Summary
우리는 마우스 비장에서 불변 자연 킬러 T (iNKT) 세포를 풍부하게하고 체외 및 생체 내 연구에 적합한 숫자로 시험관 내에서 확장하기 위해 신속하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
불변성 천연 킬러 T(iNKT) 세포는 비다형성 MHC 급 I 관련 분자 CD1d.전임상 및 임상 연구에서 암, 자가면역 및 감염성 질환에서 iNKT 세포에 대한 역할을 지원하는 자체 또는 미생물 지질 항원에 특이적인 반불변성 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체이다. iNKT 세포는 종 전체에 걸쳐 매우 보존되고 그들의 조사는 CD1d 결핍 또는 iNKT 결핍 마우스를 포함하여 마우스 모델에 의해 촉진되고, 반 불변 TCR에 특이적인 CD1d 테트라머 또는 mAbs를 가진 마우스와 남자에서 명백하게 검출할 가능성. 그러나 iNKT 세포는 드물며 모든 연구를 위해 관리 가능한 숫자에 도달하기 위해 확장되어야 합니다. 시험관 내의 1차 마우스 iNKT 세포주의 생성이 어렵다는 것이 입증되어 왔으니, iVα14-Jα18 트랜스제닉 마우스(iVα14Tg)로부터 비장 iNKT 세포를 정화하고 확장하기 위한 견고한 프로토콜을 설정하여 iNKT 세포가 30배 더 빈번하다. 우리는 여기에서 1 차적인 비장 iVα14Tg iNKT 세포가 면역자기 분리 과정을 통해 풍부해질 수 있다는 것을, 대략 95-98% 순수한 iNKT 세포를 산출한다는 것을 여기에서 보여줍니다. 정제된 iNKT 세포는 안티 CD3/CD28 구슬플러스 IL-2 및 IL-7에 의해 자극되며, 85-99%의 순도로 배양의 날 +14까지 30배 확장됩니다. 확장된 iNKT 세포는 쉽게 유전적으로 조작될 수 있으며, 생체 외에서 활성화 및 기능 메커니즘을 해부하고, 더 중요한 것은 생체 내에서의 입양 전달시에도 귀중한 도구를 제공합니다.
Introduction
불변성 천연 킬러 T 세포(iNKT 세포)는 반불변성 αβ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체로, 비정체 Vα14-Jα18 사슬에 의해 마우스에서 형성된 다양한 Vβ 사슬1의한정된 세트와 결합되어 MHC 급 I-관련 분자CD1 CD에의해 제시된 지질 항원특이이다. iNKT 세포는 여러 성숙 단계3,4를통해 발생하는 흉선에서 이미 활성화 / 타고난 이펙터 표현형을 획득하는 결과 고뇌선별 프로그램을 거치며 CD4+ 및 CD4- 하위 세트를 생성합니다. 이 프로그램을 통해 iNKT 세포는 T-bet, GATA3, PLZF 및 RORγt의 발현에 의해 식별 가능한T-H(iNKT1),TH2(iNKT2) 및 TH17(iNKT17)과 같은 T 조머(TH)이펙터 표현형을 획득한다. iNKT 세포는 다양한 미생물 지질을 인식하지만 암 및 자가 면역2와같은 세포 스트레스 및 조직 손상의 병리학적 상황의 맥락에서 조절되는 내인성 지질에 대해 자가 반응성이다. 활성화시, iNKT 세포는 직접 접촉 및 사이토카인 생성2를통해 다른 선천적이고 적응형 면역 이펙터 세포의 기능을 조절한다.
iNKT 세포의 조사는 CD1d-결핍 또는 Jα18-결핍 마우스를 포함하는 마우스 모델, 및 항원적 로드 CD1d 테트라머의 생산에 의해 촉진되었으며, 인간 반투명 TCR에 특이적인 단일 클론 항체(mAbs)의 생성에 의해 촉진되었다. 그러나, 1차 마우스 iNKT 세포주의 생성은 어렵다는 것을 입증했습니다. iNKT 세포의 항종양 기능을 보다 잘 특성화하고 입양 세포 치료에 활용하기 위해 iVα14-Jα18 트랜스제닉 마우스(iVα14Tg)6의비장 iNKT 세포를 정화하고 확장하는 프로토콜을 설정하여 iNKT 세포가 야생형 마우스보다 30배 더 빈번합니다.
