग्रहण होता है, जो कई परिपक्वता चरणों3, 4केमाध्यम से होता है, जो सीडी 4+ और सीडी4- सबसेट का उत्पादन करता है। इस कार्यक्रम के माध्यम से, iNKT कोशिकाएं क्रमशः 5 क्रमशः 5 ट्रांसक्रिप्शन कारकों टी-बेट, GATA3, पीएलजेडएफ और RORγt की अभिव्यक्ति से पहचाने जाने वाले अलग टी हेल्पर (टीएच)प्रभावकार फेनोटाइप, अर्थात् टी एच 1 (iNKT1), टी एच 2 (iNKT2) और टीएच17(iNKT17) प्राप्त करती हैं। iNKT कोशिकाएं माइक्रोबियल लिपिड की एक श्रृंखला को पहचानती हैं, लेकिन अंतर्जात लिपिड के खिलाफ आत्म-प्रतिक्रियाशील भी होती हैं जो कोशिका तनाव और ऊतक क्षति की रोगीय स्थितियों के संदर्भ में अपवर्तित होते हैं, जैसे कैंसर और ऑटोनियुसनी2। सक्रियण पर, iNKT कोशिकाएं सीधे संपर्क और साइटोकिन उत्पादन2के माध्यम से अन्य सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं के कार्यों को मिलाती हैं।

iNKT कोशिकाओं की जांच को माउस मॉडल द्वारा सुविधा प्रदान की गई है, जिसमें CD1d-कमी या Jα18-कमी वाले चूहों, और एंटीजन-लोडेड सीडी 1डी टेट्रामर्स के उत्पादन के साथ-साथ मानव अर्ध-इनवेरिएट टीसीआर के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) की पीढ़ी शामिल है। हालांकि, प्राथमिक माउस iNKT सेल लाइन की पीढ़ी मुश्किल साबित हुई है। बेहतर iNKT कोशिकाओं के एंटीट्यूमर कार्यों की विशेषता है और उन्हें दत्तक कोशिका चिकित्सा के लिए उपयोग करने के लिए, हम iVα14-Jα18 ट्रांसजेनिक चूहों (iVα14Tg)6,जिसमें iNKT कोशिकाओं को 30 गुना अधिक जंगली प्रकार चूहों की तुलना में अक्सर कर रहे हैं की प्लीहानिक iNKT कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की।

विस्तारित iNKT कोशिकाओं में विट्रो परख के लिए शोषण किया जा सकता है, और वीवो में चूहों में वापस स्थानांतरित करने पर । उदाहरण के लिए, इस सेटिंग में, हमने उनके शक्तिशाली एंटी-ट्यूमर प्रभाव7दिखाए हैं। इसके अलावा, इन विट्रो विस्तारित iNKT कोशिकाएं वीवो 8 में उनके इंजेक्शन से पहले जीन हस्तांतरण या संपादन के माध्यम से कार्यात्मक संशोधन के लिए उत्तरदायी हैं, जिससे आणविकमार्गोंके व्यावहारिक कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति मिलती है, साथ ही उन्नत सेल उपचारों का मार्ग प्रशस्त होता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां वर्णित प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और सैन Raffaele वैज्ञानिक संस्थान में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) (संख्या १०४८) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

नोट: सभी प्रक्रियाओं बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए । उपयोग किए गए सभी अभिकर्ण सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध हैं।