확장된 iNKT 세포는 시험관 내 분석, 그리고 생쥐로 다시 옮겨질 때 생체 내에서 악용될 수 있다. 이 설정에서, 예를 들어, 우리는 그들의 강력한 항 종양 효과 보여 주었다7. 더욱이, 시험관 내 확장된 iNKT 세포는 생체 내에서 그들의 주입 전에 유전자 전달 또는 편집을 통해 기능적 변형을 가능하게하며,분자 통로의 통찰력 있는 기능적 분석을 허용하고, 또한 진보된 세포 치료를 위한 길을 포장할 수 있다.
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Protocol
여기에 설명 된 절차는 검토 및 샌 라파엘과학 연구소에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (No. 1048)에 의해 승인되었다.
참고: 모든 절차는 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 사용되는 모든 시약은 재료 표에나열됩니다.
1. 비장 가공
- 기관 정책에 따라 CO2의 흡입에 의한 iVα14-Jα18 마우스의 안락사.
참고: iVα14-Jα18 마우스는 8주 이상이어야 한다. 세포의 생체 내 전달에서 세포의 거부를 피하기 위해, 여성 마우스로부터 분리 된 세포가 남성 및 여성 수신자 모두에서 입양적으로 전달 될 수 있음을 고려, 남성 마우스에서 분리 된 세포는 남성 받는 사람에서만 전송 될 수 있습니다. 시험관 내 실험의 경우 성 편견을 고려해야 합니다. 더 많은 마우스를 더 많은 세포를 얻기 위하여 풀로 만들 수 있습니다. - 마우스 비장을 해부하고 70 nm 세포 스트레이너를 통해 분쇄하여 2%의 태아 소 혈청(FBS)을 가진 10mL의 인산완충식염수(PBS)에서 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
- 300 x g의 원심분리기는 5분 동안.
- 반전으로 상체를 제거하고 적혈구 용해 버퍼로 처리합니다. 멸균 ACK (암모늄 - 염화물 칼륨) 리싱 버퍼의 1 mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고, 실온에서 3 분 동안 배양하고, 2 %의 FBS와 PBS의 5 mL로 차단합니다. 300 x g의 원심분리기는 5분 동안.
참고: ACK는 시판됩니다. 0.15MNH4Cl,10mM KHCO3,0.1 mM Na2EDTA(에틸렌디아민트라아세트산)의 용액으로 구성되어 있으며, 비스티스틸H2O, pH 7.2-7.4에 용해된다. 수제 경우 0.22 μm 필터로 여과에 의해 살균하십시오. - 반전으로 상체를 제거합니다. 2% FBS로 PBS의 3mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 파이펫팅하여 지방 잔류물을 제거합니다. 필요한 경우 다른 마우스에서 나오는 세포를 풀.
- 세포를 계산하고 FACS 분석을 위해 50 μL을 유지합니다.
2. T 세포 농축
참고: 농축 단계의 경우, 빠르게 작업하고, 세포를 차갑게 유지하고 밤새 4°C에서 미리 냉각된 다음 얼음 위에 보관하는 솔루션을 사용합니다.
- 300 x g의 원심분리기는 5분 동안.
- 2% FBS (107 셀에 대한 500 μL) 및 Fc 차단기 (2.5 μL x 107 셀)로 PBS의 적절한 양으로 모든 세포를 재중단; 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
- 107 총 세포 당 MACS 분리 버퍼 (MB)의 1-2 mL로 세척하고 10 분 동안 300 x g에서 원심분리기.
참고: MACS 버퍼는 시판됩니다. PBS pH 7.2, 0.5% 소세럼 알부민(BSA), 2mM EDTA로 구성되어 있습니다. 수제 경우 0.22 μm 필터로 여과에 의해 살균하십시오. - CD19-FITC 및 H2(IA b)-FITC(MB의 100 μL에서 5 μL x 107 셀 사용)로 셀을 반전하고 얼룩지게 하여 상체를 제거합니다. 잘 섞고 4-8°C에서 어둠 속에서 15분 동안 배양하십시오.