1. तिल्ली प्रसंस्करण

  1. संस्थागत नीति के अनुसार सीओ2 के साँस लेने से iVα14-Jα18 चूहों को इच्छामृत्यु।
    नोट: iVα14-Jα18 चूहों 8 सप्ताह पुराना या पुराना होना चाहिए। कोशिकाओं के वीवो हस्तांतरण में से कोशिकाओं की अस्वीकृति से बचने के लिए, विचार करें कि मादा चूहों से अलग कोशिकाओं को पुरुष और महिला प्राप्तकर्ताओं दोनों में दत्तक रूप से स्थानांतरित किया जा सकता है, जबकि पुरुष चूहों से अलग कोशिकाओं को केवल पुरुष प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरित किया जा सकता है। इन विट्रो प्रयोगों के लिए, किसी लिंग पूर्वाग्रह पर विचार नहीं किया जाना चाहिए । अधिक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए अधिक चूहों को पूल किया जा सकता है।
  2. माउस तिल्ली को विच्छेदन करें और 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 10 एमएल में एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए 70 एनएम सेल छलनी के माध्यम से इसे तोड़ दें।
  3. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  4. एरिथ्रोसाइट लाइसिस बफर के साथ उलटा और प्रक्रिया करके सुपरनेट निकालें। बाँझ ACK (अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम) Lysing बफर के 1 मिलील के साथ सेल गोली को फिर से खर्च करें, कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और 2% एफबीएस के साथ पीबीएस के 5 एमएल के साथ ब्लॉक करें। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    नोट: ACK व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है; इसमें बिडिडिलेड एच2ओ, पीएच 7.2-7.4 में घुलकर 0.15 एम एनएच4सीएल, 10 एमएम केएचसीओ3और 0.1 एमएमएनए 2ईडीए (एथिलेंडाइमाइमेटेटिक एसिड) का समाधान होता है। यदि घर का बना है, तो 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ निस्पंदन द्वारा बंध्याकरण करें।
  5. उलटा करके सुपरनेट निकालें। 2% एफबीएस के साथ पीबीएस के 3 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसुस्पेंड करें और पाइपिंग करके फैट अवशेषों को हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो विभिन्न चूहों से आने वाली कोशिकाओं को पूल करें।
  6. कोशिकाओं की गणना करें और FACS विश्लेषण के लिए 50 माइक्रोन रखें।

2. टी सेल संवर्धन

नोट: संवर्धन चरणों के लिए, तेजी से काम करें, कोशिकाओं को ठंडा रखें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ठंडा समाधान का उपयोग करें और फिर बर्फ पर रखा जाए

  1. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  2. 2% एफबीएस (10 7 कोशिकाओं के लिए 500 माइक्रोन) और एफसी अवरोधक (2.5माइक्रोन x 107 कोशिकाओं) के साथ पीबीएस की उचित मात्रा में सभी कोशिकाओं को फिर से खर्च करें; कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. 10 मिनट के लिए 300 एक्स ग्राम पर एमएक्स सेपरेशन बफर (एमबी) प्रति10 7 कुल कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र के 1-2 एमएल से धोएं।
    नोट: MACS बफर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। इसमें पीबीएस पीएच 7.2, 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 2 एमएम ईडीटीए शामिल हैं। यदि घर का बना है, तो 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ निस्पंदन द्वारा बंध्याकरण करें।
  4. उलटा द्वारा सुपरनेट निकालें और CD19-FITC और H2 (आईएबी)के साथ कोशिकाओं को दाग-FITC (एमबी के १०० माइक्रोन में 5 μL x 107 कोशिकाओं का उपयोग करें) । 4-8 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
  5. 10 मिनट के लिए 300 एक्स ग्राम पर एमबी प्रति10 7 कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र के 1−2 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  6. सुपरनेट को पूरी तरह से बंद करें और सेल पेलेट को एमबी के 90 माइक्रोन प्रति 107 कुल कोशिकाओं में फिर से रखें। प्रति 10 7 कुल कोशिकाओं में एंटी-फिटसी माइक्रोबीएड के10 माइक्रोल जोड़ें। 4-8 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
  7. 107 कोशिकाओं पर एमबी के 1−2 एमएल और 10 मिनट के लिए 300 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  8. सुपरनेट पूरी तरह से बंद करें और एमबी के 500 माइक्रोल में 1.25 x 108 सेल तक रीसस्ट करें।
  9. घटने के लिए आगे बढ़ने के लिए एमएसीसी सेपरेटर के चुंबकीय क्षेत्र में एक एलडी कॉलम रखें। क्लोजिंग से बचने के लिए एलडी कॉलम पर प्री-सेपरेशन फिल्टर लगाएं और एमबी के 2 एमएल से कुल्ला करें।
  10. जब कॉलम जलाशय खाली हो जाए, तो सेल सस्पेंशन को फिल्टर पर लागू करें। अवेलेबल कोशिकाओं को इकट्ठा करें जो कॉलम से गुजरते हैं।
  11. एमबी के 1 एमएल के साथ 3 बार धोएं, तभी कॉलम जलाशय खाली हो। कुल प्रवाह को इकट्ठा करें, जो टी कोशिकाओं में समृद्ध होगा, और कोशिकाओं की गिनती करेगा। FACS विश्लेषण के लिए हमेशा 50 माइक्रोन रखें।

3. iNKT सेल संवर्धन

  1. 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रलाइज करें और उलटा करके सुपरनेट को हटा दें।
  2. CD1d-tetramer-PE (माउस PBS57-CD1d-tetramer) के साथ कोशिकाओं दाग, 106 कोशिकाओं प्रति एमबी के ५० μL में एंटीबॉडी टिटरेशन के अनुसार । बर्फ पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
    नोट: प्रक्रिया एपीसी-लेबल वाले mCD1d टेट्रामर्स और एंटी-एपीसी मोतियों के साथ भी की जा सकती है; तदनुसार निम्नलिखित धुंधला में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोक्रोम को समायोजित करना। वर्तमान प्रोटोकॉल में हमने एनआईएच द्वारा प्रदान किए गए माउस पीबीएस-57-सीडी1डी-टेट्राम्र्स का उपयोग किया। αgalactosylceramide (αGal-Cer) iNKT कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त प्रोटोटिपिकल एंटीजन है; पीबीएस-57 बेहतर घुलनशीलता9के साथ αGal-Cer का एक एनालॉग है; एनआईएच टेट्रामर सुविधा सीडी1डी टेट्रामरर्स को जटिल पीबीएस-57 लिगामेंट प्रदान करती है। हालांकि, अन्य CD1d dimers/tetramers/dextramers व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और αGal-Cer के रूप में एक लिपिडिक एंटीजन के साथ लोड किया जा सकता है । हम उनके उपयोग के लिए प्रोटोकॉल को समायोजित करने की संभावना की परिकल्पना करते हैं ।
  3. 107 कोशिकाओं पर एमबी के 1−2 एमएल और 10 मिनट के लिए 300 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  4. सुपरनेट को पूरी तरह से बंद करें और सेल पेलेट को एमबी के 80 माइक्रोल प्रति 107 कुल कोशिकाओं में फिर से खर्च करें। प्रति 107 कुल कोशिकाओं में एंटी-पीई माइक्रोबीएड के 20 माइक्रोल जोड़ें। 4-8 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से और इनक्यूबेट मिलाएं।
  5. 10 मिनट के लिए 300 एक्स ग्राम पर एमबी प्रति10 7 कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र के 1−2 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं।
  6. सुपरनेट पूरी तरह से बंद करें और एमबी के 500 माइक्रोल में10 8 कोशिकाओं तक पुनर्व्यवित करें। अन्यथा यदि कोशिकाएं 108से अधिक हैं, तो तदनुसार मात्रा को समायोजित करें।
  7. सेल काउंट के मुताबिक, एमएएसएस सेपरेटर के मैग्नेटिक फील्ड मेंएलएस (10 8तक) या एमएस (107तक) कॉलम रखें। एमबी के साथ कॉलम कुल्ला (एलएस के लिए 3 एमएल, एमएस के लिए 500 माइक्रोन)।
  8. कॉलम पर सेल निलंबन लागू करें।
  9. अवेलेबल कोशिकाओं को इकट्ठा करें जो गुजरते हैं। कॉलम जलाशय खाली होने पर ही एमबी की उचित मात्रा (एलएस कॉलम के लिए 3 x 3 एमएल, एमएस कॉलम के लिए 3 x 500 माइक्रोन) जोड़कर कॉलम को 3 बार धोएं। कुल प्रवाह नकारात्मक अंशहै ।
  10. चुंबकीय क्षेत्र से कॉलम निकालें और इसे एक नए संग्रह ट्यूब पर रखें।
  11. कॉलम पर पिपेट एमबी (एलएस कॉलम के लिए 5 एमएल या एमएस कॉलम के लिए 1 एमएल); प्रदान किए गए प्लंजर को कॉलम में धकेलें और सकारात्मक अंश (iNKT कोशिकाओं में समृद्ध) को बाहर निकालें।
  12. iNKT सेल वसूली को और बढ़ाने के लिए, 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर नकारात्मक अंश को अपकेंद्रित्र करें और एक नए एलएस या एमएस कॉलम के साथ 3.6-3.7 कदम दोहराएं। सकारात्मक अंशों को पूल करें और सेल काउंट निर्धारित करें। FACS विश्लेषण के लिए सकारात्मक और नकारात्मक दोनों अंशों के 50 माइक्रोन रखें।
  13. FACS विश्लेषण द्वारा शुद्धि चरणों की जांच करें। नमूनों में शामिल हैं: तिल्ली पूर्व वीवो, टी सेल समृद्ध अंश, iNKT सकारात्मक अंश और iNKT नकारात्मक अंश । कोशिकाओं को दाग दें: सीडी 19-फिटसी, आईएबी-फिटसी, सीडी 1डी-टेट्रामर-पीई, टीसीआरआर-एपीसी और डीएपीआई।
    नोट: एक iVα14-Jα18 माउस से अपेक्षित वसूली 2x106 iNKT कोशिकाओं है ।