- 107 세포 당 MB의 1-2 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g의 원심분리기를 추가하여 세포를 씻으시면 셀을 씻으신다.
- 상체에서 완전히 피펫을 벗겨 내고 총107개의 세포당 MB의 90 μL에서 셀 펠릿을 재연한다. 총 셀10개당 10μL의 FITC 마이크로비드를 추가합니다. 잘 섞고 4-8°C에서 어둠 속에서 15분 동안 배양하십시오.
- 107 세포 당 MB의 1-2 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g에서 원심분리기를 추가하여 세포를 씻으시면 셀을 씻으시다.
- 상체에서 완전히 피펫을 벗겨 MB의 500 μL에서 최대 1.25 x 108 셀을 다시 일시 중지합니다.
- 고갈을 진행하기 위해 MACS 분리기의 자기장에 LD 컬럼을 배치합니다. 막힘을 피하려면 LD 열에 사전 분리 필터를 적용하고 MB의 2mL로 헹신다.
- 컬럼 저장소가 비어 있으면 셀 서스펜션을 필터에 적용합니다. 열을 통과하는 레이블이 없는 셀을 수집합니다.
- 컬럼 저장소가 비어있을 때만 MB1mL로 3번 씻으시다. T 세포에서 농축될 총 유출물을 수집하고 세포를 계산합니다. 항상 FACS 분석을 위해 50 μL을 유지하십시오.
3. iNKT 세포 농축
- 300 x g의 원심분리기는 5분 동안 반전으로 상판을 제거합니다.
- CD1d-테트라머-PE(마우스 PBS57-CD1d-테트라머)를 가진 세포를 염색하여106세포당 MB의 50μL의 항체 적정에 따라 염색한다. 잘 섞어서 얼음 의 어둠 속에서 30 분 동안 배양하십시오.
참고: 절차는 APC 라벨이 부착된 mCD1d 테트라머 및 안티 APC 구슬로도 수행될 수 있습니다. 다음에 사용되는 불소크롬을 조정하여 그에 따라 염색한다. 본 프로토콜에서 우리는 NIH에서 제공하는 마우스 PBS-57-CD1d-테트라머를 사용했습니다. αgalactosylceramide (αGal-Cer)는 iNKT 세포에 의해 인식되는 전형적인 항원이다; PBS-57은 용해도가 향상된 αGal-Cer의유사체입니다9; NIH 테트라머 시설은 CD1d 테트라머에 PBS-57 리간드 복합체를 제공합니다. 그러나, 다른 CD1d 디머/테트라머/dextramers는 시판되고 αGal-Cer로서 리피딕 항원으로 적재될 수 있다. 우리는 그들의 사용에 대 한 프로토콜을 조정할 수 있는 가능성을 상상. - 107 세포 당 MB의 1-2 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g에서 원심분리기를 추가하여 세포를 씻으시면 셀을 씻으시다.
- 피펫은 완전히 상체에서 피펫과 107 총 세포 당 MB의 80 μL에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 총 세포10개당 20μL의 안티-PE MicroBeads를 추가합니다. 잘 섞고 4-8°C에서 어둠 속에서 15분 동안 배양하십시오.
- 107 세포 당 MB의 1-2 mL을 추가하고 10 분 동안 300 x g의 원심분리기를 추가하여 세포를 씻으시면 셀을 씻으신다.
- 상체에서 완전히 피펫을 벗겨 MB의 500 μL에서 최대 108셀을 재연합니다. 그렇지 않으면 셀이 108을초과하는 경우, 그에 따라 부피를 조정한다.
- 세포 수에 따라, LS(최대108)또는 MS(최대107)컬럼을 MACS 분리기의 자기장에 놓는다. MB(LS용 3mL, MS용 500 μL)로 컬럼을 헹구는다.
- 셀 서스펜션을 열에 적용합니다.
- 지나갈 레이블이 없는 셀을 수집합니다. 컬럼 저장소가 비어있을 때만 적절한 양의 MB(LS 열의 경우 3 x 3mL, MS 열의 경우 3 x 500 μL)를 추가하여 컬럼을 3회 세척합니다. 총 유출물은 음수 분획입니다.
- 자기장에서 컬럼을 제거하고 새 수집 튜브에 배치합니다.
- 열에 파이펫 MB (LS 열5 mL 또는 MS 열에 대한 1 mL); 제공된 플런저를 컬럼으로 밀어 넣고 양극분수(iNKT 셀에서 농축)를 플러시합니다.
- iNKT 세포 회수를 더욱 증가시키기 위해, 10분 동안 음극을 300 x g로 원심분리하고 새로운 LS 또는 MS 컬럼을 사용하여 3.6-3.7 단계를 반복한다. 양수 분수를 풀고 셀 수를 결정합니다. FACS 분석을 위해 양수 분수와 음수 50μL을 유지합니다.
- FACS 분석을 통해 정화 단계를 확인합니다. 샘플은 다음과 같습니다: 비장 전 비보, T 세포 농축 분수, iNKT 양성 분획 및 iNKT 음수 분획. 염색 세포: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-테트라머-PE, TCRβ-APC 및 DAPI.
참고: iVα14-Jα18 마우스에서 예상되는 회복은 2x106 iNKT 셀이다.
4. iNKT 세포 활성화 및 확장
- 마우스 T 활성제 안티 CD3/CD28 자기 구슬을 1:1 비율로 정제된 iNKT 세포를 활성화합니다.
- 원심분리기 iNKT 셀 양성 분획은 300 x g에서 5분 동안.
- 한편 안티 CD3/CD28 마그네틱 구슬의 적절한 부피를 튜브로 옮기고 5초 동안 동일한 양의 PBS, 소용돌이를 추가합니다. 튜브를 자석에 1분간 놓고 상체를 폐기합니다.
- 자석에서 튜브를 제거하고 완전한 RPMI (RPMI 1640 매체, 10 % 열 비활성화 FCS, 1 mM 나트륨 피루바테, 1 % 비 필수 아미노산, 10 U /ml 페니실린 및 연쇄 상감,50M β μ-메르카포) 5NK의 적절한 부피에서 세척 된 자기 구슬을 재중단합니다. 원심 분리 된 iNKT 양수 분획을 다시 일시 중지하려면이 현탁액을 사용합니다.
- 플레이트 1 mL의 셀 서스펜션(5 x 105 iNKT 세포) 및 안티 CD3/CD28 자기 구슬은 20 U/mL IL-2를 장착한 48웰 플레이트에서 37°C에서 배양한다.
- 5일 후 10 ng/mL IL-7을 추가합니다.
- 80-90% 합류에 도달하면 세포를 1:2로 분할하고 항상 20U/mL IL-2 및 10 ng/mL IL-7을 추가합니다. 이러한 조건에서, iNKT 세포는 최대 15일 동안 확장될 수 있다.
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Representative Results
본 원고에 기재된 프로토콜은 도 1A에요약된 면역자기 분리 과정을 통해 iVa14-Ja18 형질성 마우스의 비장으로부터 iNKT 세포를 풍부하게 할 수 있다. 총 비장 T 세포는 먼저 B 세포와 단세포를 고갈하여 부정적으로 선택되고, PBS-57 지질 항원로드 CD1d 테트라머를 사용하여 iNKT 세포 양성 면역자기 분류를 통해 iNKT 세포만 구체적으로 염색할 수 있게 된다. 이 프로토콜은 단일 iVa14-Ja18 Tg 마우스의 비장으로부터 95-98% 순수 iNKT 세포의 약 2 x 106을 산출합니다. 아니 또는 정말 소수의 iNKT 세포는 음수 분수(도 1B)에서검출 될 수있다.
농축 후, iVa14 iNKT 세포는 항 CD3/CD28 구슬플러스 IL-2 및 IL-7(도2A)으로확장될 수 있으며, 그림 2B에 도시된 바와 같이 배양의 일평균 +14배의 확장이 발생한다.