4. iNKT सेल सक्रियण और विस्तार

  1. 1:1 अनुपात में माउस टी एक्टिवेटर एंटी-सीडी 3/सीडी28 चुंबकीय मोतियों के साथ शुद्ध iNKT कोशिकाओं को सक्रिय करें।
    1. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर iNKT सेल सकारात्मक अंश अपकेंद्रित्र।
    2. इस बीच एक ट्यूब के लिए विरोधी CD3/CD28 चुंबकीय मोतियों की उचित मात्रा हस्तांतरण और 5 सेकंड के लिए PBS, भंवर की एक समान मात्रा जोड़ें । ट्यूब को 1 मिनट के लिए चुंबक पर रखें और सुपरनेट को त्याग दें।
    3. चुंबक से ट्यूब निकालें और पूर्ण RPMI (RPMI 1640 मध्यम) की उचित मात्रा में धोया चुंबकीय मोती पुनर्व्यवसाण, 10% हीट-इनएक्टिवेटेड एफसीएस, 1 एमएम सोडियम पाइरुवेट, 1% गैर जरूरी अमीनो एसिड, 10 यू/एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, 50 माइक्रोन β-मर्केप्टोथेनॉल) में 1 एमएलए में 5 x10 5 आईएनकेटी सेल्स होंगे। अपकेंद्रित्र iNKT सकारात्मक अंश को फिर से खर्च करने के लिए इस निलंबन का उपयोग करें।
  2. 20 यू/एमएल आईएल-2 के साथ 48 वेल प्लेट में सेल सस्पेंशन (5 x10 5 आईएनकेटी कोशिकाओं) और एंटी-सीडी 3/सीडी 28 चुंबकीय मोतियों की प्लेट 1 एमसीएल और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. 5 दिन के बाद इसमें 10 एनजी/एमएल आईएल-7 डालें।
  4. कोशिकाओं को विभाजित 1:2 जब वे 80-90% संगम तक पहुंचते हैं, तो हमेशा 20U/mL IL-2 और 10 एनजी/एमएल आईएल-7 जोड़ें । इन स्थितियों में, iNKT कोशिकाओं को 15 दिनों तक विस्तारित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल चित्रा 1 ए में संक्षेप में एक इम्यूनोमैग्नेटिक पृथक्करण प्रक्रिया के माध्यम से iVa14-Ja18 ट्रांसजेनिक चूहों की तिल्ली से iNKT कोशिकाओं को समृद्ध करने में सक्षम बनाताहै । कुल तिल्ली टी कोशिकाओं को पहले बी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स को कम करके नकारात्मक रूप से चुना जाता है, जिसके बाद आईआईएनकेटी सेल पॉजिटिव इम्यूनोमैग्नेटिक छंटाई के साथ पीबीएस-57 लिपिड एंटीजन लोडेड सीडी 1डी टेट्रामर्स होते हैं, जो विशेष रूप से केवल iNKT कोशिकाओं को दागने में सक्षम होते हैं। यह प्रोटोकॉल एक iVa14-Ja18 टीजी माउस की तिल्ली से 95-98% शुद्ध iNKT कोशिकाओं के बारे में 2 x 106 पैदावार। नकारात्मक अंश(चित्रा 1 बी)में कोई या वास्तव में कुछ iNKT कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है।

संवर्धन के बाद, iVa14 iNKT कोशिकाओं को एंटी-सीडी 3/सीडी28 मोतियों के साथ-साथ आईएल-2 और आईएल-7(चित्रा 2A)के साथ विस्तारित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप औसतन 30 गुना विस्तार होता है + 14 संस्कृति का + 14 जैसा कि चित्रा 2Bमें दिखाया गया है ।