도 3A는 시험관내 팽창 및 CD4 분자의 발현과 함께 iNKT 세포 순도를 나타낸다. TCRβ+ CD1d-테트라머+ 이중 양성 세포의 백분율에서 감소를 관찰했습니다: 안티 CD3/CD28 비드를 통한 강력한 활성화는 세포 표면에 iNKT 세포 TCR 발현의 다운레귤레이션을 유도하고, 이중 음수 집단이 나타나고 있다. 확장된 iNKT 세포의 대부분은CD4-. 도 3B는 팽창 후 0일과 14일 동안 농축된 iNKT 세포에 대한 계보 특이적 전사 인자 PLZF 및 RORγt의 발현의 특성화를 나타낸다. 이러한 염색은 NKT1(PLZF 저Rγt-),NKT2(PLZF 고RORγt-), NKT17(PLZFint RORγt+)표현형을 식별할 수 있게 한다. 대부분 NKT1 및 NKT2인 농축 된 iNKT 세포는 TH0과 같은 이펙터 표현형을 보여줍니다. 이러한 표현형은 도 3C에도시된 PMA/이오노마이신 자극 후 IFN-γ 및 IL-4의 분비에 의해 확인된 바와 같이 14일 간의 확장 후 보존된다.
도 1: iNKT 세포 농축. A)면역자기 분리 프로토콜의 회로도 표현. B)각 농축 단계의 유동 세포측정 분석. T 세포 주파수의 백분율은 실행 가능한 림프구에 게이트된 상부 플롯에 표시됩니다. 각 단계를 따라 iNKT 세포 주파수의 백분율이 낮은 플롯에 표시되지만 실행 가능한 CD19- TCRβ+ 림프구에 게이트됩니다. 실행 가능한 CD19에 염색- 언로드 CD1d 테트라머와 TCRβ+ 림프구는 iNKT 세포 게이트를 정확하게 그릴 수 있습니다. 하나의 대표적인 실험이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: iNKT 셀 생체 외 확장. A)iNKT 셀 확장에 따라 iNKT 셀 카운트. 세 가지 대표 및 독립적인 실험이 표시됩니다. B)정제 및 활성화 후 7일과 14일째iNKT 세포수가 증가하였다. sD에 ± 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: iNKT 셀 특성화 확장. A) 확장 기간 동안 iNKT 세포 백분율 및 CD4 발현의 유동 세포 측정 분석. 상부 플롯은 실행 가능한 림프구에 문이 있습니다. 낮은 플롯은 iNKT 세포 (실행 가능한 CD1d 테트라머+ TCRβ+ 림프구)에 게이트됩니다. B)농축(0일) 및 확장(14일) iNKT 세포의 피노티픽 특성화. 플롯은 iNKT 세포 (실행 가능한 CD1d-테트라머+ TCRβ+ 림프구)에 게이트됩니다. 세포는 Foxp3 전사 인자 염색 버퍼 세트와 전사 인자를 위해 핵으로 염색되었다. NKT1(PLZF 저Rγt-), NKT2(PLZF하이 RORγt-), 및 NKT17(PLZFint RORγt +)서브세트가 확인되었고, 각 하위 집합의 주파수가 백분율로 나타났다. C)14일째 iNKT 세포를 확장하여 사이토카인 생산을 확대하였다. 플롯은 iNKT 세포 (실행 가능한 CD1d-테트라머+ TCRβ+ 림프구)에 게이트됩니다. 세포는 PMA 25 ng/mL/이오노마이신 1 μg/mL로 4시간 동안 자극되었으며, 브레펠딘 A 10 μg/mL의 마지막 2시간 동안 존재한다. 세포는 그 때 PFA 2%로 고정되었다, Permwash로 투과화하고 사이토카인 생산을 위해 세포내 염색. 게이팅 전략은 활성화되지 않은 컨트롤, 왼쪽 패널에 설정되었습니다. 하나의 대표적인 실험이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 수백만 개의 즉시 사용할 수 있는 iNKT 셀을 얻기 위해 재현 가능하고 실행 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 생체 내에서 이러한 세포의 빈약성으로 인해 이를 확장하는 방법이 매우 필요했습니다. 우리가 제안하는 프로토콜은 특정 계측이나 많은 수의 마우스를 필요로하지 않습니다. 당사는 절차에 필요한 마우스의 수를 줄이기 위해 iVα14-Jα18 형질전환 마우스를 의도적으로 이용했습니다.