चित्रा 3A iNKT सेल शुद्धता विट्रो में विस्तार और सीडी 4 अणु की अभिव्यक्ति के साथ दिखाता है । हमने टीसीआरआर+ सीडी 1डी-टेट्रामर+ डबल पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत में एक ह्रास देखा: एंटी-सीडी 3/सीडी28 मोतियों के साथ मजबूत सक्रियण कोशिका की सतह पर iNKT सेल टीसीआर अभिव्यक्ति के डाउनरेगुलेशन को प्रेरित कर रहा है, और एक डबल नकारात्मक आबादी दिखाई दे रही है। अधिकांश विस्तारित iNKT कोशिकाएं सीडी 4 थीं- चित्रा 3B विस्तार के बाद 0 और 14 दिनों में समृद्ध iNKT कोशिकाओं पर वंश-विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों पीएलजेडएफ और RORγt की अभिव्यक्ति का लक्षण वर्णन दिखाता है। यह धुंधला NKT1 (PLZFकम RORγt-),NKT2 (PLZFउच्च RORγt-),और NKT17 (PLZFint RORγt+)फेनोटाइप की पहचान करने में सक्षम बनाता है । ज्यादातर NKT1 और NKT2 होने के नाते, समृद्ध iNKT कोशिकाओं को एक टीएच0 की तरह प्रभावक फेनोटाइप दिखाते हैं । इस फेनोटाइप को विस्तार के 14 दिनों के बाद संरक्षित किया जाता है जैसा कि पीएमए/आयनोमाइसिन उत्तेजना के बाद आईएफए-γ और आईएल-4 दोनों के स्राव से पुष्टि की गई है जो चित्र 3 सीमें दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1:iNKT सेल संवर्धन। A)इम्यूनोमैग्नेटिक सेपरेशन प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। B)प्रत्येक संवर्धन चरण का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। टी सेल आवृत्तियों का प्रतिशत ऊपरी भूखंडों में दिखाया गया है, व्यवहार्य लिम्फोसाइट्स पर गेट किया जाता है। जबकि प्रत्येक चरण के साथ iNKT सेल आवृत्तियों का प्रतिशत निचले भूखंडों में दिखाया गया है, व्यवहार्य सीडी 19 पर गेटेड- TCRο+ लिम्फोसाइट्स। व्यवहार्य सीडी 19 पर धुंधला- TCRο+ lymphocytes के साथ उतारा CD1d tetramer सही ढंग से iNKT सेल गेट आकर्षित करने के लिए अनुमति देते हैं। एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:आईएनकेटी सेल इन विट्रो विस्तार। A)iNKT सेल की गिनती आईएनकेटीटी सेल विस्तार के साथ होती है। तीन प्रतिनिधि और स्वतंत्र प्रयोग दिखाए जाते हैं। B)शुद्धिकरण और सक्रियण के बाद 7 और 14 दिन में आईएनकेटी सेल संख्या में गुना वृद्धि। मतलब ± एसडी दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:विस्तारित iNKT सेल लक्षण वर्णन। ए) विस्तार अवधि के साथ iNKT सेल प्रतिशत और सीडी 4 अभिव्यक्ति का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। ऊपरी भूखंडों को व्यवहार्य लिम्फोसाइट्स पर गेट किया जाता है। निचले भूखंडों को iNKT कोशिकाओं (व्यवहार्य CD1d-tetramer+ TCRο+ लिम्फोसाइट्स) पर गेट किया जाता है। B)समृद्ध (दिन 0) और विस्तारित (दिन 14) iNKT कोशिकाओं का फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन। भूखंडों को iNKT कोशिकाओं (व्यवहार्य सीडी 1d-टेट्रामर+ TCRο+ लिम्फोसाइट्स) पर गेट किया जाता है। कोशिकाओं को Foxp3 प्रतिलेखन कारक धुंधला बफर सेट के साथ प्रतिलेखन कारकों के लिए इंट्रान्यूक्लियर दाग थे । NKT1 (PLZFकम RORγt-),NKT2 (PLZFउच्च RORγt-),और NKT17 (PLZFint RORγt+)सबसेट की पहचान की गई, प्रत्येक सबसेट की आवृत्तियों प्रतिशत में दिखाया गया है । C)14 दिन में विस्तारित iNKT कोशिकाओं द्वारा साइटोकिन उत्पादन। भूखंडों को iNKT कोशिकाओं (व्यवहार्य सीडी 1d-टेट्रामर+ TCRο+ लिम्फोसाइट्स) पर गेट किया जाता है। कोशिकाओं को पीएमए 25 एनजी/एमएल/आयनोमाइसिन 1 μg/mL के साथ 4 घंटे के लिए प्रेरित किया गया, Brefeldin के पिछले 2 घंटे के लिए उपस्थिति में एक 10 μg/mL । कोशिकाओं को तब पीएफए 2% के साथ तय किया गया था, जो परमवॉश के साथ पार हो गया था और फिर साइटोकिन उत्पादन के लिए इंट्रासेलुलर रूप से दाग दिया गया था। गेटिंग रणनीति गैर सक्रिय नियंत्रण, वाम पैनल पर सेट किया गया था । एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां हम लाखों रेडी-टू-यूज iNKT कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक प्रजनन योग्य और व्यवहार्य प्रोटोकॉल दिखाते हैं। वीवो में इन कोशिकाओं की कमी के कारण, उनका विस्तार करने के लिए एक विधि की अत्यधिक आवश्यकता थी। हम जिस प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, उसके लिए न तो किसी विशेष इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता होती है और न ही चूहों की अधिक संख्या । हमने प्रक्रिया के लिए आवश्यक चूहों की संख्या को कम करने के उद्देश्य पर iVα14-Jα18 ट्रांसजेनिक चूहों का शोषण किया।

iVα14-Jα18 ट्रांसजेनिक चूहों से iNKT सेल विस्तार के लिए एक और सफल प्रोटोकॉल साहित्य10में उपलब्ध है। इस प्रोटोकॉल में आईएनकेटी सेल शुद्धिकरण से 6 दिन पहले, ताजा बोन मैरो-व्युत्पन्न डेंड्रिटिक कोशिकाओं की पीढ़ी शामिल है, फिर α-गैलेक्टोसाइलसेरेमाइड और विकिरणित, प्लस आईएल-2 और आईएल-7 से भरी हुई है। हम प्रक्रिया में शामिल चूहों की संख्या में कमी प्रोटोकॉल का एक बड़ा लाभ पर विचार करें । यह समय बख्शने वाला भी है, क्योंकि सेल कल्चर की स्थापना एक सप्ताह के बजाय एक ही दिन रहती है । वर्तमान प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता की एक संभावित सीमा iVα14-Jα18 ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता हो सकती है, जो हालांकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इन चूहों की अनुपस्थिति में, हम बड़ी संख्या में डब्ल्यूटी चूहों का उपयोग करने की संभावना की परिकल्पना करते हैं, लेकिन डब्ल्यूटी चूहों में iNKT कोशिकाओं की कमी के कारण प्रोटोकॉल को तदनुसार स्थापित करने की आवश्यकता है।

सेल संस्कृति के दौरान, हम आमतौर पर विस्तारित iNKT कोशिकाओं की शुद्धता और फेनोटाइप की जांच करते हैं। टीसीआरआर+ सीडी 1डी-टेट्रामर+ डबल पॉजिटिव कोशिकाओं(चित्रा 3 ए)के प्रतिशत में कमी को सक्रियण के बाद कोशिका की सतह से इनवेरेंट एनकेटी सेल टीसीआर के प्राकृतिक डाउनरेगुलेशन द्वारा समझाया जा सकता है। इसके अलावा, अधिकांश विस्तारित iNKT कोशिकाओं ने CD4(चित्रा 3A)व्यक्त नहीं किया: यह एक दत्तक कोशिका चिकित्सा के संदर्भ में एक लाभ का प्रतिनिधित्व कर सकता है, क्योंकि सीडी 4- iNKT कोशिकाओं को ट्यूमर प्रगति11को नियंत्रित करने में सबसे प्रभावी पाया गया था। इसके अलावा, विट्रो विस्तार और12,13, 14, 15के बाद मानव iNKT कोशिकाओं में मनाया गया टीएच0-जैसे प्रभावकफेनोटाइप(चित्रा3सी) पूरी तरह से सुसंगत है। विस्तारित कोशिकाएं वीवो और इन विट्रो में अत्यधिक प्रतिक्रियाशील होती हैं, इस प्रकार आईएनकेटीटी सेल-आधारित दत्तक इम्यूनोथेरपी के संदर्भों में उपयोगी होती हैं। अनमैनिप्युलेटेड या विस्तारित iNKT कोशिकाओं का दत्तक हस्तांतरण तीव्र भ्रष्टाचार-बनाम-मेजबान रोग (aGVHD) को रोकता है या सुधारता है, जिससे भ्रष्टाचार-बनाम-ल्यूकीमिया प्रभाव16, 17,18,19होजाताहै । दत्तक रूप से स्थानांतरित मानव iNKT-कोशिकाओं αGal-Cer के साथ विट्रो में विस्तार xenogeneic aGVHD कम है और इस प्रभाव CD4 द्वारा मध्यस्थता कीहै-लेकिन सीडी 4+ कोशिकाओं20नहीं । इसके अलावा, यह देखते हुए कि iNKT कोशिकाओं aGVHD का कारण नहीं है, वे अपने टीसीआर के विलोपन के लिए की जरूरत के बिना कार इम्यूनोथेरेपी के लिए आदर्श कोशिकाओं का गठन और वीवो8,15में लंबे समय तक एंटीट्यूमर गतिविधि साबित हुई । वर्तमान में चाल-चालन में iNKT कोशिकाओं का शोषण किया जाता है और 21 ,22,23,24) नैदानिक परीक्षणों का निष्कर्ष निकालाजाताहै ।