iVα14-Jα18 형질전환 마우스로부터 iNKT 세포 확장을 위한 또 다른 성공적인 프로토콜은문헌(10)에서사용할 수 있다. 이 프로토콜은 iNKT 세포 정화 6일 전에 신선한 골수 유래 수지상 세포의 생성을 포함하고, 그 후에 α 갈라토실세라미드와 조사, 플러스 IL-2 및 IL-7로 로드됩니다. 우리는 시술에 관여하는 마우스의 수의 감소를 프로토콜의 큰 이점으로 간주합니다. 세포 배양의 설정이 일주일 대신 하루 지속되기 때문에 그것은 또한 시간 절약이다. 현재 프로토콜의 재현성의 가능한 제한은 iVα14-Jα18 형질전환 마우스의 가용성일 수 있으며, 이는 그러나 상업적으로 이용가능하다. 이러한 마우스가 없는 경우, 우리는 많은 수의 WT 마우스를 사용할 가능성을 예상하지만, WT 마우스에서 iNKT 세포의 빈약함으로 인해 프로토콜을 그에 따라 설정해야 한다.
세포 배양 동안, 우리는 일반적으로 확장 된 iNKT 세포의 순도와 표현형을 확인합니다. TCRβ+ CD1d-테트라머+ 이중 양성 세포의 백분율감소(도3A)는활성화 후 세포 표면으로부터의 불변NKT 셀 TCR의 자연적인 다운규제에 의해 설명될 수 있다. 더욱이, 확장된 iNKT 세포의 대부분은 CD4(도3A)를발현하지 않았다- 이것은 CD4이후- iNKT 세포가 종양진행(11)을조절하는 데 가장 효과적인 것으로 나타났기 때문에, 입양세포 치료의 맥락에서 이점을 나타낼 수 있다. 더욱이, 관찰된TH0-like 이펙터 표현형(도3C)은체외 팽창 후 인간 iNKT 세포에서 관찰된 것과 완전히 일관되어8,12,13,14,15. 확장된 세포는 생체 내 및 체외에서 매우 반응성이 뛰어나므로 iNKT 세포 기반 입양 면역 요법의 맥락에서 유용합니다. 조작되지 않거나 확장된 iNKT 세포의 채택 전달은 급성 이식대 숙주 질환(aGVHD)을 예방 하거나 개량하여 접목-대 백혈병효과(16,17,18,19)를남기지 않는다. αGal-Cer로 시험관내에서 확장된 인간 iNKT-세포는 xenogeneic aGVHD를 완화하고 이 효과는 CD4에 의해 중재되지만 CD4+ 세포(20)는아니다. 더욱이, iNKT 세포가 aGVHD를 일으키지 않는다는 점을 감안할 때, 그들은 그들의 TCR의 삭제를 위한 필요 없이 CAR 면역 요법을 위한 이상적인 세포를 구성하고 생체8,15에서장기간 항종양 활성을 가지고 있는 것으로 판명된다. iNKT 세포는 현재 진행 중에서 악용되고 임상 시험21,22,23,24를결론을 내렸다.
결론적으로, 기술된 프로토콜은 빠르고 간단하며 마우스 비장(그림3B)으로부터회수된 iNKT 세포의 수가 30배 증가할 수 있다. 이 세포는 시험 관 내 인식 분석, 공동 배양 시스템 또는 전임상 연구에서 입양 세포 치료를 위해 쉽게 악용 될 수 있습니다. iNKT 세포는 실제로 종양 면역 감시, 전염병 및 자가 면역에 중요한 역할을합니다. 이러한 맥락에서, iNKT 세포는 MHC 제한이 없는 기존의 T 세포에 대한 매력적인 대안인 강력한 도구를 나타낼 수 있다. 이러한 세포의 대량의 급속 한 세대와 시험 관에서 그들을 더 조작 하는 가능성 전례 없는 치료 전략의 개발으로 이어질 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 파올로 델라보나와 줄리아 카소라티에게 과학적 지원과 원고의 비판적 독서에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 CD1d 테트라머에 대한 NIH 테트라머 코어 시설에 감사드립니다. 이 연구는 폰다지오네 카리플로 그랜트 2018-0366 (M.F.) 및 이탈리아 암 연구 협회 (AIRC) 펠로우십 2019-22604 (G.D.에)에 의해 투자되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
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