अंत में, वर्णित प्रोटोकॉल तेज, सीधा है और माउस तिल्ली(चित्रा 3B)से बरामद iNKT कोशिकाओं की संख्या में 30x की वृद्धि की अनुमति देता है। इन कोशिकाओं को आसानी से इन विट्रो मान्यता परख, सह संस्कृति प्रणाली, या पूर्व नैदानिक अध्ययनों में दत्तक कोशिका चिकित्सा के लिए शोषण किया जा सकता है। iNKT कोशिकाओं वास्तव में, ट्यूमर प्रतिरक्षा निगरानी, संक्रामक रोगों और ऑटोआईयुनिटी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इन संदर्भों में, iNKT कोशिकाओं को एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, पारंपरिक टी MHC प्रतिबंध से रहित कोशिकाओं के लिए एक आकर्षक विकल्प जा रहा है । इन कोशिकाओं की बड़ी मात्रा की तेजी से पीढ़ी और उन्हें विट्रो में और हेरफेर करने की संभावना अभूतपूर्व चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के वैज्ञानिक समर्थन और महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पाओलो डेलाबोना और गिउलिया कैसोरेटी को धन्यवाद देते हैं। हम माउस सीडी 1डी टेट्रामर के लिए एनआईएच टेट्रामर कोर सुविधा का भी धन्यवाद करते हैं। अध्ययन Fondazione Cariplo अनुदान 2018-0366 (M.F.) और इतालवी एसोसिएशन फॉर कैंसर रिसर्च (AIRC) फैलोशिप 2019-22604 (जीडी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution in house 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-701
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Brefeldin A Sigma B6542
CD19 -FITC Biolegend 115506 clone 6D5
CD1d-tetramer -PE NIH tetramer core facility mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7 Biolegend 100528 clone RM4-5
Fc blocker BD Bioscience 553142
Fetal Bovine Serum (FBS) Euroclone ECS0186L heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer eBioscience 00-5523-00
H2 (IAb) -FITC Biolegend 114406 clone AF6-120.1
hrIL-2 Chiron Corp
Ionomycin Sigma I0634
LD Columns Miltenyi Biotec 130-042-901
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS buffer (MB) in house 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Non-essential amino acids Gibco 11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) Lonza 15140-122
PermWash BD Bioscience 51-2091KZ
PFA Sigma P6148
Phosphate buffered saline (PBS) EuroClone ECB4004L
PMA Sigma P1585
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Recombinat Mouse IL-7 R&D System 407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax Gibco 61870-010
sodium pyruvate Gibco 11360-039
TCRβ -APC Biolegend 109212 clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads Gibco 11452D
β-mercaptoethanol Gibco 31350010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
  2. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  3. Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
  4. Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
  5. Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
  6. Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
  7. Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
  8. Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
  9. Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
  11. Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
  12. de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
  13. Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
  14. Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
  15. Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
  16. Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
  17. Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
  18. Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
  19. Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
  20. Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
  21. Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
  22. Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
  23. Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
  24. Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 168 iNKT कोशिकाओं विस्तार माउस Vα14 CD1d विरोधी CD3/CD28 मोती सक्रियण लिम्फोसाइट्स
इन विट्रो और वीवो अध्ययन में माउस इनवेरियंट नेचुरल किलर टी सेल का शुद्धिकरण और विस्तार
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delfanti, G., Perini, A., Zappa, E., … More

Delfanti, G., Perini, A., Zappa, E., Fedeli, M. Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies. J. Vis. Exp. (168), e62214, doi:10.3791/62214 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter